Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

एक इन विट्रो आक्रमण परख में माउस मैमरी ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग Oncogenic सेल व्यवहार के एक उपाय के रूप में

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59732
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Villanova University

Summary

इन विट्रो सेल आक्रमण परख का उपयोग प्रोटीन मैट्रिक्स युक्त सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग करके आक्रमण और प्रवास के लिए सेलुलर क्षमता को परिमाणित करके कैंसर मेटास्टेसिस की क्षमता को मापने के लिए किया जाता है। कोशिकाओं को प्रोटीन मैट्रिक्स और एक छिद्रयुक्त झिल्ली के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए चुनौती दी जाती है, एक chemoattractant की ओर, और फिर प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मात्रा निर्धारित.

Abstract

इन विट्रो आक्रमण परख एक Boyden कक्ष में एक प्रोटीन युक्त मैट्रिक्स का उपयोग करता है सुसंस्कृत कोशिकाओं की क्षमता को मापने के लिए मैट्रिक्स के माध्यम से पारित करने के लिए और एक प्रक्रिया में एक झरझरा झिल्ली कैंसर कोशिका मेटास्टेसिस के प्रारंभिक कदम के अनुरूप. परीक्षण कोशिकाओं जीन अभिव्यक्ति के लिए बदला जा सकता है या आक्रमण क्षमता में परिवर्तन के लिए परीक्षण करने के लिए inhibitors के साथ इलाज किया. यह प्रयोग माउस स्तन ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रामक phenotype परीक्षण की खोज और क्षमता oncogenes कि सेल आक्रमण को बढ़ावा देने की विशेषता. इस तकनीक, तथापि, बहुमुखी और कई अलग अलग अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. प्रयोग ही एक दिन में किया जा सकता है और परिणाम एक दिन से भी कम समय में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. परिणाम तुलना और विश्लेषण के लिए हमलावर कोशिकाओं की संख्या की गिनती शामिल हैं. इन विट्रो आक्रमण परख एक संस्कृति है कि अधिक vivo परख में शामिल से पहले एक प्रारंभिक आकलन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है में सेल व्यवहार का निर्धारण करने के लिए एक तेजी से, सस्ती, और स्पष्ट विधि है.

Introduction

इन विट्रो आक्रमण परख एक उपयोगी उपकरण हो सकता है जब एक सेल की क्षमता को मापने के लिए एक प्रोटीन लेपित झिल्ली के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए, मेटास्टेसिस में पहले कदम के अनुरूप. घातक कैंसर कोशिकाओं की एक प्रमुख विशेषता उनके माध्यम से स्थानांतरित करने और पास के ऊतकों पर आक्रमण करने की क्षमता है। कैंसर है कि फैल गया है या metastasized अधिक उपचार चुनौतियों बन गया है और लंबी अवधि के अस्तित्व की कम दर है, जबकि स्थानीयकृत ट्यूमर का इलाज करने के लिए आसान कर रहे हैं और लंबी अवधि के अस्तित्व की उच्च दर है. metastasize करने के लिए, कैंसर कोशिकाओं प्राथमिक ट्यूमर छोड़ दो और संचार या लसीका प्रणाली में विस्थापित करना चाहिए, एक प्रक्रिया है जो extracellular मैट्रिक्स और तहखाने झिल्ली1के माध्यम से पारित करने की आवश्यकता है. उपकला मेसेन्काइमल संक्रमण (EMT) नामक प्रक्रिया में, ट्यूमर कोशिकाओं को सेल-सेल संपर्कों को तोड़ना चाहिए, दिशात्मक रूप से माइग्रेट करना चाहिए, और पास के रक्त या लसीका वाहिकाओं पर आक्रमण करना चाहिए। इस मेटास्टेसिस झरना के प्रारंभिक कदम बहुत रुचि के हैं क्योंकि इन चरणों क्या कैंसर घातक बना सकते हैं. मेटास्टेसिस के प्रारंभिक चरणों में शामिल आनुवंशिक और एपिजेनेटिक कारक अनुसंधान की एक बड़ी राशि का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, लेकिन सटीक और विश्वसनीय प्रयोगात्मक उपकरण दोनों विवो में और इन विट्रो में इन प्रारंभिक चरणों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक हैं।

