초파리 멜라노가스터의 구연산 신타제 활동의 대색 분석

미토콘드리아는 대부분의 진핵 생물에서 전력 생산 세포기관으로 가장 잘 알려져 있으며, 이는 에너지 통화인 ATP를 삼차갈래산 주기(즉, 크렙스 주기) 및 산화 인산화를 통해 생산합니다. 미토콘드리아는 또한 세포사멸^1,Ca²⁺ 항상성^2,3,반응성 산화 종(ROS)^4세대및 내포성 망상(ER)-스트레스^반응의조절과 같은 많은 다른 생리적 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 미토콘드리아 기능 장애는 모든 연령대의 신체에 영향을 미칠 수 있으며 대사, 노화 관련⁶및 퇴행성 신경 질환의 주요 원인입니다^7. 본래 미토콘드리아는 미토콘드리아 기능과 기계적으로 관련이 있습니다. 따라서, 미토콘드리아 질량의 적절한 정량화는 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 매우 중요하다^8. 구연산 신타제는 트리카르복실산 주기^9의제1단계에서 속도 제한 효소로서, 진핵 세포 내의 미토콘드리아 매트릭스에 국한되어 있으며, 따라서 그대로 미토콘드리아 질량^9,10의존재에 대한 정량적 마커로서 사용될 수 있다. 구연산염 합성 활성은 또한 온전한 미토콘드리아 단백질^11,12에대한 정상화 인자로 사용될 수 있다.

열매 파리, Drosophila melanogaster는미토콘드리아에서 중추적 인 역할을하는 많은 분자 및 경로가 진화적으로 인간^13,14,15로보존되기 때문에 미토콘드리아 기능을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 여기서, 우리는 96웰 플레이트 포맷에서^16개의 동질성 혈색 분석법에 의한 구연산염 합성 활성의 측정을 위한 빠르고 간단한 방법을 제시한다. 구연산염 합성 활성 분석에서, 구연산염 합성효소는 초파리 조직에서 동질화 촉매 작용을 아세틸 코엔자임 A(아세틸 CoA)와 함께 옥살로아세테이트의 반응을 형성하여 구연산염 CoA-SH 및^H+를형성한다. CoA-SH는 이어서 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)(DTNB)와 반응하여 412 nm에서 분광광도 측정을 쉽게 측정할 수 있는 2-니트로-5-티오벤조에이트(TNB)의 유색 생성제품을 생성합니다. 구연산염 합성 활성은 색상 생산의 속도에 의해 반영될 수 있다.

1. D. 멜라노가스터에대한 대색 구연산 신타제 활동 분석¹⁶

1. 각 샘플에 대해 10 개의 성인 파리를 수집합니다. 각 유전자형에 대해 적어도 세 배의 샘플을 수집합니다.
2. 각 시료에 대해 1.5 mL 시험관에서 20 mM HEPES (pH = 7.2), 1 mM EDTA 및 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 얼음 차가운 추출 완충액 500 μL을 준비합니다.
3. 성인이 마취 패드에_CO2로 파리를 마취하고 원하는 조직을 분리. 예를 들어, 성인 플라이 흉부들을 분리하기 위해 한 쌍의 포셉으로 플라이 흉부를 고정한 다음 가위를 사용하여 흉부와 복부의 경계를 따라 절단하여 플라이 복부를 분리합니다. 근육 구연산염 합성 활성 분석에 대한 플라이 토락을 수집합니다.
   참고 : 구연산염 합성 활동을 정상화하는 데 사용하는 경우이 단계에서 조직의 신선한 무게를 결정하십시오.
4. 10 명의 성인 플라이 토락을 얼음 차가운 추출 완충액 100 μL로 즉시 옮기고 얼음에 유봉으로 균질화하십시오. 샘플을 얼음 차가운 상태로 유지하려면 얼음에 5-10 초 동안 샘플을 균질화 한 다음 샘플을 5 s용 얼음에 앉게하고 튜브의 모든 조직이 완전히 균질화 될 때까지 반복하십시오.
   참고 : 튜브테이프, 균질화에 혈전이 없는지, 튜브의 조직이 완전히 균질화되었는지 확인하십시오. 모든 샘플 처리는 얼음에서 수행해야합니다.
5. 단백질 함량 측정을 위해 새로운 튜브에서 각 균질화된 샘플의 10 μL을 섭취하십시오. 얼음에 단백질 측정을 위해 샘플을 보관하십시오.
   참고: 단백질 샘플을 동결하여 나중에 분석을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 단백질 농도 구연산 염 합성 활동의 정상화에 대 한 내부 매개 변수 역할을.
6. 남은 각 시료에 400 μL의 얼음-차가운 추출 버퍼를 추가하여 총 부피를 500 μL로 만듭니다. 각 반응에 대해, 1 μL의 희석 된 세포 용해액을 150 μL의 신선하게 제조 된 반응 용액 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM DTNB, 0.3 mM 아세틸 CoA, 1 mMoxaloacetic 산)을 추가합니다. 거품 형성을 피하면서 부드럽게 파이펫팅하여 철저하고 즉시 섞으세요. 최소 10초 간격으로 412 nm에서 흡광도를 측정할 수 있는 플레이트 리더를 사용하여 25°C에서 4분 동안 10-30초마다 412 nm에서 흡광도를 측정합니다.
   참고: 다른 시약을 파이펫팅하기 전에 팁을 변경하고 웰에서 거품이 형성되지 않도록 하십시오. 시약의 불완전혼합은 측정에 변화를 일으킬 수 있다. 구연산염 합성 활성 분석은 시료가 수집된 직후 실온에서 수행되어야 하며, 이 분석제는 그대로 미토콘드리아 질량을 정량화하는 데 사용된다. 반응 버퍼는 사용 직전에 준비해야 하며 저장해서는 안 됩니다.
7. 광 밀도(OD) 흡광도(abs) 대 시간(분) (X축)으로 데이터를 플롯합니다. 그런 다음 반응 속도가 있는 곡선의 선형 부분에 대한 경사를 계산합니다.
   
