Summary
Selektiv instillation af intra-bronkial syre til venstre lunge i mus resulterer i ensidig og selv begrænset akut lungeskade, der modellerer humant Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) induceret af gastrisk syre aspiration.
Abstract
Selektiv intra-bronkial instillation af saltsyre (HCL) til murine Left højre Bronkie forårsager akut vævsskade med histopatologiske fund svarende til humant Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS). Det resulterende alveolært ødem, alveolær-kapillær barriere skader og leukocyt infiltration påvirker overvejende den venstre lunge, bevarer den rigtige lunge som en uskadet kontrol og tillader dyrene at overleve. Denne model af selv begrænset akut lungeskade muliggør undersøgelse af vævs opløsnings mekanismer, såsom makrofag efferocytose af apoptotiske neutrofiler og restitution af alveolær kapillær barriere integritet. Denne model har bidraget til at identificere vigtige roller for resolution agonister, herunder specialiserede Pro-løsning mæglere (Spm'er), der udgør et fundament for udvikling af nye terapeutiske tilgange til patienter med ARDS.
Introduction
Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) er en vigtig årsag til akut respirationssvigt1. Det er en fælles og dødelig eller invaliderende sygdom, der opstår i 10% af alle patienter indlagt på intensivafdelinger Worldwide2. Ifølge Berlin definition3, ARDS er defineret ved akut indtræden af hypoxemic respiratorisk svigt (< 1 uge) og bilateral pulmonal infiltrater på bryst radiografer, der ikke forklares ved hjertesvigt4. Den underliggende patogenbiologi er karakteriseret ved en overdreven inflammatorisk respons. Lungerne kan blive såret direkte, såsom i lungebetændelse eller med gastrisk syre aspiration, eller indirekte, såsom i sepsis eller efter flere blodtransfusioner4. Efter den indledende fornærmelse, ARDS patogenesen skrider frem i tre faser: exudative, proliferative, og fibrotiske faser1. Disse faser er karakteriseret ved særskilte molekylære og cellulære immun-og reparationsmekanismer, der bestemmer prognosen for ARDS patienter. Understøttende behandling forbliver den grundpille for ARDS patienter; i øjeblikket er der ingen effektive farmakologiske behandlinger for ARDS, så der er et presserende behov for ny forskning på denne ødelæggende betingelse4.
Dysregulering af det medfødte immunrespons under den exudativ fase bidrager til akut indtræden af ARDS og associeret respirationssvigt1. Potent Pro-inflammatorisk mediator signalering orkestrater den oprindelige immunrespons, fører til afbrydelse af den alveolære kapillar barriere, diffus alveolært ødem, og neutrofile infiltration til stedet for lunge vævsskade4. I ARDS, ineffektive bremse signaler for akut inflammation prædisponere til lungesvigt og kan forsinke rettidig katabasis af den skadede lunge væv5. Til dette formål kan prækliniske undersøgelser af de endogene initiering og Pro-resolution mekanismer af ARDS afdække nye terapeutiske strategier. En sådan undersøgelse kræver selv begrænsede eksperimentelle in vivo-modeller for akut lungeskade, der nøje ligner træk ved menneskelige ARDS, hvilket muliggør afhøring af mekanismer, som ligger til grund for Initierings-og afviklings faserne for vævsskade.
Den murine model præsenteres her producerer direkte akut lungeskade, der viser de kardinal patogenbiologiske processer af exudativ ARDS, nemlig alveolær-kapillar barriere forstyrrelse og neutrofile infiltration. Metoden er afhængig af selektiv intra-bronkial instillation af HCl gennem kanylering af venstre højre bronchus, lokalisering af skaden og inflammatorisk respons på venstre lunge; den uforkrænkede højre lunge kan bruges som en intern kontrol for udvalgte bestemmelser af vævsskade og inflammation. Desuden er ensidig lungeskade ikke-dødelig og afslører et opløsnings program. Dette giver et særskilt vindue til opløsning af lungebetændelse, der kan udnyttes til identifikation af endogene Pro-løsning mediatorer og cellulære mekanismer og til at åbne nye terapeutiske veje for ARDS, der fremhæver opløsningen fysiologi og Farmakologi.
