우리는 Drosophila 조직 균질제에서 온전한 미토콘드리아 질량의 정량화를 위한 구연산염 합성 활성의 색색 분석법을 제시한다.
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방법 논문
초파리 멜라노가스터의 구연산 신타제 활동의 대색 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아는 산화 인산화를 통해 ATP를 생산하고 다양한 생리적 과정을 조절함으로써 세포 대사에서 가장 중요한 역할을 합니다. 미토 콘 드리 아 기능 장애는 다양 한 신진 대사 및 신경 퇴행 성 질환의 주요 원인. 그대로 미토콘드리아는 적절한 기능에 매우 중요합니다. 효소 구연산염 신타제는 미토콘드리아 매트릭스에 국한되어 그대로 미토콘드리아 질량의 정량효소 마커로서 사용될 수 있다. 미토콘드리아에서 중요한 기능을 가진 많은 분자와 통로가 인간과 Drosophila사이에서 높게 보존된다는 것을 감안할 때, 강력한 유전 도구의 배열은 Drosophila에서유효하다는 것을, Drosophila는 미토콘드리아 기능을 공부하기 위한 좋은 모형 시스템 역할을 합니다. 여기서, 우리는 미토콘드리아를 분리하지 않고 성인 파리에서 조직 균질화에서 구연산염 합성 활성의 빠르고 간단한 측정을 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 유충, 배양 된 세포 및 포유류 조직에서 구연산염 합성 활성을 측정하는 데 적합합니다.
서론
미토콘드리아는 대부분의 진핵 생물에서 전력 생산 세포기관으로 가장 잘 알려져 있으며, 이는 에너지 통화인 ATP를 삼차갈래산 주기(즉, 크렙스 주기) 및 산화 인산화를 통해 생산합니다. 미토콘드리아는 또한 세포사멸1,Ca2+ 항상성2,3,반응성 산화 종(ROS)4세대및 내포성 망상(ER)-스트레스반응의조절과 같은 많은 다른 생리적 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 미토콘드리아 기능 장애는 모든 연령대의 신체에 영향을 미칠 수 있으며 대사, 노화 관련6및 퇴행성 신경 질환의 주요 원인입니다7. 본래 미토콘드리아는 미토콘드리아 기능과 기계적으로 관련이 있습니다. 따라서, 미토콘드리아 질량의 적절한 정량화는 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 매우 중요하다8. 구연산 신타제는 트리카르복실산 주기9의제1단계에서 속도 제한 효소로서, 진핵 세포 내의 미토콘드리아 매트릭스에 국한되어 있으며, 따라서 그대로 미토콘드리아 질량9,10의존재에 대한 정량적 마커로서 사용될 수 있다. 구연산염 합성 활성은 또한 온전한 미토콘드리아 단백질11,12에대한 정상화 인자로 사용될 수 있다.
열매 파리, Drosophila melanogaster는미토콘드리아에서 중추적 인 역할을하는 많은 분자 및 경로가 진화적으로 인간13,14,15로보존되기 때문에 미토콘드리아 기능을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 여기서, 우리는 96웰 플레이트 포맷에서16개의 동질성 혈색 분석법에 의한 구연산염 합성 활성의 측정을 위한 빠르고 간단한 방법을 제시한다. 구연산염 합성 활성 분석에서, 구연산염 합성효소는 초파리 조직에서 동질화 촉매 작용을 아세틸 코엔자임 A(아세틸 CoA)와 함께 옥살로아세테이트의 반응을 형성하여 구연산염 CoA-SH 및H+를형성한다. CoA-SH는 이어서 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)(DTNB)와 반응하여 412 nm에서 분광광도 측정을 쉽게 측정할 수 있는 2-니트로-5-티오벤조에이트(TNB)의 유색 생성제품을 생성합니다. 구연산염 합성 활성은 색상 생산의 속도에 의해 반영될 수 있다.
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프로토콜
1. D. 멜라노가스터에대한 대색 구연산 신타제 활동 분석16
- 각 샘플에 대해 10 개의 성인 파리를 수집합니다. 각 유전자형에 대해 적어도 세 배의 샘플을 수집합니다.
- 각 시료에 대해 1.5 mL 시험관에서 20 mM HEPES (pH = 7.2), 1 mM EDTA 및 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 얼음 차가운 추출 완충액 500 μL을 준비합니다.
- 성인이 마취 패드에CO2로 파리를 마취하고 원하는 조직을 분리. 예를 들어, 성인 플라이 흉부들을 분리하기 위해 한 쌍의 포셉으로 플라이 흉부를 고정한 다음 가위를 사용하여 흉부와 복부의 경계를 따라 절단하여 플라이 복부를 분리합니다. 근육 구연산염 합성 활성 분석에 대한 플라이 토락을 수집합니다.
참고 : 구연산염 합성 활동을 정상화하는 데 사용하는 경우이 단계에서 조직의 신선한 무게를 결정하십시오. - 10 명의 성인 플라이 토락을 얼음 차가운 추출 완충액 100 μL로 즉시 옮기고 얼음에 유봉으로 균질화하십시오. 샘플을 얼음 차가운 상태로 유지하려면 얼음에 5-10 초 동안 샘플을 균질화 한 다음 샘플을 5 s용 얼음에 앉게하고 튜브의 모든 조직이 완전히 균질화 될 때까지 반복하십시오.
