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방법 논문

라이브 셀에서 Fura-2-Analog를 이용한 세포내 Ca2+ 측정을 위한 새로운 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 보정 방법

5.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59881

⸱

2019년 9월 20일

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Ulsan College of Medicine/Asan Medical Center, 2Asan Medical Center, 3Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology

이 논문에서

요약

NADH 및 fura-2 유사체의 여기 및 방출 파장의 스펙트럼 중첩으로 인해[Ca2+]의 정량 적 측정 중에 라이브 셀의 두 화학 물질의 신호 간섭이 불가피합니다. 따라서, NADH 신호 간섭을 측정하는 새로운 온라인 보정 방법이개발되었다[Ca2+]

초록

[Ca2+]정량적으로 측정하기 위해 비메트릭 플루오로프로브인 fura-2 유사체가 자주 사용됩니다. 그러나, 염료 사용은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)로부터 주로 자가형광 간섭으로 인해 살아있는 세포에서 본질적으로 제한된다. 보다 구체적으로, 이것은 NADH의 대부분이 미토콘드리아에 있기 때문에 fura-2 유사체를 정량적으로 사용하여 미토콘드리아[Ca2+]를측정할 때 주요 장애물이다. 형광 염료 농도가 동일하면 특정 여기 강도가 동일한 방출 강도를 생성해야 합니다. 따라서, 두 개의 상이한 여기 파장의 방출 강도 비는 일정해야 한다. 이러한 원리에 기초하여, NADH 신호 간섭을 측정하는 새로운온라인 보정 방법이 개발되었으며, NADH 및 fura-2의 실제 신호 강도를 얻을 수 있다. 또한,[Ca2+]를계산하는 새로운 방정식은 400 nm에서 isosbestic 여기 또는 여기로 개발되었다. 이 방법을 사용하면 미토콘드리아 [Ca2+]의변화를 성공적으로 측정할 수 있습니다. 또한, 다른 일련의 여기 및 방출 파장의 경우, NADH,[Ca2+],및 pH 또는 미토콘드리아 막 전위(Θm)를포함하는 다중 파라미터를 동시에 측정할 수 있었다. 미토콘드리아[Ca2+] 및 Θm 또는 pH는 후라-2-FF 및 테트라메틸호다민 에틸 에스테르(TMRE) 또는 카르복시-세미나피-호르다플루오르-1(카르복시-SNARF-1)을 사용하여 측정하였다.

서론

세포 내 Ca2+의 중요한 역할은 널리 알려진1. [Ca2+]의정량화는 세포 생리 기능의 과정을 이해하는 데 필수적입니다. Fura-2 아날로그는 UV 범위(&400 nm)에서 흥분하기 때문에 매우 유용하며, 비율 측정 방법은 정량 측정에 적용될 수 있습니다. 따라서, pH, 막 전위 등과 같은 다른 생리학적 파라미터는 다른 형광 염료로 측정될 수 있다. 미토콘드리아Ca2+ 농도([Ca2+]m]범위는 0.08-20 μM2,3,4,5로알려졌다. fura-2 유사체 중에서 fura-2-FF는 [Ca2+]의 이 범위를 측정하는 데 적합합니다. 그러나, 살아있는 세포는 불행하게도 그들의 신진 대사 과정에 대한 NADH/NADPH를 포함하고, NADH는 fura-2 아날로그와 겹치는 여기 및 방출 스펙트럼 때문에 신호 간섭을 생성합니다. 이 간섭은 fura-2 유사체의 사용을 크게 제한합니다. 구체적으로, 유사체가 미토콘드리아[Ca2+]를측정하기 위해 적용되는 경우, NADH의 가장 높은 양이 미토콘드리아에 있기 때문에 이러한 간섭이 가장 큰 장애물이다. 이것은 NADH 변화가 미토콘드리아 막 전위(Θm)와관련이 있고 Θm의 변화가[Ca2+ ]m6,7,8에영향을 미치므로 더욱 복잡해져요. , 9. 또한,[Ca2+]m 역학을 공부하기 위해, NADH, Θm및 pH와 같은 다른 미토콘드리아 매개 변수의 상태를 아는 것이 필수적이다.

