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Immunology and Infection

समृद्ध मानव स्मृति बी सेल आबादी से वांछित विशिष्टताओं के साथ एंटीबॉडी के चयन और वसूली के लिए एकल सेल स्क्रीनिंग विधि

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59809
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1World Without Disease Accelerator, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson, 2Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson

Summary

मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से व्यक्तिगत एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने और पुनर्प्राप्त करने के लिए BSelex विधि एकल सेल पीसीआर और क्लोनिंग के साथ प्रवाह साइटोमेट्री को जोड़ती है।

Abstract

मानव एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची संभावित चिकित्सीय एंटीबॉडी और उपयोगी biomarkers के एक बड़े पैमाने पर अप्रयुक्त स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है. जबकि वर्तमान अभिकलनीय विधियाँ, जैसे कि अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS), अनुक्रम स्तर पर एंटीबॉडी प्रदर्शनों के संग्रह पर डेटा के भारी सेट उपज, कार्यात्मक डेटा की पहचान करने के लिए जो दृश्यों एक विशेष प्रतिजन या सेट के लिए प्रासंगिक हैं की आवश्यकता है एंटीजन. यहां, हम परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से मानव रक्त दाता से व्यक्तिगत एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने और पुनर्प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि परिपक्व बी कोशिकाओं के एक प्रारंभिक संवर्धन का इस्तेमाल करता है और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से आईजीजी स्मृति बी कोशिकाओं को अलग करने के लिए phenotypic सेल मार्करों और फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन का एक संयोजन की आवश्यकता है। भारी और प्रकाश श्रृंखला चर क्षेत्रों तो क्लोन और फिर से जांच कर रहे हैं. हालांकि स्मृति बी सेल डिब्बे तक ही सीमित है, इस विधि प्रवाह साइटोमेट्री का लाभ लेता है बी कोशिकाओं के लाखों पूछताछ और एक एकल सेल से युग्मित भारी और प्रकाश श्रृंखला अनुक्रम देता है अभिव्यक्ति और विशिष्टता की पुष्टि के लिए तैयार प्रारूप में. इस विधि के साथ बरामद एंटीबॉडी चिकित्सकीय क्षमता के लिए विचार किया जा सकता है, लेकिन यह भी विशिष्टता और bioinformatic दृष्टिकोण के साथ समारोह के लिए व्यक्तियों के भीतर बी सेल प्रदर्शनों का आकलन लिंक कर सकते हैं.

Introduction

एंटीबॉडी चिकित्सकीय अणुओं की एक बढ़ती हुई वर्ग हैं, और किसी भी मानव में मौजूदा बी सेल प्रदर्शनों की सूची इस तरह के एंटीबॉडी का एक संभावित स्रोत है। जब एक मानव दाता से बरामद, वे कोई अनुकूलन या "मानवीकरण" की आवश्यकता होती है, कदम है कि अन्य पशु प्रणालियों में उत्पन्न एंटीबॉडी के लिए आवश्यक हैं. मानव एंटीबॉडी की पहचान और अलगाव के लिए कई तरीके मौजूद हैं, जिनमें बी सेल सक्रियण और प्रसार1, ईबीवी रूपांतरण2,3, और हाइब्रिडोमा सेल लाइनों की पीढ़ी 4 के माध्यम से अमरीकरण शामिल है ,5. हालांकि, इन तरीकों के सभी स्क्रीन और प्रतिजन विशेष एंटीबॉडी ठीक करने के लिए व्यापक सेल संस्कृति की आवश्यकता है. मानव एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची के बारे में जानकारी बहुत अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) प्रौद्योगिकी के विकास के साथ विस्तार किया गया है, दाता के नमूनों में मौजूद अलग-अलग दृश्यों की भारी मात्रा की पहचान के लिए अनुमति देता है। हालांकि, क्योंकि एनजीएस मौजूद सभी दृश्यों का एक नास्तिक दृश्य देता है, यह एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान और अलगाव के लिए अनुमति नहीं देता है, विशेष रूप से दुर्लभ या कम आवृत्ति एंटीबॉडी के मामले में।

"BSelex" विधि का उद्देश्य मानव दाताओं में परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के परिसंचरण से प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करना है, और आगे के विश्लेषण के लिए इन एंटीबॉडी के दृश्यों को अलग करना और पुनर्प्राप्त करना है। इस विधि के प्रवाह cytometry और सेल छँटाई का इस्तेमाल बी सेल रिसेप्टर (BCR) स्मृति बी कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त का लाभ लेने के लिए. अधिक कम-थ्रूपुट आण्विक जीव विज्ञान विधियों को शुरू करने से पहले प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से प्रतिजन-विशिष्टता के लिए लाखों बी कोशिकाओं की जांच की जा सकती है। जोड़ी भारी और प्रकाश श्रृंखला पहचान सबसे NGS तरीकों, जो थोक में सेल दृश्यों का विश्लेषण में संभव नहीं है. विधि में हम यहाँ का वर्णन, कोशिकाओं को व्यक्तिगत रूप से अलग कर रहे हैं, और दोनों भारी और प्रकाश श्रृंखला दृश्यों की बनती वसूली संभव है, जो प्रत्यक्ष क्लोनिंग और पूर्ण आईजीजी की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है.

