Summary
De ontwikkeling van een Dual-functioneel conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetica (DCAF) is een roman voor de eliminatie van schadelijke antilichamen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de synthese van DCAF1 molecuul, dat selectief 4G2 antilichamen kan blokkeren om antilichaam afhankelijke verbeterings effecten te elimineren tijdens een Denguevirus infectie.
Abstract
Eliminatie van schadelijke antilichamen tegen organismen is een waardevolle aanpak voor de interventie van met antilichamen geassocieerde ziekten, zoals dengue hemorragische koorts en auto-immuunziekten. Aangezien duizenden antilichamen met verschillende epitopen in het bloed circuleren, werd er geen universele methode gerapporteerd, met uitzondering van het dubbele functionele conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetica (DCAF), om specifieke schadelijke antilichamen aan te richten. De ontwikkeling van DCAF moleculen levert een aanzienlijke bijdrage aan de voortgang van gerichte therapie, die werden aangetoond dat het elimineren van het antilichaam afhankelijke verbetering (ADE) effect in een Denguevirus (DENV) infectie model en ter bevordering van de acetylcholine receptor activiteit in een myasthenia gravis model. Hier beschrijven we een protocol voor de synthese van een DCAF-molecuul (DCAF1), dat selectief 4G2-antilichamen kan blokkeren om het ADE-effect te verzachten tijdens een dengue-virus infectie en de binding van DCAF1 tot 4G2-antilichaam door een ELISA-test te illustreren. In onze methode wordt DCAF1 gesynthetiseerd door de conjugatie van een hydrazine derivaat van een FC-III peptide en een recombinant uitgedrukt lange α-helix met antigene sequentie door inheemse chemische ligatie (NCL). Dit protocol is met succes toegepast op DCAF1 en andere DCAF moleculen voor de targeting van hun verwant antilichamen.
Introduction
Antilichamen spelen een belangrijke rol in de humorale immuunrespons voor de neutralisatie van pathogene bacteriën en virussen1. Sommige antilichamen vertonen echter schadelijke effecten op de organismen, zoals kruisreactieve antilichamen in het ade-effect tijdens denv-infectie en overmatige reactieve antilichamen in myasthenia gravis, een auto-immuunziekte2,3. ADE-effect wordt gemedieerd door de kruisreactieve antilichamen die de brug maken om denv en FC-receptor met cellen4,5te verbinden, terwijl myasthenia gravis wordt veroorzaakt door de overmatige antilichamen die acetylcholine-receptoren aanvallen tussen de cel-cel knooppunten in spierweefsel6,7. Hoewel er gedeeltelijk effectieve benaderingen zijn ontwikkeld voor de behandeling van deze ziekten8,9, zou ongetwijfeld directe eliminatie van deze schadelijke antilichamen vooruitgang voor de interventies.
Onlangs, DCAF moleculen, die hebben dual-functionele groepen, zijn ontwikkeld voor gerichte antilichamen blokkering10. DCAF is een lange peptide die bestaat uit 3 delen: 1) een antigeen deel dat specifiek kan herkennen de verwant antilichaam, 2) een FC-III of FC-III-4c-tag voor sterk binden aan de FC-regio van het antilichaam voor de remming van ofwel FC receptor of complement component eiwitten , 3) een lange α-spiraalvormige linker die deze twee functionele groepen10conjugaten. Het linker deel, ontworpen vanuit Moesin FERM domein, werd geoptimaliseerd door Rosseta software om ervoor te zorgen dat het antigeen deel en FC-III deel in een DCAF molecuul kan binden aan de Fab en FC regio's van IgG tegelijkertijd. Vier DCAF moleculen zijn gesynthetiseerd om te richten op 4 verschillende antilichamen, onder hen DCAF1 werd gebruikt om te elimineren 4G2 antilichamen, dat is een cross-reactieve antilichaam tijdens DENV-infectie om bij te dragen aan ADE-effect; en DACF4 is ontworpen voor de redding van acetylcholine-receptoren door het blokkeren van mab35 antilichaam in myasthenia gravis10.