450 nm 및 500 nm에서의 방출은 353 nm, 361 nm 및 400 nm에서 NADH 및 fura-2-FF로부터의 신호를 포함하고, 수학식은 다음과 같다. 본 명세서에서, 353 nm 및 361 nm는 각각 450 nm 및 500 nm에서 배출을 위한 후라-2-FF의 이등산 지점이다.

F361,450 = F361,450, NADH + F361,450,후라 방정식 1
F353,500 = F353,500, NADH + F353,500,후라 방정식 2
F400,500 = F400,500, NADH + F400,500, 후라 방정식 3

여기서 Fx, y는 x-nm 여기, Fx, y, NADH는 순수한 NADH 의존 방출 강도를 나타내고, Fx, y, Fura는 순수한 후라-2-FF 의존 방출 강도를 나타냅니다. 형광 염료의 동일한 농도하에서, 특정 여기 강도는 동일한 방출 강도를 생성해야 한다. 따라서, 두 개의 상이한 여기 파장의 방출 강도 비는 일정해야 한다. Ca2+ 및 fura-2는 NADH 형광 특성에 영향을 미치지 않았다; 따라서 NADH의 450 nm 및 500 nm에서의 방출 비율은 임의의 여기 파장에서 일정하였다. 동일한 규칙은 NADH 또는[Ca2+]가후라-2-FF의 방출 및 여기 스펙트럼에 영향을 미치지 않는다는 가정에 기초하여 fura-2-FF에 사용될 수 있다. 그러나,Ca2+는 후라-2-FF 방출의 스펙트럼 변화를 일으켰다. 따라서Ca2 +의효과를 제거하려면Ca2 +와무관한 isosbestic 여기를 사용해야합니다. 각 방출 파장(즉, 450 nm 및 500 nm)은 상이한 isosbestic 포인트를 가지며, 우리의 실험 설정에서, 500 nm에서 353 nm 및 450 nm에서 361 nm이 선택되었다. 이 로부터 다음 방정식은 유효한10.

Rf = F361,450, 후라/ F353,500, 후라 방정식 4
RN1 = F400,500, NADH/F361,450, NADH 방정식 5
RN2 = F353,500, NADH/F361,450, NADH 방정식 6

이러한 상수의 경우 (수학식 1) 및 (수학식 3)의 다음 방정식이 유효합니다.

F361,450 = F361,450, NADH + Rf × F353,500, 후라 방정식 7
F353,450 = RN2 × F361,450, NADH + F353,500, 후라 방정식 8
F400,500 = RN1 × F361,450, NADH + F400,500, 후라 방정식 9

이러한 방정식으로부터, Rf,RN1및 RN2가 공지된 경우, NADH 및 fura-2의 순수한 신호는 다음과 같이 얻어질 수 있다.

F361,450,NADH = (F361,450 - RF × F353,500)/(1− RF ×R N2)방정식 10
F353,500,후라 = (RN2 × F361,450 - F353,500)/(RF × RN2 - 1) 방정식 11
F400,500,후라 = F400,500 - RN1 × F361,450, NADH 방정식 12
R후라 = F353,500, 후라/ F400,500, 후라 방정식 13

Ca2+-바운드 형태의 후라-2-FF는 400 nm 여기 파장에서 실질적으로 비형광이었다. 이 속성에 따라 다음과 같은 새 교정 방정식을 파생할 수 있습니다.

[Ca2+ +] = KD ∙ (F400,500, 최대/ F353,500, 최대)× (R후라 - R분)방정식 14

여기서Kd는 해리 상수, F400,500, 최대 및 F353,500, 최대는 각각 400 nm 및 353 nm에서 여기와 500 nm에서 방출 된 신호의 최대 값이며, Rmin은 Ca 2의 최소 RFura입니다. +- 무료 상태. 이소성 여기가 사용되었기 때문에, 방정식은 다음과 같이 더 단순화 될 수있다.

[Ca2+ +] = KD ∙ (1 / R분)∙ (R후라 - R분)방정식 15

따라서 [Ca2+]를 계산하려면 Kd 및 R최소 값만 필요합니다.