Protocol
Alle dyreforsøg nedenfor er blevet gennemgået og godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse på Brigham and Women's Hospital (protokol #2016N000356).
Bemærk: Steril teknik blev fulgt for alle overlevelses procedurer. Et sterilt felt blev etableret for hver operation ved hjælp af et sterilt drapere håndklæde, mens kirurger bar sterile kirurgiske handsker, hætter, masker og rene laboratorie frakker. Alle kirurgiske instrumenter blev steriliseret ved hjælp af en autoklave, og sterilitet blev opretholdt ved hjælp af en perle sterilisator.
1. klargøring af 0,1 N HCl
- Tilsæt 11 mL ddH2O til en ravfarvet glas flaske. Tilsæt langsomt 1 mL 37% HCl (12 N) for at oprette en 1 N HCl-arbejds bestand.
Forsigtig: Sørg for, at HCl tilsættes til vandet. Dette er en sikkerhed bekymring, fordi tilsætning af vand direkte til syren kan forårsage syre til at koge og stænk ud af flasken. Når du håndterer koncentreret HCl, skal du sørge for, at syren holdes i en ventileret kemisk hætte, og at det relevante personlige beskyttelsesudstyr bæres, herunder laboratorie beklædning, handsker og sikkerhedsbriller. - Tilsæt langsomt 4 mL af den tidligere fortyndede HCl-arbejds bestand til 35 mL ddH2O i et 50 ml konisk rør for at skabe en 0,1 N HCL eksperimentel bestand.
- Mål pH af forsøgs bestanden ved hjælp af en elektronisk pH-sonde efter to-punkts kalibrering ved hjælp af lave pH-opløsninger. Titrer til pH 1,1 ved hjælp af NaOH-eller HCL-stamopløsninger efter behov, således at den endelige volumen er 40 ml.
Bemærk: Det kan være svært at måle de lave pH-værdier. For at sikre nøjagtig måling skal du sørge for, at pH-sonden er korrekt kalibreret med lave pH-standarder for at undgå over ekstrapolation af målingen. - Umiddelbart før forsøget filtreres 1 – 2 mL af den eksperimentelle HCl-bestand gennem et 0,22 μm sterilt filter til et sterilt mikrocentrifuge glas.
2. selektiv intra-bronkial instillation af HCl
-
Klargøring af operationsområdet
- Inducerer generel anæstesi ved at levere en ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) blanding ved intraperitoneal injektion. Sørg for, at musen er helt bedøvet ved forsigtigt at klemme spidsen af halen eller bagfoden. Manglende tilbagetræknings respons er påkrævet, før der foretages en hudincision. Administrer yderligere anæstesi bolte, hvis det er nødvendigt.
- Lever 0,1 mg/kg buprenorphin subkutant under halsen. Præ-operative analgetika vil styrke effekten af anæstesi og vil forbedre præ-og postoperative smerter som følge af proceduren.
- Brug elektriske klippere til forsigtigt at barbere det kirurgiske område på den ventrale overflade af musen, under hagen i den cervikale region af halsen, ved hjælp af langsomme nedadgående strøg. Fjern løs pels for at udsætte den underliggende hud fuldt ud.
- Forbered operationsområdet ved at konstante det barberede sted med 10% povidon-jod opløsning. Rengør siden med en 70% isopropyl spritserviet efter påføring af den aseptiske opløsning. Gentag dette trin 3x.
-
Isolering af luftrøret
- Placer musen i en liggende stilling på et rent kirurgisk bord og dække musen i en steril kirurgisk drapere samtidig bevare eksponeringen af det kirurgiske område. Fastgør drapere på plads.
