Summary
Questo protocollo descrive la generazione di sferoidi derivati dal paziente e l'analisi a valle, tra cui la quantificazione della proliferazione, il test di citotossicità, la citometria di flusso, la colorazione dell'immunofluorescenza e l'imaging confocale, al fine di valutare il farmaco potenziale dei candidati come terapie anti-neoplastiche. Questo protocollo supporta la medicina di precisione con l'identificazione di farmaci specifici per ogni paziente e lo stadio della malattia.
Abstract
In questo protocollo, illustreremo la procedura per la generazione di sferoidi tumorali all'interno di goccioline appese 384-well per consentire lo screening ad alto rendimento delle terapie anti-cancro in un microambiente fisiologicamente rappresentativo. Illustreremo la formazione di sferoidi di cellule staminali tumorali derivati dal paziente, nonché la manipolazione di questi sferoidi per un'analisi approfondita dopo il trattamento farmacologico. In particolare, descriviamo la raccolta di morfologia sferoide, proliferazione, vitalità, tossicità dei farmaci, fenotipo cellulare e dati di localizzazione cellulare. Questo protocollo si concentra fortemente sulle tecniche di analisi che sono facilmente implementabili utilizzando la piattaforma di sospensione a 384 gradi, rendendola ideale per lo screening farmacologico ad alta produttività. Mentre sottolineiamo l'importanza di questo modello negli studi sul cancro ovarico e nella ricerca sulle cellule staminali del cancro, la piattaforma a 384 pozzet è suscettibile alla ricerca di altri tipi di cancro e modelli di malattia, estendendo l'utilità della piattaforma a molti campi. Migliorando la velocità dello screening farmacologico personalizzato e la qualità dei risultati dello screening attraverso colture 3D fisiologicamente rappresentative, questa piattaforma è prevista per aiutare nello sviluppo di nuove terapie e specifiche per il paziente strategie di trattamento, e quindi hanno un impatto clinico di ampia portata.
Introduction
La mortalità legata al cancro in tutto il mondo haraggiunto un numero di 9,8 milioni di decessi nel 2018 1, evidenziando la necessità di migliorare lo sviluppo di migliori terapie. Purtroppo, il costo dello sviluppo di farmaci per il cancro è in aumento, con lo sviluppo di un singolo farmaco che costa circa 650 milioni di dollari2 che indica la necessità di migliori strategie per sviluppare nuovi farmaci anti-cancro. Le cellule staminali tumorali (CSC), caratterizzate da una maggiore chemiostiera3, la capacità di auto-rinnovarsi, e la capacità di semina nuovi tumori4 sono pensati per essere responsabili della ricorrenza tumorale4, metastasi5, e chemoresistance4,6, che contribuiscono tutti alla capacità maligna del tumore e quindi all'alto numero di morti. Nel cancro ovarico, queste cellule si trovano arricchite nel liquido maligno ascite nella cavità peritoneale, una condizione associata a scarsi esiti clinici1. Come risultato delle capacità maligne dei CSC, c'è stata una spinta a sviluppare nuovi farmaci mirati CSC da utilizzare in combinazione con le chemioterapie tradizionali. Ci sono diverse sfide che accompagnano lo sviluppo di farmaci mirati CSC tra cui: 1) difficoltà nell'espansione e nel mantenimento dei CSC in vitro; 2) scarsità di campioni di pazienti; 3) rilevanza fisiologica della piattaforma culturale; e 4) l'eterogeneità nella sensibilità farmacologica tra i pazienti. Questo protocollo descrive l'implementazione di una piattaforma di coltura 3D ad alta velocità effettiva in grado di superare ognuna di queste sfide. In particolare, questo sistema consente uno screening rapido dei farmaci utilizzando un piccolo numero di CSC ovariche derivati dal paziente ed è altamente suscettibile alle tecniche di analisi a valle. Ideali per studiare il cancro ovarico e i CSC, la nostra piattaforma è anche utile nello studio di altri tumori e tipi di cellule differenziate in ambienti 3D complessi.
Modelli tridimensionali complessi (3D) sono fondamentali nello studio del microambiente tumorale (TME), che è una nicchia 3D composta da cellule tumorali, cellule non cancerose e proteine della matrice extracellulare (ECM)4. Questo ambiente 3D si traduce in morfologia cellulare unica, interazioni cell-cell e cell-matrix, differenziazione cellulare, migrazione cellulare, densità cellulare e gradienti di diffusione rispetto alla tradizionale coltura cellulare 2D in vitro4. Tutti questi fattori culminano nella risposta differenziale dei farmaci all'interno delle culture 3D, mostrando una maggiore resistenza ai farmaci e rilevanza fisiologica7,8. A causa del ruolo del TME 3D nella differenziazione e chemioresistance CSC, è fondamentale vagliare farmaci mirati a CSC in microambienti fisiologici. Migliorare la rilevanza fisiologica delle piattaforme di screening farmacologico CSC ha il potenziale per migliorare lo screening farmacologico specifico del paziente, lo sviluppo di farmaci, la formulazione di strategie di trattamento e, in ultima analisi, gli esiti clinici. È altrettanto importante che la piattaforma utilizzata per lo screening farmacologico sia ad alta produttività e compatibile con metodi di analisi a valle per ridurre al minimo i costi, il tempo e il tempo di traduzione clinica dei farmaci promettenti9.
Attualmente, il complesso TME è meglio mantenuto per applicazioni di screening farmacologico attraverso modelli in vivo come modelli di tumore sinogene murinici, xenografi derivati da linee cellulari e modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente12, in quanto forniscono modelli fisiologici Condizioni. Tuttavia, la natura a bassa velocità effettiva di questi modelli, nonché i set di competenze tecniche, tempo e costo che richiedono limitano la loro utilità in applicazioni di screening dei farmaci rapido e ad alta velocità effettiva13. Come alternative a questi modelli in vivo, molti modelli 3D in vitro che utilizzano idrogel8, coltura all'interno di dispositivi microfluidici o dispositivi 'organ-on-a-chip'10,14e culture non aderenti3,8 sono stati sviluppati, a causa della loro bassa barriera all'ingresso in termini di costi, tempo e competenze richieste.