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프로토콜

모든 실험 프로토콜은 지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 솔루션 준비

  1. 단 하나 갓 고립된 심장 근세포11를준비하십시오.
    참고: 각 실험실에는 다른 세포 저장 솔루션이 있을 수 있습니다. 여기서, 근세포는 배양 배지(DMEM)에 저장된다.
  2. Ca2+-free 용액 100 mL을 준비하십시오(표 1).
  3. 50 mL 비커에 배양 배지 50 mL을 준비합니다. Aliquot 5 mL및 37°C에서 수조에 넣습니다. 남은 용액을 실온에서 유지하십시오.
  4. 50 mL의 사포닌을 50 mL의 Ca2+-free 용액에 추가하여 사포닌 용액 50 mL을 준비하십시오.
    참고 : 사포닌은 심장 근세포를 투과시키고, 세포실 구획을 제거하고, 미토콘드리아 형광만을 시각화하는 데 사용됩니다.
  5. 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해된 1mM의 후라-2-FF-AM 16 μL을 준비한다.
    참고: DMSO에 용해된 후라-2-FF-AM의 1mMM 스톡 용액을 2mL 튜브에 16 μL로 만듭니다. 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
  6. NADH 프리Ca2+-무첨가 용액 50 mL을 준비(표 1)및 NADH 프리Ca2+-포화 용액 50 mL(표 1)때 등변 점을 측정한다. KOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정합니다.
    참고: NADH 프리Ca2+-free 용액(표 1)에는미토콘드리아에서 NADH를 최소화하기 위해 미토콘드리아 기질없이 10 μM FCCP 및 100 μM ADP가 포함되어 있습니다.
  7. NADH 보정 인자 측정에 사용할 50 mL의Ca2+-free 솔루션, 50 mL의 말레이트 용액, 50 mL의 말레이트-피루바트 용액 및 50 mL의 로테네 용액을 준비합니다(표1).

2. 미토콘드리아에 플루오로프로브 로딩 절차

  1. 배양 배지의 2 mL을 1mM fura-2-FF-AM의 16 μL에 첨가하여 염료 로딩 용액을 준비한다.
    참고: 형광 염료는 빛 아래에서 깨지기 쉽습니다. 사용 직전에 솔루션을 준비하십시오. 형광염료를 함유한 용액을 어두운 곳에 보관하십시오. 후라-2-FF-AM의 최종 농도는 8 μM이다. 카복시-SNARF-1을 사용한 경우, 2 μM 카르복시-SNARF-1-AM으로 염료 로딩 솔루션을 준비하십시오.
  2. 단리된 세포의 2 mL을 가지고 5 mL 시험관에 똑바로 놓습니다.
  3. 근세포가 바닥으로 가라앉을 때까지 15분 기다렸다가 상판을 제거합니다.
    참고: 상한제에는 세포 파편이 포함될 수 있습니다. 세포 손상을 피하기 위해 튜브를 원심 분리하지 마십시오.
  4. 염료 로딩 솔루션의 2mL를 추가합니다.
  5. 4 °C에서 60 분 동안 세포로 염료 로딩 용액을 배양하십시오.
  6. 이어서, 시험관을 37°C 수조에 30분 동안 똑바로 놓는다.
  7. 상온액을 제거하고, 37°C의 미리 온난화된 배양 배지의 4 mL를 첨가한다. 37°C 수조에서 60분 동안 세포를 배양합니다.
  8. 마지막으로, 상류를 제거하고 실온에서 배양 배지 4 mL를 추가하고 튜브를 실온에서 유지하십시오.

3. 다분체 측정 시스템 도입

참고: 그림 1은 전체 시스템의 다이어그램을 보여줍니다.