- Lav en 0,5 cm langsgående indsnit i huden over luftrøret og spytkirtlerne. Brug let buede savtakket æg pincet til forsigtigt at trække huden tilbage og forsigtigt adskille spytkirtlerne for at udsætte trakeal musklerne.
- Brug savtakket æg tang til stump dissektion, forsigtigt skubbe paratracheal muskler og drille væk fascia, der omgiver luftrør, indtil brusk ringe i luftrøret er helt eksponeret.
- Brug fuldt buede savtakket æg tang til at løfte luftrør og adskille bindevæv mellem retro-luftrør og retro-fascia. Når bindevæv er løsrevet, bør spidsen af pincet glide helt bag luftrøret.
- Hold de buede pincet bag luftrøret og Grib et 10 – 15 cm stykke 4-0 flettet silke sutur med spidsen af pincet. Træk suturen bag luftrøret, så der er en jævn længde på hver side.
- Når suturen er på plads, træk forsigtigt siderne af suturen mod bageste af musen og holde siderne på plads.
-
Selektivt at kanyle den venstre højre Bronkie og indgyde HCL
- Tag en 24 G x 3/4 "angiocatheter og Indsæt nålen, facet op, ind i den forreste region af luftrøret mellem den første og anden trakeal ringe. Når korrekt indsættelse bekræftes ved direkte visualisering af nålens spids i trakeal lumen, slip suturen og før kanylen over nålen og ind i luftrøret, indtil modstanden er nået, og træk derefter nålen. Vinkel indsættelses retningen mod den venstre hoved stang Bronkie for selektiv instillation i venstre lunge.
- Når kanylen er på plads, skal du fast gribe Indsprøjtnings porten for at forhindre, at katetret skifter.
- Ved hjælp af en P200 pipette og sterile P200 pipettespidser, indgyde 2,5 ml/kg (50 μl for en 20 g mus) af sterilfiltreret 0,1 N HCL i kateteret, efterfulgt af en identisk volumen af luft.
- Træk katetret hurtigt og løft Operations brættet til en vinkel på 60 ° i 30 s.
-
Lukning af operationsområdet
- Læg kirurgisk bræt fladt og fjern suturen fra bag luftrøret.
- Brug 4-0 voksbelagt silke sutur til at lukke hudens indsnit med 2 – 3 masker.
3. post operativ pleje
- Når snittet er lukket, placere musen på sin venstre side på en varm varmepude, indtil musen genindvinder fra anæstesi. Begynd at overvåge musen for smerte og aktivitetsniveau, før du returnerer den til normale boliger.
Bemærk: Buprenorphin bør administreres ved 0,1 mg/kg subkutant hver 6-12 h i de første 24 timer. Hvis vedvarende gennembrudssmerter er til stede, forlænge det analgetiske regime, indtil smerten aftager.
4. hele lunge Bronalveolær skylning (BAL) og leukocyt Immunophenotyping
-
Euthanize musen ved at administrere 3x dosis af ketamin/xylazin anvendes i trin 2.1.1.
- For at skelne mellem interstitiel og intravaskulær neutrofiler, injicerer intravenøst et udvalgt fluorophore-mærket Ly6G antistof 5 min før eutanasi. Dette mærke skal være egnet til detektion ved flow cytometri til at skelne intravaskulær neutrofiler fra lunge interstitiel og alveolære neutrofiler, som vil blive mærket under vævs præparatet med en anden fluoroforet (se nedenfor).
- Placer musen på et kirurgisk bord og krog de forreste fortænder omkring en løkke af 2-0 flettet silke sutur.
- Følg trin 2.2.2 – 2.2.6. for at forberede luftrøret til kanylering.
Bemærk: Sørg for, at membranen ikke er punkteret for at maksimere Trans-alveolær oppustethed under lunge skylning; venstre lunge overholdelse falder efter skade, hvilket kan kræve et højere Trans-alveolært trykkrav for lunge skylning. - Kanyle røret efter trin 2.3.1, men Undlad at fremskynde kateteret under Carina; sæt kateteret parallelt med luftrøret.