In de huidige studie, genomen DCAF1 als het voorbeeld, we toonden de protocollen voor de synthese van DCAF molecuul en de detectie van de interactie tussen een DCAF en haar verwant antilichamen. De DCAF1 wordt semi-gesynthetiseerd door NCL-aanpak11,12,13,14, die het hydrazine derivaat van een FC-III-peptide en de uitgedrukte linker-antigeen delen samen conjugaten. De NCL aanpak heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van volledig chemische synthese en volledig recombinant expressie voor DCAF1 synthese, omdat beide methoden leiden tot lage opbrengst en hoge kosten. De huidige aanpak is niet alleen de meest kosteneffectieve manier om de volledige DCAF te krijgen, maar kan ook de conformatie van de linker deel vergelijkbaar als zijn oorspronkelijke vorm te handhaven. Aangezien verschillende DCAF moleculen vergelijkbare sequenties hebben, met uitzondering van de antigeen onderdelen, kunnen onze methoden voor DCAF1 synthese en de interactie test tussen DCAF1 en 4g2 antilichaam worden toegepast op andere DCAF moleculen om hun verwant antilichamen ook te blokkeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. chemische synthese van het hydrazine derivaat van een FC-III peptide
- 2-cl-(TRT)-cl-hars omzetten in 2-cl-(TRT)-NHNH2 -hars
- Weeg 625 mg 2-cl-(TRT)-cl Resin (0,25 mmol) in een 25 mL peptide synthese vat.
- Voeg 5 mL N, N-dimethylformamide (DMF) toe aan de hars van de bovenkant van het vat, zet de dop terug, schud het vat zachtjes gedurende 15 sec. en giet het vervolgens af. Herhaal DMF-wassing nog twee keer.
- Voeg 5 mL dichloormethaan (DCM) toe aan het vat, zet de dop terug, schud het vat zachtjes gedurende 15 sec. en giet het vervolgens af. Herhaal DCM wassen nog twee keer.
- Herhaal stap 1.1.2 drie keer.
- Gebruik 6 mL van 50% (vol/vol) DMF/DCM om de hars gedurende 30 minuten te laten opzwellen en vervolgens af te tappen.
- Overdracht 6 mL 5% (vol/vol) NH2NH2 in DMF schud het mengsel met 120 TPM, 30 °c gedurende 30 minuten en giet de oplossing vervolgens af met een vacuümpomp.
Opmerking: Voeg 0,3 mL hydrazine hydraat toe aan 5,7 mL DMF om 5% (vol/vol) te krijgen NH2NH2. Vers bereid NH2NH2 voor gebruik.
Let op: hydrazine hydraat is een gevaarlijke stof en kan kanker veroorzaken. Draag een Labcoat, handschoenen en een masker. Voer de experimenten uit in een rook afzuigkap. - Voeg 5 mL DMF toe aan het vat, schud het zachtjes gedurende 15 sec. en giet het vervolgens af.
- Herhaal stap 1.1.6 en was de hars door de stappen 1.1.2-1.1.4 tweemaal te herhalen.
- Voeg 6 mL van 5% (vol/vol) MeOH/DMF toe aan het vat, schud het zachtjes gedurende 10 minuten en giet het vervolgens af.
Opmerking: deze stap is zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat de niet-gereageerd sites op de hars zijn afgedekt. - Was de hars grondig door de stappen 1.1.2-1.1.4 te herhalen.
- Voeg 5 mL DCM toe aan de hars, schud het zachtjes gedurende 15 s en giet het vervolgens af om 2-cl-(TRT)-NHNH2 -hars te verkrijgen.
Opmerking: de hars wordt geel of licht groen wanneer de vervanging succesvol is.
- Peptide verlenging
- Voeg 1 mmol van de Fmoc-Ala-OH (934 mg) en 0,95 mmol van 1-[bis (Dimethylamino) methyleen]-1H-1, 2, 3-triazolo-[4, 5-b] Pyridinium hexafluorofosfaat 3-oxide (HATU) (360 mg) in een 5 mL buisje met 3 mL DMF.
Let op: blootstelling aan HATU kan een allergische reactie veroorzaken. Draag een Labcoat, handschoenen en een masker. - Voeg 2 mmol N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (0,36 mL) toe aan de opgeloste oplossing en Vortex voor 0,5 – 1 min.
Opmerking: kritieke stap: de activering moet niet meer dan 5 min, als de geactiveerde aminozuren isomeriseren van de meer actieve O-formulieren naar de minder actieve N-formulieren na verloop van tijd. - Voeg de geactiveerde Fmoc-Ala-OH toe aan het reactievat met de 2-cl-(TRT)-NHNH2 hars, bereid uit stap 1,1. Schud zachtjes met 120 rpm, 30 °C gedurende 20 minuten in een constant-temperatuurshaker en giet de oplossing vervolgens af met een vacuümpomp.
- Voeg 5 mL DMF toe om de hars te wassen, schud het voorzichtig voor 15 sec. en giet het vervolgens af.
- Voeg 1 mmol van de Fmoc-Ala-OH (934 mg) en 0,95 mmol van 2-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-1, 1, 3, 3-tetramethylaminium hexafluorofosfaat (HCTU) (390 mg) toe aan een buisje van 5 mL met 3 mL DMF.
Let op: blootstelling aan HCTU kan een allergische reactie veroorzaken. Draag een Labcoat, handschoenen en een masker. - Voeg 2 mmol DIEA (0,36 mL) toe aan de buis en Vortex voor 0,5 – 1 min om het op te lossen.
