Summary
Dieses Protokoll skizziert die Etablierung eines Mausmodells für das Studium von Malassezia-Host-Interaktionenin der Haut. Es beschreibt die Kultivierung von Malassezia in vitro, die Infektion der murinen Haut mit Malassezia, und die anschließende Analyse der Entzündung und der Pilzbelastung im Hautgewebe.
Abstract
Tiermodelle sind für die Erforschung von Infektionskrankheiten von entscheidender Bedeutung. Sie bilden eine wichtige Grundlage für die Analyse des gesamten Spektrums von Wechselwirkungen, die zwischen Mikroben und ihrem Wirt in vivo auftreten, auf gewebespezifische Weise. Pathogene Pilze werden zunehmend als ernste Bedrohung für den Menschen erkannt und die Nutzung solcher Infektionsmodelle hat unser Verständnis der Pilzpathogenität erheblich verbessert. Arten der Gattung Malassezia sind die am häufigsten vorkommenden Pilze der menschlichen Haut mikrobiota und sie sind auch mit der Entwicklung von schweren entzündlichen Hauterkrankungen wie seborrhoische Dermatitis und atopische Dermatitis verbunden. Ein ursächliches Verhältnis zwischen Malassezia und Krankheitspathogenese bleibt jedoch unbekannt, eine Tatsache, die auf die schlechte Kenntnis des komplexen Übersprechens von Malassezia mit dem Hautimmunsystem zurückzuführen ist. Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines experimentellen Mausmodells, das es ermöglicht, die Wechselwirkung von Malassezia mit der Säugetierhaut in vivo zu untersuchen. Es skizziert die Methode zur Kultivierung von Malassezia spp. unter Laborbedingungen, wie man die murine Haut mit Malassezia spp. infiziert und wie man das Ergebnis einer Infektion mittels der Hautentzündung und Pilzbelastungsanalysen bewertet. Das hier beschriebene Modell funktioniert bei vollständig immunkompetenten Tieren und setzt nicht auf immunsuppressive oder antibiotische Vorbehandlung der Tiere. Darüber hinaus ist es an nahezu alle gentechnisch veränderten Mausstämme anpassbar und kann mit anderen Hautkrankheitsmodellen kombiniert werden. Diese Eigenschaften machen dieses Infektionsmodell zu einem sehr leistungsfähigen Werkzeug, um die angeborene und adaptive Immunantwort des Wirts gegen Malassezia in der Haut in vivo im Detail zu untersuchen.
Introduction
Die Haut wird von vielen verschiedenen Mikroben bevölkert. Die ständige Exposition der Haut gegenüber der Mikrobiota trägt zur Gestaltung und Erziehung des Immunsystems des Wirts bei. Pilze werden zunehmend als ein wichtiger Teil der Mikrobiota anerkannt und sie erfüllen eine wichtige Rolle für die Wirt Physiologie und Immunität, ähnlich wie Bakterien und Viren1. Arten der Gattung Malassezia sind bei weitem die am häufigsten vorkommenden Pilze, die die Haut von warmblütigen Wirbeltieren besiedeln und sie machen mehr als 90% der menschlichen Haut Mycobiom2,3aus. 18 verschiedene Arten von Malassezia wurden bisher aus der menschlichen und tierischenHaut4 identifiziert.
Verschiedene Pathologien der Haut werden gedacht, um, zumindest teilweise, als Folge einer dysbalanced Mikrobiota Zusammensetzung entstehen. Dysbiose kann zum Überwachsen von Arten mit pathogenem Potenzial führen, was zu opportunistischen Infektionen und Krankheit5. Konsequenterweise gibt es einen zunehmenden Beweis dafür, dass Malassezia,neben seinem commensal Lebensstil, trägt zur Entwicklung von verschiedenen Hautpathologien, von Schuppen und Pityriarsis versicolor zu schwereren entzündlichen Erkrankungen wie als seborrhoische Dermatitis und atopische Dermatitis4,6. Während ein ursächlicher Zusammenhang zwischen Malassezia und pityriarsis versicolor hergestellt wurde, bleibt die pathophysiologische Rolle des Pilzes bei schwereren Hautpathologien weitgehend unbekannt.
Die Bestimmung der Rolle von Malassezia bei Hauthomöostase und Krankheit erfordert ein tieferes Wissen über die Wechselwirkung des Pilzes mit der Haut und dem hautförmigen Immunsystem. Bemerkenswert ist, dass die Forschung an Malassezia im Vergleich zu anderen menschlichen Pilzpathogenen (z. B. Candida albicans oder Aspergillus fumigatus) noch im noch jungen Stadium ist. Dies ist auf die Schwierigkeit bei der Kultivierung von Malassezia unter Laborbedingungen und das Fehlen geeigneter experimenteller Modelle zur Untersuchung des Pilzes in Kontakt mit dem Wirt in vivo zurückzuführen. Frühere Experimente mit isolierten Zellen in der Kultur zeigten eine breite Palette von direkten und indirekten Wechselwirkungen zwischen Malassezia und verschiedenen Immun- und Nichtimmunzellen7. Diese In-vitro-Experimente rekapitulieren jedoch nur teilweise die Situation der komplexen Hautumgebung in vivo, wo zahlreiche zelluläre und molekulare Ereignisse gleichzeitig zwischen dem Pilz und verschiedenen Zelltypen auftreten.