- Med kateteret indsat skal du binde suturen rundt om luftrøret for at holde kateteret på plads.
- Indstill og udtag to på hinanden følgende 1 mL aliquoter af iskold PBS-/-(uden magnesium eller calcium) med 0,6 mM EDTA ved hjælp af en 1 CC-sprøjte. For immunophenotyping ved flowcytometri, Fjern hver alikvot og vend tilbage til et 5 mL polystyren FACS-rør på is.
- For at sikre euthanasia, udføre en thoracotomi ved hjælp af kirurgisk saks efterfulgt af hjertets punktering. Lungerne kan høstes til videre forarbejdning.
- Centrifuger BAL i 10 min ved 800 g ved 4 °C for at pille cellerne.
- Supernatanten omdannes til et 2 mL mikrocentrifuge glas og alikvot til 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Opbevares ved-80 °C ved efterfølgende analyse.
- Resuspension af celle pellet i PBS-/-med 2% FBS for leukocyt differentialanalyse ved flow cytometri.
- For at skelne mellem interstitiel og intravaskulær neutrofiler skal du fjerne den venstre og højre lunge separat og behandle lungerne for flow cytometri som i Abdulnour et al. 20146.
- Plette den resulterende cellesuspension ved hjælp af udvalgte FACS-antistoffer, og sørg for at plette for Ly6G, der er konjugeret med en anden fluoroforet end Ly6G-antistoffet fra trin 4.1.1.
5. vurdering af alveolær barriere permeabilitet ved hjælp af Evan blå farvestof (EBD)
- Intravenøst injicere Evans blå farvestof (40 mg/kg) 30 min før eutanasi.
- Euthanize musen ved hjælp af ketamin/xylazine overdosis (trin 4,1).
- For at måle alveolær barriere integritet skal du følge trin 4.2 – 4.9 for BAL-opsamling.
- Overfør 100 μL BALF til en klar bund 96-brønd-mikropladen sammen med 100 μL af dobbelte EBD-standarder. Brug PBS-/-som blank.
- Brug en mikroplade læser til at måle BALF-absorbansen ved 620 nm og 740 nm. Absorbansen anvendes ved 740 nm for at korrigere for hæe kontaminering i prøverne7.
- At måle vaskulære barriere integritet, perfuse lungerne ved langsomt at injicere 5 mL iskold PBS-/-gennem højre ventrikel af hjertet. Fjern den venstre lunge.
- Tør den venstre lunge i 72 h ved 58 °C for at fjerne overskydende vand.
- Behandl det tørrede lunge væv som i Radu og Chernoff 20138, og mål abscisse ved 620 nm og 740 nm.
6. lunge histologi
- Kanyle røret ved at følge trin 4.1 – 4.5.
- Til tryk Fastgør lungerne ved 20 cm H2O, brug en ring stativ og klemme til at løfte en 60 ml sprøjte monteret med ventil styrede slanger og fyldt med en SELECT fixativ løsning (f. eks. zink fikseret), således at menisk af fikseret opløsning er 20 cm over Lungerne.
- Fastgør slangen til kateteret og Åbn værdien. Fyld langsomt lungerne med fikativ, indtil de stopper med at oppustethed.
- Tag kateteret 3/4 af vejen ud af luftrøret. Binde luftrør med sutur før helt fjerne kateteret for at minimere tab af fixative.
- Fjern lungerne og hjertet en bloc.
Bemærk: Sørg for, at lungerne ikke punkteres under fjernelsen for at bevare det tryk inanvendte fikativ. - Fastgør lungerne i 24 timer i 25 mL fixativ ved stuetemperatur.
- De faste lunger vaskes i sekventielle 20 min. intervaller i PBS-/-, 30% ethanol og 50% ethanol.
- Efter den sidste vask opbevares lungerne i 70% ethanol til histologi behandling som i Eickmeier et al. 20139.
