Summary
本研究的目的是通过测试1-90年后脑动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）后脑梗死和感觉运动功能，建立和验证用于脑缺血恢复和后遗症阶段研究的动物模型。在老鼠天。
Abstract
本研究的目的是建立和验证动物脑缺血模型在恢复和后遗症阶段。选择了雄性斯普拉格-道利大鼠的中脑动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型。通过改变大鼠的重量（260–330克），使用Longa的得分和TTC染色筛选出螺纹螺栓类型（2636/2838/3040/3043）和脑梗死时间（2-3小时），隆加的分数越高，梗死体积越大，模型成功率也更高。通过评估感觉运动功能和梗塞体积，在重新灌注后的1-90天观察期内获取并使用了最佳模型条件（300 g、3040螺纹螺栓、3小时脑梗死时间）。在这些条件下，双边不对称试验有1至90天的显著差异，网格行走试验有1天至60天的显著差异;两者的差异可能是一个合适的传感器电机功能测试。因此，在脑缺血的恢复和后遗症阶段发现一种新型大鼠模型的最合适条件：300克大鼠用3040螺纹螺栓进行MCAO治疗，用于3小时脑梗死，然后重新注入。适当的传感器运动功能测试是双边不对称测试和网格行走测试。
Introduction
脑缺血分为三个阶段，不同的中风后指标：急性阶段（1周内）、恢复阶段（1周至6个月）和后遗症阶段（6个月以上）。目前，大多数研究都集中在脑缺血的急性期，因为它有显著的影响和多相对的研究模型1，2，3。然而，脑缺血的恢复和后遗症，由于其长期的残疾并发症，不能忽视。因此，本研究的目的是探索一个稳定、可靠和相对简单的动物模型，研究脑缺血的恢复和后遗症。
在众多实验性脑缺血模型中，我们通过螺纹螺栓插入右中脑动脉（MCA）使用中脑动脉闭塞（MCAO）。该模型类似于人类中风，它可以产生更大的梗塞体积，导致许多与中风相关的行为障碍，并可以通过去除螺纹螺栓4，5，6允许血液再灌注（R）。MCAO/R也被认为是脑缺血7的黄金标准动物模型。此外，脑损伤的严重程度取决于螺纹螺栓的直径和插入长度，脑缺血的持续时间，以及动物体重（大鼠大脑更大，脑血管较厚）8。因此，通过改变螺纹螺栓类型、梗死时间和大鼠重量，可以为MCAO/R大鼠脑缺血的恢复和后遗症找到合适的模型。为了验证大鼠模型，我们使用 TTC 染色和传感器运动功能实验（双边不对称测试、网格行走测试、轮盘试验和提升绳测试）对 MCAO/R 模型进行了为期 1 天、35 天、60 天和 90 天的研究。
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Protocol
动物受试者的程序和使用已获得国家卫生研究院批准用于照料和使用实验室动物。该协议针对中脑动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）和感觉运动功能的测试进行了专门调整。
1. 实验设计和分组
- 使用大鼠 MCAO/R 模型筛选大鼠脑缺血模型方法，使用 Longa 的得分和 TTC 染色，具有更严重的脑损伤和更高的模型成功率。
- 对体重为260~330克、年龄为7~9周的雄性斯普拉格-道利大鼠进行实验。真正的大鼠重量为 275 × 15 g，275 g 为 300 g ，320 ± 10 g 为 320 g。
- 使用以下七个分组（重量、螺纹螺栓类型、梗死时间）：组 1 与 15 个大鼠（275 克、2636、2 小时）;组2与15个大鼠（275克，2636，3小时）;组3与15个大鼠（275克，2838，2小时）;组4与15个大鼠（275克，2838，3小时）;组5与13个大鼠（300克，3040，3小时）;组6与10个大鼠（320克，3040，3小时）;组7与13个大鼠（300克，3043，3小时）。
- 通过TTC染色研究大脑恢复状态，并使用适当的传感器运动功能测试，通过双边不对称测试、网格行走试验、旋转试验和提升绳测试，在MCAO/R测试1、35、60、90天之后，以表明长期功能缺陷。
- 使用体重为300~10克、年龄为8~9周的雄性斯普拉格-道利大鼠。
- 使用以下五个分组：包含 20 个大鼠的对照组（正常组）;1天组，有16只老鼠;一个35天的小组，有16只老鼠;60天组，有17只老鼠;和一个90天的小组，有19只老鼠。
- 在步骤 1.1 或步骤 1.2 中的传感器运动功能测试中，在 Longa 得分后，麻醉并斩首所有用于 TTC 染色的大鼠。
2. 在大鼠中建立单方面的MCAO/R模型9
注：在手术过程中，轻轻使用微钳以防止血管破裂。隔离血管时，避免损伤大鼠颈部的神经和其他血管。必须小心，为所有生存外科手术提供适当的无菌技术。视频后面介绍的技术应该在整个过程中练习。
- 在整个手术过程中，在小型动物恒温器中保持大鼠的体温在37.0~0.5°C。准备四个 6 厘米 5-0 缝合线。