उपकरण ऐसे घाव भरने के रूप में सेल प्रवास में परिवर्तन को मापने के लिए (स्क्रैच) assays या इस तरह के नरम agar assays के रूप में 3 डी वातावरण में विकास आंशिक रूप से मेटास्टेसिस के प्रारंभिक कदम को मापने के प्रयोगात्मक तरीकों के लिए की आवश्यकता को संबोधित कर सकते हैं, लेकिन आक्रमण को मापने के लिए एक परख है अधिक चुनौतीपूर्ण के बाद से प्रक्रिया एक जटिल ट्यूमर microenvironment के भीतर शरीर में होता है. स्क्रीनिंग दवाओं या जीन परिवर्तन के प्रयोजनों के लिए आक्रमण और मेटास्टेसिस में महत्वपूर्ण कारकों का निर्धारण करने के लिए, एक प्रणाली है कि सुसंस्कृत कोशिकाओं के साथ विट्रो में इस्तेमाल किया जा सकता है और विवो में metastatic कोशिकाओं द्वारा सामना की चुनौतियों की नकल आक्रमण परख2है, 3. स्तन कैंसर महिलाओं में कैंसर का सबसे अधिक निदान प्रकार है और महिलाओं में कैंसर की मौत का दूसरा प्रमुख कारण है, इसलिए स्तन कैंसर सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस के लिए जिम्मेदार जीन को समझना सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, माउस कोशिकाओं स्तन कैंसर और इसकी प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली हैं.

इन विट्रो आक्रमण परख बॉयडेन चैंबर असेंबली पर आधारित है जहां विकास माध्यम के दो कक्षों को छिद्रयुक्त झिल्ली3से अलग किया जाता है . ट्यूमर microenvironment नकल करने के लिए, एक प्रोटीन युक्त जेल भी दूसरे में एक chemoattractant से एक कक्ष में कोशिकाओं को अलग करने और एक तहखाने झिल्ली बाधा के रूप में कार्य करने के लिए शामिल है। रसायनकी की ओर पलायन करने के लिए, कोशिकाओं को पहले प्रोटीन युक्त बाधा से गुजरना होगा फिर छिद्रयुक्त झिल्ली के माध्यम से पारित होना चाहिए - एक प्रक्रिया जो कि मेटास्टैटिक कोशिकाओं को स्ट्रोमा के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए अनुरूप है। प्रोटीन युक्त जेल प्रयोग की जरूरतों के आधार पर बदला जा सकता है, लेकिन आम तौर पर कोलेजन, या तहखाने झिल्ली निकालने के होते हैं (जैसे, Matrigel)4. यह प्रोटीन, प्रोटीग्लाइकन और विकास कारकों का एक जटिल मिश्रण है, लेकिन ज्यादातर लेमिनिन और कोलेजन IV 4,5होते हैं। कोशिकाओं तो आम तौर पर पॉलीकार्बोनेट, पॉलिएस्टर, या polytetrafluoroethylene (PTFE) से बना एक झरझरा झिल्ली के माध्यम से पारित करना होगा। झिल्ली व्यावसायिक रूप से या एक प्रोटीन जेल के बिना या बिना खरीदा जा सकता है (आमतौर पर कोलेबन), या जेल अलग से खरीदा जा सकता है और जोड़ा. छिद्र आकार सेल आकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। जबकि छिद्र आकार 0.4 से उपलब्ध हैं - 8.0 डिग्री, केवल 3.0 से pores - 8.0 डिग्री मीटर सेल प्रवास के लिए काफी बड़े हैं. आक्रमण परख स्थानांतरित करने और आक्रमण करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता पर inhibitors की प्रभावशीलता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. जबकि सटीक ट्यूमर microenvironment कि विवो में मौजूद है की कमी, इन विट्रो आक्रमण परख एक कम समय में कई स्थितियों स्क्रीनिंग पर फायदेमंद है, जबकि पशु मॉडल के लिए की जरूरत को कम से कम. इन प्रयोगों का लक्ष्य संदिग्ध oncogenes के जीन अभिव्यक्ति की तुलना और इन विट्रो आक्रमण परख और अन्य परीक्षणों का उपयोग कर कैंसर सेल व्यवहार और रोग आक्रामकता पर प्रभाव का निर्धारण करने के लिए है। कुल मिलाकर, आक्रमण परख मेटास्टैटिक क्षमता का निर्धारण करने के लिए सुसंगत, मात्रात्मक, और तेजी से परिणाम प्रदान करता है, जबकि भी एक अपेक्षाकृत सस्ती, सीधा, और अनुकूलनीय विधि जा रहा है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रयोगों और तरीकों Villanova विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अधिकृत के रूप में प्रदर्शन किया गया.