Representative Results
Selektiv intra-bronkial HCl-instillation resulterer i ensidig akut lungeskade
Metoden til selektiv intra-bronkial instillation af HCl til venstre højre Bronkie er illustreret i figur 1a. Den deraf følgende akutte lungeskade involverer hele venstre lunge, og efter intravenøs administration af EBD og lunge perfusion forblev EBD kun i venstre lunge (figur 1b). EBD ekstravasation i venstre lunge blev kvantificeret og konstateret at være signifikant forøget i forhold til Sham selektiv instillation (figur 1c; tilpasset fra abdulnour et al. 20146). Som reaktion på lungeskade, cirkulerende leukocytter diapedese i det betændte væv. I denne model gennemgår vaskulære neutrofiler Trans-Endothelial migration til den skadede lunge interstitium. Interstitiel neutrofiler akkumuleret i venstre lunge 24 timer efter instillation af HCl, i modsætning til højre lunge, hvor få interstitiel neutrofiler observeres (figur 1d). Disse resultater indikerer, at den selektive venstre højre intra-bronkial instillation metode resulterede i murine akut lungeskade, der var stort set lokaliseret til venstre lunge og produceret patologiske ændringer, der også ses med menneskelige ARDS, herunder øget alveolær-kapillar barriere brud og neutrofile infiltration.
Ensidig akut lungeskade muliggør undersøgelse af afviklingsmekanismer
For at studere opløsningen fase af syre-induceret akut lungeskade mus skal være i stand til at overleve den oprindelige fornærmelse. Adskiller sig fra intratrakeal HCl, instillation i kun venstre højre Bronkie fører til en selv-begrænset skade med ensartet overlevelse i ellers raske mus. Lungerne kan opnås fra mus på enten tidlige eller senere tidspunkter som i figur 2a. Lunge histologi viser vævsskade og betændelse på orgel og cellulært niveau med exudativ inflammation 24 h efter skade karakteriseret ved markant alveolært ødem og neutrofilinfiltration i venstre lunge. Bemærk, at der ikke er nogen signifikant skade eller leukocyt tilstrømning til den ubeskadigede kontrol højre lunge (figur 2a). 72 h efter skade, ødem og cellulære infiltrater er væsentligt nedsat, repræsenterer en løsning exudativ fase. Alveolære neutrofiler kan overvåges ved flow cytometri (CD45+/Cd68-/F4/80-/Ly6g+/cd11b+) opnået ved hel lunge skylning. Neutrofiler stigning i venstre lunge 24 h efter den indledende skade og fald betydeligt ved 48 og 72 h (figur 2b). Hvis senere tidspunkter undersøges, vil neutrofiltallet vende tilbage til baseline, og mekanismerne i senere faser af katabasis, såsom Fibro reaktioner, kan blive undersøgt.