Protocol

मानव स्वयंसेवकों से नमूनों के उपयोग के बाद प्रोटोकॉल Scripps अनुसंधान संस्थान संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया. रक्तदान से पूर्व दानदाताओं से जानकारी प्राप्त की गई।

1. अभिकर्मक तैयारी

  1. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी)
    1. फिकॉल-प्लाक प्लस आइसोलेशन द्वारा सामान्य मानव दाताओं से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें। 90% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 10% डाइमेथिल सल्फाइड (डीएमएसओ) में 50 मिलियन कोशिकाओं/एमएल पर क्राइवोरपेरपोर। -80 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को फ्रीज करें और दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
  2. छँटाई के लिए लेबलिंग लक्ष्य प्रतिजन पेप्टाइड्स
    1. उत्पन्न या एक टर्मिनल बायोटिन के साथ लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट पेप्टाइड्स प्राप्त (अप करने के लिए 70 अवशेषों लंबे)।
    2. प्रत्येक व्यक्ति बायोटिनेलेटिड पेप्टाइड के लेबल 4 एनमोल को अलग-अलग ट्यूबों में स्ट्रेप्टविडकेन सहसंयोजक रूप से पीई (आर-फाइकोरिथ्रिन) या एपीसी (एलोफिकोसाइनिन) से जुड़ा हुआ है। स्ट्रेप्टाविडिन (एसए) के लिए 9:1 पेप्टाइड के मोलर अनुपात का उपयोग करके तैयार की, एसए-पीई के लिए लगभग 3.2 डिग्री सेल्सियस और 5.7 डिग्री एसए-एपीसी के लिए अंतिम सांद्रता के साथ। बायोटिन टेट्रामर को एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में तैयार की।
    3. प्रत्येक पेप्टाइड मिश्रण रात भर इनक्यूबेट, अंधेरे में, धीमी गति से मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    4. पॉलीऐक्रिलमाइड मोती युक्त माइक्रोकॉलम के माध्यम से लेबल पेप्टाइड्स पारित करके असीमित फ्लोरोफोर निकालें।
    5. पेप्टाइड टेट्रामर को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने तक स्टोर करें।

2. सेल छंटनी

  1. CD22+ अलगाव से पहले कम से कम 1 h से 16 h तक, दाता PBMCs thaw और 37 डिग्री सेल्सियस पर आराम करने के लिए अनुमति देते हैं।
    1. फ्रीजर से जमे हुए PBMCs की शीशियों निकालें और तुरंत एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान करने के लिए स्थानांतरण। जब शीशियों लगभग thawed रहे हैं, कार्य क्षेत्र के लिए स्थानांतरण.
    2. प्रत्येक शीशी की सामग्री को एक 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें प्रीवार्म्ड माध्यम होता है (दानदाताओं को अलग रखना)। 50 एमएल के अंतिम खंड में माध्यम जोड़ें. धीरे से सामग्री मिश्रण.
    3. कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए 370 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट को छोड़ दें, आरपीएमआई पूर्ण माध्यम के 15 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और एक सेल गिनती करें।
    4. RPMI पूर्ण माध्यम के साथ 2.0 x 107 कोशिकाओं/एमएल के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें, और कम से कम 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक T75 फ्लास्क या बड़ा और इनक्यूबेट करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए कम से कम 1 एच और अप करने के लिए 16 एच thawed कोशिकाओं के लिए वसूली समय की अनुमति देने के लिए।
    5. कोशिकाओं को एकत्र करें (यदि वांछित हो तो पूलिंग) और अपकेंद्रित्र 370 x g पर 6 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। supernatant छोड़ें और बर्फ ठंड एमएएक्स बफर के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (पीबीएस, पीएच 7.6 0.5% बीएसए और 2 एमएम EDTA युक्त), एमएएक्स बफर के साथ 50 एमएल लाने के लिए और एक सेल गिनती प्रदर्शन।
    6. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    7. CD22+ B कक्षों को CD22 microbeads पर कैप्चर के माध्यम से सकारात्मक चयन द्वारा अलग करें. सभी washes के लिए MACS बफ़र का प्रयोग करें. गणना और अपकेंद्रित्र 400 x g के लिए 7 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस. अपेक्षित वसूली कुल पीबीएमसी आबादी का 5-10% है।