Le piattaforme di coltura idrogel sono vantaggiose nel controllo fine offerto sulla composizione della matrice, le proprietà meccaniche e la struttura della matrice15; tuttavia, possono inibire la coltura cellulare ad alta densità14. Inoltre, la raccolta di cellule da idrogelpuò può complicare l'analisi a valle, a causa di effetti potenzialmente dannosi dei metodi di raccolta15. I dispositivi microfluidici, d'altra parte, sono dispositivi su microscala che consentono il rilevamento dell'uscita all'interno dello stesso dispositivo e per la coltura cellulare su scale fisiologicamente rilevanti con un consumo minimo di reagenti, tempi di reazione ridotti, sprechi ridotti al minimo e rapida diffusione14. Queste caratteristiche li rendono piattaforme promettenti per studiare la tossicità dei farmaci, l'efficacia e la farmacocinetica. Tuttavia, le sfide di una coltura di cellule 3D efficiente, quantificabile, riproducibile e user-friendly, nonché sistemi di pompaggio ingombranti e costosi, hanno limitato le applicazioni microfluidiche nella ricerca ad alto rendimento10. Le configurazioni di rilevamento efficienti e l'implementazione potenzialmente difficile in tutti i campi hanno anche ostacolato l'adozione diffusa di sistemi microfluidici10.
Al contrario, gli sferoidi generati in condizioni non aderenti nei miscelatori rotanti (nutatori), nelle piastre di fissaggio ultra-basse e nelle goccioline appese non includono componenti di matrice definiti dall'utente. Queste metodologie sono particolarmente rilevanti per studiare il cancro ovarico in quanto le condizioni non aderenti sono rappresentative delle condizioni in cui gli sferoidi crescono all'interno della cavità peritoneale5. All'interno di questi metodi di coltura non aderenti, i nutatoor e gli sferoidi a goccia appesa hanno dimostrato di presentare una maggiore compattazione, rimodellamento e chemioresistance rispetto agli sferoidi generati nelle piastre di attaccamento ultra-basso, suggerendo un aumento fisiologico pertinenza16,17,18,19. A causa della maggiore capacità per lo screening ad alto rendimento da pozzi di dimensioni più piccole e di un numero minimo di celle richiesto, la generazione di sferoidi in piastre appese è una piattaforma ideale per lo screening farmacologico. Qui, vi presentiamo una piattaforma fisiologica 3D regolabile in piastre di goccia appese a 384-pozzo, che è facile da implementare e altamente suscettibile di analisi a valle, che lo rende ideale per lo screening farmacologico ad alta produttività del cancro ovarico e CSC ovarici.
La nostra piattaforma fisiologica 3D offre tutti i vantaggi della coltura 3D, compresi i contatti fisiologici delle cellule cellulari, i gradienti di diffusione, le densità cellulari e le proteine ECM prodotte naturalmente, che possono contribuire a risposte realistiche dei farmaci16, 17,18,19. Inoltre, generando questi sferoidi con CSC derivati dal paziente, siamo in grado di determinare le risposte specifiche del paziente ai farmaci1 con molti repliche tecniche contemporaneamente, per superare l'eterogeneità che può essere trovata all'interno del tumore del paziente campioni20. Inoltre, la cultura 3D ha dimostrato di migliorare la manutenzione delle popolazioni di CSC3,16 e quindi è rappresentativa delle popolazioni arricchite di CSC negli asciti7. Questo combinato con una facile analisi a valle, compresa l'analisi della citometria di flusso della vitalità e delle proporzioni CSC, consente una valutazione ottimale dell'efficacia dei farmaci mirati dal CSC. Infine, questa piattaforma fisiologica è compatibile con l'imaging in più momenti durante l'esperimento, la valutazione della morte e della proliferazione cellulare, l'organizzazione cellulare e la morfologia con immunohistochimica, segnalazione solubile con ELISA su condizionato medio, fenotipi cellulari con citometria di flusso, ed espressione genica dopo PCR.
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Protocol
Tutti i campioni di pazienti vengono raccolti nell'ambito di un protocollo IRB approvato da pazienti consenzienti, i cui campioni vengono de-identificati dopo la debulking del tumore e la raccolta degli asciti.
1. Generazione di Sferoidi da piccoli numeri cellulari in 384-bene appeso piastre goccia
- Mettere la piastra di goccia appesa in un sonicatore riempito con sterile deionizzato (DI) acqua e sonicare per 20 min.
- Con una mano guantata, rimuovere la piastra dal sonicatore e lavarla con acqua DI corrente.
- Lasciare che la piastra si sieda in un bagno di 0,1% acido pluronico per 24 h per prevenire l'assorbimento delle proteine e l'aderenza sferoide ai pozzi.
- Rimuovere i piatti con una mano guantata e risciacquare entrambi i lati della piastra con acqua DI corrente accuratamente.
- Toccare o scuotere vigorosamente la piastra all'interno di un armadio di biosicurezza per rimuovere l'acqua dai pozze in un ambiente sterile.
- Posizionare la piastra sotto la luce UV per 30-60 min su ciascun lato per sterilizzare le piastre e ridurre al minimo la contaminazione.
NOT: La piastra può anche essere esposta al gas di ossido di etilene in una camera per la sterilizzazione. - Riempire ogni pozzetto di una piastra di 6 pozze con 4-5 mL di sterile acqua DI autoclaved e sandwich la piastra di goccia appesa tra il coperchio e il fondo della piastra 6-bene. Aggiungere 800-1.000 gradi di acqua DIDATTICa sterile intorno al bordo della piastra di goccia appesa per fornire un ambiente umido, stabile e sterile per ridurre al minimo il volume perso per evaporazione (Figura 1 A-C).
- Per le cellule coltivate in 2D, il mezzo aspirato che copre le cellule nella loro fase di log della crescita e lava con 1x fosfato tampinato salina (PBS) per rimuovere le tracce di siero bovino fetale (FBS) nel mezzo di crescita, in quanto ostacola l'azione della trypsin.
- Aspirati il PBS e aggiungete 1,5-2 mL di 0,25% di trypsin-EDTA al piatto di coltura dei tessuti da 100 mm. Incubano cellule per 5 min in un'incubatrice impostata a 37 .
NOT: Le cellule possono staccarsi a velocità diverse, quindi le piastre devono essere controllate su un microscopio luminoso della panca per garantire il distacco delle celle dopo 5 min. - Aggiungere 6-8 mL di mezzo cellulare contenente FBS o qualsiasi siero al piatto per neutralizzare la trypsin, raccogliere le cellule con un pipet sierologico da 10 mL e depositarle in un tubo conico da 15 mL.
- Contare le celle caricando 10 litri di sospensione cellulare su ciascun lato di un emocitometro e seguire il protocollo di conteggio associato.
- Per le cellule derivate dal paziente raccolte da tumori solidi primari o metastatici o da asciti che non sono stati coltivati 2D, preparare le sospensioni a singola cellula nel mezzo privo di siero (SFM) descritto in precedenza3.
- Elaborare i tessuti tumorali come descritto in precedenza e conservare le sospensioni a singola cellula per un uso successivo nel mezzo di congelamento appropriato21,22.
- Per il tessuto tumorale solido, macinare meccanicamente con una lama di rasoio e filtrare la soluzione risultante attraverso un filtro di 40 m prima di isolare le cellule desiderate da un gradiente di densità21,22.