Figur 1: selektiv intra-bronkial HCL-instillation producerer ensidig lungeskade defineret ved alveolær barriere brud og neutrofile infiltration. (A) repræsentation af kanylen af murine venstre højre Bronkie for selektiv instillation af HCl i venstre lunge. (B) resected højre (RL) og venstre (LL) lunger udsat for selektiv syre instillation og perfektioneret efter intravenøs Evan blå farvestof. (C) kvantificering af interstitiel Evans blå farvestof fra homogeniseret, perfbrugt lunge 24 h efter syre skade eller fingeret kontrol; Figur tilpasset fra Abdulnour et al. 20146. Værdier repræsenterer Mean ± SEM, hvor n ≥ 5. *p < 0,05, Mann-Whitney U test.D) repræsentativt flow cytometri af intravaskulær (I.V.; fluoroforet 1) og interstitiel (I.S.; fluoroforet 2) neutrofiler som procent af total CD45+ celler i forarbejdet lunge 24 timer efter syre skade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: ensidig akut lungeskade er selv-løse. A) repræsentativ H & E histologi (10x) af venstre lunger opnået fra naive mus (0 H) eller mus 24, 48, 72 H efter skade, sammen med den tilknyttede højre lunge fra samme mus (skala bar = 250 μm). B) repræsentativ flow cytometri af alveolære neutrofiler (Ly6G+ CD11b+) opnået fra hele lunge skylning som procent af total CD45+ celler i naive (0 h) mus eller mus 24, 48 og 72 h efter syre skade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den intra-bronchiale instillation metode, der er beskrevet her, bruger selektiv kanylering af venstre højre Bronkie til indgyde HCL i venstre lunge, hvilket resulterer i ensidig og selv begrænset murine akut lungeskade. Denne murine syre lungeskade model nøje repræsenterer den inflammatoriske respons, histopatologi, og fysiologiske dysfunktion set i menneskelige ARDS, hvor gastrisk syre aspiration er et fælles bundfald eller medvirkende faktor4. Eksponeringen af murin-luftvejene til lav pH HCl resulterer i øget permeabilitet af den alveolære kapillær barriere, alveolært ødem og dyb neutrofilinfiltration på skadestedet. Disse hændelser observeres ikke i den uforkrænkede højre lunge. Derudover producerer denne model hurtige inflammatoriske reaktioner, der toppe inden for 24 timer efter syre instillation, og deler ændringer i genekspression med menneskelige ARDS, såsom differentialekspression af fosfolipase D isoformer10.
Selv om denne murine prækliniske model gengiver mange af funktionerne i ARDS på molekylære, cellulære, og væv niveauer, det ikke fuldt ud rekapitulere menneskelige ARDS. Definitionen af ARDS omfatter bilateral lunge involvering3, mens den instillation metode, der er beskrevet her, resulterer i design i ensidig lungesygdom. Desuden kræver dyrene ikke kontinuerlig mekanisk ventilation, immobilitet eller parenteral sedation. Resultater præsenteret her (vide Supra) og andetsteds6,9,11,12,13 viser, at ensidig syre induceret lungeskade gengiver de fleste af de patologiske kendetegn ved Samtidig give den enestående mulighed for at bruge den rigtige lunge som intern kontrol og til at studere opløsningen fase af denne sygdom. Som sådan, den model, der diskuteres her modeller ARDS patogenbiologi, men også giver mulighed for mekanisk undersøgelse af grundlæggende lunge væv respons på skade og afvikling mekanismer, som kan være relevante for at tackle denne vigtige sygdom.
Instillation af HCl repræsenterer direkte akut lungeskade, så det er modellering aspekter af Patofysiologi forbundet med aspiration pneumonitis. Desuden er den oprindelige venstre lunge fornærmelse i denne model genereret ved hjælp af steril HCl snarere end bakterier-lastet gastrisk indhold set i nogle menneskelige aspiration begivenheder, der kan også føre til lungebetændelse14. I mennesker, aspiration af patogene bakterier kan resultere i sekundær bakteriel lungebetændelse, der forværrer den akutte inflammatoriske respons, forlænge den oprindelige lungeskade og øge patientens modtagelighed for at udvikle ARDS14. Denne potentielle begrænsning er blevet behandlet af investigatorer med vilje indgyde patogene bakterier Escherichia coli (E. coli)15 efter steril HCL. Desuden er denne metode blevet anvendt til at undersøge patogen medierede betændelse ensidig bakteriel lungebetændelse kan være induceret af selektiv venstre lunge instillation af bakterier, såsom E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16, og Streptococcus pneumoniae18 . Den selv begrænsede akutte lungeskade model, der er beskrevet her, kan også anvendes til at studere respirator induceret lungeskade (VILI), en vigtig årsag til øget dødelighed i menneskelige ARDS19. Eksperimentelle animalske modeller af VILI involverer normalt mekanisk ventilation i naive mus med tidevands volumener, der er meget højere end hvad der er klinisk anvendt til at forårsage lungeskade (> 15 ml/kg; Se tidligere arbejde20,21). Mod en mere klinisk relevant model af VILI kan instillation af intra-bronkial syre som beskrevet her først anvendes til at fremkalde ikke-dødelig lungeskade efterfulgt af mekanisk ventilation ved tidevands volumener inden for det kliniske område (6-12 mL/kg). Denne hypotetiske dyremodel kan give investigatorerne mulighed for at studere VILI på en klinisk relevant måde, når de er udviklet og valideret. Sammen, disse murine modeller fremhæve alsidigheden af selektiv intrabronchial instillation metode til at generere ensidige lunge fornærmelser, der nøje ligner patologier forbundet med menneskelige lungesygdomme.