    8. 40 लाख प्रति एमएल FACS बफर पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित (Tris बफर, पीएच 8.0 युक्त 0.5% बीएसए और 2 एमएम EDTA) और व्यक्तिगत रूप से या एक पूल के रूप में दाताओं के सेल धुंधला के साथ आगे बढ़ना.
  2. स्मृति बी सेल छँटाई के लिए दाग कोशिकाओं
    1. साइटोमीटर सेट अप के लिए कोशिकाओं की एक एलिकोट निकालें और इस्तेमाल किए गए लेबलिंग फ्लोरोफोर्स में से प्रत्येक के लिए मुआवजे। बिना दाग वाले कक्षों को नियंत्रण के रूप में शामिल करें.
    2. CD22 की संख्या के लिए अंतिम धुंधला मात्रा की गणना+ कोशिकाओं प्राप्त (2 मिलियन प्रति 100 $L दाग).
    3. बी कोशिकाओं के लिए extracellular मार्करों जोड़ें (CD19-PerCP-Cy5.5), आईजीजी (IgG-FITC), और स्मृति डिब्बे (CD27-PECy7) निर्माताओं की कमजोर पड़ने सिफारिशों के अनुसार, और धीरे मिश्रण. अलीकोट 107 कोशिकाओं नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक 1.5 एमएल ट्यूब में और एक 15 एमएल ट्यूब के लिए शेष कोशिकाओं को स्थानांतरित.
    4. दोहरी लेबल biotin-SA tetramers नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब के लिए 36 एनएम प्रत्येक पीई के लिए एक अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और APC सॉर्ट ट्यूब में पेप्टाइड्स की संख्या से गुणा और मात्रा लाने के लिए 0.5 एमएल अंतिम FACS बफर के साथ (उदाहरण के लिए, 10 पेप्टाइड्स x 36 nM $360 एनएम).
    5. पेप्टाइड tetramers पर सॉर्ट ट्यूब के लिए जोड़ें 36 एनएम पीई और APC के लिए प्रत्येक और टीबीएस बफर के साथ 2x106 प्रति 100 $L करने के लिए कोशिकाओं को लाने के लिए. अंधेरे में और 30-60 मिनट के लिए कोमल रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस, 400 x ग्राम, 7 मिनट पर 2x धो लें, पिछले धोने से पहले गिनती करने के लिए एक alicot को हटाने। 5 एमएल फिल्टर कैप ट्यूबों का उपयोग कर कोशिकाओं को फ़िल्टर करें। DAPI जोड़ें (4',6-diamidino-2-phenylindole) दाग करने के लिए 0.3 $M अंतिम एकाग्रता सिर्फ कोशिका झिल्ली अखंडता के एक मार्कर के रूप में छँटाई करने से पहले.
  3. प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से एकल सेल छँटाई
    1. छँटाई के लिए 96-वेल पीसीआर प्लेटों के 48 कुओं को तैयार करें।
      1. एक मास्टर मिश्रण तैयार करें: प्रति नमूना 10x आरटी बफर का 2 डिग्री एल, आरNase अवरोध करनेवाला का 0.5 डिग्री सेल्सियस, बाँझ पीसीआर-ग्रेड पानी का 7.5 डिग्री एल। Alicot 10 $L प्रति अच्छी तरह से, कवर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक तरह के लिए तैयार है.
    2. पूरे नमूने का विश्लेषण करते हुए, कक्ष सॉर्टर पर नकारात्मक नियंत्रण चलाएँ.
      1. एकल सेल छँटाई के लिए उपयुक्त सेल आबादी को अलग करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वार सेट करें।
        1. प्लॉट FSC क्षेत्र बनाम एसएससी क्षेत्र और सेट गेट R1 लिम्फोसाइटों को अलग करने के लिए।
        2. प्लॉट FSC ऊंचाई बनाम FSC चौड़ाई और सेट गेट R3 FSC doubts को बाहर करने के लिए।
        3. प्लॉट एसएससी ऊंचाई बनाम एसएससी चौड़ाई और सेट गेट R4 एसएससी doubts को बाहर करने के लिए।
        4. प्लॉट एसएससी ऊंचाई बनाम DAPI और लाइव सेल कोअलग करने के लिए गेट R5 सेट (DAPI -)।
        5. प्लॉट IgG बनाम CD19 और सेट गेट R6 IgG+ बी कोशिकाओं को अलग करने के लिए (CD19+ आईजीजी+).
        6. प्लॉट IgG बनाम CD27 और सेट गेट R7 स्मृतिबी कोशिकाओं का चयन करने के लिए (CD27 उच्च).
        7. प्लॉट Antigen-PE (Ag-PE) बनाम प्रतिजन-APC (Ag-APC) और सेट गेट R8 एक एजी-पीई के रूप में+/
    3. प्रतिजन-सकारात्मक से स्मृति कोशिकाओं की एक समान संख्या लीजिए (Ag+) शोर करने के लिए संकेत के निर्धारण के लिए नमूना.
    4. फेनोटाइप CD19+ CD27+ Ag-PE+ Ag-APC+ (गेट R8) तैयार 96-वेल PCR प्लेट्स में होने वाले एकल कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें।
    5. एल्यूमीनियम टेप पैड के साथ कवर प्लेटें, 400 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए centrifuge, और भविष्य क्लोनिंग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.