  1. 여기 광원의 경우 3ms 이내의 빛을 변경할 수 있는 빠른 단색화기(폴리크롬 II)를 사용하십시오.
  2. 신호 강도를 높이기 위해 반전된 현미경으로 오일 침지 렌즈(40x, NA 1.3)를 사용하십시오.
  3. 근적외선 필터와 CCD(충전 결합 장치) 카메라를 사용하여 형광 신호 간섭 없이 물체 필드를 모니터링합니다.
  4. 개체 필드 이미지를 캡처하여 영역을 가져옵니다.
  5. 배경을 줄이기 위한 셀을 표시하기 위해 필드 다이어프램으로 모니터 화면의 개체 필드를 조정합니다.
  6. 각 밴드 패스 필터(450, 500, 590 및 640 nm)가 있는 4개의 광증배튜브를 사용하여 광자 계수 방법으로 방출 파장을 감지합니다. 적절한 이색 거울을 사용하여 방출 라이트를 분할하고 리디렉션합니다.
    참고: 여기 표시등은 방출 광에 비해 매우 강합니다. 따라서 가장 높은 차단 특성을 가진 밴드 패스 필터를 선택하여 배경을 줄입니다. 광자 계수 시스템은 PMT, 광자 카운터 유닛 및 고속 카운터의 조합으로 구성됩니다. 시스템을 제어하고 데이터를 샘플링하기 위해 맞춤형 드라이빙 소프트웨어가 사용되었습니다. 이 메서드를 다른 시스템과 적용할 방법을 찾아야 합니다.

4. 다분측정 시스템을 통한 NADH 보정 방법

  1. 후라-2-FF의 이소성 지점의 식별.
    참고: 많은 보고는 형광 특성이 세포에서 변경된다는 것을 명시했습니다. 따라서, 모든 절차를 수행하여 상체에서 간섭을 보정하기 위해 파라미터를 구한다.
    1. 염료가 장착된 세포를 현미경으로 장착하고 세포를 바닥으로 가라앉힐 때까지 3분 동안 기다립니다.
      참고: 40x 대물 렌즈로 하나의 대물필드당 하나의 셀을 볼 수 있도록 셀 수를 조정합니다.
    2. 37°C에서 NADH 프리 Ca2+-무첨가 용액을 주입하십시오.
    3. 세포를 표적으로 한 후, 섹션 4.1에 도시된 바와 같이 무세포 배경 및 세포 영역을 측정한다. 셀 영역에서 셀 배경을 계산합니다.
      참고: 각 실험에서 두 배경 신호를 모두 수정해야 합니다.
    4. 사포닌 용액을 60s에 퍼우고 NADH가 없는 Ca2+-free 용액으로 되돌아갑니다.
    5. 0.1 nm 단계로 350 nm에서 365 nm까지의 여기 스캔에 의해 450 nm 및 500 nm에서 Fura-2-FF 방출 신호를 동시에 측정합니다.
    6. NADH 프리 Ca2+-포화 용액을 주입하고 4.2.5 단계를 반복하십시오.
    7. Ca2+-채도가 낮은 솔루션의 신호를 Ca2+-free 조건의 신호에서 뺍니다.
    8. 다른 단일 심장 근세포와 함께 4.2.2에서 4.2.7까지의 절차를 반복하십시오.
      참고: 신호 강도가 약해지면 4.2.1에서 반복합니다. 적어도 5 개의 다른 세포에 대한 절차를 반복하십시오.
    9. 획득한 모든 신호에서 각 여기에서 방출의 표준 편차를 계산하고 isosbestic 점으로 최소 표준 편차(SD) 값을 보여주는 여기 파장을 선택합니다.
      참고: 대표적인 수치는 그림 2에나와 있습니다.
  2. 셀 영역이 있는 배경 신호 감지 및 보정 방법
    참고: 배경에는 두 가지 종류가 있습니다. 하나는 셀에서 오고 다른 하나는 커버 슬립 (셀없는 배경)에 반사에서 온다. 각 실험에서 두 배경을 수정해야 합니다.
    1. 염료가없는 세포를 현미경으로 욕조에 장착하고 세포를 바닥으로 가라 앉힐 때까지 3 분 동안 기다립니다. NADH 프리 Ca2+-free 솔루션을 약 5분 동안 사용하십시오.
      참고: 모든 용액 관류 속도는 37°C에서 2-3 mL/min입니다.
      참고: 40x 대물 렌즈로 하나의 대물필드당 하나의 셀을 볼 수 있도록 셀 수를 조정합니다.
    2. 대상 셀을 덮도록 개체 필드를 설정합니다.
    3. 셀을 필드 밖으로 이동한 후 셀없는 창의 배경 신호를 측정하고 오프셋으로 설정합니다.
      참고: 신호는 광자 계수 시스템에서 감지되는 신호입니다.
    4. 셀을 초기 위치로 되돌리고 셀 배경 신호와 셀 영역을 측정합니다.
      참고: 여기 표시등이 밴드패스 필터로 필터링되더라도 여전히 많은 양의 필터링된 라이트가 포함되어 있습니다. 이 빛은 세포를 칠 때 분산되며 광자 계수 시스템이 매우 민감하기 때문에 상당한 배경 신호를 발생시킵니다. 수정해야 합니다.
      참고: 셀 영역은 캡처된 셀 이미지와 사용 가능한 이미징 소프트웨어로 계산될 수 있습니다. 셀 영역의 단위는 픽셀 수를 포함한 임의의 단위일 수 있다. 저기 표준화가 필요합니다.
    5. 4.1.1에서 4.1.4까지 10회 반복하여 세포 영역과 세포 배경 신호 사이의 관계를 얻었다.
      참고: 나중에, 세포 배경 신호는 관계에서 셀 영역에서 계산될 수 있다. 여기 전구가 노화되기 때문에이 절차는 적어도 매달 반복되어야합니다.
  3. R 요인의 측정
    1. 섹션 4.2에서 얻은 신호에서 수학식 4로 Rf를 계산합니다.
    2. 염료가 없는 세포를 현미경에 장착하고 Ca2+-free 용액을 주입합니다.
    3. F361, 450, NADH,F400, 500, NADH,F361, 450, NADH및 F353, 500,NADH와 같은 신호를 측정합니다.
    4. malate 솔루션을 침투하고 4.3.3을 반복하십시오. 신호를 측정합니다.
    5. 피루바테 용액을 침전시키고 4.3.3을 반복합니다. 신호를 측정합니다.
    6. 말레이트-피루바테 용액을 주입하고 4.3.3을 반복합니다. 신호를 측정합니다.
    7. 로테네 용액을 주입하고 4.3.3을 반복합니다. 신호를 측정합니다.
      참고: 5 mM 피루바테, 5 mM malate 플러스 5 mM 피루바테 및 10 μM 로테논 첨가에 기록된 NADH 신호의 예는 도 3에도시되어 있다.
    8. F361, 450, NADH 대 F400, 500, NADH 및 F361, 450, NADH 대 F353, 500, NADH의각 경사를 계산합니다. 그림 3에도시된 바와 같이 . 각 경사는 RN1 및 RN2를나타냅니다.