- Voeg de geactiveerde Fmoc-Ala-OH toe aan het reactievat. Schud zachtjes met 120 rpm, 30 °C voor 40-60 min in een constant-temperatuurshaker en giet de oplossing vervolgens af met een vacuümpomp.
- Was de hars door de stappen 1.1.2-1.1.4 te herhalen.
- Voeg 4 mL van 20% (vol/vol) Piperidine in DMF toe aan de hars, schud het zachtjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en giet vervolgens de oplossing af.
Let op: Pyridine is zeer licht ontvlambaar en giftig. Voer de experimenten uit in een rook afzuigkap. - Voeg nog eens 4 mL van 20% (vol/vol) Piperidine in DMF toe aan de hars, schud het zachtjes gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en giet vervolgens de oplossing af.
- Volg de stappen 1.2.1-1.2.10 te koppel en debescherm de Fmoc-Ala-OH, Fmoc-thr-OH, Fmoc-CYS-OH, Fmoc-his-OH en Fmoc-Ala-OH. Herhaal stappen 1.2.5-1.2.10 om de Fmoc-TRP-OH, Fmoc-val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-glu-OH, Fmoc-Gly-Oh en Fmoc-ASP-Oh te koppel en debeschermen.
- Herhaal stap 1.1.2-1.1.4 om de hars grondig te wassen.
- Herhaal stap 1.1.3 om de hars te wassen en vervolgens de hars gedurende 5 minuten te stofzuigen.
- Voeg 1 mmol van de Fmoc-Ala-OH (934 mg) en 0,95 mmol van 1-[bis (Dimethylamino) methyleen]-1H-1, 2, 3-triazolo-[4, 5-b] Pyridinium hexafluorofosfaat 3-oxide (HATU) (360 mg) in een 5 mL buisje met 3 mL DMF.
- Decolleté van het hydrazine afgeleide FC-III ruw peptide
- Voeg 12 ml cocktails trifluorazijnzuur (TFA)/2 toe, 2 ′-(ethyleenedioxy) diethanethiol (Dodt)/triisopropylsilaan (tips)/m2O (92,5/2.5/2.5/2.5) aan de hars, en gebruik vervolgens een constant-temperatuur Shaker om de peptide van de hars op 200 rpm te klieven, 37 °C over 2 h. Filtreer het mengsel in een centrifugebuis van 50 mL.
- Voeg 1 mL cocktails toe aan de hars om het te wassen en vang het filtraat op in de centrifugebuis van 50 mL. Herhaal twee keer.
- Concentreer het mengsel op 2 mL door een vaper-rotor in een rook afzuigkap en voeg vervolgens 20 mL voorgekookte diethyl ether in de buis toe om ruwe peptiden te precipderen.
Opmerking: de watervrije ether moet worden voorgekookt tot 0 °C om te voorkomen dat er gewelddadige warmte vrijkomt, wat nevenreacties van het ruwe peptide kan veroorzaken. - Inbroed de peptide precipitatie bij-20 °C voor 1-2 h.
- Centrifugeer bij 5.000 x g, 4 °c gedurende 10 minuten en verwijder het oplosmiddel voorzichtig uit de centrifugebuis.
- Voeg tweemaal 20 mL voorgekookte diethylether toe aan de buis volgens de stappen 1.3.3-1.3.5 om de neerslag te wassen. Lucht-droog het peptide product in een horlogeglas voor ongeveer 15 min. Bewaar de gedroogde ruwe peptiden bij 4 °C voor verdere analyse.
- Zuivering van het hydrazine derivaat van een FC-III peptide
- Gebruik het High-Performance vloeistofchromatografie (HPLC) systeem om de peptide te zuiveren met een 30 min gradiënt elutie (0-1 min, 5% b; 1-20 min, 50% b; 20-25 min, 85% b; 25-30 min, 85% b) bij een debiet van 1 ml/min.
Opmerking: de kolom is in 4,6 mm ID, 250 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% TFA in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% TFA.
- Gebruik het High-Performance vloeistofchromatografie (HPLC) systeem om de peptide te zuiveren met een 30 min gradiënt elutie (0-1 min, 5% b; 1-20 min, 50% b; 20-25 min, 85% b; 25-30 min, 85% b) bij een debiet van 1 ml/min.
2. eiwit expressie en zuivering van linker-en antigeen onderdelen
- Plasmide constructie
- Synthetiseren van de hele gen sequentie die SUMO-linker-antigeen kan uitdrukken (Zie tabel van de materialen).