Hierin skizzieren wir das Protokoll für ein experimentelles Modell der Malassezia-Hautinfektion bei Mäusen, das wir vor kurzem eingerichtet haben, um die Pilz-Wirt-Interaktion in vivo7zu untersuchen. Dazu gehören Verfahren für (1) die erfolgreiche Kultivierung von Malassezia in vitro, (2) die epikutane Anwendung von Malassezia auf die murine Ohrhaut und (3) die technischen Details zur Analyse der Malassezia-induziertenHaut. Entzündung und die Pilzbelastung der infizierten Haut. Wichtig ist, dass dieses Modell nicht auf Immunsuppression (z. B. durch Kortikosteroide) oder Antibiotika-Behandlung von Mäusen vor der Infektion angewiesen ist, wie es in anderen Mausmodellen der Pilzinfektion8,9praktiziert wird. Im Gegenzug ermöglicht es das Studium des gesamten Spektrums der angeborenen und adaptiven Immunantwort gegen Malassezia in der normalen Haut. Bemerkenswert ist, dass inzuchtfreie Mäuse, die unter bestimmten pathogenfreien (SPF)-Bedingungen gehalten werden, nicht von Natur aus mit Malassezia kolonisiert werden und daher ihre Exposition gegenüber dem Pilz nicht zu einer anhaltenden Kolonisation führt, sondern vom Wirt innerhalb ca. 1,5 Wochen. Das Modell ermöglicht jedoch die Untersuchung der Mechanismen der Antimykotika-Wirtsreaktionsinitiierung und -regulierung, die wiederum die Grundlage dafür ist, wie Immungedächtnis erzeugt wird. Das Modell ist vielseitig, da es leicht auf eine Vielzahl von genetisch veränderten Mausstämmen angewendet werden kann und es mit anderen bestehenden Hautkrankheitsmodellen kombiniert werden kann, wie Modelle von Barrieremangel, um die Auswirkungen von Malassezia unter pathologische und entzündliche Hauterkrankungen7. Daher bietet das beschriebene Modell der experimentellen Malassezia-Hautinfektion bei Mäusen ein hohes Maß an Flexibilität, um die Wechselwirkung des Pilzes mit dem Immunsystem der Haut im Kontext von Homöostase und Krankheit zu untersuchen.
Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Hautinfektion von Mäusen mit Malassezia spp. Aufgrund ihres pathogenen Potenzials werden Malassezia spp. in einigen Ländern, einschließlich der Schweiz, als BSL2-Erreger eingestuft. Bitte überprüfen Sie die lokalen Richtlinien und befolgen Sie die Vorschriften der lokalen Behörden. BSL2-klassifizierte Organismen sollten von geschultem Personal in einem BSL2-zertifizierten Biosicherheitsschrank (BSC) behandelt werden. Biologische Abfälle, die mit BSL2-klassifizierten Organismen kontaminiert sind, sowie Schlachtkörper von Mäusen, die mit solchen Organismen infiziert sind, sollten vor der Entsorgung autoklaviert werden. Bei Experimenten mit Mäusen sollten alle Anstrengungen unternommen werden, um Leiden zu minimieren und die höchsten ethischen und humanen Standards nach den 3R-Prinzipien (ersetzen, verfeinern, reduzieren) zu gewährleisten10. Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden mit M. pachydermatis (ATCC 14522), M. furfur (ATCC 14521) und M. sympodialis (ATCC 42132)7durchgeführt.
Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden gemäß der Verordnung über den Umgang mit Organismen in geschlossenen Systemen des Bundesamtes für Umwelt, Schweiz (www.bafu.admin.ch) durchgeführt. Die Mausexperimente wurden streng nach den Richtlinien des Schweizerischen Tierschutzgesetzes durchgeführt und nach den vom Veterinäramt des Kantons Zürich (Lizenznummer 168/2018) genehmigten Protokollen durchgeführt.
1. Anbau von Malassezia unter Laborbedingungen
HINWEIS: Bewahren Sie alle Reagenzien und Medien, die für dieses Protokoll verwendet werden, bei Raumtemperatur (RT, 20 – 25 °C) auf, sofern nicht anders angegeben, da die niedrigere Temperatur das Pilzwachstum hemmen kann.
- Bereiten Sie das flüssigkeitsmodifizierte Dixon (mDixon) Medium auf das Malassezia-Wachstum vor. Zur Zubereitung von 500 ml flüssigem mDixon-Medium 18 g Malzextrakt, 10 g getrocknete Ochsen-Galle, 5 ml Tween-40, 3 g Pepton, 1 ml Glycerin und 1 ml Ölsäure in 500 ml destilliert H2O (dH2O) auflösen. Stellen Sie das Medium mit HCl und Autoklav auf pH 6 ein. Bewahren Sie das Medium bei RT auf.