Ud over at tillade selektiv instillation af forskellige skadelige stoffer til venstre lunge, teknikken med intra-bronkial instillation efter trakeostomi kræver ikke udvidet uddannelse, lang procedure tid, eller komplekst udstyr, og i erfarne hænder forårsager minimal lidelse for dyrene. På trods af dette, flere problemer kan opstå under selektiv HCl instillation procedure, der kan påvirke eksperimentelle resultater. Forkert kanylering af den venstre hovedstamme Bronkie kan resultere i bilateral lungeskade, der mindsker overlevelsen af eksperimentelle mus og behersker brugen af den rigtige lunge som en uskadet intern kontrol. Dette kan undgås ved at fiske kateteret tilstrækkeligt mod venstre lunge under kanyle, indtil modstanden er nået. Efter injektion af HCl skal en bolte af luft injiceres, kateteret hurtigt fjernes, og Operations brættet bragte oprejst til en 60 ° vinkel. Disse trin er afgørende for at sikre, at syren når de distale luftveje i venstre lunge og forhindrer refluks af syre i den rigtige lunge og luftrør, som kan forårsage proksimal skade. Inden for 24 timer efter instillation er skaden i venstre lunge diffus med omfattende lungeødem, der påvirker både den distale og proksimale venstre lunge.
Under metodeudvikling i voksne 8-12 uge gamle mus, 2,5 mL/kg intra-bronkial HCl produceret betydelig endnu subletale akut lungeskade; lavere doser af HCl resulterede ikke i reproducerbar og homogen lungeskade. Selvom vi ikke har udført denne model i yngre (f. eks. 3-6 uger gamle) eller ældre mus (f. eks. 10-14 måneder gamle), forventer vi, at vægtbaseret dosering af HCl vil resultere i en lungeskade-fænotype svarende til det, der er noteret i 8-12 uger gamle mus. Vi anbefaler, at investigatorerne titrerer HCl-doserne for at opnå den ønskede grad af lungeskade, før der udføres eksperimenter med mus ved ekstreme vægte.
Denne selektive syre instillation procedure tilbyder en ikke-dødbringende murine model af sterile væv betændelse, der reducerer behovet for støttende pleje, såsom mekanisk ventilation. Med forlænget overlevelse af sårede mus, den syre-induceret inflammation har tid nok til selv-løse. Afviklingsfasen af denne model er blevet brugt til at identificere timeligt regulerede endogene bioaktive lipid-mediatorer, betegnet specialiserede Pro-løse mediatorer (Spm'er), såsom lipoxin A4 (lxa4), Maresin 1 (MaR1), og resolvins6 ,11,12,16. Administration af udefrakommende Spm'er til sårede mus øger opløsningen af syre induceret lungeskade ved at dæmpe inflammatoriske mekanismer og fremme katabasis af det skadede lunge væv. Disse spm'er fremme clearance af alveolært ødem12, øge efferocytose af apoptotiske neutrofiler ved rekrutteret makrofager16, og fremskynde re-epitelialisering af luftvejene og alveolerne12 at reducere vaskulære lækage og vævs hypoksi. I en model af patogen-induceret lungeskade, 15-EPI-resolvin D1 også udstillet antimikrobielle handlinger gennem øget bakteriel fagocytose af makrofager og øget bakteriel clearance fra den inficerede lunge16. Undersøge disse endogene afviklingsmekanismer giver indsigt i potentielle nye terapeutiske strategier for patienter med ARDS5.