- Snijd 10 ng van PET-28a lege Vector en 50 ng van het gesynthetiseerde SUMO-linker-antigeen DNA-fragment met behulp van NcoI en XhoI in een 37 °C waterbad voor 3 uur.
- Reinig de dubbel-enzym verteerde vector en DNA fragment door DNA gel extraction Kit.
- Voeg 5 μL DNA verteerde DNA-fragment, 5 μL verteerde vector, 1 μL T4-DNA-ligase, 2 μL 10x ligase buffer en 7 μL ddH2O toe aan een reactie buis, en inincuberen het vervolgens 's nachts bij 16 °c.
- Meng 10 μL van het ligatie product van stap 2.1.4 in 100 μL van de bevoegde cellen (DH5α) en zet het op een ijsbad gedurende 30 min. plaats de bevoegde cellen in een water bad van 42 °C voor 90 s en breng het snel over in een ijsbad gedurende 2 minuten. Voeg 800 mL LB vloeibaar medium (zonder antibiotica) aan de buis en schud het bij 37 °C, 180 rpm voor 1 h. mantel de bevoegde cellen op een kanamycine LB plaat om ze gelijkelijk verdeeld te maken, en zet de plaat 's nachts in een 37 ° c incubator.
- Kies 5 enkele kolonies van de plaat en kweek de bacteriën in 5 mL LB medium in een reageerbuis met een 37 °C Shaker.
- Extract plasmiden uit de bacteriën geoogst uit stap 2.1.6 met behulp van plasmide extractie Kit.
- Stuur de plasmiden voor gensequencing en kies de positieve kolonie die SUMO-linker-antigeen fusie-eiwit kan uitdrukken. Transformeer de positieve plasmide naar BL21 (DE3) plysS bevoegde cellen na stap 2.1.5.
- Eiwit zuivering
- Kies een enkele kolonie van transformanten uit stap 2.1.7 in 5 mL LB vloeibaar medium met kanamycine (50 μg/mL). Schud de culturen 's nachts bij 200 rpm, 37 °C.
- Inoculeren 1 L voorverwarmde LB medium met kanamycine (50 μg/mL) in een kolf met 5 mL van de nachtelijke culturen, en groeien bij 37 ° c met krachtig schudden, totdat de OD600 0,6 is.
- Voeg Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) toe aan de gemiddelde tot de eindconcentratie van 0,4 mM en schud de kolf met 200 rpm 's nachts bij 20 °C.
Opmerking: lage temperatuur voor eiwit inductie is belangrijk om te voorkomen dat inclusie lichaam vorming, dus zorg ervoor dat de temperatuur is niet meer dan 22 °C. - Na het oogsten van de cellen, voeg 50 mL lysisbuffer toe aan de celpellets om de cellen te hervatten. Sonicate de celllysates tweemaal gedurende 5 minuten bij 200 W, echografie 3 s, interval 3 s op ijs. Centrifugeer het op 15, 000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c om de supernatants te verzamelen.
NB: de lysisbuffer bestaat uit 50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 10 mm imidazol. Stel de pH-waarde in op 8,0 met behulp van NaOH. - Voeg 2 ml van de 50% ni-NTA sephorase, geevenwichts door lysisbuffer, toe aan de geklaard supernatanten en meng zachtjes door schudden (200 rpm op een roterende Shaker) bij 4 °c gedurende 1 uur.
- Laad het lysaat-en ni-NTA-mengsel in een kolom met de onderste uitlaatklep en verwijder de onderste dop en gooi de kolom doorstroom weg.
- Was driemaal met 6 mL wasbuffer en elueer het beoogde eiwit 3 keer met 1,5 mL eletie buffer. Verzamel het eluaat in één buis.
Opmerking: de wasbuffer bestaat uit 50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 30 mm imidazol. Stel de pH-waarde in op 8,0 met behulp van NaOH. De elutie buffer bestaat uit 50 mM NaH2po4, 300 mM NaCl, 250 mm imidazol. Stel de pH-waarde in op 8,0 met behulp van NaOH. - Plaats het eluaat in een dialyse zakje in 1 L van 50 mM PBS bij 4 °C om het eiwit te dezout. Vervang nieuwe fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 3 keer.
- Splijting van de SUMO-tag
- Voeg 2 mL kleine Ubiquitin-achtige modifier (SUMO) gelabelde eiwitten toe bij de concentratie van 1 mg/mL, 1 mL SUMO protease (Zie tabel van de materialen), 1 ml van de 10X Sumo protease buffer en 6 ml DDH2O om de reactie oplossing te bereiden.
Opmerking: SUMO tag eiwitconcentratie is ongeveer 1 mg/mL. Overmatige concentraties na enzym vertering kunnen de coagulatie van het eiwit veroorzaken. - Inbroed het mengsel voor 12-16 uur bij 4 °C.
