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방법 논문

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

6.4K 조회수

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DOI:

10.3791/59226

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2019년 5월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering and Yale Systems Biology Institute, Yale University, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 3Center for Cell Dynamics and Department of Cell Biology, Johns Hopkins University

이 논문에서

요약

우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.

초록

2D 세포 배양 시스템의 다양 한 한계는 살아있는 조직의 공간적 및 화학적 복잡성을 더 잘 모방 하 고 생체 내 조직 기능을 모방 하는 3D 세포 배양 및 분석 플랫폼에 대 한 관심을 촉발 시켰습니다. 최근 미세 제조 기술의 진보는 세포가 잘 정의 된 세포 외 기질 (ECM)과 가용성 또는 매트릭스 관련 생체 분자의 정의 된 집합으로 통합 될 수 있는 생체 외 환경에서의 개발을 촉진 시켰다. 그러나, 기술 장벽은 연구 실험실에서 그들의 대폭적인 사용을 제한 했습니다. 여기서, 우리는 정의 된 화학 유인 구배와 함께 3D 미세 환경에서 세포와 멀티 셀로 노이 드와 3D 문화와 실험을 위한 간단한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 플랫폼의 사용은 상피 세포와 유기 체의 반응의 분석을 위해 표 피 성장 인자 (EGF)와 같은 성장 인자의 그라데이션에 관한 것 이다. EGF 그라데이션은 유 방 소기관에서 지시 된 지점 형성으로 이어지는 며칠 동안 장치에서 안정 하였다. 이 분석을 통해 셀 그룹에의 한 집단 그라데이션 감지가 더 민감하고 단일 셀 이라고 결론을 내릴 수 있었습니다. 우리는 또한 포토 리소 그래피 시설이 나 고급 소프트 리소 그래피 기술이 필요 하지 않은 제조 방법을 설명 합니다. 이 방법은 암을 포함 하 여 발달 및 병리학 적 상태 분석의 맥락에서 3D 세포 거동을 연구 하는 데 도움이 될 것입니다.

서론

생리 적 환경에서 세포는 셀 외 기질 (ECM)에 내장 되어 과다 한 생체 분자에 노출 됩니다. 세포와 주변 미세 환경 사이의 상호 작용은 마이그레이션, 성장, 분화 및 생존1을포함 하 여 다양 한 표현 형을 제어 하는 세포내 프로세스를 조절 합니다. 많은 것은 종래의 2D 세포 배양에서 세포 거동에 대해 배웠다. 그러나 3D 하이드로 겔에 내장 된 세포에 대 한 생체 내 이미징 및 실험의 출현으로, 세포 거동에 중요 한 차이는 간단한 2D 시험관 내 배양과 3D 조직 유사 환경에서 인식 되었습니다. 셀이 ECM 섬유와 상호 작용 하 고 3D 매트릭스 내에서 기계적 특성을 감지 하는 동안 젤의 재료 강성은 2D 시험관 시스템에서 완전히 독립 된 변수가 아닙니다. 차원은 초점 부착 형성을 변경 하 여 다른 세포 형태학과 행동을 초래 합니다. 또한 2D 표면의 셀은 3D에서 모든 방향으로 열린 셀 보다 더 적은 신호 전달에 노출 됩니다.

이러한 한계는 생체 조직의 공간적 및 화학적 복잡성을 나타내고 체 내 조직 기능을 더 잘 예측 하는 3D 시스템에 대 한 관심을 증가 시켰습니다. 그들은 ECM3,4에 무작위로 산재 된 세포에 세포 마이크로 구조체를 자체 조립 하는 것과 같은 다양 한 형태로 개발 되었습니다. 미세 제조 기술의 최근 진보는 표현 형 변화를 연구 하기 위한 3d 배양 시스템 (5,6,7,8,9 )의 출현을 촉진 하 고 가용성 신호에 대 한 세포 반응; 그러나, 기술 장벽은 연구 실험실에서 널리 사용을 제한 합니다. 대부분의 경우 제작 공정에는 포토 리소 그래피 기법과 배경 지식을이 필요 합니다. 더욱이, 장치를 성공적으로 구축 하 고 장기간에 걸쳐 장치의 최적 기능을 달성 하기 위해 다양 한 요인을 제어 해야 합니다.