For bedst at studere den rumlige regulering af afviklings mekanismerne er der behov for in vivo-forsøgsmodeller. Akutte lungeskade modeller skal omfatte relevante akutte inflammatoriske reaktioner og organ dysfunktion med inddragelse af vært resolution fremme molekylære og cellulære processer. Disse mekanismer kan kvantificeres ved hjælp af etablerede opløsnings indekser22. Den selektive intra-bronkiale instillation metode til at generere ensidig akut lungeskade har vist sig nyttigt i denne henseende at sonde endogene opløsning mediatorer og veje. Fremtidige undersøgelser, der uddyber vores forståelse af disse aktive opløsnings processer, har løftet om at føre til terapeutiske agonister, der efterligner bioaktionerne af endogene lipid-mediatorer for at forbedre opløsningen af inflammation og afbøde sygelighed og dødelighed af ARDS og andre vigtige lungesygdomme.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Joseph Mizgerd for hans bidrag til udviklingen af den selektive intra-bronchiale metode og for hans nyttige kommentarer og gennemgang af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhedstilskud P01GM095467 (B.D.L.) og K08HL130540 (R.E.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Zinc Fixative | BD Biosciences | 552658 | |
| 2-0 Braided Silk Suture | Surgical Specialties | SP118 | |
| 24 G x 3/4" Disposable Safelet I.V. Catheter | Excel | 26751 | |
| 33 mm, 0.22 µm syringe filter unit | Millipore-Sigma | SLGP033RS | |
| 4" Long Serrated Slight Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| 4" Long Tip Serrated Full Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| 4.5 " Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | |
| 6" Crile Wood Needle Holder | Roboz | RS-7860 | |
| 60 mL syringe | BD Biosciences | 309653 | |
| Anti-mouse FITC-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 11-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Anti-mouse PE-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 12-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Bead sterilizer | |||
| Betadine Solution Swabstick | Betadine | 67618-153-01 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Clear flat-bottomed 96-well microplate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) without Ca2+ or Mg+ | life technologies | 14190-144 | |
| Electric clippers | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore-Sigma | E6758 | |
| Evans Blue Dye | Millipore-Sigma | E-2129 | |
| Heating pad | |||
| Hydrochloric acid, 37% | Millipore-Sigma | 258148 | |
| Ketamine | Henry-Schein | 56344 | |
| Microplate reader (640, 720 nm) | |||
| P200 Pipette | |||
| P200 Pipette Tips | |||
| pH probe | |||
| Ring stand with extension clamp | |||
| Sterile Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Sterile Mouse Drape 8" x 8" with Oval Adhesive Fenestration | Steris | 88VCSTF | |
| Sterile Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 56890 | |
| Sterile Towl Drape | Dynarex | 4410 | |
| Wax Coated 4-0 Braided Silk Suture | Covidien | SS733 | |
| Xylazine | AKORN | NDC: 59399-111-50 |
References
- Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).
- Bellani, G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- The ARDS Definition Task. Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS. The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D.
- Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -E. E., Engstrom, B. D. Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases. Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526 (2014).
- Chen, H., et al. Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. 73 (73), e50062 (2013).
- Eickmeier, O., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury. Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury. Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).
- Fukunaga, K., Kohli, P., Bonnans, C., Fredenburgh, L. E., Levy, B. D. Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury. Journal of Immunology. 174 (8), 5033 (2005).
- Colby, J. K., et al. Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia. American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).
- Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury. The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).
- Mandell, L. A., Niederman, M. S.
- Seki, H., et al. The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury. Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).
- Abdulnour, R. E., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation. Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).
- Traber, K. E., et al. Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia. American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).
- Yamamoto, K., et al. Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).
- Acute Respiratory Distress Syndrome Network. Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).
- Peng, X., et al. Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).
- Serhan, C. N., Levy, B. D. Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).