참고 : 튜브테이프, 균질화에 혈전이 없는지, 튜브의 조직이 완전히 균질화되었는지 확인하십시오. 모든 샘플 처리는 얼음에서 수행해야합니다. - 단백질 함량 측정을 위해 새로운 튜브에서 각 균질화된 샘플의 10 μL을 섭취하십시오. 얼음에 단백질 측정을 위해 샘플을 보관하십시오.
참고: 단백질 샘플을 동결하여 나중에 분석을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 단백질 농도 구연산 염 합성 활동의 정상화에 대 한 내부 매개 변수 역할을. - 남은 각 시료에 400 μL의 얼음-차가운 추출 버퍼를 추가하여 총 부피를 500 μL로 만듭니다. 각 반응에 대해, 1 μL의 희석 된 세포 용해액을 150 μL의 신선하게 제조 된 반응 용액 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM DTNB, 0.3 mM 아세틸 CoA, 1 mMoxaloacetic 산)을 추가합니다. 거품 형성을 피하면서 부드럽게 파이펫팅하여 철저하고 즉시 섞으세요. 최소 10초 간격으로 412 nm에서 흡광도를 측정할 수 있는 플레이트 리더를 사용하여 25°C에서 4분 동안 10-30초마다 412 nm에서 흡광도를 측정합니다.
참고: 다른 시약을 파이펫팅하기 전에 팁을 변경하고 웰에서 거품이 형성되지 않도록 하십시오. 시약의 불완전혼합은 측정에 변화를 일으킬 수 있다. 구연산염 합성 활성 분석은 시료가 수집된 직후 실온에서 수행되어야 하며, 이 분석제는 그대로 미토콘드리아 질량을 정량화하는 데 사용된다. 반응 버퍼는 사용 직전에 준비해야 하며 저장해서는 안 됩니다. - 광 밀도(OD) 흡광도(abs) 대 시간(분) (X축)으로 데이터를 플롯합니다. 그런 다음 반응 속도가 있는 곡선의 선형 부분에 대한 경사를 계산합니다.
구연산염 합성 활성을 정규화하기 위해 시료 단백질 농도로 값을 나눈다. 구연산염 합성 활성은
참고: 샘플 단백질 농도는 단백질 농도 분석 키트에 의해 측정될 수 있다.
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결과
도 1은 상이한 유전자형의 Drosophila 흉부 조직 균질화를 측정하기 위해 구연산염 합성 활성 색인식 분석법을 사용하여 얻은 시간이 지남에 따라 412 nm에서 의 OD 흡광도에 대한 운동 곡선의 예를 제시한다. PGC-1α는 미토콘드리아 생물발생의 마스터 레귤레이터라는 것은 잘 알려져 있습니다. PGC-1α는 초파리와 인간 사이에서 기능적으로 보존된다. 초파리 RNF34(dRNF34)는 초파리 PGC-1α, dPGC-1에 대한 E3 유비퀴틴 리가제이며, dPGC-1 단백질분해를 촉진한다 17. 전송 전자 현미경 및 미토콘드리아 DNA qPCR은 dPGC-117의녹다운에 의해 억압되는 미토콘드리아 함량을 증가시키는 초파리 근육에서 dRNF34의 녹다...
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토론
Drosophila를 모델로 사용하는 신진 대사 연구는 파리의 유전적 배경, 식단 및 재고 유지 를 고려해야합니다18. 구연산염 합성 활동의 측정에 다른 유전 적 배경의 영향을 피하기 위해, 초파리의 다른 변종은 10 세대에 대한 제어 균주에 역교차되어야한다. 우리의 실험에 사용된 모든 Drosophila 긴장의 유전 배경은 w1118입니다,그래서 우리는 대조군으로 w1118를 이용했습니다. 일반적으로, 우리는 w1118이 대부분의 Drosophila 긴장에 대한 유전 적 배경이며 캔톤-S보다 백크로스가 훨씬 쉽기 때문에 좋은 통제라고 생각합니다. 식이 요법과 재고 유지 보수는 모든 실험 그룹에 대해 정확히 동일해야합니다. 우리의 실험에서, 파리는 일반적으로 25 °C와 50-60 % 상대 습도에서 유지됩니다. 샘...
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31401013 및 31471010), 상하이 시 과학 기술위원회, 상하이 푸장 프로그램 (14PJ1405900), 그리고 자연 과학 재단의 보조금에 의해 지원되었다 상하이 (19ZR1446400).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산(HEPES) | 시그마-알드리치 | V900477 | |
| -아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올(트리즈마 베이스) | 시그마-알드리치 | V900483 | |
| 아세틸-CoA | 시그마-알드리치 | A2181 | |
| 디티오-비스-니트로벤조산(DTNB) | 시그마-알드리치 | D8130 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | 시그마-알드리치 | V900106 | |
| 옥살로아세테이 | 트 시그마-알드리치 | O4126 | |
| 펠렛 유봉 | 상곤 | F619072 | |
| 펠렛 유봉 모터 | Tiangen | OSE-Y10 | |
| 플레이트 리더 | BioTek | Eon | |
| 단백질 BCA 분석 키트 | Beyotime | P0010S | |
| 가위 | WPI | 14124 | |
| 트리톤 X-100 | 상곤 | A110694-0100 |
참고문헌
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