5. TMRE 또는 카복시-SNARF-1의 여기 및 방출 표시등 선택

  1. 미토콘드리아 전위를 측정하기 위한 TMRE가 추가로 사용된 경우, 530 nm 여기 파장 및 590 nm 방출 파장을 사용한다.
  2. 미토콘드리아 전위를 측정하기 위한 카복시-SNARF-1이 추가로 사용된 경우, 540 nm의 여기 파장 및 590 nm 및 640 nm12의방출 파장을 사용한다.

6. 후라-2-FF의 Kd 값 선택

  1. pH의 변화는 fura-2-FF10에대한Ca2+ 바인딩에 대한 Kd 값에 영향을 줄 수 있습니다. 미토콘드리아의 경우 pH 7.5에서 5.28의 Kd 값을 사용합니다.

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결과

미토콘드리아 Ca2+ 수정으로 인한 변경10
그림 4는 보정 전후의[Ca2+]m의 변화를 보여줍니다. 결과는[Ca2+]m의상당한 변화를 명확하게 보여 주었다. 시토솔산 Ca2+([Ca 2+]c)가없는 미토콘드리아 휴식 칼슘 농도는 1.03±0.13 μM(평균 ±S.E., n=32)이었고, 1-μM에서[Ca2+]m의 최대는 29.6±1.61 μM(0.6 ±1.61 μM) 평균 ± S.E., n = 33)(그림 5).

NADH, [Ca2+ +], 및 Θm10의 동...

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토론

간섭 보정 방법은 NADH 및 fura-2 유사체의 신호를 측정하기 위해 성공적으로 개발되었습니다. 정확한 교정을 위해서는 신호의 정확한 측정이 필수적입니다. 그러나, 형광 장치의 본질적인 특성은 후라-2의 NADH와 관련이 없는 배경 신호를 생성한다. 최고 품질의 밴드 패스 필터는 빛의 원치 않는 파장의 10-8까지 만 통과 할 수 있습니다. 그러나 단일 셀의 형광 신호는 매우 작고, 밴드 패스 필터 후 여기 빛의 반사는 실제 형광 신호를 오염시킬 만큼 충분히 강합니다. 따라서 배경 신호를 주의 깊게 수정해야 합니다.