- Bereiten Sie mDixon Agar-Platten vor, indem Sie vor dem Autoklaviern 7,5 g Agar zu 500 mL mDixon-Medium hinzufügen. Kühlen Sie den mDixon-Agar nach dem Autoklavieren mit einer Lenkstange und einer magnetischen Heizplatte langsam ab, um eine teilweise Erstarrung des Mediums beim Abkühlen zu vermeiden.
- Sobald der Agar auf 50 – 60 °C abgekühlt ist, geben Sie die Flüssigkeit in petri-Schalen in einer laminaren Fließhaube ab und lassen Sie sie bei RT über Nacht trocknen.
HINWEIS: Die Agarplatten können bei 4 °C für mehrere Wochen gelagert werden, wenn sie eingewickelt und auf dem Kopf gehalten werden, um Verdunstung zu vermeiden. - Erhalten Malassezia isolates und beleben lyophilisierte Bestände von Malassezia nach den Anweisungen des Anbieters erhalten.
- Impfen Sie 10 ml flüssiges mDixon-Medium in einem sterilen 100 ml Erlenmeyerkolben mit der wiederbelebten Malassezia Suspension gemäß den Anweisungen des Anbieters. Inkubieren Sie die Kultur in einem Schüttel-Inkubator bei 30 °C und 180 Umdrehungen pro Minute.
- Überprüfen Sie das Wachstum der Malassezia-Kultur regelmäßig, indem Sie das Aussehen der Cremefarbe und Trübung überprüfen. Die Wachstumskinetik hängt von der Art und dem Stamm von Malassezia ab und kann besonders langsam sein, wenn Malassezia aus einem lyophilisierten Bestand frisch wiederbelebt wird. (Abbildung 1A).
- Bereiten Sie Glycerinvorräte vor, indem Sie 3 Teile der dicht gewachsenen Malassezia-Kultur in mDixon-Medium mit 1 Teil sterilem 99% Glycerin mischen. Aliquot die Malassezia/glycerin Mischung in sterile Schraubkappenrohre und lagern bei -80 °C.
- Zur In-vitro-Vermehrung Die Malassezia aus der flüssigen Kultur in mDixon oder aus dem gefrorenen Glycerinbestand auf eine mDixon-Agarplatte (von 4 °C zu RT gebracht) mit einer Impfschleife.
HINWEIS: Übertragen Sie mDixon Agarplatten vor dem Gebrauch von 4 °C auf RT, da kalter mDixon-Agar das Pilzwachstum hemmt. - Inkubieren Sie die Agarplatte(n) mit Malassezia kopfüber in einem (nicht schüttelnden) Inkubator bei 30 °C. Überprüfen Sie regelmäßig das Wachstum der Malassezia-Kolonien.
HINWEIS: Malassezia Kolonien auf mDixon Agar Platten erscheinen innerhalb von 3 - 5 Tagen und sind cremefarben stumpf, glatt mit konvexer Höhe (Abbildung 1B). - Malassezia-Kolonien auf mDixon-Agarplatten bei RT für 2 Wochen aufbewahren. Danach bereiten Sie eine neue mDixon Agarplatte vor, indem Sie Malassezia aus dem gefrorenen Glycerinbestand, wie in 1.7 beschrieben, streichen.
2. Vorbereitung des Inokulums zur experimentellen Malassezia-Infektion von Mäusen
- Impfen 10 ml flüssiges mDixon-Medium in einem sterilen 100 ml Erlenmeyerkolben mit 3 - 5 einzelnen Malassezia-Kolonien aus einer mDixon-Agarplatte (siehe Schritt 1, Abbildung 1B).
- Inkubieren Sie die Malassezia-Kultur für 48 bis 96 h bei 30 °C und 180 U/min, bis die Kultur cremefarben und trüb ist (Abbildung 1A).
HINWEIS: Die für das Wachstum von Malassezia benötigte Zeit hängt von der Malassezia-Art und dem Stamm und der Menge des Pilzes ab, der für die Impfung verwendet wird. - 2 ml der Malassezia-Kultur in ein steriles 2 ml Mikrozentrifugenrohr und zentrifuge für 1 min bei 10 000 x g übertragen.
- Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet, indem Sie es in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) aufhängen. Zentrifuge wieder für 1 min bei 10.000 x g.
- Nach dem Waschen das Pellet in 1 ml PBS durch kräftiges Pipettieren aufsetzen und die optische Dichte der Lösung bei 600 nm (ODA600) mit einem Spektrometer messen. Verdünnen Sie die Malassezia Suspension 20 – 50 x mit PBS für die OD-Messung, um sicherzustellen, dass der Messwert zwischen 0,1 und 1 liegt.
ANMERKUNG: Die Dichte einer 3-Tage-Kultur von Malassezia variiert im Allgemeinen zwischen 15 und 30 ODA600, abhängig von der Malassezia-Art und Stamm und der Anzahl der Hefezellen, die für die Impfung der Kultur verwendet werden (Schritt 2.1). Malassezia neigt dazu, Aggregate zu bilden, daher ist eine kräftige Pipettierung notwendig, um die Homogenität der Suspension zu gewährleisten. - Aliquot ein Volumen der Malassezia Suspension in PBS, die einer Dichte von 4 ODA600 in einem sterilen 2 ml Rohr entspricht. Bereiten Sie 1 Röhre pro Tier vor, um infiziert zu werden.
