여기서, 우리는 xenogeneic 이식편 대 숙주 질환(xenoGVHD) 모델에서 질병을 유도하고 점수를 매기는 프로토콜을 제시한다. xenoGVHD는 인간 T 세포의 면역 억제를 연구하는 생체 내 모델을 제공한다. 추가적으로, 우리는 면역 억제를 정량화하는 공구로 디지털 PCR를 가진 조직에서 인간 적인 T 세포를 검출하는 방법을 기술합니다.
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방법 논문
디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점
이 논문에서
요약
초록
급성 이식편 대 숙주 질환(GVHD)은 혈액학적 결핍 및 악성 종양에 대한 치료로서 조혈 줄기 세포 이식을 받는 환자에게 상당한 제한이다. 급성 GVHD는 공여자 T 세포가 외국 항원으로 숙주 조직을 인식하고 숙주에게 면역 반응을 장착할 때 발생한다. 현재 처리는 감염과 재발에 영향을 받기 쉬운 환자를 렌더링하는 유독한 면역 억제 약을 관련시킵니다. 따라서, 기증자 T 세포를 효과적으로 표적으로 하고 부작용을 감소시킬 수 있는 급성 GVHD 치료를 제공하기 위한 연구가 진행 중이다. 이 전 임상 작업의 대부분은 생체 내 시스템에서 뮤린 세포보다는 인간 세포에 면역 억제 요법의 테스트를 허용 하는 xenogenic GVHD (xenoGVHD) 뮤린 모델을 사용 합니다. 이 프로토콜은 xenoGVHD를 유도하는 방법과 일관된 결과를 보장하기 위해 임상 점수를 장님과 표준화하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 이 프로토콜은 마우스 조직에 있는 인간 적인 T 세포를 검출하기 위하여 디지털 PCR를 사용하는 방법을 기술합니다, 이후에 시험된 치료의 효험을 정량화하기 위하여 이용될 수 있는. xenoGVHD 모델은 GVHD 요법을 테스트하는 모델뿐만 아니라 인간 T 세포를 억제 할 수있는 모든 치료법을 제공하며, 이는 많은 염증성 질환에 적용 될 수 있습니다.
서론
동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)은 가난한 예후를 가진 백혈병과 같은 혈액학적 악성 종양으로 고통받는 환자를 위한 일상적인 처리가 되었습니다. HSCT의 중요한 합병증은 급성 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)입니다. 2012년의 한 연구에서는 급성 GVHD가 형제 기증자로부터 이식을 받는 HSCT 환자의 39%와 관련없는기증자로부터 이식을 받는 환자의 59%에서 개발되었다고 보고했습니다 1. 급성 GVHD는 기증자 유래 T 세포가 수령인의 장기를 공격할 때 발생합니다. GVHD에 대한 유일한 성공적인 치료법은 매우 독성이 높고 감염 및 종양 재발의 위험을 증가시키는 고면역 억제 제2로 치료하는 것입니다. 따라서, 최근 몇 년 동안 급성 GVHD 생존에서 이루어진 개선에도 불구하고 3,4,5,장기 완화를 촉진하는 최소한의 독성으로 개선된 GVHD 요법에 대한 중요한 필요성이 여전히 존재한다.
다음 방법의 전반적인 목표는 xenogeneic GVHD (xenoGVHD)를 유도하고 점수를 매기....
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프로토콜
모든 마우스 실험은 캔자스 대학 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 거쳐 준수하고 승인을 받아 수행되었습니다. 모든 건강한 인간 혈액 샘플은 캔자스 대학 의료 센터의 기관 검토 위원회의 승인을 받고 정보에 입각한 동의하에 얻어졌습니다.
1. NSG 마우스의 조사
- PBMC 주입 하루 전에, 조사 8-12 주 오래 된 NSG 마우스 (어느 섹스 사용할 수 있습니다). 멸균 된 생체 안전 성 캐비닛에 살균 된 파이 케이지 또는 마이크로 이졸레이터에 마우스를 놓습니다. Cs137 소스 또는 작은 동물 조사기(예를 들어, RS 2000)에서 마우스를 조사하여 총 투여량 150 cGy의 느린 회전으로 균등한 조사를 보장한다.
- 멸균 된 생체 안전 캐비닛에 깨끗한 케이지에 마우스를 놓습니다.
2. 주입을 위한 인간 PBMC의 준비
- 마우스 당 1.1 x 107 PBMC를 분리하기에 충분한 건강한 인간의 혈액을 수집합니다. 헤파린화된 혈액을 인산완충식염수(PBS)에서 2% 태아 소 혈청(FBS)의 동일한 부피로 희석합니다.