1. संस्कृति माउस मैमरी ट्यूमर कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति

  1. सबसे पहले, परीक्षण किया जा करने के लिए सेल लाइनों तैयार करते हैं।
  2. BALB/cV चूहों के प्रजनन कॉलोनी का प्रयोग करें। इन चूहों में चूहे स्तन ट्यूमर वायरस के BALB/cV तनाव ले, दूध में पिल्ले को प्रेषित6,7. प्रजनन महिलाओं के पचास प्रतिशत उम्र के 10 महीने से स्तन ट्यूमर विकसित.
    1. एक ट्यूमर सेल लाइन स्थापित करने के लिए, एक IACUC को मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक ट्यूमर असर बांध बलिदान। 70% EtOH में पेट की त्वचा को भिगो दें और एक लेमिनर प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत ट्यूमर को हटा दें। ट्यूमर के नीचे जोड़सकते हैं, इसलिए peritoneum puncturing से बचने के लिए ध्यान रखना.
    2. बाँझ हैंक्स संतुलित नमकीन समाधान (HBSS) की एक छोटी राशि के साथ एक पेट्री डिश में गैर-नेक्रोटिक क्षेत्रों से ट्यूमर टुकड़े प्लेस और एक बाँझ उस्तरा ब्लेड के साथ बहुत पतले कीमा।
    3. एक T25 सेल संस्कृति फ्लास्क युक्त एक T25 सेल संस्कृति फ्लास्क के लिए स्थानांतरित 5 एमएल Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम या DMEM (4.5 ग्राम/L ग्लूकोज, फिनोल लाल, और एल-ग्लूटामाइन) के साथ पूरक 50% भ्रूण बोवाइन सीरम या FBS और 1% एंटीबायोटिक / इलाज सेल संस्कृति में कोशिकाओं को बढ़ने के साथ एक इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 और 100% आर्द्रता 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    4. 24-48 एच के बाद गैर-अनुकूल कोशिकाओं को धो लें और डीएमईएम को 50% एफबीएस और 1% एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ बदलें। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर पर वापस लाएं।
    5. तरल संस्कृति मीडिया हर 3 दिन बदलें.
    6. विभाजन या कोशिकाओं को पारित जब वे 90% confluent हैं. संस्कृति मीडिया निकालें और HBSS (कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना) के साथ अनुयायी कोशिकाओं को धो लें। कोशिकाओं गोल और अलग कर रहे हैं जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-5 मिनट के लिए 0.25% Trypsin-EDTA समाधान के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं। ताजा संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं 1:10 पतला और एक नया फ्लास्क में जोड़ें. एक टी-25 सेल संस्कृति फ्लास्क 5-8 एमएल संस्कृति मीडिया, HBSS के 5 एमएल धोने के लिए, और tripsin-EDTA के 1 एमएल पारित करने के लिए की आवश्यकता है। इनक्यूबेटर को फ्लास्क वापस करें।
    7. पहले पारित होने के बाद 40% के लिए FBS एकाग्रता को कम करें, फिर 30% दूसरे मार्ग के बाद, फिर 20% तीसरे मार्ग के बाद, और अंत में 10% सभी बाद के मार्ग के लिए। 10% FBS के साथ मानक DMEM माध्यम में विकास की स्थापना की प्रक्रिया चार मार्ग और 2 - 8 महीने की आवश्यकता है.
  3. एक बार सेल लाइन (एस) की स्थापना कर रहे हैं, गैर जरूरी जीन के लिए SHRNA लक्ष्य MRNA या CRISPR के transfection द्वारा संदिग्ध oncogenes की अभिव्यक्ति को बदल.
    1. लगातार परिणामों के लिए पश्चिमी दाग और / या आरटी-QPCR द्वारा सत्यापित कर रहे हैं कि व्यक्तिगत क्लोन के साथ एंटीबायोटिक प्रतिरोधी स्थिर सेल लाइनों की स्थापना, हालांकि, क्षणिक transfections के रूप में अच्छी तरह से काम कर सकते हैं के बाद से परख केवल 22 एच नियंत्रण सेल लाइनों के साथ की आवश्यकता है गैर-विशिष्ट लक्ष्य अनुक्रम भी आवश्यक हैं।