   
   
   구연산염 합성 활성을 정규화하기 위해 시료 단백질 농도로 값을 나눈다. 구연산염 합성 활성은
   
   
   
   참고: 샘플 단백질 농도는 단백질 농도 분석 키트에 의해 측정될 수 있다.

도 1은 상이한 유전자형의 Drosophila 흉부 조직 균질화를 측정하기 위해 구연산염 합성 활성 색인식 분석법을 사용하여 얻은 시간이 지남에 따라 412 nm에서 의 OD 흡광도에 대한 운동 곡선의 예를 제시한다. PGC-1α는 미토콘드리아 생물발생의 마스터 레귤레이터라는 것은 잘 알려져 있습니다. PGC-1α는 초파리와 인간 사이에서 기능적으로 보존된다. 초파리 RNF34(dRNF34)는 초파리 PGC-1α, dPGC-1에 대한 E3 유비퀴틴 리가제이며, dPGC-1 단백질분해를 촉진한다 17. 전송 전자 현미경 및 미토콘드리아 DNA qPCR은 dPGC-117의녹다운에 의해 억압되는 미토콘드리아 함량을 증가시키는 초파리 근육에서 dRNF34의 녹다운을 보여주었다. 이러한 결과에 따라 우리는 drosophila 근육에 dRNF34의 녹다운 미토콘드리아 구연산염 합성 활동을 증가 시킬 것 이라고 가설, dPGC-1의 녹다운에 의해 반전 해야 하는. 실제로, 여기에 설명된 구연산염 합성 활성의 색색 분석법을 사용하여, 우리는 drosophila 근육에서 dRNF34의 녹다운이 dPGC-1의 녹다운에 의해 반전된 미토콘드리아 구연산염 합성 활성을 증가시키는 것을 발견했습니다. 구체적으로 여기에 기술된 방법을 사용하여, 각 분석법에 대해 초기 선형 효소 레이트(d.s)가 확립되었다(도1). 수식과 결정 계수가 있는 추세선(R2)은 그래프(그림1)에나타내었습니다. 추세선의 경사는 다른 유전자형의 최대 구연산염 합성 활동과 동등한 최대 반응 속도를 나타냅니다. 다른 유전자형에 대한 경사는 다릅니다(그림 1). 결정 계수는 1에 가깝습니다. 추세선의 수식은 더 신뢰할 수 있습니다. 상이한 유전자형의 단백질 농도 정규화 최대 구연산염 합성 활동은 도 1 데이터로부터 계산하였다(도2). 근육 특이적 dRNF34 녹다운을 가진 플라이 토락의 최대 구연산염 합성 활성이 증가하였고, 이는 근육 특이적 dPGC-1 녹다운에 의해 반전되었다(그림2).

도 1: 구연산염 합성 활성의 비색 분석에 대한 운동 곡선의 예. (a)24B-Gal4>+(b)24B-Gal4>dRNF34RNAi(II) 및(c)24B-Gal4>dRNF34RNAi(II), dPGC-1RNAi의 대흉균균을 시테라테스의 유색 분석기를 실시하였다. 수평 축은 반응 시간을 나타내고 수직 축은 412nm의 OD 흡수를 나타냅니다. 각 유전자형에 대해 선형 효소 비율이 확립되었습니다. 추세선이 그려지고 추세선의 수식과R2가 그래프에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 운동 곡선으로부터 계산되고 단백질 농도에 의해 정규화된 최대 구연산염 합성 활동. 근육 특이적 dRNF34 녹다운을 가진 플라이 토락스의 최대 구연산염 합성 활동은 증가하였고, 이는 근육 특이적 dPGC-1 녹다운에 의해 반전되었다. 모든 데이터는 ANOVA 테스트에 의해 ± SEM (*p < 0.01, 및 복제당 n = 3, 10 thoraxes)에 대한 Tukey의 테스트로 표시됩니다. 이 그림은 웨이 외17에서수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.