- Zentrifugieren Sie die Rohre, die Malassezia enthalten, für 1 min bei 10.000 x g.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Malassezia-Pellet in 200 l nativem Olivenöl (entsprechend 2 ODA600 Hefezellen/100 l Olivenöl)aus.
HINWEIS: Olivenöl wurde gefunden, um ein gutes Vehikel für epikutane Infektion mit Malasseziazu sein, da Malassezia eine lipophile und lipidabhängige Hefe ist. Olivenöl wird besser von der Haut absorbiert als PBS. Beachten Sie jedoch, dass es nicht einfach ist, Malassezia in Olivenöl auszusetzen. Verbessern Sie die Malassezia/Olivenöl Suspension durch Wirbeln. Halten Sie die Suspension bei RT, bis sie für eine Infektion verwendet wird. - Bereiten Sie Rohre mit Olivenöl allein für Scheininfektion von Kontrolltieren.
3. Mäuse mit Malassezia zu infizieren
- Bestellen Sie weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6 - 8 Wochen und lassen Sie sie sich in der Versuchstieranlage für mindestens eine Woche akklimatisieren. Berechnen Sie 3 - 5 Mäuse pro Gruppe, einschließlich einer nicht infizierten Kontrollgruppe.
- Bereiten Sie sterilen Anästhetikum-Cocktail mit 1,3 mg/ml Xylazin und 6,5 mg/ml Ketamin in PBS zu. 5 ml des Anästhetikums-Cocktails reichen aus, um 20 Tiere zu anästhesieren. Passen Sie das Volumen des Cocktails an die Anzahl der tiere an, die anbeäsiert werden sollen.
- Anästhesisieren Sie Tiere, indem Sie 10 L/g Körpergewicht des Anästhetikums Cocktails intraperitoneal injizieren (entsprechend 65 mg Ketamin und 13 mg Xylazin pro kg Körpergewicht) und die anästhesierten Tiere bei 37 °C auf ein Heizkissen legen.
HINWEIS: Bei der angegebenen Dosis bleiben die Tiere in der Regel für 30 - 60 min anästhesiert.
- Anästhesisieren Sie Tiere, indem Sie 10 L/g Körpergewicht des Anästhetikums Cocktails intraperitoneal injizieren (entsprechend 65 mg Ketamin und 13 mg Xylazin pro kg Körpergewicht) und die anästhesierten Tiere bei 37 °C auf ein Heizkissen legen.
- Überprüfen Sie die Reflexe, indem Sie den hinteren Fuß mit Zangen kneifen, um sicherzustellen, dass die Tiere vollständig beästhebt sind.
- Tragen Sie eine Augencreme auf die Augen auf, um Austrocknung während der Anästhesie zu verhindern.
- Messen Sie optional die Ohrdicke beider Ohren mit einem Bremssattel (0 - 5 mm Bereich). Messen Sie zwei verschiedene Bereiche jedes Ohres und berechnen Sie die durchschnittliche Ohrdicke pro Ohr.
HINWEIS: Die Messung der Ohrdicke ist optional und hängt von der Forschungsfrage ab. Wenn jedoch die Ohrdicke als Auslese für Hautentzündungen verwendet wird, ist es notwendig, die Grunddicke des Ohres vor der Infektion zu messen. (siehe Schritt 4). - Optional die epidermale Barriere der dorsalen Ohrhaut durch mildes Bandabisolieren stören: Tragen Sie manuell ein kleines Stück Klebeband auf die Haut auf und entfernen Sie es wieder. Wiederholen Sie dies für 5 aufeinanderfolgende Runden mit einem frischen Klebeband für jede Runde.
HINWEIS: Malassezia induziert eine ausgeprägtere Hautentzündung bei barrieregestörter Haut im Vergleich zu ungestörter Haut (Abbildung 2A)7. - Topisch 100 l (2 ODA600) der Malassezia/OlivenölSuspension auf die Rückenseite jedes Ohres mit einer sterilen Pipette auftragen. Schließen Sie eine Kontrollgruppe von Tieren ein, die nur mit Olivenöl behandelt werden (fahrzeugbehandelte Kontrollgruppe).
HINWEIS: Wirbel die Malassezia/ Olivenöl Suspension kräftig, um eine homogene Malassezia Suspension unmittelbar vor der Anwendung zu gewährleisten. - Lassen Sie die anästhesierten Tiere auf dem Heizkissen, um Unterkühlung zu vermeiden, bis sie Anzeichen einer Erholung zeigen (Whisker-Bewegung, erhöhte Atemfrequenz, etc.).
- Injizieren Sie 200 l sterile und vorgewärmte 2% Glukoselösung subkutan in die Nuchalfalte, um ihren Stoffwechsel und ihre Rehydratation zu unterstützen.
HINWEIS: Um eine sterile 2% Glukoselösung vorzubereiten, lösen Sie 1 mg Glukose in 50 ml PBS auf und filtern Sie sie mit einem 0,2 m-Filter. Die Lösung kann bei 4 °C gelagert werden. - Die Tiere zurück in ihren Käfig bringen.