3. सिंगल सेल क्लोनिंग

  1. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं
    1. एकल बी सेल सॉर्ट प्लेट को 80 डिग्री सेल्सियस से निकालें। 2 मिनट के लिए बर्फ पर Thaw. खोलने से पहले कुओं के नीचे पूल सामग्री के लिए 3,300 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए थाली स्पिन.
    2. रिवर्स प्राइमर के रूप में 10% गैर-आयनिक डिटर्जेंट और ओलिगो (डीटी) के साथ एक डीएनटीपी/बफर मास्टर मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक अच्छी तरह से एक सेल युक्त करने के लिए एंजाइम मिश्रण जोड़ें और मिश्रण नहीं है.
    3. 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट 5 मिनट। एंजाइम मास्टर मिश्रण जोड़ें जिसमें 100 एमएम डीटीटी, आरनेस अवरोधक, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस एंजाइम शामिल हैं ताकि कुल मात्रा को 20 डिग्री सेल्सियस तक लाया जा सके। 50 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, फिर 80 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट।
    4. पीसीआर कदम शुरू करने से पहले बर्फ के लिए स्थानांतरण
  2. बहु कदम नेस्टेड PCR प्रतिक्रियाओं
    1. उपयोग अलग नेस्टेड PCR प्रतिक्रियाओं भारी श्रृंखला (HC) और प्रकाश श्रृंखला (एलसी) प्रवर्धन के लिए उपयोग किया जाता है.
    2. PCR प्रवर्धन के पहले दौर के लिए (चरण I), आगे प्राइमर और एक एकल रिवर्स प्राइमर का एक पूल का उपयोग करने के लिए अलग पीसीआर प्रतिक्रियाओं में एचसी और एलसी चर क्षेत्रों बढ़ाना (चित्र2). डिजाइन के अनुसार, आगे प्राइमर का पूल जर्मलाइन लीडर (एल) अनुक्रमों का एक बड़ा प्रतिशत बढ़ाना होगा और रिवर्स प्राइमर प्रत्येक श्रृंखला के डाउनस्ट्रीम स्थिरक्षेत्रों के लिए विशिष्ट है, जिसमें प्रकाश श्रृंखला ओंकार 16 के लिए कप्पा (जेड) और लैम्ब्डा (जेड) दोनों शामिल हैं।
      1. प्रत्येक PCR (चरण I) प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में cDNA उत्पाद के 2.5 $L का उपयोग करें. प्रत्येक के लिए 1 डिग्री सेल्सियस की अंतिम प्रतिक्रिया एकाग्रता के लिए प्राइमर जोड़ें। 2x सांद्रता के लिए 10x polymerase बफर डबल, प्रतिक्रिया प्रति 25 डिग्री सेल्सियस के लिए अंतिम मात्रा ले आओ। 50 चक्रों के लिए ख्94 डिग्री सेल्सियस/4 मिनट; 94 डिग्री सेल्सियस/15 s, 55 डिग्री सेल्सियस /20 s, 68 डिग्री सेल्सियस/60 s; 68 डिग्री सेल्सियस/3 मिनट का उपयोग करके एचसी पीसीआर प्रतिक्रियाओं को चलाएं। 50 चक्रों के लिए $98 डिग्री सेल्सियस/4 मिनट; 98 डिग्री सेल्सियस /15 s, 72 डिग्री सेल्सियस /20 s, 72 डिग्री सेल्सियस/60 s; 72 डिग्री सेल्सियस/3 मिनट का उपयोग करके एलसी पीसीआर प्रतिक्रियाओं को चलाएं।
    3. प्रत्येक (चरण II) PCR प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में चरण I उत्पाद के 2.5 $L का उपयोग करें. एचसी और एलसी (जेड और जेड) फ्रेमवर्क 1 क्षेत्र के लिए विशिष्ट आगे प्राइमर का पूल जोड़ें और प्रत्येक एंटीबॉडी श्रृंखला के जंक्शन क्षेत्र के लिए विशिष्ट रिवर्स प्राइमर का एक पूल जोड़ें। 2x एकाग्रता के लिए 10x polymerase बफर डबल, और पीसीआर प्रतिक्रियाओं 50 चक्र प्रत्येक चरण मैं के रूप में एक ही पैरामीटर का उपयोग कर चलाते हैं।
    4. सकारात्मक प्रवर्धन हिट कल्पना करने के लिए 1% agarose जेल पर पूरा PCR प्रतिक्रियाओं चलाएँ. युग्मित amplicons पुनर्प्राप्त करें (एक ही सेल से दोनों भारी और प्रकाश श्रृंखला) और जेल निष्कर्षण के माध्यम से अलग. सटीक लिगेशन मिश्रण गणना के लिए OD260 के माध्यम से डीएनए टुकड़ा एकाग्रता का निर्धारण।
    5. एक लिंकर टुकड़ा और अभिव्यक्ति वेक्टर रीढ़ की हड्डी के साथ बरामद भारी और प्रकाश श्रृंखला टुकड़े का मिश्रण एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर एक 4-खंड लिगेशन प्रतिक्रिया का उपयोग कर।
    6. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर रासायनिक सक्षम बैक्टीरिया में लिगेशन प्रतिक्रियाओं रूपांतरण। एंटीबायोटिक प्लेटों पर चढ़ाया जाने के बाद, शेष परिवर्तन संस्कृति में 4 एमएल विकास मीडिया (एंटीबायोटिक के साथ) जोड़ें, और 250 आरपीएम पर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेट करें। यह "लिगेशन मिक्स कल्चर" है।
    7. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर रात भर लिगिंग मिश्रण संस्कृतियों से miniprep डीएनए तैयार है, और जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड डीएनए एकाग्रता का निर्धारण।

4. Antigen-विशिष्टता की पुष्टि के लिए एलिसा स्क्रीन

  1. 10 एमएल निलंबन 293 कोशिकाओं में धनायनी लिपिड आधारित अभिकर्मक के साथ मिनीप्रेप डीएनए के 10 डिग्री ग्राम, और 3-4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (8% सीओ2) पर घूर्णन करते समय 125 आरपीएम पर घूर्णन करते समय इनक्यूबेट। फसल के लिए, अपकेंद्रण संस्कृति 10 मिनट पर 1,000 x ग्राम और ठीक स्पष्ट मीडिया.
    1. प्रोटीन ए के लिए आत्मीयता के माध्यम से supernatants में आईजीजी एकाग्रता को मापने.
    2. प्रत्येक आईजीजी (सुपरनेंट में) एंजाइम से जुड़े adsorbent परख (ELISA) सॉर्ट के लिए इस्तेमाल किया व्यक्तिगत पेप्टाइड्स के खिलाफ द्वारा 20 g/mL पर परीक्षण, एक streptavidin प्लेट पर कब्जा कर लिया या एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में actin. पुनः संयोजक क्लोन का पता लगाने के लिए मानव आईजी जी फैब के खिलाफ एक बकरी विरोधी मानव peroxidase माध्यमिक एंटीबॉडी का प्रयोग करें. पृष्ठभूमि के घटाव के बाद, ओडी और 0.5 स्क्रीन सकारात्मक के रूप में परिभाषित किया गया है।
    3. एक अतिरिक्त ELISA प्रदर्शन करके स्क्रीन सकारात्मक हिट की पुष्टि करें, IgG supernatant के कमजोर पड़ने का उपयोग कर एक एकाग्रता वक्र से शुरू करने के लिए 20 डिग्री ग्राम प्रति एमएल, और प्रारंभिक स्क्रीन ELISA में reactivity दिखा प्रत्येक प्रतिजन के लिए OD के खिलाफ साजिश रचने.