- 将小型动物麻醉机（带废气处理装置）的氧气流量设定为0.4~0.6 L/min，异苯可联的浓度为5%。把老鼠放在麻醉机里。
- 动物昏倒后，把老鼠放在手术固定台上。将大鼠的嘴连接到麻醉机的面罩（氧气流量保持不变;将异常的浓度调整为3%）。通过观察缺乏四肢张力、角膜反射和疼痛，确认动物已进入深度麻醉。
- 用纸绷带（或其他工具）固定四肢，使其躺在手术台上。
- 用电动量勒去除颈部涂层，用75%酒精消毒（碘化物更好）。用钩子固定老鼠的嘴。
- 用眼科剪刀沿颈部中央纵向形状切割 2⁄3 厘米。
- 分离常见的胡萝卜动脉。用眼科钳子分离皮下肌肉。使用自制缩回器完全暴露视野。用眼钳分离气管的前肌肉后，沿着右胸肌腱分离，直到常见的胡萝卜动脉可见。
- 用眼科钳子隔离常见的胡萝卜动脉、外部胡萝卜动脉和内颈动脉。利盖特常见的胡萝卜动脉（硬结），外部胡萝卜动脉远离心脏端（硬结），和内胡萝卜动脉（松结）与5-0缝合。用5-0缝合线，在心脏末端附近的外部胡萝卜动脉。
- 插入螺纹螺栓。使用眼科剪刀在外颈动脉中切开一个小开口，然后轻轻插入螺纹螺栓。缝合一直松结的外部胡萝卜动脉的缝合，并切断外部胡萝卜动脉。
- 松开内颈动脉的松结，继续将螺纹螺栓插入中脑动脉的开头（缝合标记）。然后切断外露的螺纹螺栓。
- 到达缺血时间（2-3 小时）后，用一个微钳固定外部胡萝卜动脉的断裂，用另一个微钳轻轻拉出螺纹螺栓。当螺纹螺栓的前端完全从内部颈动脉中拉出时，用 5-0 缝合线衬砌的外部胡萝卜动脉，然后完全拉出螺纹螺栓。
- 松开常见的胡萝卜动脉，在伤口表面涂抹50，000 U的青霉素钠粉，防止感染。缝合皮下肌肉和皮肤与4缝合。
- 使用1 mL注射器（SQ-PEN注射更好）向大鼠口服±0.2 mL无菌盐水，以防止将大鼠放回笼子后术后缺水。
- 根据隆加的得分10，在24小时重新灌注后选择动物。在步骤 1.1 中为下一个 TTC 染色选择 Longa 得分为 1⁄3 的动物，选择 Longa 得分为 2+3 的动物，在步骤 1.2 中学习 1、35、60、90 天。
注：隆加的得分是10：0，没有神经缺陷;1分，未能延长左前角;2分，向左盘旋;3分，落在左边;4分，不能自发行走，有抑郁意识。 - 通过单向方差分析隆加的得分。显示的值表示平均值 = S.D. P < 0.05 表示差异。
3. TTC 染色
注：大鼠脑切片模具和刀片在使用前必须在-20°C冰箱中预冷却，以防止因温差大而引起粘附。在染色过程中，防止脑切片和培养板之间的粘附，这可能导致染色不足。
- 在 Longa 在步骤 1.1 中得分或步骤 1.2 中的传感器运动功能测试之后，通过 400 mg/kg 氯水合物的腹内注射来麻醉大鼠。
- 用手术剪刀或老鼠斩首器将老鼠斩首。用手术剪刀和止血钳切除大脑。
- 将大脑置于-20°C的冰箱中30分钟，以方便切片。
- 从冰箱中取出大脑，并将其放入预冷却的大鼠脑切片模具中。使用预冷却刀片将大脑切成六个 2 毫米厚的连续部分。
- 在 6 孔培养板中用 2% 5-三苯-2H-四氯二氯甲酸酯 （TTC） 染色。
- 在摇动的床上在37°C下将部分培养30-60分钟。每10分钟翻转一次部分，直到大脑缺血区和正常区域明显为白色和红色。
- 按从大脑背面到前部垂直切片的顺序排列。使用标尺确保每行的总长度相同。使用数码相机拍照。
- 分析梗塞卷。
- 使用照片店软件预处理照片
- 使用照片店 CS6 导入照片。00:00-00:14
- 单击"选择"以选择脑切片，单击"选择|反向.00:15-00:36
- 单击"前景"以选择黑色并单击"确定"。00:37-00:42
- 按Alt +删除以填充背景颜色，按CTRL +D取消选择。00:43-00:46
- 单击文件|保存到桌面。00:47-01:08
- 使用 Image Pro Plus 软件预处理照片。
- 打开图像专业加6.0软件，并导入照片。01:09-01:24
- 对于缺陷修改，使用对比度增强工具调整亮度，使背景为黑色。01:25-01:37
- 使用"滤镜"中的"中值"工具删除高光。01:38-01:46
- 使用 Image Pro Plus 软件计算左（正常）大脑区域
- 使用分割选择颜色并调整H/S/I值，使大脑切片与黑色背景分离。01:47-02:12
- 返回计数|大小。02:13-02:16
- 点击计数|在"编辑"中拆分对象以将大脑与中线分开。该软件将自动区分左脑和右脑区域。02:17-02:49
- 使用 Image Pro Plus 软件计算正确的梗死大脑区域
- 实施步骤 3.8.1-3.8.2。02:50-03:14
- 选择计数|大小。03:15-03:21
- 点击绘图|在"编辑"中合并对象工具。手动选择缺血区，然后单击"计数"以计算缺血区。03:16-05:31
- 使用 Image Pro Plus 软件计算健康大脑区域
- 实施步骤 3.8.1-3.8.2。05:32-06:44