4. Analyse von Malassezia-induzierterHautentzündung
HINWEIS: Dieses Verfahren beschreibt die Analyse von Malassezia-induzierteOhrschwellung während der Infektion, die als Parameter der Hautentzündung dient. Voraussetzung für die Analyse der pilzinduzierten Ohrschwellung ist die Messung der Ohrstärke vor Bandabstreifen und/oder Infektionen (Schritt 3.5).
- Bereiten Sie Isoflurane Kammer für kurzfristige Anästhesie von Malassezia-infiziert und Kontrolle Tiere.
- Übertrage ein Tier nach dem anderen in die Kammer und warte, bis das Tier vollständig befruchtet sei.
HINWEIS: Anzeichen einer richtigen Anästhesie sind komplette Körperentspannung sowie langsame und schwere (Flanken-)Atmung. Überwachen Sie die Anästhesie sorgfältig, da eine längere Exposition gegenüber Isofluran tödlich sein kann. - Entfernen Sie das Tier aus der Kammer und legen Sie es auf ein Gewebe.
- Messen Sie die Dicke des Ohres(n) mit einem Bremssattel (Bereich 0 - 5 mm). Messen Sie zwei verschiedene Bereiche jedes Ohres und berechnen Sie die durchschnittliche Dicke pro Ohr (siehe Schritt 3.5).
- Das Tier zurück in den Käfig bringen.
HINWEIS: Isoflurane Anästhesie ist sehr kurzlebig, und die Tiere erholen sich innerhalb von 30 s nach entfernung aus der Isofluran-Kammer. - Berechnen Sie die Erhöhung der Ohrdicke, indem Sie die durchschnittliche Ohrdicke, gemessen vor dem Bandabisolieren und/oder der Infektion, von der durchschnittlichen Ohrdicke subtrahieren, die zu jedem Zeitpunkt nach der Infektion gemessen wird.
- Zeichnen Sie die berechneten Werte als Erhöhung der Ohrdicke oder alternativ als die gesamte Ohrdicke im Laufe der Zeit für jedes Tier oder jede Tiergruppe(Abbildung 2B).
5. Analyse der Pilzbelastung in der infizierten Haut
- Bereiten Sie ein steriles 2 ml Mikrozentrifugenrohr für jedes zu erntende Ohr vor, das 0,5 ml steriles 0,05% NP40 in dH2O und eine autoklavierte Stahlkugel (5 mm Durchmesser) enthält.
- Wiegen Sie die Rohre mit einer Präzisionswaage und notieren Sie das genaue Gewicht.
- Euthanisieren Sie die Mäuse durch CO2-Erstickung.
- Entfernen Sie das Ohr(e) an der Basis und übertragen Sie es in das Rohr mit 0,5 ml sterilem 0,05% NP40 in dH2O, wie in den Schritten 5.1 - 5.2 beschrieben.
- Wiegen Sie das Rohr, das das Ohrgewebe enthält, und berechnen Sie das tatsächliche Gewicht jeder Probe, indem Sie das Gewicht der Röhre ohne das Organ vom Gewicht des Rohres mit dem Organ subtrahieren.
- Homogenisieren Sie das Ohrgewebe für 6 min bei 25 Hz mit einem Gewebe homogenisator. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe gut homogenisiert ist.
- Platte 100 l jeder Probe (entsprechend 1/5 jedes Homogenats, Verdünnungsfaktor = 5) auf mDixon Agarplatten und inkubieren die Platten kopfüber in einem 30°C Inkubator.
HINWEIS: Die Menge des homogenierten Plattierens sollte entsprechend der zu erwartenden Pilzbelastung angepasst werden. Achten Sie darauf, ausreichend homogen zu platte, um mindestens 10 und nicht mehr als 250 Kolonien pro Platte zu erhalten, um eine einfache Aufzählung zu ermöglichen. Optional platten mehrere Platten pro Probe mit unterschiedlichen Verdünnungen von Homogenat. - Überprüfen Sie regelmäßig das Wachstum der Malassezia-Kolonien.
HINWEIS: Kolonien werden in der Regel nach 2 - 3 Tagen sichtbar. Die Zeit, die für Malassezia Kolonien zu wachsen benötigt, hängt von der Art und Stamm von Malassezia. - Zählen Sie die Kolonien pro Platte.
- Berechnen Sie die Anzahl der KBE/g-Gewebe mit der folgenden Formel:
CFU/g Gewebe = (Anzahl der Kolonien/Platte) x (Verdünnungsfaktor) / (Gewicht der Hautprobe in g).
HINWEIS: Die ungefähre minimale Nachweisgrenze kann anhand der folgenden Formel beurteilt werden: minimale Nachweisgrenze = (1 Kolonie/Platte) x (Verdünnungsfaktor) / (Durchschnittsgewicht aller Hautproben in g). - Pilzlasten werden in der Regel auf einer logarithmischen Skala geplottet (Abbildung 2C).