Representative Results

इस विधि मानव दाताओं से प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी को अलग करने के लिए एक बहु कदम प्रक्रिया को शामिल किया गया. यहाँ दिखाए गए प्रतिनिधि डेटा में, कोशिकाओं को प्रवाही लेबल पेप्टाइड्स के एक पूल के साथ incubated थे ताऊ प्रोटीन के कई अलग अलग डोमेन का प्रतिनिधित्व, फॉस्फोरीलेटेड पेप्टाइड्स सहित putative फॉस्फोरिलेशन साइटों की नकल करने के लिए. इन पेप्टाइड्स के रूप में इस्तेमाल किया गया "बैट" ब्याज की tau epitopes (ओं) के साथ प्रतिक्रियाशील हैं कि कोशिकाओं की पहचान करने के लिए. छँटाई के लिए तैयारी में, फ्लोरोसेंट लेबल phenotypic मार्करों के एक पैनल को समृद्ध बी सेल आबादी के भीतर विभिन्न सेल आबादी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया. साइटोमेट्री फाटकों की एक श्रृंखला लक्ष्य स्मृति बी कोशिकाओं को अलग करने के लिए तैयार की गई थी (चित्र 1)। लिम्फोसाइट्स को उनके सेल आकार और दानेदारता के आधार पर आगे तितर बितर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) के भूखंडों का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री6,7में अलग किया गया था। कई कोशिकाओं के बहिष्करण के बाद ("डबल्स") और मृत कोशिकाओं, phenotypic मार्करों IgG के अलगाव की अनुमति दी+ स्मृति बी कोशिकाओं IgG के माध्यम से, CD19 (बी सेल) और CD27 (स्मृति). इस दृष्टिकोण में, CD27 मार्कर दो असतत आबादी में वितरित नहीं करता है, इसलिए CD27 के शीर्ष 45%+ व्यक्त कोशिकाओं अंतिम गेट के लिए शामिल किए गए हैं. अंत में, कोशिकाओं को डबल सकारात्मक दोनों APC और पीई फ्लोरोफोर्स के लिए गैटिंग ग्राफ के ऊपरी दाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग में वितरित, पेप्टाइड्स के दोनों लेबल संस्करणों के लिए प्रतिक्रिया का संकेत. तैयार गेट के भीतर गिर कोशिकाओं को अलग और एक 96 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में हल किया गया. दो अलग अलग लेबल के साथ प्रतिजन का उपयोग संकेत से शोर अनुपात बढ़ जाती है और बाद में आणविक जीव विज्ञान की प्रक्रिया में झूठी सकारात्मक की संख्या कम कर देता है. हल किए गए कक्ष अंतिम गेट में स्मृति B कक्षों के लगभग 0.1% और प्रारंभिक कक्ष नमूने के 0.001% का प्रतिनिधित्व करते हैं.

एकल कोशिका क्लोनिंग का पहला रीडआउट संबंधित भारी एवं प्रकाश चर शृंखलाओं के प्रवर्धन की पुष्टि है (चित्र 2)। दोनों amplicons की बनती वसूली वांछित है के बाद से, पीसीआर प्रतिक्रियाओं agarose जेल पर साथ-साथ मूल्यांकन कर रहे हैं, और मिलान जोड़े जेल और डीएनए निकाले टुकड़े से excised हैं। प्रवर्धन की विशिष्ट दक्षता 30-50% भारी श्रृंखला और 50-70% प्रकाश (कपा) श्रृंखला है। युग्मित amplicons की वसूली आमतौर पर 25-40% दक्षता के बीच है. ये दक्षताएँ दाता पूलकेण्ड के बीच भिन्न होती हैं, और प्रतिनिधि डेटा (चित्र 3) 24 एकल कोशिकाओं (42% युग्मित पुनर्प्राप्ति) से बहुत ही कुशल प्रवर्धन का एक उदाहरण है। आईजीजी क्लोनिंग के बाद, आईजीजी अभिव्यक्ति वेक्टर मानव भ्रूण गुर्दे (HEK-293) निलंबन कोशिकाओं, जो अभिव्यक्ति को अधिकतम करने के लिए उपयोग किया जाता है में transfected है। सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग पुनः संयोजक एंटीबॉडी प्रस्तुत से प्रोटीन contaminating कम कर देता है, और बाद में बाध्यकारी assays में शोर को कम करने में मदद करता है. बरामद एंटीबॉडी ताऊ पेप्टाइड्स के मूल पैनल के खिलाफ जांच कर रहे हैं और ELISA द्वारा प्रतिक्रिया के लिए रन बनाए (चित्र 4) . ओडी की प्रारंभिक सीमा - 0ण्5 पृष्ठभूमि के ऊपर का उपयोग सकारात्मक प्रतिजन प्रतिक्रिया को इंगित करने के लिए किया जाता है, और गैर-विशिष्ट बाइंडिंग के लिए नियंत्रण के रूप में जेड-एक्टिन प्रोटीन का उपयोग किया जाता है। प्रवाह cytometry और छँटाई कदम पेप्टाइड्स का एक मिश्रित पूल का उपयोग करते हैं, स्क्रीनिंग एलिसा बरामद IgGs के विशिष्ट reactivities deconvoluting का पहला कदम है. 10 IgGs परख के तीन फॉस्फोरीलेटाहुआ CBTAU22.1 पेप्टाइड के खिलाफ प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया, और एक गैर phosphorylated CBTAU27.1 के लिए प्रतिक्रियाशील था (चित्र 4ए). अतिरिक्त पुष्टि प्रारंभिक स्क्रीन में पहचान पेप्टाइड्स के खिलाफ एक ही रिकॉमबिनेंट एंटीबॉडी नमूने की एक एकाग्रता वक्र का उपयोग कर पूरा किया गया था, और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक अतिरिक्त पेप्टाइड (चित्र 4बी).. प्रत्येक सकारात्मक हिट के लिए, एक व्यक्ति प्लाज्मिड क्लोन रूपांतरित पूल से अलग किया गया था और एक ही ELISA विधि द्वारा reconfirmed. केवल क्लोन 34 प्रस्तुत डेटा दिखाया गया है, और जबकि गैर phosphorylated CBTAU27.1 के लिए प्रतिक्रिया की पुष्टि की गई थी, कम आत्मीयता बाइंडिंग भी फॉस्फोरीलेटिड 27.1 पेप्टाइड के साथ मनाया गया था (चित्र 4ब्) .