- 使用分割选择颜色并调整H/S/I值，使脑切片的正常部分与黑色背景分离。06:45-07:10
- 返回计数|大小并单击"计数"以计算此区域。07:11-07:21
- 单击"编辑"中的"拆分对象"以将大脑与中线分开。 该软件将自动区分左脑和右脑区域。07:22-08:08
- 使用照片店软件预处理照片
- 计算梗塞体积 （%）和梗塞和收缩体积 （%）：
梗塞体积 （%） = [右梗区/（2 x 左脑区域）] x 100。
梗塞和收缩体积 （%） = [（左脑区域 - 右健康脑区域） / （2 x 左脑区域）] x 100。
注：右脑是受伤部位。数据由单向方差分析分析。显示的值表示平均值 = S.D. P < 0.05 表示差异。
4. 评估传感器电机功能
注：选择Longa得分为2⁄3的大鼠（300克，3040螺纹螺栓，3小时脑梗死时间），从1-90天开始进行传感器运动功能实验。在学习期间保持安静，不要打扰动物。数据由双向方差分析。显示的值表示平均值 = S.D. P < 0.05 表示差异。
- 双边不对称测试11
- 用同样的压力将纸带（5厘米长，0.8厘米宽）包裹在大鼠每个前爪的树皮部分三次。
- 对于每只大鼠，记录每只前爪接触的次数，用相机在5分钟内取出胶带，包括不受影响的爪子时间和受影响的爪子时间。
- 30 分钟后，再次重复步骤 4.1.1 和 4.1.2。
- 计算传感器运动偏置的平均值 （%）：
感觉运动偏置 （%） = （不受影响的爪子时间 - 受影响的爪子时间）//（未受影响的爪子时间 + 受影响的爪子时间） x 100
- 网格行走测试
- 将大鼠放在高架网格表面平台的中心（面积：1 m2;高度：90 厘米），网格开口为 2.5 厘米2。
- 轻轻推大鼠的臀部，鼓励大鼠穿过网格表面。
- 使用相机在 1 分钟内记录未受影响的（右）和受影响的（左）四肢造成的足部故障数以及总步数。
- 计算错误时间：
错误时间 （%） = [未影响（右）肢体 - 受影响的（左）肢体]/总步数 x 100。
注： 删除了低于 20 步数据的步骤总数。
- 罗塔罗德测试12，13
- 使用支持软件在计算机上设置大鼠旋转杆疲劳装置（直径 90 mm），速度为 13 rpm，持续 5 分钟。
- 启动计算机程序，同时将大鼠放在轮状梯级上。
- 如果大鼠从运行中掉下来或持续行走 5 分钟并记录旋转时间，则结束试验。
- 让老鼠休息30分钟。
- 重复步骤 4.3.2_4.3.4 两次，然后选择最大值作为最后一个旋转时间。
- 提升绳测试14
- 将起重绳仪器（高 70 厘米;绳索直径 0.2 厘米，长 40 厘米）放在桌子上。
- 让老鼠用前肢抓住绳子，把老鼠吊起来。
- 记录悬挂时间并计算分数。
注：绳索上3：0⁄2秒的分数;绳子上2：3⁄4秒的分数;绳子上1：5~6秒的分数;分数为 0：超过 7 秒。
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Representative Results
使用上述程序为MCAO/R模型与隆加的分数和TTC染色，平均重量（275/300/320克），螺栓类型（2636/2838/3040/3043的不同处理;表 1）缺血时间（2-3小时）和1天再灌注用于筛选大鼠最佳脑缺血模型。300 g 重量、3040 螺纹螺栓和 3 小时脑梗塞时间的模型参数最适合面临的最大脑梗死、最高龙加的得分和最大的模型成功率。在275g重量、2636螺纹螺栓和2小时脑梗死时间的传统处理上，这一方法得到了显著改善（图1）。
此外，具有 300 g 重量、3040 螺纹螺栓、3 小时脑梗塞时间和 2⁄3 Longa 分数的大鼠接受了传感器运动功能测试（双边不对称测试、网格行走测试、轮状测试和提升绳测试）和 TTC 染色，以研究恢复过程1-90天脑缺血状态。在MCAO/R之后的1天、35天、60天和90天之后，梗塞和收缩量分别为23.4%、19.6%、16.1%（P <0.01，与第一天相比）和15.7%（P <0.01，与第一天相比）。 在MCAO/R之后的第一天，梗塞量最大。随着时间的推移，梗塞体积变小，收缩体积变大。在 MCAO/R 60 天后，梗塞和收缩体积不再改变。
双边不对称试验中的感应电机偏差、网格行走试验中的网格行走误差时间和提升绳测试中的提升绳得分均显著增加，而轮式试验中的旋转时间在1之后明显减少。MCAO/R的一天（图3），表明所有四个测试在急性脑缺血阶段都有意义。然而，在 MCAO/R 35 天、60 天和 90 天之后，只有感觉运动偏差以时间依赖的方式维持较大的功能障碍。在MCAO/R的35天和60天后的网格行走测试中，网格行走误差时间存在显著差异。结果表明，双边不对称试验和网格行走试验可适用于大鼠的恢复和后遗症阶段的传感器运动功能测试。