- Per campioni di asciti, cellule concentrate per centrifugazione, lisci globuli rossi nel tampone di ammonio-cloruro-potassio (ACK), lavare in 1x PBS, e quindi passare attraverso un filtro da 40 m e un ago da 28 G 4 volte22.
- Per l'isolamento dei CSC ovarici, ordinare le celle con citometria di flusso come descritto di seguito in dettaglio.
- Le singole celle appena isolate vengono congelate per essere immagazzinate e scongelate quando necessario per la sperimentazione.
- Per preparare la sospensione cellulare per la placcatura, calcolare il volume desiderato della soluzione cellulare necessaria per la placcatura: 20 l per goccia X numero totale di goccia - volume totale della soluzione necessaria.
- Diluire la concentrazione cellulare alla concentrazione cellulare desiderata per 20 -L (cioè 100 cellule in un calo di 20 l).
- Mescolare delicatamente la sospensione cellulare utilizzando un tuboprima prima della placcatura per garantire una distribuzione omogenea delle cellule e migliorare l'uniformità tra le goccioline.
NOT: L'esordiazione della sospensione cellulare può portare alla morte delle cellule e detriti negli sferoidi a goccia appesa. - Collocare la punta della pipetta nel pozzo con un angolo di circa 45 gradi e il tubo di 20 l della soluzione cellulare in ogni goccia appesa.
NOT: I modelli di placcatura possono essere regolati in base al numero di sferoidi necessari. Placcare sferoidi in ogni altro pozzo è più sicuro quando non sono necessarie grandi quantità di sferoidi in un esperimento, perché impedisce la fusione accidentale delle goccioline (Figura 1D, E). Se per un esperimento sono necessarie grandi quantità di sferoidi, piastrare ogni pozzo lasciando una fila di pozzi di confine su tutti i lati (Figura 1F). - Posizionare il coperchio della piastra a 6 pozzetti sulla parte superiore della piastra di caduta appesa e utilizzare una striscia termoplastica elastica che è insensibile alla perdita di umidità, per sigillare i bordi e prevenire l'evaporazione aggiuntiva delle goccioline. Incubare in un'incubatrice umidificata standard di CO2 (5% CO2, 37 gradi centigradi).
- Alimentare le gocce appese una volta ogni 2-3 giorni per ricostituire il mezzo di coltura cellulare per le sostanze nutritive necessarie aggiungendo 2-3 - L ad ogni sferoide contenente bene.
NOT: Dopo l'imaging, si consiglia sempre di alimentare le gocce appese, poiché l'esposizione all'aria durante l'imaging porta all'evaporazione.
2. Aggiunta di coltura cellulare Media per appendere goccia Sferoide Piastre
- Rimuovere la striscia termoplastica e il coperchio all'interno di un armadio di biosicurezza e aggiungere 2–3 - L del mezzo di coltura appropriato ad ogni pozzo contenente una goccia appesa.
NOT: Il volume aggiunto dipenderà dalla dimensione della caduta e dalla quantità di tempo che interviene tra le poppate. - Dopo l'alimentazione, coprire la piastra con il coperchio superiore e applicare la striscia termoplastica fresca ai bordi esterni prima di rimettere la piastra nell'incubatrice.
3. Phase Contrast Imaging della morfologia degli sferoidi
- Rimuovere la striscia termoplastica intorno ai bordi della piastra in un armadietto di biosicurezza.
- Rimuovere con attenzione la piastra di 384-well hanging drop spheroids dall'armadio di biosicurezza con il coperchio ancora in posizione e metterlo nel vassoio del microscopio ad un microscopio epifluorescente.
- Utilizzare l'opzione di imaging dal vivo nel software di imaging a 4x, 10x o 20x per osservare gli sferoidi a goccia appesa e scattare le immagini desiderate.
- Dopo aver salvato le immagini, riportare la piastra nell'armadio di biosicurezza e le celle di alimentazione come descritto sopra.
- Piastra di risuggillatura con una striscia termoplastica fresca e riporre la piastra sigillata nell'incubatrice.
4. Quantificazione della proliferazione e della vitalità all'interno degli Spheroid
- Sferoidi di piastra in un numero sufficiente di pozzi per ottenere >10 repliche tecniche per ogni punto di tempo (cioè, giorno 1 e giorno 7) che deve essere esaminato.
NOT: I pozzi che vengono utilizzati per questo saggio non sono generalmente utilizzati di nuovo a causa di potenziali contaminanti dal tintura resazurina. - Aggiungere ai pozzi destinati all'analisi della proliferazione 2 L L di una soluzione filtrata a base di resazurina come se si nutrisse di quei pozzi e si incubasse per un periodo di incubazione predeterminato.
NOT: Questo tempo di incubazione può variare in base al tipo di cellula e al numero di cellule nello sferoide. Si consiglia di determinare il tempo di incubazione richiesto necessario prima di iniziare gli esperimenti di proliferazione iniziando le misurazioni dopo 1 ora di incubazione e poi ri-misurando ogni 30 min fino a quando il segnale letture in plateau pozzi di controllo. Le letture dei saggi possono essere prese tutte le volte che si desidera. L'incubazione è tipicamente 4 h per gli sferoidi iniziati con 100 cellule tumorali. - Accendere il lettore di microplacie seguito per la prima volta dal software lettore di piastre associato almeno 15 minuti prima della prima lettura per consentire alla macchina di riscaldarsi e fissare la temperatura interna a 22 gradi centigradi in quanto la temperatura può influire sulle letture.
- Aprire un protocollo di lastra di 384 pozze con eccitazione 530/25 nm e lunghezze d'onda di emissione di 590/35 nm con Ottica impostata su Bottom, Guadagno impostato su 35, Velocità di lettura impostata su Normalee tipo di lettura impostato su Fluorescence .
- Dopo il periodo di incubazione, aprire il panino a goccia in un armadio di biosicurezza e portare la piastra 384-pozza con il coperchio ancora in posizione per il lettore di piastra.
- Posizionare la piastra 384-well con il coperchio ancora in posizione nel vassoio lettore piastra, che verrà esteso una volta che la macchina è riscaldata e fare clic su Ok per leggere la piastra.
- Riportare la piastra del pozzo alla base 6-well e posizionarla nell'incubatrice. Se tutti i punti temporali sono stati letti per il giorno, sigillare la piastra prima di rimetterla nell'incubatrice.
- Salvare l'esperimento nella finestra popup e quindi fare clic su Sì quando viene richiesto Eseguire PowerExports per la piastra 1 per emettere i dati dal software del lettore di lastre in un foglio di calcolo per l'organizzazione.