Figure 1
चित्र 1 : प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से प्रतिजन-प्रतिक्रियाशील एकल कोशिकाओं का अलगाव। (ए) दिखाया गया एक प्रतिनिधि भूखंड है जहां लिम्फोसाइट जनसंख्या तैयार गेट के भीतर निहित थी। (B) आगे और साइड स्कैटर पर आधारित गेट्स (FSC-height v FSC-width (R3); एसएससी- ऊंचाई v SSC- चौड़ाई (R4) doubts को बाहर करने के लिए इस्तेमाल किया गया. बाद के भूखंडों में केवल तैयार फाटकों के भीतर कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया था। DAPI+ कोशिकाओं मृत और बाहर माना जाता था (R5). इस प्रयोग में, 3.7 x 107 "लाइव" कोशिकाओं से पूछताछ की गई. जीवित कोशिकाओं के बहुमत बी कोशिकाओं (CD19+थे), और आईजीजी+ कोशिकाओं (4.66%) इस आबादी (R6) से अलग थे. CD27 के शीर्ष 43.2%+-expressing स्मृति कोशिकाओं चयन गेट (R7) में शामिल किए गए थे. (ग) क्वाड्रेंट 2 (क्यू 2) में दोनों लेबल किए गए एंटीजन (पेप्टाइड-एपीसी वी पेप्टाइड-पीई) के प्रति प्रतिक्रियाशील कोशिकाएं निहित थीं, और इन कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट में अलग-अलग सॉर्ट किया गया था और उन्हें अलग-अलग बरामद किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : पीसीआर प्रवर्धन क्लोनिंग के लिए आईजीजी भारी और प्रकाश चर अनुक्रम ठीक हो। (ए) भारी (वीएच) और प्रकाश (वीके या Vl) शृंखला चर क्षेत्र ों को नेस्टेड पीसीआर अभिक्रियाओं का उपयोग करके वसूल किया जाता है। कदम मैं प्राइमर देशी नेता अनुक्रम से आगे बढ़ाना और निरंतर क्षेत्र के भीतर से रिवर्स. एकाधिक तीर 7-12 प्राइमर के बीच के एक पूल का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसका उपयोग संभावित germlines की व्यापक कवरेज सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है। चरण II प्राइमर नेस्टेड होते हैं, जो चर ओपन रीडिंग फ़्रेम के चरम सिरों के लिए विशिष्ट होते हैं, और अभिव्यक्ति वेक्टर में सन्निकट अनुक्रम के लिए समजात हैं जो amplicons के सिरों पर अनुक्रम जोड़ते हैं। (बी) लिंकर में निरंतर प्रकाश श्रृंखला (सी.के. या सीएल) होती है, जिसके बाद भारी श्रृंखला प्रवर्तक और एक गैर-नेटिव सिग्नल पेप्टाइड अनुक्रम होता है। amplicons, linker, और प्लाज्मिड रीढ़ एक साथ चरण द्वितीय पीसीआर प्रवर्धन के दौरान उत्पन्न ओवरलैपिंग समजात अनुक्रम के माध्यम से ligated रहे हैं, और एक बरकरार प्लाज्मिड के रूप में अलग. अंतिम अभिव्यक्ति वेक्टर में रिकॉमबिनेंट भारी और प्रकाश श्रृंखला स्वतंत्र द्वारा संचालित कर रहे हैं (और समान) CMV प्रमोटरों, और अलग प्रोटीन के रूप में अनुवाद कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : आईजी भारी और प्रकाश चर श्रृंखला amplicons एकल कोशिकाओं से बरामद कर रहे हैं. नेस्टेड पीसीआर प्रतिक्रियाओं (चरण द्वितीय) सीधे पर लोड किया गया 1% agarose जेल और कल्पना. भारी श्रृंखला (एच) और कप्पा प्रकाश श्रृंखला (एल) एक ही सेल से पीसीआर प्रतिक्रियाओं आसन्न कुओं में लोड किया गया तो युग्मित amplicons आसानी से देखा गया. सफल भारी और प्रकाश श्रृंखला उत्पादों के मोटे तौर पर कर रहे हैं 400 बीपी और 350 बीपी क्रमशः. युग्मित amplicons के सफल वसूली एक (*) द्वारा निरूपित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : Antigen विशिष्टता पुनः संयोजक IgGs से पुष्टि की है. बरामद भारी और प्रकाश श्रृंखला दृश्यों युक्त Plasmids अभिव्यक्ति के लिए एचईके कोशिकाओं में transfected हैं। चार दिनों के बाद, रिकॉमबिनेंट एंटीबॉडी ELISA द्वारा प्रतिक्रिया के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. (क) स्पष्ट मीडिया में आईजीजी सांद्रता को मापा गया था और इसे 20 ग्राम/ छँटाई के लिए इस्तेमाल पेप्टाइड्स के पूल व्यक्तिगत रूप से streptavidin प्लेटों में अच्छी तरह से प्रति 40 pmol का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया. सभी आईजीजी डुप्लिकेट कुओं में परीक्षण किया गया. (बी) क्लोन कि OD450 माप प्रदर्शित किया गया और 0.5 स्क्रीन में पहचान पेप्टाइड्स के खिलाफ 1:5 कमजोर पड़ने चरणों का उपयोग कर (क्लोन #32, #34, #35) फिर से मूल्यांकन किया गया. (ग) एक बार एक हिट के रूप में पुष्टि की, एक एकल प्लाज्मिड क्लोन क्लोन से अलग किया गया था #34 बदल ligations, transfected, और ELISA द्वारा reconfirmed. एक ही क्लोन #32 और #35 (डेटा नहीं दिखाया) के लिए किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत विधि प्रवाह साइटोमेट्री और एकल कोशिका क्लोनिंग को जोड़ती है, और हम यहाँ का वर्णन तरीकों हम पहले टिलर और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित तरीकों के आधार पर11. उनके काम में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की वसूली और क्लोनिंग का वर्णन किया गया है ताकि व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्तर पर मनुष्यों में बी सेल प्रदर्शनों का अध्ययन किया जा सके। हम उनकी प्रक्रिया के प्रमुख घटकों को अनुकूलित किया है स्मृति बी कोशिकाओं की आबादी से प्रतिजन-विशिष्ट monoclonal एंटीबॉडी की वसूली की अनुमति देने के लिए, बहु कदम प्रवर्धन प्राइमर रणनीति सहित. प्रमुख संशोधन लेबल प्रतिजन "बैट" के अलावा है. अतिरिक्त अनुकूलन प्रकाशित प्रोटोकॉल के लिए किया गया है, सहित (लेकिन सीमित नहीं) एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में क्लोनिंग वेक्टर रीढ़ को संशोधित करने, germline प्रदर्शनों के अतिरिक्त प्राइमर कवरेज (दोनों नेता अनुक्रम और रूपरेखा 1), उच्च अभिव्यक्ति के लिए निलंबन HEK293 कोशिकाओं के transfection, और पीसीआर प्रवर्धन के दौरान उच्च निष्ठा polymerases का उपयोग करें।