우리의 방법은 정의 된 화학 유인 구배와 함께 3 차원 미세 환경에 세포 및 멀티 세포 소기관을 통합 하 고 EGF10에 대 한 상피 반응을 분석 하기 위한 3d PDMS 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 당사의 데이터에의 하면, 얕은 EGF 그라데이션에 반응 하는 소기관의 용량은 갭 접합부를 통한 세포 간 화학적 커플링에서 발생 합니다. 이는 취약 하 고 시끄러운 공간적으로 등급이 매겨진 입력을 보다 정밀 하 게 감지할 수 있는 소기관의 가능성을 시사 합니다. 제조 공정은 청정 실 시설이 나 포토 리소 그래피 기술이 필요 하지 않습니다. 그러나, 3D PDMS 디바이스는 3D 생리학적 환경의 필요한 요인을 포함 한다. 이 방법은 3D 셀룰러 동작을 연구 하는 데 도움이 될 것 이며 다른 세포 유형, chemoattractants 및 ECM 조합으로 큰 연구 잠재력이 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 작업은 검토 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 진행 되었다, 존스 홉킨스 대학, 의학의 학교.

1. mesofluidic 장치의 제작

  1. 3D CAD 소프트웨어를 사용 하 여 PDMS 장치용 몰드 마스크를 설계 합니다.
  2. 열 저항 수 지가 있는 스테레오 리소 그래피 장비를 사용 하 여 금형을 인쇄 합니다.
    참고: 여기에 설명 된 절차는 상업용 3D 프린팅 서비스에 의해 수행 되었습니다.
  3. 경화제와 함께 PDMS 모노 머 용액을 10:1 비율로 철저히 섞어 줍니다. 3 mL의 PDMS 혼합물을 소자의 제조에 요구 하였다. 총 체적은 조작 하는 금형의 수에 따라 달라 집니다.
  4. 진공을 적용 하 여 혼합물을 가스 제거 하 고 1 시간 동안 내부 실험실 진공 또는 진공 건조 기에 감압 펌프를 사용 한다.
  5. 접착 테이프로 몰드 표면을 살짝 두 드려 먼지를 제거한 다음 PDMS 혼합물을 몰드에 부 어 넣습니다. 거품이 공정에 도입 되는 경우, 진공 건조제에 탈 기를 반복 한다. 금형의 기둥 사이에 갇힌 기포는 날카로운 바늘로 파고 하 여 제거 할 수 있습니다.
    참고: 실 온에서의 탈 기 공정은 1 시간 이내에 이루어져야 합니다.
  6. 80 ° c에서 2 시간 동안가 열 하 여 PDMS를 경화 시킨다. 몰드가 실 온에서 냉각 되도록 합니다.
  7. 블레이드를 사용 하 여 몰드와 PDMS 사이의 경계를 자른 다음 몰드에서 PDMS를 조심 스럽게 벗 겨 냅니다.
  8. 22 mm x 22mm 커버 슬립에 맞게 PDMS 파트를 트림 하 고 입구에 구멍을 뚫습니다.
    참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
  9. 낮은 보풀 조직으로 표면을 닦 고 70% 에탄올로 PDMS 부분과 22mm x 22mm 커버 슬립을 청소 합니다. 그런 다음 접착 테이프로 큰 먼지 입자를 제거 합니다.
  10. PDMS 부품과 커버 슬립을 자동 멸 균 (121 ° c, 습식 15 분간 건조) 또는 1 시간 동안 자외선에 노출 시키는 방법으로 소독 합니다.
  11. 조직 배양 후드에 5 분간 코로나 방전 총으로 PDMS 파트와 커버 슬립의 바닥면을 처리 한 후 함께 결합 한다.
    주의: 폴리스 티 렌 폼과 같은 비 전도성 물질을 바닥에 놓고이 과정에서 모든 전도 물질을 제거 하십시오. 콜라겐 젤과 유리 커버 슬립 사이의 결합을 증가 시키기 위해 치료 후 5 분 이내에 즉시 장치에 교원 질을 주입 하십시오.

2. 세포 준비: 1 차 유 방 관 능 분리

참고: 유 방 관 능 분리의 세부 사항은 이전 작업11에서 찾을 수 있습니다. 임의의 종류의 단일 세포 또는 관 능 노이 드를 자신의 절연/분리 프로토콜에 따라 제조할 수 있다.