- Centrifugeer het mengsel op 15.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en gooi de aggregaten weg. Voeg 0,5 ml van de 50% ni-NTA slurry, met een evenwichts afwijking van 50 mm PBS, toe aan de 10 ml supernatanten en meng zachtjes door schudden (200 rpm op een roterende Shaker) bij 4 °c gedurende 60 min.
- Laad het lysaat en het ni-NTA mengsel in een kolom met de onderste uitlaat afgetopt. Verwijder de onderste dop en sla de stroom vervolgens op in een centrifugebuis van 15 mL.
Opmerking: Histahet SUMO-eiwit is bindend voor de kolom. Het linker-antigeen deel, dat begint met CYS voor NCL-reactie, is in de stroom doorheen. - Centrifugeer de stroom gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 15.000 x g en gooi de aggregaten weg. Reinig het linker-antigeen-onderdeel met behulp van HPLC met een gradiënt elutie van 25 min (0-1 min, 5% B; 1-3 min, 15% B; 3-20 min, 45% B; 20-21 min, 85% B; 21-25 min, 85% b) bij een debiet van 1 mL/min.
Opmerking: de kolom is in 4,6 mm ID, 250 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% TFA in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% TFA. - Verzamel het gezuiverde product van de HPLC en vriesdrogen 's nachts in om het linker-antigeen product te krijgen.
- Voeg 2 mL kleine Ubiquitin-achtige modifier (SUMO) gelabelde eiwitten toe bij de concentratie van 1 mg/mL, 1 mL SUMO protease (Zie tabel van de materialen), 1 ml van de 10X Sumo protease buffer en 6 ml DDH2O om de reactie oplossing te bereiden.
3. montage van DCAF1 door inheemse chemische ligatie
- Samenvoegen van FC-III peptide en linker-antigeen deel
- Weeg 1,8 mg (1 μmol) hydrazine derivaat van een FC-III peptide in een 2 mL EP Tube en Voeg 0,8 mL 6 M GnHCl toe in 0,2 M NaH2po4 (pH 3,0) oplossing om het op te lossen door vortexing.
Opmerking: 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2po4 (pH 3,0) oplossing wordt bereid door de pH-waarde aan te passen met HCl of NaOH.
Let op: NaOH en HCl zijn zeer corrosief. Draag een Labcoat, handschoenen en een masker. - Na het centrifugeren van de buis bij 7.200 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur, zet de buis in een ijszout bad en gebruik het magnetische roeren om de oplossing gedurende 15 minuten zachtjes te agiteren.
- Voeg 40 μL 0,5 M NaNO2 toe aan de oplossing om de hydrazine groep te oxideren. Roer de oplossing zachtjes voor nog eens 15 minuten in het ijszoutbad.
- Weeg en voeg 11 mg gezuiverd linker-antigeen deel bereid uit stap 2,3 en 13,6 mg 4-mercaptophenylazijnzuur (MPAA) in de reactie buis in het ijszoutbad, roer gedurende 5 minuten en pas vervolgens de pH-waarde aan op 6,8-7,0 bij kamertemperatuur met 6 M NaOH.
Opmerking: de pH-waarde op neutraal instellen is de kritieke stap om de ligatie reactie te initiëren. - Voeg na 12 uur 0,4 mL van 0,1 M Tris (2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride (TCEP) neutrale oplossing (pH 7,0) toe aan het reactiesysteem en roer gedurende 20 minuten om de reactie te beëindigen.
Opmerking: 0,1 M TCEP neutrale oplossing (pH 7,0) wordt bereid door het oplossen van TCEP in 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2po4 (pH 3,0) oplossing, en het gebruik van NaOH om de pH-waarde aan te passen 7,0. - Centrifugeer de buis bij 15.000 x g gedurende 10 minuten, analyseer en reinig het ligatie product met HPLC met een verloop-elutie van 26 min (0-1 min, 5% b; 1-21 min, 45% b; 21-22 min, 85% b; 22-26 min, 85% b) bij een debiet van 1 ml/min. Het verwachte rendement voor de ligatie reactie is meer dan 50%.
Opmerking: de kolom is in 4,6 mm ID, 250 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% TFA in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% TFA.
- Weeg 1,8 mg (1 μmol) hydrazine derivaat van een FC-III peptide in een 2 mL EP Tube en Voeg 0,8 mL 6 M GnHCl toe in 0,2 M NaH2po4 (pH 3,0) oplossing om het op te lossen door vortexing.
- Ontzwaveling van het geconjugeerde
- Los het geconjugeerde (3,4 mg, 0,3 μmol) op, bereid uit stap 3.1.6 in 50 μL van 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2po4 (pH 7,0) oplossing.