- Valori medi di fluorescenza per ogni condizione e normalizzare dalla media della condizione di controllo per segnalare un cambiamento di piega nella proliferazione in varie condizioni sperimentali.
- Quando si confronta il giorno 1 al giorno 7, normalizzare dividendo per giorno 1 fluorescenza media per ottenere un cambiamento di piega nella proliferazione nel tempo.
- Calcolare le barre di errore utilizzando l'errore standard della media e determinare la significatività statistica tra i gruppi sperimentali con un test statistico appropriato, come il test T a due code dello studente.
5. Valutazione della tossicità dei farmaci negli spheroid
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Somministrazione di farmaci
- In qualsiasi momento dopo la formazione di sferoidi, consegnare il farmaco diluito alla concentrazione desiderata in modo che una dose di 2 oL contenga 10 volte la concentrazione finale di droga desiderata.
NOT: Si tratta di un'evaporazione di 2 o più l dalla goccia in modo che il volume finale del trattamento post farmacologico sia di 20 anni. Ad esempio, una dose di cisplatina di 50 M avrà una soluzione preparata di 500 M. Se le goccioline contengono più di 20 , la concentrazione di droga e/o il volume aggiunto deve essere regolata di conseguenza. - Trattare i campioni di controllo con 2 l'l di mezzo di coltura cellulare.
NOT: La cisplatina è soluluttizzata in acqua. Di conseguenza, i controlli sono 2 L di coltura cellulare medio; tuttavia, se il veicolo della droga è un solvente diverso (ad esempio, DMSO), i controlli dovrebbero essere un mezzo di coltura cellulare con una concentrazione uguale di DMSO utilizzata nel trattamento farmacologico. - Continuare a monitorare il farmaco trattato e gli sferoidi di controllo durante tutto il periodo di incubazione del farmaco con microscopia di fase per avere una registrazione visiva dell'effetto della tossicità dei farmaci e con la tonalità di resazurina come descritto sopra per monitorare la vitalità cellulare.
NOT: Tipicamente, i farmaci vengono aggiunti dopo 5-7 giorni nelle gocce appese e tossicità misurata dopo 48-72 hs, ma questo può essere variato a seconda dell'esperimento. I farmaci possono essere aggiunti non appena si formano sferoidi stabili, di solito tra 1-4 giorni.
- In qualsiasi momento dopo la formazione di sferoidi, consegnare il farmaco diluito alla concentrazione desiderata in modo che una dose di 2 oL contenga 10 volte la concentrazione finale di droga desiderata.
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Quantificazione della tossicità dei farmaci per conteggio cellulare
- Al momento finale del trattamento farmacologico, raccogliere 10 sferoidi ciascuno da pozzi di controllo e trattati con farmaci utilizzando un pipet da 1.000 l e depositare ogni serie di sferoidi nel proprio tubo di microcentrifuga.
- Scomporre gli sferoidi in singole cellule ripetendo il pipettaggio.
NOT: Per ridurre i potenziali danni alle cellule dovuti a ripetuti pipettature, la digestione enzimatica con un enzima come la trypsin può essere eseguita per facilitare la generazione di soluzioni a cella singola prima della pipettatura23. La minimizzazione della morte cellulare dovuta alla pipettatura dipende dal tipo di cellula e dovrebbe essere ottimizzata di conseguenza. Se si è preoccupati per la morte dovuta alla disaggregazione, fare riferimento all'analisi con la tonalità di retozurina e al saggio di citotossicità per metodi alternativi che non richiedono la disaggregazione degli sferoidi. - Centrifugare i tubi per 5 min a 400 x g per raccogliere le cellule sul fondo dei tubi di microcentrifuga e aspirare il supernatante.
- Aggiungere 20 - L di supporti freschi o 1x PBS ad ogni tubo e mescolare bene.
- Aggiungere il blu Trypan a un rapporto di 2 L L di macchia blu Trypan a 20 -L di sospensione cellulare.
- Caricare 10 l di cellule e sospensioni blu Trypan in ogni camera dell'emocitometro e contare le cellule al microscopio luminoso, con cellule colorate blu che rappresentano cellule morte e cellule non colorate che rappresentano cellule vive.
- La cella attiva % : (Numero di celle vive - numero totale di celle) x 100.
6. Caratterizzazione dello Spheroid con tecniche istologiche
NOT: Ci sono due opzioni di stampo 3D stampata in un polimero biocompatibile per replicare stampi matrice sferoide realizzati da Ivanov et al.24: 1) 20 ben stampo che può contenere 28 L per bene e 2) 63 ben stampo che può contenere 9 L per bene (Figura 2D).
- Sterilizzare lo stampo istologico e il suo bordo asciugandoli con il 70% di etanolo e attaccare saldamente il bordo intorno allo stampo e posare lo stampo in posizione verticale. Entrambi gli stampi si adattano a circa 3 mL di fluido (3.203 mL per la matrice di 20 sferoidi e 3.196 mL per la matrice di 63 sferoidi).
- Ricoprire leggermente l'array di sferoidi con 10.000 cSt Si olio utilizzando un tampone di cotone appuntito per facilitare la rimozione del gel di lavorazione del campione fuso nelle fasi successive.
- Riscaldare il gel di elaborazione del campione fino a quando non si liquefa tramite microonde per 10-20 s con il tappo allentato.
- Aggiungere tra 2,6 e 2,8 mL di gel di lavorazione fuso nello stampo fino a circa livellare con la parte superiore del bordo.
- In pochi minuti, una volta solidificato, rimuovere il gel di elaborazione gettato separando il bordo dallo stampo e quindi invertendo lo stampo dell'array.
- Inserire la punta della pinzetta tra lo stampo e il bordo per separarli con attenzione e quindi utilizzare un raschietto cellulare per aiutare a spostare il gettito dallo stampo se non si stacchi subito.
- Raccogliere gli sferoidi dalla piastra a goccia appesa con il botteganti il contenuto di un singolo pozzo su un piatto di Petri da 100 o 150 mm con un pipet da 1.000 luna, e isolare visivamente lo sferoide.
- Pipet 5 - L dei contenuti del pozzo tra cui lo sferoide identificato in uno dei pozzetti dell'array, fino a riempire l'array.
- Attendere 3 min per assicurarsi che gli sferoidi si siano depositati sul fondo della serie prima di pipettare delicatamente gel di elaborazione fuso in ciascuno dei pozzi facendo attenzione a non disturbare gli sferoidi.
- Aggiungere ulteriore gel di lavorazione per livellare la parte superiore della serie e, una volta raffreddato, posizionare l'array di sferoidi solidificati in una cassetta etichettata per la lavorazione.
- Sommergi la cassetta con etichetta in formalina del 4% durante la notte per fissare gli sferoidi a 4 gradi centigradi e poi conserva in 70% etanolo a 4 gradi centigradi fino a quando non è pronta per la lavorazione.