참고:이 프로토콜을 사용하면 PMBC 수율은 일반적으로 전혈
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결과
인간 PBMC를 받은 남녀 모두의 8-12주 령 NSG 마우스를 치명적으로 조사한 결과, PBS만을 받은 음성 대조군 마우스에비해 10일 전후의 GVHD의 임상 적 징후를 보이기 시작했다(도 1A). XenoGVHD 마우스는 23.5 일의중간 생존을 가졌다 (도 1B). 디지털 PCR을 사용하면, CD3 엡실론 양성 인간 T 세포는 인간 PBMC를 수신한 마우스의 폐 및 간 샘플에서 검출될 수 있었다. PBS를 주사한 마우스로부터의 조직 샘플을대조군으로 사용하였다(도 2).
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토론
질병 진행은 일반적으로 xenoGVHD 모델에서 일관적이며, 다른 공여자로부터 PBMC를 주사하더라도, 그래서 여러 실험을 결합할 수 있다. 이러한 일관성을 유지하는 데 필요한 주요 단계는 적절한 즉 주입 기술, 눈가리개 및 일관된 점수입니다. Nervi 등25에 의한 연구는 정맥 꼬리 정맥 주사에 비해, PBMC의 복고풍 궤도 주사가 더 일관된 생착과 더 심한 GVHD 귀착되었다는 것을 보여주었습니다. Leon-Rico 외26은 또한 레트로 궤도 주사가 꼬리 정맥 주사에 비해 마우스에서 보다 일관된 조혈 줄기 세포 생착을 초래한다는 것을 입증했습니다. 그러나, 필요한 경우, 꼬리 정맥 주사는 xenoGVHD 모델27,28,29에서대체 방법으로 사용될 수 있다.
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
우리는 이러한 실험에 사용되는 디지털 PCR 기계를 제공하고 제공되는 기술 지원을 위해 Lane Christenson의 실험실을 인정하고 싶습니다. 또한 토마스 양키 박사님의 지도와 멘토링에 감사드립니다. 이러한 연구는 트립 가족 재단에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 에펜도르프 튜브 | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 mL 혈청학 피펫 | VWR International | 89130-898 | |
| 10mL BD Vacutainers - 나트륨 헤파린으로 캡을 씌운 녹색 | Becton Dickinson | 366480 | |
| 250 µ L Ranin 피펫 팁 | Rainin | 17001118 | 물방울 생성을 위해 다른 피펫 또는 피펫 팁을 사용하지 마십시오 |
| 50 mL 코니컬 튜브 | VWR International | 89039-656 | |
| 96-Well ddPCR 플레이트 | Bio-Rad | 12001925 | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) 용해 버퍼 | Lonza | 10-548E | 선택적 |
| 알코올 와이프 | Fisher Scientific | 6818 | |
| Anesthesia Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | 동물 시설 제공 |
| 마취 기계 | Parkland Scientific | PM1002 | 동물 시설 제공 |
| BD Vacutainer Safety-Lok 혈액 채취 세트 | Becton Dickinson | 367281 | |
| DG8 QX100 / QX200 액적 발생기 용 카트리지 및 개스킷 | Bio-Rad | 1864007 | |
| DNAse 및 RNAse 무료 분자 등급 H2O | Life Technologies | 1811318 | |
| 에틸 알코올, 순수, 200 proof, 분자 생물학 | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| 태아 소 혈청 | 애틀랜타 생물학 | S11150 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
| 인슐린 주사기 | Fisher Scientific | ||
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | 동물 시설 제공 |
| 액체 질소 | N/A | N/A | |
| 마우스 조사기 파이 케이지 | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | 11개의 마우스 |
| 수용 Nexcare Gentle Paper Tape(일명 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
| P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad | 1814040 | |
| Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | ||
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | 액적 생성을 위해 다른 피펫 또는 피펫 팁을 사용하지 마십시오. |
| Qiagen DNeasy 혈액 및 조직 키트 | Qiagen | 69506 | |
| qPCR 플레이트 | VWR International | 89218-292 | |
| QX200 액적 디지털 PCR 시스템 | Bio-Rad | 12001925 | EvaGreen 또는 프로브 기반 디지털 PCR 애플리케이션용 액적 발생기, 액적 리더, 노트북 컴퓨터, 소프트웨어, 관련 구성 요소 소모품 포함 |
| Bio-Rad | 1864006 | 용 QX200 액적 생성 오일 | |
| EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| RNase 및 DNase-free 플레이트 씰 | Thermo Scientific | 12565491 | |
| RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| 멸균 거즈 패드 (2" x 2", 12-Ply) | Fisher Scientific | 67522 | |
| 멸균 인산염 완충 식염수 | Fisher Scientific | 21040CV | |
| 멸균 저수지 | VWR International | 89094-662 | |
| 수술용 가위 | Kent Scientific | INS600393-4 | |
| 외과용 겸자 | Kent Scientific | INS650914-4 |
참고문헌
- Jagasia, M., et al. Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation. Blood. 119 (1), 296-307 (2012).
- Bolanos-Meade, J., et al. Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate ....
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