- Voeg 50 μL van 1 M TCEP, 10 μL tBuSH en 5 μL 0,1 M VA-044 oplossing toe aan het bovenstaande mengsel.
Opmerking: 0,1 M VA-044 oplossing wordt bereid door het oplossen van 9,7 mg VA-044 poeder in 0,3 mL van 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2po4 (pH 7,0) oplossing. De VA-044-oplossing moet vóór gebruik vers worden bereid, omdat VA-044 gemakkelijk kan worden geoxideerd door blootstelling aan lucht. - Stel de uiteindelijke pH van de oplossing in op 6,9 en houd de solutiomat 37 °C gedurende ongeveer 5 uur roeren.
- Centrifugeer de buis bij 15.000 x g gedurende 10 minuten en verwijder de onoplosbare stof. Analyseer en reinig het ligatie product met HPLC met een verlopende elutie van 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) bij een debiet van 1 mL/min. Het verwachte rendement voor de ontzwavelings reactie is ongeveer 40%.
Opmerking: de kolom is in 4,6 mm ID, 250 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% TFA in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% TFA.
- Verwijdering van ACM om het eindproduct te krijgen DCAF1
- Los de peptide (1,35 mg, 0,11 μmol) op, bereid uit stap 3.2.4 in 200 μL 32 mM AgOAc, en roer vervolgens het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
- Voeg 3 μL 1M Dithiothreitol (DTT) toe in 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2po4 (pH 7,0) oplossing om de zilver thiolaten op peptide te converteren naar vrije thiolen.
- Na hevig roeren gedurende 1 minuut, centrifugeer de buis op 15.000 x g gedurende 10 minuten om de onoplosbare stof te verwijderen. Analyseer en reinig het eindproduct met HPLC met een verlopende elutie van 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) bij een debiet van 1 mL/min. Het verwachte rendement voor de ACM deprotection-reactie is ongeveer 30%.
Opmerking: de kolom is in 4,6 mm ID, 250 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% TFA in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% TFA. - Na HPLC-zuivering het eindproduct 's nachts bevriezen en los het poeder op in PBS (50 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 8,0). Centrifugeer de buis bij 15.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en gooi de pellet weg.
- Pas de concentraties van het eindproduct (van stap 3,4) en linker-antigeen deel (van stap 2.3.6) tot 10 μM, noteer de circulair dichroïsme (CD) spectra van 260 tot 195 nm van deze twee producten met behulp van een CD-spectrometer bij 25 ° c met 1 mm padlengte.
Opmerking: CD-spectra worden gebruikt om aan te tonen dat de hoeveelheid α-spiraalvormige structuur in het eindproduct gelijk is aan die in de recombinant uitgedrukt.
4. detectie van de producten door massaspectrometrie
- Scheid het product van elke chemische reactie met een 60 min gradiënt elutie (0-8 min, 2% b; 8-10 min, 5% b; 10-35 min, 30% b; 35-50 min, 50% b; 50-52 min, 80% b; 52-58 min, 80% b; 58-59 min, 2% b; 59-60 min, 2% a) bij een debiet van 0,300 μL/min met een Nano-HPLC-systeem dat direct wordt afgewisseld met de hoge resolutie massaspectrometer.
Opmerking: de analytische kolom is in 75 μm ID, 150 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% mierenzuur in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% mierenzuur. - Bedien de massaspectrometer in de Full-scanmodus en stel het m/z-bereik in op 300-2000 en resolutie op 60.000.
- Open de Mass Spectra data en vind de toppen van het product in elke stap om te bevestigen dat de chemische reactie succesvol is voorbereid.
5. ELISA-test van de interactie tussen DCAF1 en 4G2-antilichamen
- Coat een 96-well microtiterplaat met 1 pmol anti-GST antilichaam (Zie tabel van de materialen) in 100 μL coating buffer/put, verzegelen de plaat en incuberen het bij 4 °c 's nachts op een shaker.
- Blokkeer elk goed met 200 μL van 1% BSA in PBS, sluit de plaat af en incuberen deze bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een shaker.
- Was elke Put 4 keer door PBS te gebruiken met 0,05% Tween 20.
- Voeg het GST-gesmolten antigeen-eiwit (0,05 pmol in 100 μL blokkerende oplossing) toe aan de putjes, sluit de plaat af en incuberen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: GST-gesmolten antigeen-eiwit wordt uitgedrukt in bacteriën en gezuiverd door GSH Sepharose. - Herhaal stap 5,3 om de plaat te wassen.
- Voeg 1 pmol 4G2-antilichaam of 1 pmol 4G2-antilichaam plus de andere liganden toe: antigeen, FC-III of DCAF1 bij serie hoeveelheden (0,1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol en 1000 pmol) in 100 μL blokkerende oplossing/goed, sluit de plaat af en inbroed 2 uur bij kamer
- Herhaal stap 5,3 om de plaat te wassen.