2. इन विट्रो आक्रमण परख

  1. प्रयोग के दिन 1 के लिए 70-90% confluent जब तक एक T25 फ्लास्क में अनुलग्न माउस स्तन ट्यूमर कोशिकाओं हो जाना।
    नोट: अन्य सेल लाइनों या प्रयोगात्मक शर्तों अलग सेल संस्कृति मीडिया की आवश्यकता हो सकती है. उदाहरण के लिए, यदि हार्मोन-प्रतिक्रियाशील स्तन कैंसर कोशिकाओं का परीक्षण किया जा रहा है, लकड़ी का कोयला फ़िल्टर सीरम यौगिकों कि एस्ट्रोजन या अन्य हार्मोन रिसेप्टर्स को सक्रिय हटाने के लिए आवश्यक हो सकता है.
  2. एक सेल संस्कृति हुड में लगभग 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (से -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण) के लिए उन्हें वार्मिंग द्वारा Boyden कक्ष आवेषण तैयार करें। अप्रयुक्त सम्मिलित करने के लिए फ्रीज-थॉ व चक्र से बचें। प्रत्येक प्रयोग के लिए प्रत्येक सेल लाइन के लिए सांख्यिकीय रूप से मान्य डेटा जनरेट करने के लिए तीन सम्मिलनों (प्रतिकृति) का उपयोग करें.
    1. अच्छी तरह से करने के लिए पूर्व-वार्म्ड 37 डिग्री सेल्सियस सीरम मुक्त DMEM मीडिया जोड़ें और फिर डालने। 24-अच्छी तरह से व्यंजन के लिए डिज़ाइन किए गए आवेषण के लिए, 500 डिग्री सेल्सियस सीरम-मुक्त DMEM को अच्छी तरह से जोड़ें और फिर 500 डिग्री सेल्सियस सीरम-मुक्त DMEM को डालने के लिए जोड़ें ताकि छिद्रयुक्त झिल्ली और जेल दोनों पक्षों पर हाइड्रेटेड हो।
      नोट: एक 6 अच्छी तरह से पकवान के लिए डिजाइन बड़ा आवेषण के लिए, दोनों पक्षों पर सीरम मुक्त DMEM के 2 एमएल का उपयोग करें.
  3. अच्छी तरह से हाइड्रेट और acclimate करने के लिए कम से कम 2 एच के लिए 5% सीओ2 और 100% आर्द्रता के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में आवेषण के साथ पकवान प्लेस।
  4. विकास मीडिया को हटाने और 5 एमएल HBSS के साथ कोशिकाओं rinsing द्वारा कोशिकाओं को तैयार.
    1. HBSS निकालें और 1 एमएल 0.25% trypsin-EDTA समाधान के लिए जोड़ें 1 - 5 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस पर या जब तक कोशिकाओं गोल दिखाई देते हैं या फ्लास्क से टुकड़ी के लक्षण दिखा.
    2. सभी कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लास्क को धीरे से टैप करें। DMEM के 5 एमएल + 10% FBS में कोशिकाओं को पुन: निलंबित और एक बाँझ 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए स्थानांतरण।
    3. कोशिकाओं को धीरे से गोली करने के लिए 5 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। मीडिया निकालें और कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए 5 एमएल सीरम मुक्त DMEM के साथ बदलें।
    4. सीरम मुक्त मीडिया में centrifugation और निलंबन दोहराएँ दो बार 3 washes की कुल के लिए और अधिक.
    5. सीरम मुक्त DMEM के अंतिम 5 एमएल में कोशिकाओं को अच्छी तरह से resuspend और सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं का कोई clumps हैं.
  5. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिका सांद्रता निर्धारित करें। केवल व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें. सीरम मुक्त DMEM के 5 एमएल में 5 x 104 कोशिकाओं/
    नोट: यह एकाग्रता एक 24 अच्छी तरह से पकवान में डालने के प्रति 2,500 कोशिकाओं पैदावार. कोशिकाओं की यह संख्या प्रवास और आक्रमण की उच्च दरों के साथ आक्रामक कैंसर कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है. कम आक्रामक सेल लाइनों अधिक कोशिकाओं की आवश्यकता हो सकती है, अप करने के लिए 10,000 कोशिकाओं को अवलोकन पर हमला कोशिकाओं के लिए डालने के प्रति. यदि कम सेल आक्रमण की उम्मीद है, सेल संख्या में वृद्धि से हमलावर कोशिकाओं को अधिकतम करने पर विचार करें. यदि वृद्धि हुई सेल आक्रमण की अपेक्षा है, कम कोशिकाओं के साथ शुरू करते हैं.