  1. 쥐의 유선 조직을 메스로 하 여 조직을 이완 하 고 37 ° c에서 30 분 동안 50 mL의 콜라 게 나 제/트립 신 용액 (마우스 당 10ml)의 0.1 g을 사용 하 여 보충 하 고, 트립 신과 콜라 게 나 제, 0.1의 g , FBS의 5 mL, 1 μ g/m l 250 μ l 및 50 μ g/mL 겐 타 마이 신의 50 μ l.
  2. 콜라 게 나아 제/트립 신 용액을 10 분 동안 1250 x g 에서 원심 분리 하 여 흡 인에 의해 상층 액을 제거 한다. DMEM의 10ml의 세포를 분산 시키고 10 분 동안 1250 x g 에서 원심 분리기를 분리 합니다. 흡 인에 의해 DMEM/F12를 제거한 후, DNase (2 단위/μ l)의 40 μ l로 보충 된 4Ml/f12 DMEM의 세포를 재 중단 하십시오.
  3. 2-5 분 동안 DNase 용액을 손으로 흔들고 10 분간 1250 x g 에서 원심 분리 합니다.
  4. 단일 세포에서 4 개의 차동 원심 분리 (펄스-1250 x g )를 통해 소기관을 분리할 수 있으며 의도 한 속도에 도달한 후 원심 분리기 3-4을 중지 합니다. 각 펄스 사이에, 상층 액을 흡 인 하 고 10ml의 DMEM/F12에서 펠 렛을 소생 한다.
  5. 콜라겐 준비를 위해 1% 페니실린/streptomycin와 1% 인슐린 트랜스 페 린-셀 렌-X와 DMEM의 원하는 양의 성장 배지의 최종 펠 렛을 재 일시 중단 하십시오.

3. 콜라겐 준비 및 주입

참고: 다른 유형의 ECM 젤은 자체 겔 화 프로토콜에 따라 제조할 수 있습니다.

  1. 콜라겐 타입 I 용액 (3.78 mg/ml)을 준비 하 고, 10 배 DMEM, 1nnaoh 용액을 얼음에 정상적인 성장 배지로 제조 하였다.
    참고: 절차가 완료 될 때까지 얼음을 보관 하십시오.
  2. 1 N NaOH 용액 6 μ l를 추가 하 고, 200 μ l의 성장 배지 및 50 μ l의 DMEM을 미리 냉장 된 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고 용액을 완전히 섞어 줍니다.
  3. 425 μ l의 콜라겐을 미리 혼합 된 용액에 넣고 파이 펫 팅을 통해 철저히 섞어 줍니다.
  4. 콜라겐 혼합물을 짧게 (5 초 미만) 원심 분리 하 여 혼합물 로부터 기포를 제거 한다.
  5. 중성화 된 콜라겐 용액을 얼음 위에 1 시간 동안 보관 하 여 섬유 형성을 유도 한다.
  6. 세포 현 탁 액의 50 μ l을 콜라겐 혼합물에 넣고 완전히 섞어 줍니다.
    참고: 최종 콜라겐 농도는 2mg/ml입니다.
  7. 전체 챔버가 채워질 때까지 PDMS 디바이스의 입구를 통해 200 μ l pipet를 사용 하 여 용액을 주입 한다. 콜라겐 혼합물이 기둥의 틈새를 통과 하는 경우, 겔 화 후에 날카로운 외과 잎으로 과잉 콜라겐 젤을 잘라냅니다.
  8. 상기 장치를 배양 기에 37 ° c에서 1 시간 동안 5% co2로 유지 하 여 겔 화를 유도 한다.
  9. 양쪽에 있는 저장소를 성장 매체로 채우고 공초점 이미징이 수행 될 때까지 5% CO2를 사용 하 여 37 ° c의 인큐베이터에 장치를 보관 하십시오.

4.3D 이미징 및 정량화

  1. 라이브 셀 이미징 배양 챔버를 공초점 현미경에 설치 하 고 온도와 CO2 내지 37을 각각 미리 설정 한다. 습도를 높이기 위해 챔버의 저수지에 물을 추가 하 고 필요한 경우 젖은 물티슈를 챔버에 놓습니다.
  2. 챔버에 PDMS 디바이스를 배치 하 고 그라데이션 형성에서 EGF의 ' 소스 '로 서 하나의 저장소에 EGF를 추가 한다. 다른 저장소는 공간적으로 등급을 매긴 EGF 분포의 개발에 필요한 ' 싱크 '를 제공 합니다. 2.5 nM의 EGF를이 연구에서 0.5 nM/mm의 기울기를 만들기 위한 싱크에 첨가 하였다.
  3. 관심 있는 소기관의 부피를 덮는 Z 스택의 범위를 설정 하 고 이미징을 시작 합니다.
    주의: 광 독성을 피하려면 공초점 이미징에서 낮은 레이저 강도를 시도 하거나 다중 광자 이미징 기술을 사용 하십시오.
  4. 상업용 소프트웨어나 사용자 지정 프로그램을 사용 하 여 2D 이미지 스택에서 3D 이미지를 재구성할 수도 있습니다. 소기관 또는 개별 세포의 이동 으로부터 연장 되는 지점의 길이와 각도를 측정 한다. 여기서, ImageJ를 사용 하 여 상기 관 능 체를 중심으로 자유형 윤곽을 그려 정량화를 수행 한다.