图1：300g重量，3040螺纹螺栓，3小时脑梗死时间可能是MCAO/R引起的脑缺血损伤的最佳条件。（A，B）脑组织梗塞体积的图片和形图（n = 9+12）。（C） 隆加的分数 （n = 9+12）。（D） 大鼠模型成功率的统计（n = 10+15）。模型成功率 = （大鼠总数 - MCAO/R 之后的死亡大鼠 - MCAO/R 之后的失败大鼠）/大鼠总数。失败大鼠是模型大鼠没有合适的隆加分数。误差柱表示 S.D.， =P < 0.05， =P < 0.01。这个数字已由刘等人15日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：在MCAO/R之后，梗塞和收缩量逐渐从1天下降到90天。（A） 大鼠脑组织的TTC染色.（B） 梗塞和收缩体积的形图 （n = 16-19）。误差柱表示 S.D.， =P < 0.01 与 MCAO/R 之后的第一天。这个数字已由刘等人15日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：双边不对称试验和网格行走试验是脑缺血恢复和后遗症阶段合适的感测运动功能试验。（A） 在脱粘实验中右肢撕裂有利.（B） 网格行走测试中的网格行走误差时间。（C） 轮罗试验的时间长度.（D） 吊绳测试的分数.误差柱表示 S.D.， n = 15+19， =P < 0.05， =P < 0.001。这个数字已由刘等人15日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
| 类型 | 螺纹螺栓的直径 | 螺纹螺栓头的直径 | 推荐重量的老鼠 | 水平 |
| 2636 | 0.26 毫米 | 0.36 毫米 | 250-280克 | A4 |
| 2838 | 0.28 毫米 | 0.38 毫米 | 280-350克 | A4 |
| 3040 | 0.30 毫米 | 0.40 毫米 | 360-400克 | A4 |
| 3043 | 0.30 毫米 | 0.43 毫米 | >400 g | A4 |
| 注：A4级螺纹螺栓是标准，头端是半球形，前端覆盖多流明，标记，消毒，并购买使用无需任何处理（本表已由Liu等人修改，2018年）。 | ||||
表 1：线程污点信息。这张表是从刘等人15号修改的。
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Discussion
许多建立方法和行为指标的模型在急性脑缺血中得到了很好的应用，在脑缺血的恢复和后遗症阶段可能没有显著变化。然而，在恢复和后遗症阶段，脑缺血患者的数量最大。必须选择适合缺血性中风的恢复和后遗症的动物模型。
我们使用大鼠的MCAO/R模型来筛选大鼠的合适重量（260~330克）、螺纹螺栓类型（2636/2838/3040/3043）以及最严重的梗死损伤、高模型成功率和可见行为指标的脑梗塞时间（2-3小时），适用于脑缺血的恢复和后遗症。
体重300克的老鼠，用3040螺纹螺栓和3小时脑梗死时间有较大的梗塞体积，更严重的行为缺陷，和更大的模型成功率（图1）。此外，我们还通过TTC染色和传感器运动功能测试（双边不对称试验、网格行走试验、轮罗试验和提升绳试验）在再灌注1-90天后提供了该大鼠模型的验证方法。我们发现，双边不对称试验和网格行走试验可用于研究缺血的恢复和后遗症，因为这些指标的显著差异分别持续90天和60天。梗塞和收缩体积越大，传感器运动缺陷越严重，如图2和图3所示。
该方法主要适用于MCAO引起的脑缺血。然而，该模型在人和大鼠之间的大脑解剖上存在差异，例如附带循环的等级。另一个限制是，TTC 染色无法看到白质回收。通过MR成像或其他方法对附带循环和白质回收的进一步研究可以证实该模型的预测价值。
最关键的问题是，在大鼠中创建MCAO/R模型的技能并不容易，需要实践。在实验之前，确认可接受的并行模型成功率。需要更多的仪器和方法来测试中风的恢复和后遗症阶段的感应运动功能。如果使用更困难的任务（例如将转速从 10 rpm 提高到 30 rpm），则轮状测试可能会出现较长的缺余期。其他行为测试可能也适用于此模型，如步态检测。应使用更精确的检测方法用于脑缺血的恢复和后遗症患者，这可以识别药物或其他治疗工具的效果。
作为研究脑缺血在恢复和后遗症阶段的新动物模型，本文介绍的方法意义非凡，值得推广。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（81603315，81603316），中国江西省重点研发计划（20171ACH80001），福建省高校产业与学术合作项目的支持。中国 （2018Y41010011）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical Microscope | Leica (Germany) | S8 | Microscopic operating instrument |