Representative Results
In-vitro-Anbau von Malassezia
Im Vergleich zu anderen häufiger verwendeten Pilzmodell-Erreger wie C. albicans oder A. fumigatusist Malassezia in vitro schwieriger zu kultiton. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass Malassezia für seine Nährstoffanforderungen auf exogene Lipidquellen angewiesen ist, da es nicht in der Lage ist, Fettsäuren zu synthetisieren11. Das mDixon-Medium eignet sich zur Kultivierung mehrerer Malassezia-Arten, darunter M. pachydermatis, M. furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. globosa und M. yamatoensis in vitro7 ,12. Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder für das Wachstum von M. sympodialis im flüssigen mDixon-Medium und auf mDixon-Agar, wie in Schritt 1 und Schritt 2 beschrieben.
Analyse von Hautentzündungen und Pilzbelastung von Malassezia Hautentzündung
Die Exposition von Malassezia gegenüber der Maus-Ohrhaut, die durch Band-Stripping vor der Infektion gestört wurde, führt zu einer verschärften Entzündung der Haut, gekennzeichnet durch epidermale und dermale Hyperplasie und Entwicklung von Ödemen7. Schritt 4 und 5 skizzieren die Methoden zur Analyse malassezia-induzierte Ohrschwellung und die Pilzbelastung der Haut. Beide Parameter stellen wichtige Auslesungen für die Überwachung des Infektionsverlaufs dar. Abbildung 2A zeigt die Zunahme der Ohrdicke, die nach der M. Furfur-Exposition gegenüber der Haut beobachtet werden kann, die barrieregestört war, verglichen mit der ungestörten Haut von WT C57BL/6-Mäusen. Abbildung 2B zeigt ein repräsentatives Zusammenfassenddiagramm der Erhöhung der Ohrdicke im Laufe der Zeit. Abbildung 2C zeigt die Pilzbelastung in der Ohrhaut am 2. Tag nach einer Infektion mit M. pachydermatis.
Abbildung 1: In-vitro-Anbau von Malassezia.
(A) M. sympodialis Stamm ATCC 42132 wuchs für 3 Tage bei 30 °C und 180 U/min in flüssigem mDixon-Medium (links) neben einem Kontroll-Erlenmeyerkolben mit mDixon-Medium, das nicht geimpft wurde (rechts). (B) Kolonien des M. sympodialis-Stamms ATCC 42132 auf mDixon-Agar nach 5 Tagen Inkubation bei 30 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Analyse der Malassezia-Hautinfektion auf der Grundlage der Ohrdicke und pilzbelasteten Belastung.
(A) Histologie von Ohrabschnitten von C57BL/6-Mäusen, die 5 Tage lang mit Olivenöl (Fahrzeug, links) behandelt oder mit m. Furfurstamm JPLK23 infiziert wurden (Mitte und rechts). Auf der rechten Seite wurde die Ohrenhaut vor der Infektion mit Klebeband abgestreift. Die Abschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) befleckt. (B) Übersichtsdiagramme, die die Zunahme der Ohrdicke im Laufe der Zeit für C57BL/6-Mäuse zeigen, die Malassezia ausgesetzt waren oder als Kontrollen nicht infiziert wurden. Die absolute Dicke der M. pachydermatis-Sorte ATCC 14522-exponierte oder mit Fahrzeugen behandelte Ohrhaut zu jedem Zeitpunkt wird auf der linken Seite angezeigt; Die Erhöhung der Ohrdicke zu den angegebenen Zeitpunkten relativ zur Basislinie am Tag 0 ist rechts dargestellt. (C) Pilzbelastung in der Haut von C57BL/6-Mäusen, die mit dem M. pachydermatis-Stamm ATCC 14522 infiziert oder mit Olivenöl als Kontrolle (Fahrzeug) behandelt wurden. In beiden Fällen wurde die Haut mit Klebeband abgestreift. Jedes Symbol in den Übersichtsdiagrammen B und C stellt ein Tier dar. Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde mit einwegigem ANOVA (B) oder Student es t-test (C) berechnet. p <0.001, ****p <0.0001, D.L.: Erkennungslimit Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Infektion der Haut des häufig verwendeten Inzucht-Mausstamms C57BL/6 durch Malassezia spp. Anpassung dieses Protokolls an andere Mausstämme mit einem anderen genetischen Hintergrund (z.B. Balb/c) oder an gentechnisch veränderte Maus Stämme können eine Anpassung der Infektionsdosis, des Zeitpunkts(der Analyse) usw. benötigen. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, sollten Mäusegruppen immer das gleiche Alter und Geschlecht haben. Die Quelle der Mäuse sollte stabil gehalten werden, da selbst geringfügige Veränderungen des genetischen Hintergrunds und Unterschiede in der Mikrobiota, die zwischen Anbietern existieren und sogar zwischen verschiedenen Einheiten einer einzigen Zuchtanlage existieren können, unvorhersehbare Auswirkungen auf die Infektionsverlauf. Bei der Einrichtung des in diesem Protokoll beschriebenen Malassezia-Infektionsmodells wird empfohlen, eine Pilotstudie durchzuführen, um den Infektionsverlauf sorgfältig zu überwachen, einschließlich des Ausmaßes der Besiedlung, der Kinetik der Pilzclearance und des Grades der Entzündungen und Pathologie, die induziert werden könnten (z. B. wenn die Ohrenhaut vor der Infektion barrierefrei ist), um die optimalen Assay-Bedingungen zu bestimmen.
Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und Unterschiede zwischen Versuchsgruppen zuverlässig zu erkennen, muss die Anzahl der pro Gruppe verwendeten Tiere auf der Grundlage der statistischen Analyse berechnet werden. Der Stichprobenumfang wird auf der Grundlage von Effektgröße, Fehlerquote und Leistung berechnet, die biologische und experimentelle Schwankungen berücksichtigen (z. B. aufgrund von Schwankungen im Immunsystem). Vermeiden Sie es aus ethischen Gründen, unnötig viele Tiere zu verwenden. In Bezug auf Malassezia Hautinfektion, Behandlung nur ein Ohr mit dem Pilz und mit dem anderen Ohr als Kontrolle innerhalb der gleichen Maus, ist nicht ratsam, weil Mäuse den Pilz auf beide Ohren verbreiten können, während der Pflege. Die Verwendung von 1/2 Ohr für verschiedene methodische Auslesevorgänge wie die Bestimmung der Pilzbelastung, die Isolierung von Immunzellen oder die histologische Analyse reicht jedoch oft aus und führt zu einer signifikanten Verringerung der für Experimente verwendeten Tierzahlen.
18 verschiedene Malassezia-Arten wurden bis heute beschrieben. Inter- und Intraspezies-Variationen innerhalb der Gattung Malassezia können die Interaktion mit dem Wirt beeinflussen, wie wir auch aus Studien über andere menschliche pathogene Pilze gelernt haben13. Verschiedene Malassezia-Arten und -Stämme unterscheiden sich in ihrer Herkunft (z.B. m. pachydermatis ist die häufigste Tierart, während M. restricta, M. globosa und M. sympodialis die am häufigsten isolierten Arten sind. prominente Mitglieder des Pilzhautmikrobioms beim Menschen mit variabler Verteilung dieser Arten auf verschiedene Hautbereiche). Einige Arten wurden mit Commensalismus in Verbindung gebracht, während andere als pathogener angesehen werden, obwohl detaillierte Beweise relativ schwach bleiben. Wichtig ist, dass einige Arten und Stämme von Natur aus schwieriger zu züchten sind als andere. Daher muss die Entscheidung, welche Art/Sorte für die Infektion verwendet werden soll, auf der Forschungsfrage beruhen.
Experimentelle Infektion der murinen Haut mit einigen mikrobiellen Organismen wie Candida albicans oder Staphylococcus aureus erfordern die Störung der epidermalen Barriere vor der Infektion, z.B. mit Sandpapier14, 15,16. Im Gegensatz dazu ist das hier beschriebene Modell der Malassezia-Infektion ebenso effizient mit und ohne Barrierestörung7. Der Grad der Entzündung durch den Pilz induziert wird massiv erhöht, wenn die Haut vor der Infektion bandabgetragen wird7. Ob die Haut vor der Anwendung von Malassezia manipuliert werden sollte, hängt daher von der Forschungsfrage ab. Es gibt verschiedene Modelle chronischer und akuter Hautentzündungen (z.B. Modelle für verzögerte Typüberempfindlichkeit (DTH) und Kontaktüberempfindlichkeit (CHS)) und Modelle von Barrieremangel, die für die Untersuchung des Beitrags von Commensalhefe von Interesse sein können. Hautpathologien.
Inzuchtmäuse, die unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten werden, werden (nach unserem Wissen) nicht natürlich mit Malasseziakolonisiert. Daher stellt die experimentelle Anwendung von Malassezia auf die Mausohrhaut eine primäre Exposition gegenüber dem Pilz dar, die eine akute Reaktion im Wirt induziert, was wiederum zu einer Pilzfreiheit innerhalb von 1 - 2 Wochen7führt. Während das in diesem Protokoll beschriebene Modell daher nur teilweise die Situation bei immunkompetenten Menschen oder anderen Wirtsorganismen widerspiegelt, die dauerhaft mit Malasseziabesiedelt sind, ermöglicht die experimentelle Infektion ein großes Möglichkeit, die antimykotische Immunität und die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die dieser Reaktion zugrunde liegen. Es ermöglicht auch die Untersuchung von Variationen in der Reaktion auf verschiedene Malassezia Arten und Stämme unter verschiedenen experimentellen Bedingungen (z. B. mit und ohne BarriereStörung der Haut).