  6. इनक्यूबेटर से सेल कल्चर डिश निकालें और धीरे से डालने से मीडिया को प्रेरित करें। डालने लिफ्ट और अच्छी तरह से मीडिया aspirate. जल्दी से काम करना, निचले कक्ष में chemoattractant जोड़ें. एक 24 अच्छी तरह से पकवान के लिए, 5% FBS के साथ DMEM के 750 $L जोड़ें.
    1. अच्छी तरह से में डालने प्लेस और डालने के लिए कोशिकाओं को जोड़ें. एक 24 अच्छी तरह से पकवान के लिए, सेल निलंबन के 500 $L का उपयोग करें. एक 6 अच्छी तरह से पकवान डालने के लिए, chemoattract के 2.5 एमएल और कोशिकाओं के 2 एमएल का उपयोग करें. सुनिश्चित करें कि झिल्ली के दोनों ओर हवा के कोई बुलबुले मौजूद नहीं हैं।
    2. 22 ज के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए पकवान वापस.
  7. 22 ज के बाद, कोशिकाओं को ठीक करें और दागें। निर्धारण के लिए 1x फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) में 1% पैराफार्मेल्डिहाइड का समाधान तैयार की जा सके।
    1. एक साफ 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति पकवान में, व्यक्तिगत कुओं के लिए fixative के 1 एमएल जोड़ें तो वहाँ प्रत्येक डालने के लिए एक अच्छी तरह से है.
    2. 10% इथेनॉल (v/v) के साथ पीबीएस के समाधान में 0.1% क्रिस्टल बैंगनी (w/v) का धुंधला समाधान (ताजा बनाया) तैयार करें। इसी तरह, प्रत्येक डालने के लिए एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति पकवान में एक साफ अच्छी तरह से करने के लिए धुंधला समाधान के 1 एमएल जोड़ें.
    3. प्रत्येक डालने के एक बल के साथ एक समय में निकालें और डालने के अंदर एक बाँझ कपास झाड़ू जगह है और unmigrated कोशिकाओं को दूर करने के लिए झिल्ली के ऊपरी पक्ष झाड़ू.
    4. एक दूसरे कपास झाड़ू के साथ दोहराएँ. झिल्ली बल्कि मजबूत है, तो कोमल दबाव जबकि swabing झिल्ली की अखंडता समझौता नहीं करता है.
    5. सम्मिलित करने के अंदर से किसी भी शेष मीडिया को निकालें और अलग कोशिकाओं को धोने के लिए PBS के 750 $L जोड़ें।
    6. पीबीएस निकालें और धोने दोहराएँ. झिल्ली के नीचे पर माइग्रेट कोशिकाओं को ठीक करने के लिए एक अच्छी तरह से युक्त स्थिर में डालने रखें। सभी सम्मिलित करता है के लिए दोहराएँ.
    7. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए आवेषण को ठीक करें।
    8. निर्धारण के बाद सम्मिलित करें निकालें। 750 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ फिर से डालने को धो लें।
    9. दाग सभी चले गए और निश्चित कोशिकाओं के लिए धुंधला समाधान के साथ अच्छी तरह से में डालने प्लेस. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को दाग.
      नोट: 6-वेल डिश आवेषण के लिए, 2 एमएल स्थिर समाधान, 2 एमएल धुंधला समाधान, और 2 एमएल PBS वॉश का उपयोग करें।
  8. आसुत पानी के साथ एक बीकर का प्रयोग करें आवेषण destain. सम्मिलित करें और आसुत पानी में डुबकी जब तक डालने से चल रहे पानी स्पष्ट है.
    1. किसी भी अतिरिक्त पानी की बूंदों को निकालें और एक फिल्टर कागज sidewise पर सम्मिलित जगह सूखी हवा (आमतौर पर रात भर).
  9. प्रत्येक डालने के लिए एक साफ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड लेबलिंग द्वारा इमेजिंग के लिए झिल्ली तैयार करें और स्लाइड के केंद्र में माइक्रोस्कोप विसर्जन तेल की एक छोटी बूंद रखें।
    1. प्लास्टिक डालने के अंदर पर झिल्ली की परिधि के आसपास कटौती करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग कर डालने से झिल्ली को अलग करें।
    2. forceps का उपयोग कर झिल्ली निकालें और यह जगह में पकड़ करने के लिए स्लाइड पर तेल ड्रॉप के शीर्ष पर जगह है।
      नोट: झिल्ली बहुत पतली और बहुत हल्के होते हैं, इसलिए वे आसानी से कोमल हवा के प्रवाह से खो सकते हैं।