- Elaborare con standard 1 h paraffin programma e quindi incorporare gli array sferoide in modo che gli array elaborati sono rivolti in posizione verticale con la parte inferiore dei pozzi più vicino alla faccia del blocco.
- Assicurarsi che gli array siano incorporati il più piatti possibile, con la faccia inferiore a filo con il fondo del blocco e posizionare i blocchi sul ghiaccio.
- Caricare il blocco sul microtoma e regolare il blocco in modo che la lama sia parallela alla faccia del blocco caricato.
- Matrice di taglio (profondità del campione di 15 m) fino a raggiungere la parte inferiore dei pozze dell'array, assicurandosi che i pozze circolari siano visibili sui campioni tagliati.
- Passare a una profondità del campione di 5 m e continuare a tagliare e raccogliere nastri. Controllare al microscopio ogni poche fette per determinare se è stata raggiunta la profondità dello sferoide. Una volta raggiunti gli sferoidi, ogni diapositiva successiva non è più visibile.
- Macchia ogni diapositiva con protocollo H&E standard.
7. Live Dead Cytotoxicity Assay
- Ad ogni goccia appesa, aggiungere il colorante cellulare vivo, calcein-AM alla concentrazione finale di 2 M, e il colorante cellulare morto, ethidium homodimer-1 alla concentrazione finale di 4 M, tenendo presente che il volume di goccia è di 20 .
NOT: Cercate di mantenere i volumi aggiunti al minimo, e in genere aggiungere 2 l'l dei coloranti combinati. - Rimettere i piatti in incubatrice in una piastra a 6 pozze con un coperchio e incubare gli sferoidi per 45 min a 37 gradi centigradi.
NOT: A seconda delle dimensioni degli sferoidi, questo tempo di incubazione varia significativamente. Ad esempio, gli sferoidi al di sotto dei 400 m in genere richiedono solo 30-45 min di tempo di incubazione, mentre gli sferoidi più grandi più grandi più vicini agli 800 m hanno richiesto fino a 90 min di tempo di incubazione. I tempi di incubazione devono essere ottimizzati per l'esperimento di un individuo. - Per la successiva creazione di immagini, raccogliere sferoidi con un pipet da 1.000 gradi in un armadio di biosicurezza e depositare ogni sferoide su vetrini al microscopio di vetro pre-puliti.
- Sferoidi di immagine attraverso il vetro, su un microscopio confocale invertito.
NOT: A seconda della vicinanza del microscopio confocale al laboratorio in cui vengono raccolti sferoidi, gli sferoidi possono essere immagine nella goccia originale di media posta sul vetrino o racchiusi nel 2% agarose se è necessaria una maggiore stabilità per il trasporto sferoide. - Utilizzando la modalità di acquisizione multidimensionale nel software del microscopio, individuare lo sferoide utilizzando l'illuminazione DIC a ingrandimento 10x e quindi eseguire la scansione del piano z per identificare le altezze che comprendono lo sferoide.
- Fare clic sulla serie z e impostare il limite superiore e inferiore della z-scan leggermente superiore alla parte superiore dello sferoide e leggermente inferiore alla parte inferiore dello sferoide.
- Eccitare gli sferoidi a 488 nm per calcein-AM (cellule vive; verde) e 561 nm per ethidium homodimer-1 (celle morte; rosso) con la dimensione del passaggio consigliata dal software, il massimo guadagno e l'esposizione minima per ogni colore.
- Fare clic su Acquisisci per ottenere un'immagine composita z-stack di cellule vive e morte all'interno dello sferoide.
- Quantifica le proporzioni vive/morte utilizzando il software di elaborazione delle immagini per quantificare una percentuale di intensità di pixel dal canale corrispondente alle cellule vive rispetto alla percentuale di intensità di pixel dal canale corrispondente alle cellule morte dal composito immagini di proiezione z.
NOT: A causa delle limitazioni nella quantificazione di una struttura 3D con una proiezione 2D, un metodo alternativo per quantificare la fluorescenza dal vivo contro quella morta, all'interno delle piastre di goccia appese è quello di utilizzare un lettore di piastre seguendo il protocollo incluso con il calcein-AM e l'etidio kit homodimer-1.
8. Immunofluorescenza
- Riscaldare una soluzione agarose a bassa fusione 2%, in modo che la soluzione è viscosa e appena sopra punto di fusione e posto su un vetrino al microscopio per creare un letto morbido di agarose
- Raccogliete sferoidi spingendo 20 -L di PBS attraverso la goccia sul letto morbido del 2% di agarose.
NOT: Questo dovrebbe essere fatto rapidamente in modo che agarose non si solidifichi prima che gli sferoidi siano incorporati. - Una volta che l'agarose si raffredda e gel con lo sferoide raccolto intrappolato all'interno (sotto 5 min), aggiungere 4% neutro bufferato formalina per fissare gli sferoidi. In alternativa, aggiungere metanolo freddo ghiaccio e fissare gli sferoidi incorporati agarose a -20 gradi centigradi per 30 min.
- Lavare 3x per 5 min ciascuno con 1x PBS, scartando PBS dopo ogni lavaggio.
- Blocco per 1 h a RT con siero 10% (cioè siero di cavallo) e soluzione di sapone 0.15% (Triton X-100) in 1x PBS.
- Lavare 3x per 5 min ciascuno con 1x PBS, scartando PBS dopo ogni lavaggio.
- Macchie sferoidi con anticorpo fluorescente desiderato a diluizione anticorpale raccomandata o predeterminata (cioè falloidina fluorescente ad una diluizione 1:100), incubazione per almeno 90 min a temperatura ambiente, coperto di luce.
NOT: I protocolli variano a seconda dell'anticorpo e la diluizione dell'anticorpo e dell'anticorpo potrebbe dover essere ottimizzata a seconda dell'esperimento. - Visualizza sferoidi macchiati fluorescenti con il microscopio confocale invertito utilizzando i metodi descritti nella sezione precedente per l'imaging degli sferoidi.
- Le immagini composite z-stack dimostreranno la morfologia 3D negli sferoidi.
9. Raccolta e analisi delle popolazioni di cellule staminali tumorali con citometria di flusso
- Preparazione di sferoidi per l'analisi della citometria del flusso
- Raccogliere gli sferoidi da ogni pozzo nelle piastre di goccia appese utilizzando un pipet da 1.000 litri e depositarli in un tubo di centrifuga di 15 mL per la disaggregazione con tubi ripetuti.
- Contare cellule vitali su un emocitometro utilizzando Trypan Blue per determinare il numero di cellule e la concentrazione come descritto sopra.