- Voeg anti-muis IgG, HRP-linked antilichaam (1:20000 verdunning) toe in 100 μL blokkerende oplossing/goed, sluit de plaat af en inincuberen 30 min bij kamertemperatuur op een shaker.
- Was elke put 6 keer door PBS te gebruiken met 0,05% Tween 20.
- Meng TMB-reagens A en B 1:1 in volume onmiddellijk vóór gebruik, voeg 100 μL/goed toe en inincuberen 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Voeg 100 μL/put van stop oplossing toe en gebruik een plaat lezer om de OD450 -waarden voor elke put binnen 30 minuten te meten.
6. ELISA-test van de interactie tussen FC-III en IgG-molecuul
- Coat een 96-well microtiterplaat met 1 pmol anti-CA antilichaam (Zie tabel van de materialen) in 100 μL coating buffer/put, verzegelen de plaat en incuberen deze bij 4 °c 's nachts op een shaker.
- Herhaal de stappen van 5,2 tot 5,3.
- Voeg de FC-III of FC-III-4C gesmolten CA-eiwit (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 en 1 pmol in 100 μL blokkerende oplossing) toe aan de putjes, sluit de plaat af en incuberen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: FC-III of FC-III-4C gesmolten CA-eiwit wordt uitgedrukt in bacteriën en gezuiverd door ni-NTA. - Herhaal de stappen van 5,7 naar 5,11 en controleer de resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het stroomdiagram voor de syntheseroute door inheemse chemische ligatie in dit artikel wordt weergegeven in Figuur 1. Figuren 2-6 Toon de chromatogrammen (A) en massa spectra (B) van chemisch gesynthetiseerd hydrazine derivaat van een FC-III-peptide, recombinant uitgedrukt linker-en antigeen-deel, het gezuiverde product van de NCL-reactie, de gezuiverde product uit de ontzwavelings reactie en het gezuiverde eindproduct DCAF1, respectievelijk. De chromatogrammen tonen de zuivert van alle producten meer dan 90%, terwijl de massa Spectra na elke reactie het molecuulgewicht van het product aangeven. De deconvolutionele molecuulgewichten worden ook weergegeven in figuren 3-6, die het nauwkeurige molecuulgewicht van elk product weerspiegelen. Figuur 7 toont het principe van de Elisa-assay (a) en de resultaten van antigeen-peptide, FC-III en DCAF1, competitief remmen 4G2-antilichaam binding. Zowel antigeen peptide als DCAF1 blokkeren de 4G2-binding significant, terwijl de FC-III-peptide geen invloed heeft op de antigeen-antilichaam interactie.
Figuur 1. De workflow van de inheemse chemische ligatie methode voor de semi-synthese van DCAF1 molecuul.
Ten eerste wordt de hydrazine derivaat van een FC-III-peptide verkregen door een solide fase peptide synthese. Dan, de SUMO tag gesmolten linker en antigeen deel wordt uitgedrukt en gezuiverd van bacteriën, gevolgd door de SUMO tag decolleté. Na de NCL-reactie van de twee fragmenten ondergaat het product ontzwaveling en verwijdert het de ACM-groepen om DCAF1 molecuul te worden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Het chromatogram en het massaspectrum van het hydrazine derivaat van een FC-III peptide.
Dit cijfer toont aan dat het LC-Profiel van het gezuiverde peptide (a) en de mono-isotopen piek bij m/z 915,92 overeenkwam met de maat-aangeladen peptide (B). Dit cijfer is gewijzigd van verwijzing 10, figuur 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Het chromatogram en het massaspectrum van het linker-en het antigeen deel.
Deze afbeelding toont het LC-Profiel van het gezuiverde fragment (a) en het deconvolutional molecuulgewicht van dit fragment wordt berekend als 9429,0 uit het massaspectrum (B). Dit cijfer is gewijzigd van referentie 10, figuur S2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Het chromatogram en het massaspectrum van het conjugatie product door de NCL-reactie.
Deze afbeelding toont het LC-profiel dat het ligatie product bewaakt op 0 h (boven), 12 h (midden) en het gezuiverde peptide (onder) (A) en het deconvolutionele molecuulgewicht van dit product wordt berekend als 11227,0 uit het massaspectrum (B). Dit cijfer is gewijzigd van referentie 10, figuur S2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5. Het chromatogram en het massaspectrum van het product na ontzwavelings reactie.
Deze afbeelding toont het LC-Profiel van het gezuiverde product (a) en het deconvolutional molecuulgewicht van dit product wordt berekend als 11195,0 uit het massaspectrum (B). Dit cijfer is gewijzigd van referentie 10, figuur S2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6. Het chromatogram, massaspectrum en CD-spectra van het molecuul DCAF1.