यहाँ वर्णित विधियों के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रवाह साइटोमेट्री और एकल सेल क्लोनिंग के बीच संक्रमण के पास हैं। सबसे पहले, प्लेट में हल एकल कोशिकाओं की उचित नियुक्ति आवश्यक है. सॉर्टर पर ड्रॉप-देरी सही तरीके से सेट करना एक महत्वपूर्ण चरण है. पर्यावरण कारकों, जैसे कम आर्द्रता, भी ध्यान में रखा जाना चाहिए, के रूप में हम अपनी वसूली क्षमता काफी गिरावट पाया है जब तक एक स्थिर बंदूक लक्ष्य सॉर्ट प्लेटों पर प्रयोग किया जाता है. सेल प्लेसमेंट के बाद, प्लेटें यह सुनिश्चित करने के लिए centrifuged हैं कोशिकाओं कुओं के नीचे बफर के 10 डिग्री एल से संपर्क किया है. इन उपायों के सभी आणविक जीव विज्ञान भाग के लिए महत्वपूर्ण हैं सफल होने के लिए. यदि शर्तें किसी एकल सेल की रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के लिए उप-अनुकूल हैं, तो पीसीआर प्रवर्धन भी $-actin का उपयोग मुश्किल हो सकता है। प्रस्तुत विधि की ताकत कोशिकाओं के लाखों लोगों से पूछताछ करने की क्षमता है और केवल पसंद के प्रतिजन के खिलाफ प्रतिजन प्रतिक्रिया मानदंड से मेल खाते हैं कि लोगों को सॉर्ट. यह शोर अनुपात करने के लिए संकेत की आवश्यकता के रूप में संभव के रूप में उच्च हो, जो छँटाई से पहले चारा सांद्रता के अनुकूलन द्वारा किया जाता है. दोहरी लेबल चारा झूठी सकारात्मक कोशिकाओं की वसूली को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो हो सकता है अगर फ्लोरोफोर्स में से एक उच्च पृष्ठभूमि है. एक से अधिक प्रतिजन चारा का उपयोग संकेत कर सकते हैं: शोर अनुकूलन और अधिक कठिन है, लेकिन एक साथ कई पेप्टाइड्स पूछताछ करने की क्षमता इस विधि का एक और लाभ है.

जब पुनर्प्राप्ति क्षमता कम होती है, तो यह पुष्टि करने के लिए नेस्टेड जेड-एक्टिन प्राइमर का एक सेट उपयोग किया जाता है कि टेम्पलेट cDNA मौजूद है. इस दृष्टिकोण के लिए दोष यह है कि यह निर्धारित करने के लिए कि क्या वहाँ अच्छी तरह से या रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में कोई सेल मौजूद नहीं था विफल रहा है, समस्या निवारण मुश्किल बना रही है. कभी-कभी विपरीत हो जाएगा और क्षमता अपेक्षा से अधिक होती है। भारी श्रृंखला के लिए विशिष्ट वसूली के बीच है 30-45% और प्रकाश श्रृंखला अधिक हैं, के बीच 40-60%. प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया (चरण मैं और द्वितीय) एक एकल सेल से बढ़ाना करने के लिए 50 चक्र का उपयोग करता है। कुल चक्र की उच्च संख्या भी इस विधि संदूषण के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है. amplicons के अनुक्रम विश्लेषण एक संदूषक शुरू किया गया है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या एक असामान्य रूप से उच्च वसूली दर वैध रूप से प्राप्त किया गया है.

पसंद के एक प्रतिजन के खिलाफ देशी मानव एंटीबॉडी ठीक करने के लिए इस विधि की उपयोगिता कई महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. सबसे पहले, केवल घुलनशील प्रोटीन है कि लेबल किया जा सकता है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है "बैट" प्रवाह cytometry के लिए. प्रतिनिधि परिणामों में प्रस्तुत प्रकार के लिए, हम ताओ प्रोटीन से संश्लेषित ओवरलैपिंग पेप्टाइड्स की एक श्रृंखला का इस्तेमाल किया, पूरे प्रोटीन का उपयोग कर के बाद से मुश्किल साबित कर दिया. रैखिक पेप्टाइड्स का उपयोग इष्टतम नहीं है, क्योंकि यह गैर रेखीय या संरचनात्मक एपिटोप के खिलाफ एंटीबॉडी की पहचान को सीमित कर सकता है। तथापि, हम ताऊ के विरुद्ध अनेक विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने में सक्षम थे और ये वर्तमान में आगे मूल्यांकन8,9के दौर से गुजर रहे हैं । एक और सीमा आणविक जीव विज्ञान वसूली और IgGs की क्लोनिंग के कम थ्रूपुट है. प्रारंभिक छँटाई रणनीति कोशिकाओं के लाखों लोगों की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है, लेकिन बाद में आणविक जीव विज्ञान प्रसंस्करण कई चरणों के होते हैं. चल रहे अनुकूलन के लिए नए प्रौद्योगिकियों को शामिल करने के प्रयास, गिब्सन विधानसभा10 के रूप में कई कदम सुव्यवस्थित है, लेकिन बाधा व्यक्तिगत भारी और प्रकाश श्रृंखला जोड़े क्लोनिंग बनी हुई है.