Die Studie von Malassezia - Wirtsinteraktionen beschränkte sich in der Vergangenheit auf In-vitro-Experimente mit isolierten Zelltypen in Kulturen (z. B. Keratinozytenzelllinien, PBMCs). Obwohl diese Studien einige Sendemittel auf Pilz- und Wirtsdeterminanten werfen, die das Zusammenspiel zwischen Malassezia und dem Wirt17prägen, erlauben sie es nicht, ein umfassendes Verständnis des Pilzes zu erlangen - Wirtsinteraktion im Komplex Umgebung der Haut, die mehrere Zelltypen umfasst, die in ständiger Kommunikation sind, wie Keratinozyten, Fibroblasten und geweberesidente Immunzellen, aber auch Leukozytenpopulationen, die das Gewebe nur bei mikrobiellem Haut. Dieses mehrzellige Netzwerk kann nicht vollständig in den In-vitro-Modellen reproduziert werden, selbst bei den meisten fortschrittlichen Organoidsystemen. So stellt die experimentelle Infektion von Mäusen immer noch den Goldstandard in der Immunologie und Infektionskrankheitsforschung dar, und die Verfügbarkeit des hier beschriebenen Modells stellt einen Durchbruch auf dem Gebiet der Malassezia-Forschung dar. Wichtig ist, dass dieses Modell auf der epikutanen Anwendung von Malassezia auf der ansonsten ungestörten Mausohrhaut beruht und nicht die Inokulation des Pilzes durch Injektion in das Gewebe impliziert, z. B. subkutan oder intraperitoneal, Frühere Studien berichteten18, die beide weiter von der Situation bei natürlich kolonisierten Wirten entfernt sind.
Die Möglichkeit, das in diesem Protokoll beschriebene Modell der Malassezia-Infektion mit anderen verfügbaren Mausmodellen zu kombinieren, erhöht den Umfang und die Flexibilität der Anwendung erheblich. Letztere umfassen verschiedene Modelle spezifischer Hauterkrankungen, wie das Modell des Barrieremangels, das wichtige Merkmale der atopischen Dermatitis imitiert, einer Krankheit, die mit Malassezia bei Menschen und Hunden verbunden ist. Darüber hinaus kann eine epikutane Infektion der Haut mit Malassezia leicht auf Mäuse mit genetischen Defekten in Wirtsgenen von Interesse angewendet werden, oder an Mäusen, bei denen eine Zellart von Interesse genetisch gelöscht oder pharmakologisch erschöpft werden kann (z. B. durch Diphtherietoxin-Verabreichung bei Diphtherietoxin-Rezeptor-exemitten Mäusen). Solche Modelle stellen ein unvermeidliches Werkzeug dar, um die Wirtsreaktion auf kominsale und pathogene Mikroben, einschließlich Malassezia, zu sezieren und die Rolle dieser Gene und Zelltypen in der Pilz-Wirt-Interaktion zu bewerten. Die Analysen der Malassezia-Host-Hautinteraktionkönnen weit über das in diesem Protokoll beschriebene Maß hinaus erweitert werden. Dazu gehören Analysen durch Histologie (z.B. zur Bestimmung des Grades der Hautpathologie oder der epidermalen Verdickung, die durch den Pilz induziert wird), durch immunhistochemie oder immunfluoreszierende Färbung von Gewebeabschnitten mit Antikörpern, die gegen den Zelltyp gerichtet sind. bestimmten Markern oder anderen Molekülen von Interesse. Es kann auch die Isolierung von Zellen (z. B. Gewebe-Resident oder Gewebe-infiltrierende Leukozyten-Teilmengen) aus dem infizierten Hautgewebe beinhalten, um die Polarisation, Regulierung und Dynamik der Immunantwort auf Malassezia in großer Tiefe zu untersuchen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Universität Zürich, Schweiz, unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | - | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | - | - | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | - | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
- Iliev, I. D., Leonardi, I. Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).
- Findley, K., et al. Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin. Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).
- Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. L. Fast, noninvasive method for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 40 (9), 3350-3357 (2002).
- Theelen, B., et al. Malassezia ecology, pathophysiology, and treatment. Medical Mycology. 56, suppl_1 10-25 (2018).
- Williams, M. R., Gallo, R. L. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis. Current Allergy and Asthma Reports. 15 (11), 65 (2015).
- Malassezia and the Skin. , Springer. (2010).
- Sparber, F., et al. The Skin Commensal Yeast Malassezia Triggers a Type 17 Response that Coordinates Anti-fungal Immunity and Exacerbates Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryotic Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Solis, N. V., Filler, S. G.
- Russel, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co. London. (1959).
- Wu, G., et al. Genus-Wide Comparative Genomics of Malassezia Delineates Its Phylogeny, Physiology, and Niche Adaptation on Human Skin. PLoS Genetics. 11 (11), 1005614 (2015).
- Leong, C., Buttafuoco, A., Glatz, M., Bosshard, P. P. Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia spp. with an Optimized Colorimetric Broth Microdilution Method. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1883-1893 (2017).
- Schonherr, F. A., et al. The intraspecies diversity of C. albicans triggers qualitatively and temporally distinct host responses that determine the balance between commensalism and pathogenicity. Mucosal Immunology. 10 (5), 1335-1350 (2017).
- Igyarto, B. Z., et al. Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses. Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).
- Liu, H., et al. Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure Drives Skin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses. Cell Host Microbe. 22 (5), 653-666 (2017).
- Nakagawa, S., et al. Staphylococcus aureus Virulent PSMalpha Peptides Induce Keratinocyte Alarmin Release to Orchestrate IL-17-Dependent Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 22 (5), 667-677 (2017).
- Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. Host Responses to Malassezia spp. in the Mammalian Skin. Frontiers in Immunology. 8, 1614 (2017).
- Yamasaki, S., et al. C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1897-1902 (2009).