Fura-2는 미토콘드리아 Ca2+측정에 로딩 문제가 있습니다. 첫째, 염료를 미토콘드리아에 구체적으로 적재하는 것은 쉽지 않으며, 다른 세포기관에 비특이적 로딩이 잘못될 수 있다. 미토콘드리아Ca2+ 농도는 일반적으로 시토졸보다 높고, 높은 Kd 값을 가진 fura-2-FF를 사용하면...

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공개 사항

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 교육부(2018R1A6A3A0111832)가 지원하는 국립연구재단(NRF)을 통해 기초과학 연구 프로그램(NRF-2016M3C1A696606)의 지원을 받았습니다. 산업통상자원부(10068076)에 의해

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2 mL eppendorf tubeAxygenMCT-200-C2 mL Tube
AD/DA converterInstrutechITC-18Equipment
ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrateSigma-aldrichA5285Chemicals
Band pass filterEaling Electro-Optics, Inc35-3920장비, 640± 11nm
Band 통행 여과기Omega 광학690-9823장비, 590± 15nm
Band pass filterOmega Optical500DF20-9916장비, 500± 20nm
밴드 패스 필터Chroma Technology Corp.60685장비, 450± 30nm
Calcium chloride solutionSigma-aldrich21114Chemicals
carboxy-SNARF-1(AM)InvitrogenC1272Chemicals
Charge-coupled device (CCD) cameraPhilipsFTM1800NH/HGIEquipment
Dichroic mirror크로마 테크놀로지 코퍼레이션86009장비, 다중대역 이색성 거울, 반사 : < 400nm, 490&플러스mn; 10, 560&플러스mn; 10, 전송 : 460± 15, 510&플러스mn; 20, >580nm
<강>다이크로익 미러Chroma Technology Corp.567DCXRU장비, 반사 : < 560nm, 투과 : > 580 nm
Dichroic mirrorChroma Technology Corp.480DCLP장비, 반사 : < 470nm, 투과 : > 490 nm
Dichroic mirrorChroma Technology Corp.20728장비, 다대역 이색성 거울, 반사 : < 405nm, 470&플러스mn; 30, 투과 : 430nm ~ 520nm, > 640 nm
< 강> 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) < / 강>시그마 알드리치154938화학
< 강>DMEM, Dulbecco ' 의 변형된 독수리' s 매체시그마-알드리치D5030화학
<강>EGTA, 에그타진산, 에틸렌-비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산, 글리콜 에테르 디아민 테트라아세트산시그마-알드리치E4378화학
<강>FCCP, 메톡살로니트릴 4-트리플루오로메톡시페닐히드라존시그마-알드리치21857화학물질
field 다이어프램Nikon86506Equipment
Fura-2-FF(AM)TEFLABS137chemicals
Green tubeDWMtest tube
Hepes,  4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid))Sigma-aldrichH3375Chemicals
High-speed counterNational InstrumentsNI-6022Equipment
Hot mirrorChroma Technology Corp.21002장비, 50:50
<강력>도립 현미경 니콘TE-300장비
<강력>말레이트시그마-알드리치27606화학
<강력>근적외선 필터 Chroma Technology Corp.D750/100X장비, 750± 100nm
<강력>오일 이멀젼 렌즈 니콘MRF0140040배, 개구수 1.3; 장비
광자 카운터 장치HamamatsuC3866장비
광자 증배기 튜브HamamatsuR2949장비
Polychrome IITill PhotonicsSA3/MG04장비
염화칼륨Merck1.04936화학 물질
< 강> 수산화 칼륨 용액 < / 강>시그마 알드리치P4494화학 물질
< 강> 피루브 산 염 < / 강>시그마 알드리치107360화학 물질
< 강> 로테논 < / 강>시그마 알드리치R8875화학
< 강>사포닌 < / 강>시그마 알드리치S4521화학 물질
TMRE, 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르 분자 프로브T669화학 물질
적인

참고문헌

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