Deze afbeelding toont het LC-Profiel van de gezuiverde DCAF1 (a), het deconvolutional molecuulgewicht van dit molecuul berekend als 11053,0 uit het massaspectrum (B) en de cd-spectra van het eindproduct (ononderbroken lijn) en het linker-antigeen deel ( streepjeslijn) in FCAF1. Dit cijfer is gewijzigd van verwijzing 10, figuur 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7. ELISA-test van DCAF1 molecuul.
A) de workflow van de sandwich-Elisa-test. Eerste anti-GST antilichaam is gecoat op een goed bord. Vervolgens wordt GST-Fused antigeen peptide geïnineerd. Vervolgens wordt 4G2 antilichaam met verschillende concentraties van DCAF1, antigeen of FC-III toegevoegd voor colorimetrische analyse. B) de ELSIA-resultaten van antigeen, FC-III en DCAF1 die remming van de effecten van 4G2-binding met verschillende ligand concentraties aantonen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschrijft de semi-synthese en detectie van DCAF1 met behulp van NCL benadering, die wordt weergegeven in Figuur 1. Kort, de twee fragmenten van DCAF1 zijn chemisch gesynthetiseerd en recombinantly uitgedrukt, respectievelijk; dan, de volledige lengte DCAF1 molecuul wordt geassembleerd, aangepast en gezuiverd. Voor de door hydrazine afgeleide FC-III-fragment synthese is het gebruik van 2-cl-hars met lage capaciteit heel belangrijk, omdat een hoge capaciteit een negatief effect heeft op de aanmaak van hydrazine en leidt tot een lage opbrengst van het product. De linker-en antigeen deel worden uitgedrukt met SUMO tag om twee redenen: eerste, SUMO tag kan de oplosbaarheid van de fusie-eiwitten verbeteren; tweede, SUMO protease is een conformatie-erkende protease, die het mogelijk maakt het vrijgegeven product te starten met CYS residu voor de verdere ligatie reactie. Een van de meest kritische stappen in eiwit expressie en zuivering is de SUMO protease decolleté. De concentratie van SUMO tag-gesmolten eiwit moet worden aangepast aan het juiste bereik. Een te hoge of te lage concentratie zou leiden tot eiwit aggregatie of moeilijkheden voor de verdere zuivering na de spijsvertering. Een andere kritieke stap van dit protocol is het aanpassen van de pH-waarde tijdens de NCL-reactie, die is gebaseerd op thiol-Ester-uitwisseling die in neutrale buffer moet gebeuren. Fijne controle van de pH-waarde in de reactiebuffer is nuttig om de ligatie-efficiëntie te verbeteren.
Dit protocol is geschikt voor de synthese van andere DCAF moleculen met verschillende antigeen sequenties, omdat de sequenties van verschillende DCAF moleculen zijn vrij gelijkaardig en het antigeen deel meestal weinig bijdraagt aan de hele structuur en de aard van DCAF. We gebruikten dit protocol bijvoorbeeld om nog drie DCAF moleculen te synthetiseren om hun verwant antilichamen te targeten. Onder hen, DCAF4 is ontworpen om te blokkeren mAb35 antilichamen, die acetylcholine receptor kan neutraliseren en veroorzaken myasthenia gravis in een rat model. We gebruikten DCAF4 om de klinische symptomen bij ratten te verminderen met mAb35-geïnduceerde myasthenia gravis, en de acetylcholine receptor te redden door remming van de complement component eiwitten.
De toepassing van onze techniek wordt beperkt door verschillende factoren: ten eerste, de opbrengst van DCAF molecuul gesynthetiseerd door de huidige aanpak is laag (meestal minder dan 10%) vanwege de meerdere zuiveringsstappen; Ten tweede zijn antilichamen met conformationale determinanten moeilijk te targeten door DCAF; derde, DCAF kan induceren extra immuunrespons in organismen in vergelijking met traditionele kleine samengestelde drug. Wij stellen voor dat de toepassing van dit protocol op andere antilichaam-geïnduceerde pathologische omstandigheden zal helpen bij het synthetiseren van meer DCAF moleculen gericht elimineren van schadelijke antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd deels gesteund door de Tsinghua University-Gates Foundation (nr. OPP1021992), de National Natural Science Foundation of China (nr. 21502103, 21877068 en 041301475), en het nationale sleutel onderzoeks-en ontwikkelingsprogramma van China (nr. 2017YFA0505103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. Human Physiology (4th ed.). , Thomson Learning. (2003).
- Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
- Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
- Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
- Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
- Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
- Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
- Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
- Vikas, K., Kaminski, H. J.
- Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
- Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
- Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
- Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
- Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).