3. इमेजिंग और विश्लेषण

  1. चूंकि छिद्रझिल्ली स्पष्ट हैं और क्रिस्टल बैंगनी के साथ दाग कोशिकाओं उन्हें इसके विपरीत दे, कोशिकाओं को देखने के लिए एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। कई नमूनों के लिए परिमाणित करने के लिए एक कैमरा और / 5x, 10x, या 20x आवर्धन पर कक्षों को देखें। परिमाणीकरण के लिए, 10x आवर्धन पर एकाधिक, गैर-ओवरलैपिंग छवियों का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, 10x आवर्धन पर झिल्ली पर सभी माइग्रेट कोशिकाओं गिनती.
  2. सभी नमूनों के लिए प्रति क्षेत्र हमलावर कक्षों या कक्षों की कुल संख्या निर्धारित करें. प्रत्येक प्रयोग के लिए, तीन प्रतिकृति आवेषण के साथ परख में प्रत्येक शर्त प्रदर्शन और सांख्यिकीय उपयोगी परिणामों के लिए कई बार दोहराएँ.
  3. विभिन्न विकास दर और प्रवास दरों के साथ विभिन्न सेल लाइनों की तुलना करते समय, एक समानांतर प्रयोग करने के लिए कोशिकाओं है कि एक प्रोटीन मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण और प्रोटीन मैट्रिक्स के बिना एक Boyden चैंबर विधानसभा की तुलना (केवल मुक्त कोशिकाओं). प्रत्येक कक्ष पंक्ति के लिए प्रतिशत आक्रमण परिकलित करें (प्रणाम कक्षों की संख्या/
    नोट: यह दृष्टिकोण आक्रमण दर की तुलना माइग्रेशन दरों से करने में मदद कर सकता है. यदि एक ही सेल लाइन पर लागू विभिन्न शर्तों की तुलना करते हैं, तो अकेले आक्रमण की गणना करना अधिक प्रासंगिक परिकलन है. झिल्ली के बाहरी किनारे कभी कभी केंद्रीय क्षेत्रों की तुलना में कोशिकाओं की एक उच्च संख्या है और इसलिए, कम सटीक है. यदि ऐसा होता है, मात्रा निर्धारण से उन कोशिकाओं को बाहर और सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को एक दोहराने प्रयोग में एक कपास झाड़ू से हटा रहे हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रोटीन मैट्रिक्स के माध्यम से इन विट्रो आक्रमण की इस विधि का उपयोग जिंक उंगली प्रोटीन की परिवर्तित अभिव्यक्ति के साथ माउसस्तन ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रामक फीनोटाइप और ऑनकोजेनिक कोशिकाओं के व्यवहार का आकलन करने के लिए किया गया था । अन्य दृष्टिकोण है कि भी सेल प्रवास और 3 डी वातावरण में विकास की जांच के साथ संयोजन के रूप में, यह पाया गया कि ट्यूमर सेल लाइनों में $c3h8 की अभिव्यक्ति के उच्च स्तर, या एक प्लाज्मिड से प्रमोटर मध्यस्थता अभिव्यक्ति द्वारा, सेल की तेजी से दरों में हुई प्रसार, तेजी से प्रवास, 3 डी वातावरण में वृद्धि, और इन विट्रो आक्रमण परख8में आक्रमण में वृद्धि हुई। इसके विपरीत, SHRNA constructs द्वारा अभिव्यक्ति में कमी कम आक्रामक प्रसार, प्रवास, और आक्रमण8के परिणामस्वरूप . इन परिणामों की पुष्टि विवो में की गई, जहां अधिक अभिव्यक्ति के $c3h8 बड़े ट्यूमर है कि तेजी से दिखाई दिया उत्पादन किया, जबकि कम अभिव्यक्ति कम ट्यूमर है कि छोटे और कम लगातार8थे का उत्पादन किया.

इस काम का विस्तार करने के लिए, अभिव्यक्ति प्लाज्मिड जो SHRNA-मध्यस्थ दस्तक को बचा सकते हैं,' उन्हें माउस स्तन कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से ट्रांसफेक्टेड किया गया था ताकि यह मूल्यांकन किया जा सके कि इन कक्षों में आक्रामक सेल वृद्धि और व्यवहार को फिर से स्थापित किया जा सकता है या नहीं. अभिव्यक्ति के सभी दस्तक और बचाव पश्चिमी धब्बा या आरटी-क्यूपीसीआर8द्वारा सत्यापित किए गए थे। एक आक्रमण परख का प्रयोग 24 कूप डिश में प्रति कक्ष 5,000 कोशिकाओं के साथ किया गया था और चित्र 1 और चित्र 2में दर्शाए अनुसार तस्वीरों के साथ प्रलेखित किया गया था। चित्र ााालक 3 आक्रमण परख के परिणामों को दिखाता है, जो यह प्रदर्शित करता है कि सेल आक्रमण में किस प्रकार कमी आई है, यह कि क3h8 अभिव्यक्ति के SHRNA पर कमी आई है, लेकिन अभिव्यक्ति को बचाए जाने पर उस आक्रमण को बचाया जाता है. इन आंकड़ों से पता चलता है कि आक्रमण परख और अधिक महंगा और लंबा दृष्टिकोण पर तैयार करने से पहले इन विट्रो में सेल लाइनों के परीक्षण के लिए एक तेजी से विधि प्रदान कर सकते हैं.