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결과

EGF는 유 방 땀 샘의 형태 형성을 촉진 하는 필수 레 귤 레이 터 이며, 침 습성 암 성장에서 유방암 상피 세포의 이동을 유도 하는 중요 한 화학 유인 제입니다. 위에서 설명한 메조 스코프 유체 장치를 사용 하 여 정의 된 EGF 그라데이션 (도 1a, B)에 대 한 세포의반응을 연구 하였다. 이 장치는 폭이 5mm, 길이 10mm, 높이 1mm의 문화 영역을 생성 합니다. 배양 영역의 측면은 표면 장력을 통해 세포 배양 영역 내의 액체 ECM 및 세포 혼합물을 트랩 하는 데 사용 되는 육각형 기둥에 의해 개방 우물에서 분리 된다. 우리는이 3D 문화의 크기를 감안할 때, 포토 리소 그래피10에 의해 적절 한 크기의 몰드를 구성 하는 것이 매우 어렵고, 비싸고, 시간이 많이 소요 될 것 이라는 점을 ...

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토론

PDMS 몰드의 제작은 상업용 3D 프린팅 서비스를 사용 하 여 수행 되었지만, 사내 하이 엔드 3D 프린터로도 수행할 수 있습니다. 다양 한 3D 제작 방법 중에서 입체 리소 그래피는 고해상도 몰드 생성에 권장 됩니다. PDMS 경화는 고온 (80 ° c)에서 발생 하기 때문에 인쇄를 아웃소싱 할 경우 재료는 충분히 열적으로 내성이 있어야 하며이를 명시적으로 지정 해야 합니다. 열 후 경화는 부품의 열 저항을 높이기 위해 인쇄 서비스 회사와 논의 할 수 있습니다. 인쇄 서비스 및 재료의 세부 사항은 재료 표에명시 되어 있습니다.

경화 된 PDMS의 기계적 성질은 경화 온도에 따라 달라진 다. PDMS 혼합물을 오븐에서 경화 하기 전에 오랜 시간 동안 실 온에서 보관 하면, 완전 경화 후에도 너무 탄성이 된다. 따라서, 실 온에서의 탈 기 공정은 1 시간 이내에 이루어져야 한다. 탈 기는 PDMS 내의 미세 기포를 제거 하는 데 도움을 줄 수 있는 ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 AJE (NSF PD-11-7246, 유방암 연구 재단 (BCRF-17-048) 및 NCI U54 CA210173) 및 AL (U54CA209992)에 대 한 보조금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
22mm x 22mm 커버슬립 Fisher Scientific12-542-B
콜라겐 I, 랫피셔 사이언티픽CB-40236
콜라겐이즈시그마-알드리치C5138
COMSOL 다중물리 4.2COMSOL Inc확산 역학 시뮬레이션에 사용
10x DMEMSigma-AldrichD2429
DEME/F12Thermo Fisher11330032
DNaseSigma-AldrichD4623
EGF 재조합 마우스 단백질Thermo FisherPMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)Life technologies16140-071
Fiji-ImageJ분기 길이와 각도를 측정하는 데 사용됨
GentamicinGIBCO 5750-060
IMARIS비트플레인
인슐린시그마-알드리치19278
인슐린-트랜스페린-셀레늄-XGIBCO 51500
저보푸라기 조직Kimberly-Clark ProfessionalKimtech 와이프
금형 재료Proto labsAccura SL5530 
금형 인쇄 장비프로토 랩Stereolithogrphy최대 치수 : 127mm x 127mm x 63.5mm, 레이어 두께 : 0.0254mm
몰드 프린팅 서비스프로토 랩 사용자정의https://www.protolabs.com/
NaOH시그마 - 알드리치S2770
페니실린 / 스트렙토 마이신VWR16777-164P
스피닝 디스크 컨 포칼 현미경Solamere Technology Group
Sylgard 184전자 현미경 과학184 SIL ELAST KIT PDMS 키트
트립신시그마-알드리치T9935

참고문헌

  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
  2. Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
  3. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  4. Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720(2015).
  5. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
  6. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  7. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
  8. Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
  9. Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
  11. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).

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