- Sospensione cellulare aliquota in cinque tubi di microcentrismo in modo che ciascuno contenga un minimo di 50.000 cellule.
- Centrifugare tutti i tubi a 400 x g per 5 min in una microcentrifuga.
- Aspirare il supernatante da ogni tubo e risospendere i pellet in 100 gradi di tampone.
- Tubi di etichetta "Unstained", "DAPI", "APC-iso", "DEAB" e "ALDH/CD133", rispettivamente.
- Aggiungete al tubo APC-isotipo l di aPC-isotipo e al tubo CD133 di CD133 al tubo ALDH/CD133, come determinato dalla diluizione seriale e dalla raccomandazione dei produttori.
- Aggiungere al tubo DEAB/CD133 il 5 di DEAB e 0,5 ll di ALDH e 1 L di ALDH al tubo ALDH/CD133.
- Vorticare tutti i tubi per circa 2 s e incubare a 37 gradi centigradi per 45 min.
- Vorticare tutti i tubi di nuovo e centrifugare a 400 x g per 5 min in una microcentrifuga.
- Etichetta tubi FACS "Unstained", "DAPI", "APC-iso", "DEAB" e "ALDH/CD133" e riempire un contenitore di schiuma isolante da mettere da parte.
- Aspirati supernatante e resolvere il controllo "instainto" in 400 -l FACS Buffer (1x PBS con 2% FBS) e tutte le altre tube in 400 .L di FACS DAPI Buffer (FACS Buffer con 300 m 4',6-diamidino-2-phenylindole).
- Mettere i tubi nel contenitore con ghiaccio fino ad essere analizzati su un citometro di flusso.
NOT: Per ordinare le cellule staminali del cancro ovarico, raccogliere tutte le cellule che il citometro misura per essere ALDH e CD133 con cancelli impostati per includere 0.5% segnale APC non specifico e 0.15% segnale ALDH non specifico. Almeno 10.000 cellule devono essere analizzate per ottenere risultati affidabili. Ulteriori dettagli sono disponibili nelle pubblicazioni recenti3,17.
- Analisi delle popolazioni di ALDH/CD133 in FlowJo
- Fare doppio clic sull'icona FlowJo per aprire il programma e trascinare i file .fcs ottenuti dal software di citometria di flusso nell'area di lavoro.
- Fare doppio clic sul file non colorato e impostare l'asse y su Altezza di dispersione laterale (SSC-H) e l'asse x sull'altezza di dispersione in avanti (FSC-H).
- Fare clic sul pulsante T accanto a ciascun asse per regolare la scala e la trasformazione per massimizzare la separazione tra le diverse popolazioni di cellule.
- Fare clic sul pulsante di gating poligono e disegnare un cancello poligono intorno alla popolazione di celle ed etichettare la popolazione 'Celle'.
- Fare doppio clic sulla popolazione cells nel workspace per visualizzare solo le celle all'interno della popolazione 'Cells', quindi fare clic sull'asse FSC per modificare il canale dell'asse in FSC-larghezza e quindi fare clic sull'asse SSC e modificare il canale dell'asse per il FSC-H.
- Scegliere lo strumento Cancello rettangolo e disegnare un rettangolo intorno alla popolazione più densa di celle a sinistra che si estende per l'intero asse y per escludere potenziali doppietti verso destra della finestra ed etichettare questo cancello 'Celle singole'.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse e copiare il cancello Celle e il gate Celle singole annidate e incollarli sotto ogni esempio nell'area di lavoro.
- Fare doppio clic sul gate Celle singole nidificato sotto il campione DAPI nell'area di lavoro per visualizzare la popolazione di celle singole da tale tubo campione e fare clic sull'asse FSC e modificare il canale dell'asse nel canale DAPI - Area.
- Fare clic sull'asse SSC e modificare il canale dell'asse in Istogramma.
NOTA: Le cellule vive saranno verso sinistra in quanto escludono DAPI, mentre le cellule morte prenderanno il DAPI e appariranno verso destra del grafico. - Fare clic sul pulsante T accanto all'asse DAPI e fare clic su Personalizza asse per regolare la scala per massimizzare la separazione tra picchi negativi DAPI positivi e DAPI.
NOT: Apparirà una finestra con le opzioni di ridimensionamento. Spesso, impostando il campo Scala su Biex e regolando i decenni extra negativi e la base di larghezza produrrà la massima separazione. - Fare clic su Applica nella finestra popup per applicare le modifiche di ridimensionamento, scegliere il pulsante Dissezione e distribuirlo sul picco negativo DAPI, corrispondente alla popolazione di celle attive.
- Etichetta questo cancello 'Live Cells' e fai clic con il pulsante destro del mouse per copiare il cancello 'Live Cells' per incollarlo sotto il cancello 'Single Cells' sotto i tubi 'APC-iso, 'DEAB' e 'ALDH/CD133' per selezionare la stessa porzione di celle vive in ogni tubo campione.
- Quindi fare doppio clic sulla popolazione di cellule vive nidificata sotto il file di esempio APC-iso e passare l'asse x al canale ALDH - Area e l'asse y al canale APC - Area.
- Ancora una volta, regolare la scala dell'asse facendo clic sul pulsante T e Personalizza asse di ogni asse in modo che gli eventi siano localizzati nell'area inferiore sinistra del grafico e selezionare l'opzione Quad gate e fare clic sulla finestra di stampa per stabilire un cancello quadrante .
- Regolare l'intersezione del cancello in modo che circa lo 0,5% della popolazione si trovi nella parte superiore sinistra della finestra del grafico o del quadrante 'APC positivo'.
NOT: Questo 0,5% rappresenta la colorazione non specifica dell'isotipo APC. - Fare clic con il pulsante destro del mouse su ogni etichetta quadrante singolarmente nell'area di lavoro e rinominarla in modo appropriato. Controllare o comando fare clic su ogni etichetta del gate quadrante nell'area di lavoro e copiarla.
NOT: 'Q1' rappresenta le celle CD133; 'Q2' rappresenta le celle CD133 e ALDH' ; 'Q3' rappresenta le celle ALDH; e 'Q4' rappresenta le cellule CD133 e ALDH-. - Incollare i gate del quadrante nella popolazione di Live Cells nidificata nel file 'DEAB'. Regolare la linea verticale in modo che circa lo 0,15% della popolazione cellulare si trovi all'interno del quadrante 'ALDH' facendo attenzione a non spostare la linea orizzontale.
NOT: Questo 0,15% rappresenta un segnale ALDH non specifico.- Per assicurarsi che la linea orizzontale non cambi la posizione, copiate i nuovi gate quadrante nidificati sotto il file DEAB e incollateli nelle celle dinamiche sotto il file iso APC. Selezionare Sì quando viene richiesto di sostituire il gate quadrante esistente.