Figure 1
चित्र 1: आक्रमण परख घटक. (ए) Boyden कक्ष एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति पकवान के लिए डालने. (बी) कोशिकाओं के साथ 22 एच ऊष्मायन के बाद निर्धारण, दाग लगाने और धोने के लिए 24-कूप ऊतक संस्कृति डिश का उपयोग किया जाता है। संख्या 1, 2, और 3 किसी एकल कक्ष पंक्ति की प्रतिकृतिएँ हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: समय पैमाने के साथ आक्रमण परख flowchart. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र ााालीना 3: माउस स्तन ट्यूमर कोशिकाओं के नमूना आक्रमण परख परिणाम ]c3h8 की अभिव्यक्ति के लिए बदल गए, जो oncogenic phenotype को बदल देता है. (ए, बी) माउस स्तन ट्यूमर से अलग कोशिकाओं stably MRNA या लक्षित करने के एक नियंत्रण अनुक्रम को लक्षित SHRNA के साथ transfected थे [c3h8 MRNA. (ग) बाद में सेल लाइन को पुनः संयोजक [c3h8 को SHRNA द्वारा अप्रभावित होने के लिए डिज़ाइन किया गया व्यक्त करके बचाया गया था। कोशिकाओं क्रिस्टल बैंगनी के साथ दाग और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 10x आवर्धन पर कब्जा कर रहे हैं। स्केल बार - 500 डिग्री मी. (डी) क्वांटिफिकेशन दिखाता है कि कम अभिव्यक्ति $c3h8 हमलावर कोशिकाओं और मेटास्टेसिस क्षमता की संख्या में कमी आई। जीन अभिव्यक्ति का बचाव सेल आक्रमण की उच्च दरों को बचाता है। मान एक 24 अच्छी तरह से आक्रमण परख डालने से हमला कोशिकाओं की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रयोग में प्रत्येक प्रतिकृति के लिए, हमलावर कोशिकाओं की औसत संख्या की गणना की गई थी. यह तीन प्रयोगों के लिए दोहराया गया था. त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इन विट्रो आक्रमण परख कैंसर सेल आक्रमण को बढ़ावा देने के कारकों का अध्ययन करने के लिए एक सस्ती, तेजी से, मात्रात्मक, और सीधा तरीका है. स्तन कैंसर महिलाओं के बीच सबसे अधिक निदान कैंसर है. स्तन कैंसर के तीन प्रमुख subtypes में से, ट्रिपल नकारात्मक, (या ईआर-, पीआर-, HER2/ इसलिए, जीन और अभिव्यक्ति है कि मेटास्टेसिस में परिणाम को समझने में मदद कर सकते हैं रोग के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्य और आनुवंशिक मार्करों लगता है. जबकि कैंसर सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण जीन के कई की पहचान की गई है और विशेषता है, अभिव्यक्ति का स्तर और मेटास्टेसिस ड्राइवरों बनाम मेटास्टेसिस suppressors की गतिविधि रोग प्रगति का एक महत्वपूर्ण पहलू हो सकता है9, 10|

जीन अभिव्यक्ति के अलावा, इन विट्रो आक्रमण परख का उपयोग कैंसर कोशिका आक्रमण11,12 को बढ़ावा देने या रोकने में माइक्रोआरए और अन्य नियामकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है . इन विट्रो आक्रमण सेटअप विधि inhibitors के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बहु सेल प्रकार ट्यूमर वातावरण, CRISPR संपादित कोशिकाओं, या सेलुलर विकास के वातावरण में अल्पकालिक परिवर्तन. बहुमुखी प्रतिभा और अनुकूलनशीलता इस परख बहुत लाभप्रद बनाते हैं.

आक्रमण परख जीन और कारकों है कि करने के लिए योगदान या ट्यूमर प्रगति को रोकने के विश्लेषण में एक पहला कदम में इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, यान एट अल (2010) इन विट्रो आक्रमण assays का इस्तेमाल किया अत्यधिक आक्रामक स्तन कैंसर सेल लाइन MDA-MB 23113द्वारा EMT दबाने में GATA-3 की भूमिका को परिभाषित करने के लिए . तब वे यह दिखाने में सक्षम थे कि यह दमन एक विवो परख13में मेटास्टेसिस बनाने की क्षमता में कमी के साथ संबंधित था . संभावित चिकित्सीय रणनीतियों शुरू में मार्ग inhibitors की क्षमता द्वारा विशेषता किया जा सकता Matrigel के माध्यम से आक्रमण को सीमित करने के लिए, यह भी पशु मॉडल में ट्यूमर गठन पर इन inhibitors के प्रभाव के साथ correlating. इन विट्रो आक्रमण परख ज्ञात और क्षमता oncogenes और बातचीत भागीदारों की अधिक गहराई से विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक oncoप्रोटीन या उत्परिवर्तनों के तेजी से विश्लेषण के ज्ञात कार्यात्मक रूपांकनों के आणविक विच्छेदन एक प्रारंभिक स्क्रीन या महत्व के आकलन के रूप में इन विट्रो आक्रमण परख के साथ किया जा सकता है. यह महत्वपूर्ण डोमेन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आणविक स्तर पर सेल phenotypes के एक कार्यात्मक समझ प्रदान कर सकते हैं.