| Blade | Gellette | / | Cutting brain sections |
| Constant Temperature Shaking Bed | Taicang Experimental Equipment Factory | THZ-C | To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature |
| Digital Camera | Canon | 700D | For taking pictures of TTC staining |
| Electric Shaver | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 3000# | Removal of hair from the neck of rats |
| Forceps Hamostatic | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 14 cm | Using for brain removing |
| Image Pro Plus Software | Media Cybernetics Inc. | 6.0 | Analyze the infarct volume |
| Isoflurane | RWD Life Science | 217170702 | Anesthetic gas |
| Microforceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Microshear | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Ophthalmic Forceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Auxiliary skin and muscle anatomy |
| Pphthalmic Scissors | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Using for cutting the skin of neck |
| Rat Brain Slice Mold | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 400 g | For standard, uniform cutting of brain tissue |
| Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus | Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. | ZH-300B | To test the sensorimotor function |
| Small Animal Anaesthesia Machine | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | ABM3000 | A gas anesthetic machine |
| Small Animal Thermostat | Beijing Damida Technology Co., Ltd. | DM.7-YLS-20A | To maintain animal body temperature constant during operation |
| Surgical Scissors | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 16 cm | Using for decapitate and brain removing |
| Suture | Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. | 4-0 / 5-0 | Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations |
| Thread Bolt | Beijing Cinontech Co. Ltd. | 2636/2838/3040/3043-A4 | Blockage of the middle cerebral artery in rats |
| 5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) | Sigma | LOT#BCBP3272V | Brain section staining reagent |
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