- Verificare nell'area di lavoro che la percentuale 'CD133' sia ancora approssimativamente 0,5 nel file 'APC-iso'.
- Copiare e incollare i gate del quadrante nella popolazione "Live Cells" del file 'ALDH/CD133'.
NOT: La percentuale della popolazione di cellule vitali presente nel quadrante in alto a destra sarà la percentuale di CSC doppio positivo aldilà e CD133 all'interno del campione.
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Representative Results
Gli sferoidi formati con linee cellulari o CSC derivati dal paziente possono essere formati con una gamma di piccoli numeri di cellule all'interno delle goccioline sporgenti (Figura 2A). Gli sferoidi si formano in modo affidabile con un minimo di 10 cellule per pozzo, il che consente la conservazione di campioni di pazienti rari. Le cellule all'interno di questi sferoidi sono circondate da altre cellule in 3 dimensioni come sarebbero in vivo, consentendo contatti fisiologici delle cellule cellulari e tassi di diffusione. Le cellule tumorali all'interno degli sferoidi proliferano causando gli sferoidi a espandere le dimensioni (Figura 2B). Poiché le cellule o le linee cellulari più aggressive crescono più velocemente delle loro controparti, è importante quantificare la capacità di proliferazione di ogni campione ed esaminare come il trattamento farmacologico influisce sulla proliferazione di ogni campione. Per fare questo, un saggio di attività metabolica, come un analisi della fluorescenza a base di retoescenza, può essere facilmente eseguito con la piattaforma fisiologica 384-well, senza alcun requisito per la raccolta di sferoidi, i cui risultati possono essere visti in Figura 2C. Più sferoidi possono anche essere raccolti, fissati, sezionato e macchiati con anticorpi ematossialina e eosina o immunofluorescenti allo stesso tempo per identificare le morfologie cellulari e l'organizzazione all'interno di sferoidi, nonché la distribuzione dei tipi di cellule e ECM proteine (Figura 2D, E).
Per esaminare l'effetto del trattamento farmacologico sulla morfologia sferoidea, gli sferoidi possono essere facilmente visualizzati mediante l'imaging a contrasto di fase (Figura 3A). Più quantitativamente, l'effetto del trattamento farmacologico sulla proliferazione delle cellule tumorali o del CSC può essere misurato anche mediante letture di fluorescenza della fluorescenza della tintura retozurina nel controllo degli sferoidi non trattati rispetto agli sferoidi trattati dal farmaco (Figura 3B). Come convalida della morte cellulare dopo il trattamento farmacologico, la vitalità all'interno del controllo e gli sferoidi trattati con farmaci possono essere facilmente determinati tramite l'aggiunta di calceina-AM ed etidium homodimer-1 a più sferoidi per ogni condizione (Figura 3C). Dopo il tempo di incubazione, gli sferoidi macchiati possono essere raccolti con una pipetta e immagine al microscopio confocale.
Infine, raccogliendo sferoidi e disperdendoli in sospensioni a cella singola, la presenza di CSC e altri marcatori di fenotipo cellulare può essere analizzata con citometria di flusso (Figura 4). Il confronto dei cFC validi tra diversi trattamenti farmacologici all'interno dello stesso paziente, nonché tra i pazienti può aiutare a discernere l'efficacia di vari farmaci mirati CSC in modo specifico per il paziente.
Figura 1: 3D alta velocità effettiva 384 appesi stoccaggio goccia sferoide e layout di placcatura. (A) La piastra di goccia appesa è posta sul fondo di una piastra 6 pozzetto parzialmente riempita con acqua. (B) Il coperchio di 6 piastra di pozzo è posto sulla parte superiore della piastra di goccia appesa per creare camera di idratazione sterile. (C) Pila di lastre a 6 pozze da suggellare con una striscia termoplastica per la protezione dalla perdita di umidità e dai contaminanti. (D) Modello di placcatura alternato per piastra a goccia appesa. I quadrati rosa indicano pozzi pieni di cellule e miscela media. Le aree blu indicano le camere d'acqua per l'idratazione. Le caselle grigie indicano pozzi vuoti che fungono da confine tra camere di idratazione e goccioline sferoidi. (E) Immagine dal vivo della piastra a goccia appesa placcata con il modello del pozzo alternato. (F) Tutti i ben layout modello di placcatura utilizzato per gli esperimenti di sferoidi goccia appesa ad alta velocità. I quadrati rosa indicano pozzi cellulari placcati e aree blu indicano camere piene d'acqua per una maggiore idratazione. I quadrati grigi indicano pozzi di confine che fungono da confine tra le sezioni di idratazione e le aree di coltura cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sferoidi CSC derivati dal paziente morfologia e proliferazione all'interno di gocce sporgenti 3D. (A) Immagine dal vivo della piastra sferoide a goccia da 384 appesi, vista dal basso. (B) Immagini al microscopio della luce progressiva della crescita sferida di CSC derivata dal paziente dopo 2, 3 e 5 giorni in una goccia appesa. Le barre di scala (CIntensità di fluorescenza ) mostra un aumento significativo dopo 7 giorni di coltura di goccia appesa, correlati alla proliferazione e alla crescita del paziente appeso derivato sferoidi CSC (Unpaired due coda t-test, p < 0.0001, n >10). (D) Immagine dello stampo della matrice di sferoidi utilizzato per creare un cast per la raccolta di sferoidi per la sezionamento istologica. (E) Immagine H&E di uno sferoide coltivato con cellule staminali tumorali ovariche primarie, cellule staminali mesenchysiche, cellule endoteliali e cellule mononucleari periferiche periferiche a donatore raccolte nell'array degli sferoidi. Barra di paura : 100 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi del trattamento farmacologico degli sferoidi CSC derivati dal paziente, gocce appese. (A) Sferoidi CSC derivati dal paziente seminati a 50 cellule/goccia trattate con crescenti concentrazioni di paclitaxel dopo 5 giorni di crescita. Immagini rappresentative scattate 48 h dopo il trattamento farmacologico. (B) Quantificazione della vitalità cellulare attraverso la fluorescenza recidiva a concentrazioni crescenti di trattamento paclitaxelo. Tutti i campioni hanno una significativa riduzione della vitalità rispetto al controllo. (ANOVA unidirezionale, p <0.0001, n> 8). (C) Immagini confocali di cellule vive (calcein-AM) e morte (ethidium homodimer-1) all'interno dello sferoide a goccia appesa. Il colore verde indica che le celle vive e il colore rosso indicano la popolazione di cellule morte. Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione dei CSC negli sferoidi CSC derivati dai pazienti generati e mantenuti sulla piattaforma di rilascio 384-hanging. (A) Nell'analisi dei dati di citometria di flusso, la popolazione cellulare viene prima selezionata utilizzando una porta poligonale per eliminare gli eventi attribuibili ai detriti. (B) Le singole cellule vengono quindi selezionate per eliminare potenziali segnali di doppietta che potrebbero oscurare i risultati. (C) Tutte le singole celle vive vengono quindi selezionate in base all'esclusione DAPI. (D) L'asse verticale di un cancello quadrante viene regolato nel controllo DEAB per consentire una colorazione ALDH non specifica di circa lo 0,15%. (E) L'asse orizzontale del cancello quadrante è regolato nel controllo ISO APC per consentire una colorazione APC non specifica di circa lo 0,5%. (F) Il cancello del quadrante viene quindi utilizzato per determinare la percentuale di cellule CD133, ALDH e CD133/ ALDH sono presenti nella popolazione di cellule vive nella condizione sperimentale CD133 più ALDH. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La piattaforma di lastra di goccia appesa 384-well per la formazione di sferoidi 3D è uno strumento facilmente implementato per qualsiasi biologia cellulare o laboratori di biologia del cancro. Questa piattaforma fisiologica consente lo studio delle linee cellulari, così come dei campioni di pazienti primari all'interno di colture 3D fisiologicamente rilevanti, consentendo allo stesso tempo uno screening farmacologico ad alto rendimento. La piattaforma assicura inoltre che le condizioni di coltura siano fortemente regolabili, consentendo uno stretto controllo sulle densità di placcatura, sui rapporti di co-coltura cellulare, sui componenti extracellulari e sulla composizione media. Inoltre, questa piattaforma fisiologica consente agli esperimenti di essere altamente suscettibili di tecniche di analisi a valle che richiedono conteggi di cellule grandi o piccole come qRT-PCR, FACS e vari metodi di imaging. Mentre la facilità d'utilizzo viene fornita con l'esperienza, i nuovi apprendisti diventano rapidamente di successo, una volta che la velocità e la facilità di pipettaggio sono padroneggiate. Pertanto, questa piattaforma fisiologica è altamente applicabile per lo screening farmacologico 3D personalizzato, le indagini di biologia e chemoresistance CSC.
Alcuni punti di preoccupazione quando si implementa questa piattaforma includono il trasferimento di piastra e il trattamento farmacologico. Quando si trasferiscono piastre da un luogo all'altro come richiesto per l'alimentazione di routine, l'imaging e l'analisi, è necessario prendere precauzioni attente per evitare inutili spintoni. Afferrare le piastre dai bordi esterni mantenendole il più livellato possibile e fare attenzione a evitare movimenti stridenti quando si posiziona la piastra verso il basso. Questo aiuta a evitare la perdita di goccioline o la fusione di gocce vicine. Allo stesso modo, l'attenzione vigile dovrebbe essere data al compito di trattare sferoidi goccia appesi per evitare un dosso inequino di uno sferoide appeso goccia. Come con qualsiasi tecnica, la fiducia e la precisione con questi compiti arrivano con la pratica.
Alcune limitazioni sono innate a questa piattaforma fisiologica 3D. In primo luogo, l'instabilità delle goccioline può essere un problema a lungo termine, se non si presta attenzione a mantenere il corretto volume totale delle goccioline. Inoltre, come accennato in precedenza, il trasporto e lo stoccaggio delle piastre devono essere effettuati con attenzione per evitare la perdita o la fusione delle goccioline. Inoltre, la dimensione per questo ambiente 3D è dettata dalla dimensione innata delle goccioline stabili di 20 gradi, anche se molte repliche possono essere prodotte per un numero migliorato di cellule.
Le modifiche a questa piattaforma fisiologica 3D possono essere utilizzate per aumentare la produttività e modificare le caratteristiche fisiologiche. Ad esempio, il layout delle gocciole può essere modificato per includere ogni pozzo all'interno del pozzo 384 per aumentare la produttività. Inoltre, la piattaforma di drop appeso 3D è altamente favorevole alle indagini di co-coltura con la semplice inclusione di più tipi di cellule in ogni pozzo. Per generare e mantenere con successo sferoidi, la densità di semina cellulare e media di coltura cellulare può essere facilmente modulata, per regolare strettamente le dimensioni degli sferoidi. Con queste variabili altamente regolabili sono possibili innumerevoli indagini nell'ambito degli sferoidi derivati dai pazienti fisiologici 3D.
Mentre la maggior parte dei metodi di analisi descritti sono ampiamente utilizzati nella ricerca scientifica, ci sono alcune limitazioni specifiche per l'analisi di sferoidi generati goccia appesa con alcuni di questi metodi. Ad esempio, quando gli sferoidi vengono coltivati per lunghi periodi di tempo nelle piastre di goccia appese, le dimensioni delle goccioline possono aumentare in modo significativo causando la treccia delle goccioline durante l'imaging a contrasto di fase, compromettendo potenzialmente la qualità dell'immagine. Questo può essere migliorato prendendo una quantità equivalente di mezzo di ogni pozzo prima di aggiungere mezzo fresco. Inoltre, tecniche come la citometria di flusso e il conteggio delle singole cellule vitali possono essere influenzate dalla tecnica utilizzata per rompere gli sferoidi, che possono essere dannosi per le cellule. Come tale, è importante per ogni laboratorio per ottimizzare le tecniche di disaggregazione sferoide in base alle loro cellule e sperimentare per ridurre al minimo i danni alle cellule, massimizzando la densità delle singole cellule. Infine, l'analisi istologica degli sferoidi può essere complicata dalle loro piccole dimensioni e richiede la pratica per ottenere sezioni di successo.
Nel complesso, la piattaforma di sferoid e goccia appesa 3D è ampiamente adattabile all'interno della ricerca sul cancro e sul non cancro. Il sistema è facile da imparare e fornisce un ambiente 3D fisiologicamente rilevante per la coltura cellulare in un formato ad alta produttività. Il tempo di avvio di questa piattaforma fisiologica 3D è minimo, con pochi, se non nessuno, ostacoli di analisi tecnica da superare. La versatilità di questo sistema fornisce un mezzo per lo screening specifico del paziente di chemioterapici efficaci per la medicina di precisione, in un ambiente più fisiologico che mai.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato principalmente dal DOD OCRP Early Career Investigator Award W81XWH-13-1-0134(GM), doD Pilot award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Investigator Initiated award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for Ovarian Cancer and Michigan Ovarian Cancer alleanza. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institute del National Institutes of Health con il numero di premio P30CA046592. CMN è supportato dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship sotto il n. 1256260. MEB è sostenuta dalla borsa di studio del Dipartimento di assistenza universitaria nelle aree di bisogno nazionale (GAANN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 mL conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1x DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1x F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | - | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum - premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | - | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | - | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | - | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | - | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | - |
References
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