"BSelex" विधि प्रतिजन प्रतिक्रिया प्रदर्शित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए स्मृति बी कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त बीसीआर का इस्तेमाल करता है, और फिर प्रवाह साइटोमेट्री11,12के माध्यम से इन अलग-अलग कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें। बीसीआर पर इस निर्भरता के कारण, विधि स्मृति बी सेल डिब्बे तक ही सीमित है, और प्लाज्मा ब्लास्टकेरूप जैसे एंटीबॉडी स्रावित कोशिकाओं (एएससी) को कैप्चर नहीं करता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण ASCs की तुलना में प्रतिजन-विशिष्ट इम्यूनोग्लोबिन की एक व्यापक प्रदर्शनों को ठीक करने के लिए फायदेमंद हो सकता है. इन्फ्लुएंजा टीकाकरण अध्ययनों से पता चलता है कि जबकि प्रतिक्रियाशील ASCs विस्तारित बी सेल क्लोन की एक छोटी संख्या से प्रभुत्व किया जा सकता है, प्रतिजन विशेष स्मृति बी सेल आबादी शायद ही कभी क्लोन12है. टी कोशिकाओं की सतह पर टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) जीन व्यवस्था और पुनर्संयोजन में बी सेल रिसेप्टर के लिए समानता के पास विविधता को अधिकतम करने के लिए. यहाँ प्रस्तुत विधि में वर्णित है क्या करने के लिए इसी तरह एकल सेल दृष्टिकोण टी सेल प्रदर्शनों का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है, वसूली और अल्फा और बीटा चेन13के एकल सेल क्लोनिंग सहित . हालांकि, TCR मान्यता पेप्टाइड्स MHC अणुओं द्वारा प्रस्तुत किया जा करने की आवश्यकता है, पेप्टाइड-विशिष्ट टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए लेबल चारा दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण जटिलता जोड़ने. बी कोशिकाओं के विपरीत, टी कोशिकाओं पूरे चर क्षेत्र की आत्मीयता परिपक्वता से गुजरना नहीं है, इसलिए कम CDR3 क्षेत्र की पहचान और कुछ flanking अनुक्रम सब है कि पहचान और पुनर्गठन के लिए आवश्यक है. अंत में, इस विधि प्रवाह साइटोमिट्री का उपयोग आईजीजी अणुओं की पहचान का वर्णन करता है, लेकिन यह भी विभिन्न आइसोटाइप के बी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए वैकल्पिक phenotypic मार्करों का उपयोग करने के लिए संभव है।

वर्तमान में, एंटीजन विशिष्टता के कार्यात्मक विश्लेषण के साथ अगली पीढ़ी अनुक्रमण से एकत्र डेटा की भारी मात्रा को जोड़ने के लिए विकसित किए जा रहे हैं, लेकिन इन तरीकों को अभी भी परिष्कृत किया जा रहा है। अपनी सीमाओं के बावजूद, यहाँ वर्णित विधि दोनों संक्रामक और गैर संक्रामक रोगोंकेलिए संभावित चिकित्सीय मूल्य के साथ एंटीबॉडी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 8 ,14,15, और एक विश्वसनीय का प्रतिनिधित्व करता है बी कोशिकाओं या व्यापक सेल संस्कृति के व्यापक हेरफेर के बिना, मनुष्यों से प्रासंगिक एंटीजन-विशिष्ट IgGs ठीक करने के लिए दृष्टिकोण।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

लेखकों को कई विधि संशोधनों और वर्तमान BSelex मंच के शोधन के व्यापक परीक्षण के लिए लुसी Chammas, मार्था कोस्टा, जूली किम, नैन्सी Herdia, और जेरेमी Macedo शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter MoFlo cell sorting
Biotinylated peptides New England Peptide Cell sorting "bait"
Micro Bio-spin P30 gel column BioRad #7326223
Streptavidin (R-PE) Thermo Scientific SA10041
Streptavidin (APC) Thermo Scientific S32362
CD22 MicroBeads, human  Miltenyi #130-046-401
LS columns Miltenyi #130-042-401
Pre separation filters  Miltenyi #130-041-407
PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 BD Biosciences BD#340951
PE-Cy7 mouse anti-human CD27  BD Biosciences #560609
FITC mouse anti-human IgG BD Biosciences #560952
DAPI Life Technologies #D21490
RNaseOUT Life Technologies #10777-019
Bovine serum albumin, Fraction V Sigma #A4503
RPMI media Hyclone #SH30096.01
HI FBS (Fetal bovine serum) Invitrogen #10082147
Mastercycler Gradient Eppendorf Model #6325 PCR machine
PCR 96-well plates Phenix MPS-500
PCR Plate mats Phenix SMX-PCR96
Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix Clontech #639125
Superscript IV First-strand synthesis system Invitrogen #18091050
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Scientific F-531-L
Platinum polymerase Invitrogen #10966108
Nuclease-free water QIAGEN #129114
Oligonucleotide primers IDT assorted Primers for all PCR steps
Gel Extraction Kit QIAGEN #28706
PCR Purification kit QIAGEN #28106
Miniprep Kit QIAGEN #27106
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5520S Gibson assembly
Expi293 Expression Media Invitrogen #A14351-01
ExpiFectamine 293 Transfection Kit Invitrogen #A14525
Opti-MEM Media Invitrogen #31985070
CO2 incubator (Multitron)
Octet RED384 System Pall/ Forte Bio
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates Thermo Scientific #15500
Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area Corning #3690
Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody Jackson Labs #109-036-097
Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody Jackson Labs #115-035-072
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component)  KPL #52-00-03
TMB Stop Solution KPL #50-85-06

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References

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Perry, S. T., Keogh, E., Morton, M., Koudstaal, W., Pascual, G. Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations. J. Vis. Exp. (150), e59809, doi:10.3791/59809 (2019).

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