जबकि Boyden चैंबर आक्रमण परख कई फायदे हैं, वहाँ सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, आक्रमण परख केवल intravasation पर लग रहा है, मेटास्टेसिस के प्रारंभिक चरणों में से एक है, लेकिन बाद में कदम नहीं जब कैंसर की कोशिकाओं माध्यमिक स्थानों उपनिवेश. इसलिए, मेटास्टेसिस क्षमता का केवल एक आंशिक दृश्य निष्कर्ष निकाला जा सकता है। परख के 22 एच लंबाई, जबकि लचीला, कुछ सेल विभाजन है कि अतुल्यकालिक सेल आबादी के आक्रमण को मापने में सूक्ष्म परिवर्तन तिरछा सकता बाहर नहीं कर सकते. Mitomycin सी जैसे अवरोधक तेजी से डाइविंग कोशिकाओं के मामले में सेल विभाजन को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, chemotaxis के लिए 5% FBS समाधान का उपयोग धीरे-धीरे समय के साथ फैलाना और दोनों ऊपरी और निचले कक्षों के बीच साम्य होगा. प्रोटीन जेल का घनत्व इस प्रसार को धीमा कर देता है और सेल को जेल और झिल्ली (haplotaxis) भर में बाद में पलायन के विकल्प के साथ या प्रोटीन मैट्रिक्स के माध्यम से और FBS (chemotaxis) के उच्च सांद्रता की ओर pores के माध्यम से प्रस्तुत करता है। वैकल्पिक chemotaxis एजेंटों प्रतिस्थापित किया जा सकता है या आक्रमण के लिए कम समय भत्ते केवल कोशिकाओं है कि समानता से पहले आक्रमण को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह लचीलापन है, नहीं कठोरता, इन विट्रो आक्रमण परख है कि अनुकूलन के लिए अनुमति देता है कि इस परख इतना उपयोगी बनाता है. इस परख के भविष्य रूपांतरों यौगिकों की एक बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग शामिल, जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन, और allele-विशिष्ट दवा प्रभावशीलता का आकलन. इसके अलावा, घूम मीडिया के साथ एक दोहरी कक्ष प्रणाली कोशिकाओं को चुनौती देने के लिए एक प्रोटीन मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण कर सकता है, एक तरल वातावरण पार, और एक माध्यमिक स्थान पर एक दूसरे प्रोटीन मैट्रिक्स पर पुनर्स्थापित. अंत में, एक और अधिक चुनौतीपूर्ण झिल्ली इन विट्रो आक्रमण परख प्रणाली के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है जैसे गैर इनवेसिव कोशिकाओं के एक मोनोलेयर कि कैंसर की कोशिकाओं को पार करने के लिए और अधिक कठिन हो जाएगा.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान R15CA169978 द्वारा समर्थित किया गया था. अतिरिक्त धन Villanova विश्वविद्यालय से आया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353504
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermoFisher 15240062
BALB/c mice
Cell Culture Incubator
Cell Culture Treated Flasks
Clinical cenrifuge
Cotton swab Puritan 25-806
Crystal Violet Sigma Aldrich C0775
Distilled water
DMEM ThermoFisher 10566-016 high glucose, GlutaMAX
Ethanol
FBS Sigma Aldrich F2442-500ML
Forcepts
Glass Slide VWR 16004-422
HBSS ThermoFisher 14025076 no calcium, no magnesium
Hemocytometer
Imersion oil
Invasion Chambers (24-well) Corning 354480 Cat. #354481 for 6-well
Light Microscope
Lipofectamine Transfection Reagent
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
PBS
Scalpel, disposable #11
shRNA
Sterile Transfer pipet
Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
  2. Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
  3. Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
  4. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
  5. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  6. Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
  7. Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).
  8. Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
  9. Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
  10. Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
  11. Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), pii: BSR20180571 (2018).
  12. Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
  13. Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).

Tags

आनुवंशिकी अंक 148 सेल प्रवास सेल आक्रमण सेल व्यवहार मेटास्टेसिस Boyden चैंबर स्तन कैंसर Oncogene
एक इन विट्रो आक्रमण परख में माउस मैमरी ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग Oncogenic सेल व्यवहार के एक उपाय के रूप में
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, J. A., Knepper, J. E. The… More

Schmidt, J. A., Knepper, J. E. The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior. J. Vis. Exp. (148), e59732, doi:10.3791/59732 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter