Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

השרשה וניטור על ידי PET/CT של מודל אורתוטופית של מזותליומה של האדם בעכברים האטורי

Published: December 21, 2019 doi: 10.3791/60272
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1MicroPET/SPECT/CT Imaging Laboratory, Centre for BioMedical Imaging (CIBM), Division of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, University Hospitals and University of Geneva, 2Division of Thoracic and Endocrine Surgery, University Hospitals and University of Geneva

Summary

מאמר זה מתאר את הדור של מודל העכבר אורתוטופית של מזותליומה האנושית על ידי השרשה של H2052/484 מזותליומה תאים לתוך חלל הצפק של עכברים החיסוני החיסונית. ניטור האורך של הפיתוח של גידולים הפנים הוערך על ידי לא פולשני ובלה מורכבת ודאלי [18F] -2-fluoro-2-deoxy-D-גלוקוז פליטת פוזיטרון טומוגרפיה ודימות טומוגרפיה ממוחשבת.

Abstract

מזותליומה ממאירה (MPM) הוא גידול נדיר אגרסיבי הנובעים הmesothelium המכסה את הריאות, הלב, ואת חלל החזה. פיתוח MPM משויך בעיקר אסבסט. טיפולים מספקים הישרדות צנועה בלבד מאז ממוצע ההישרדות החציוני הוא 9 – 18 חודשים מרגע האבחנה. לכן, יש לזהות טיפולים יעילים יותר. רוב הנתונים המתארים מטרות טיפוליות חדשות הושגו מתוך ניסויים בתחום החוץ וצריך להיות מאומת בvivo מודלים פרה קליניים. מאמר זה מתאר אחד מודל MPM הנושא אמין שהושג לאחר ההזרקה של קו MPM תא אנושי H2052/484 לתוך החלל הפלאורלי של עכברים החיסונית החיסוני. השתלת באתר אורתוסייט מאפשר ללמוד את ההתקדמות של הגידול הטבעי בסביבה vivo. פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/טומוגרפיה ממוחשבת (PET/CT) דימות מולקולרי באמצעות קליני [18f] -2-fluoro-2-Deoxy-D-גלוקוז ([18f] fdg) מעקב האבחנה היא שיטת האבחון של הבחירה לבדיקת חולים עם MPM. לכן, [18F] FDG-PET/CT שימש כדי longitudinally לפקח על התקדמות המחלה של מודל H2052/484 הנושא. טכניקה זו יש פוטנציאל 3r גבוה (reduce מספר בעלי חיים, rגדר כדי להפחית את הכאב ואת חוסר הנוחות, ו Rגדר ניסויים בבעלי חיים עם חלופות) מאז פיתוח הגידול יכול להיות מפוקח באופן לא פולשני ומספר בעלי החיים הנדרשים יכול להיות מופחת משמעותית.

מודל זה מציג שיעור פיתוח גבוה, צמיחה גידול מהיר, הוא חסכוני ומאפשר תרגום קליני מהיר. על-ידי שימוש זה MPM הנושא מודל מבע, החוקרים יכולים להעריך את התגובות הביולוגי של מודל MPM אמין בעקבות התערבויות טיפוליות.

Introduction

מזותליומה ממאירה (MPM) הוא סרטן הקשורים בדרך כלל עם החשיפה סיבי אסבסט1,2,3. למרות אסבסט הוחרם ברוב המדינות המערביות4,5,6, השכיחות של MPM עדיין גדל7,8. לאחרונה, חשיפה של עכברים פחמן צינוריות מרמז כי הם עלולים לגרום לסיכון בריאותי משמעותי בבני אדם9,10. הנתונים מצביעים על כך שחשיפה למוצרים אלה עלולה לגרום לדלקות כרוניות ולשינויים מולקולריים (למשל, הפסד של מסלולים סרטניים-מדכא) כי התקדמות ושתתות מזותליומה ממאירה. כיום, מרובת קירות פחמן צינוריות הם אחד המוצרים החשובים ביותר של ננוטכנולוגיה והם משולבים יותר ויותר במוצרים שונים כגון, חומרים מרוכבים, אחסון אנרגיה, רפואה, אלקטרוניקה, חומרים לתיקון סביבתי.

MPM הוא סרטן עם פרוגנוזה גרועה, ורוב המטופלים מתים בתוך שנתיים לאחר האבחנה בשל יעילות מוגבלת של שיטות הטיפול הנוכחי11. הבחירה של הטיפול MPM תלוי בשלב הסרטן. עבור השלב המוקדם ביותר MPM (שלב 1 ואולי כמה שלב 2 או 3 גידולים), הגישה הקלינית היא טיפול רב מודאלי כולל כריתת כירורגית של גידולים, הקשורים הקרנות וכימותרפיה12. כימותרפיה משולבת עם ציספלטין טינית ו pemetrexed מצוין לטיפול ברוב החולים שאובחנו עם מחלה פולשנית מקומי מקומית, כי הוא לא קלה לניתוח כירורגי, או מי הם לא אחרת מועמדים לכירורגיה מרפא13,14. יש, לכן, צורך דחוף לפתח טיפולים יעילים יותר עבור חולים MPM. עם זאת, יש אימות מעטים בדגמי בעלי חיים vivo המשקפים את הרלוונטיות הקלינית של MPM. מספר מודלים murine MPM פותחו אך רובם לא בנאמנות לאחר לכידה היבטים מורכבים של הגידול MPM מיקרוסביבה15,16,17,18. השימוש בMPM אסבסט המושרה בעכברים, מהונדסים גנטית MPM מודלים העכבר, או מודלים של השתלת syngeneic של קווי MPM מורטין מוגבלים על ידי הבדלים בסיסיים פנומטאריים ופונקציונלי, וכתוצאה מכך, לתרגם בצורה גרועה תגליות חדשות למרפאה. אחרים מודלים טרום קלינית murine MPM להסתמך בעיקר על תת עורית או הצפק של קווי תאים אנושיים בעכברים לקויה. בעוד מודלים אלה קל לפקח ולספק נתונים בסיסיים, מיקרו הסביבה של אלה xenografts זה לא דומה לגידולים אנושיים לפגוע בכוח translational של רוב המחקרים הפרה-קליניים האלה17,19. לעומת זאת, אורתובנושא xenografts טוב יותר לשקף את ההתנהגות הגידול החולה ואת התגובה לטיפול כפי שהם מוקפים מיקרוסביבה דומה כמו אחד שנמצא באתר הגידול המקורי16.

הדמיה מולקולרית על-ידי [18F] fdg-PET/CT היא שיטת הבחירה כדי longitudinally הצג התקדמות המחלה בחולים עם MPM20,21. לכן, להזדקק לשיטה זו שאינה פולשנית הדמיה מקדם מאוד את התרגום של מחקרים פרה-קליניים לניסויים קליניים16,22. כמו-כן, היא מסייעת להפחית את מספר החיות הנדרש, שכן כל חיה מייצגת את שליטתה בזמן.

במאמר זה, אנו מציגים את הנושא מהימן מבע מודל MPM שהתקבל לאחר ההזרקה של קו MPM התא האנושי H2052/484 לתוך חלל הצפק של עכברים athymic. ביחד עם [18F] fdg-PET/CT הדמיה, מודל זה הוא שיטה בעלת ערך ומגוון ללמוד אפקטים פונקציונליים ומכניסטיים של אסטרטגיות אבחון חדשות וטיפולים עבור MPM אנושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים המתוארים להלן אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש בוועדה ובמשרד הוטרינרים של ז'נבה, שוויץ (אישור GE/106/16). קו התא MPM H2052/484 הוקם והתאפיין במעבדה שלנו כמפורט במאמר של קולין DJ ו-et al.23. בקצרה, H2052/484 קו התא הוקמה מגידול בבית החזה שהתקבל לאחר הזרקה הפנים של NCI-H2052 (ATCC) תאים לתוך האטומים לקויה עכברים עירום.

1. תכנון ניסיוני

  1. קביעת מספר העכברים הנחוצים בהתאם לניסוי באמצעות חישוב כוח סטטיסטי (לדוגמה http://powerandsamplesize.com/Calculators/).
  2. לפחות שבוע לפני השרשה, לרכוש שמונה עד עשרה שבועות הנשי העירום נקבה עכברים Foxn1nu nu/nu והבית אותם בסביבה ספציפית-פתוגן (SPF) לפחות שבוע.

2. הכנת תאים לשרשה

  1. חשב כמה תאים H2052/484 נחוצים כמו כל עכבר מוזרק עם 1 x 106 תאים (שלב 1.1). הכינו מספר נוסף של תאים כזריקה לעכברים יכלול דגימת מזרק.
  2. התרבות MPM H2052/484 קו התא ב RPMI 1640 בינונית בתוספת 10% (v/v) העובר סרום (FBS), 100 יחידות/מml ו 100 μg/mL סטרפטומיצין בחממה לתרבות רקמות ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
  3. התאים התרבותיים להשתלה כ 80% המפגש (~ 7 x 106 תאים לכל 15 ס מ צלחת פטרי).
  4. , בערך 1 לפני השתלה. הכן את התאים
  5. להיפטר מהתקשורת, לשטוף תאים עם PBS סטרילי ללא סידן ומגנזיום (10 מ"ל לכל 15 ס מ צלחת פטרי) ו לנתק תאים על ידי הדגירה עבור 5 דקות עם 0.05% טריפסין-2 מ"מ EDTA (2 מ"ל לכל 15 ס"מ צלחת פטרי).
  6. לאסוף את התאים בRPMI בינונית (10 מ"ל לכל 15 ס מ צלחת פטרי) ולספור את התאים באמצעות הומוציטומטר.
  7. לאסוף את המספר המתאים של תאים עבור מספר העכברים להיות מוזרק בהתחשב כמחושב לפי שלב 1.2.
  8. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות, לשטוף את הגלולה תא ב 10 מ ל של RPMI בינונית ללא fbs ו צנטריפוגה שוב ב 300 x g עבור 3 דקות.
  9. להשעות מחדש את התאים בנפח מתאים של בינונית RPMI ללא FBS לריכוז של 1 x 106 תאים לכל 50 μl כמו כל עכבר חייב להיות מוזרק עם נפח של 50 μl.

3. השתלת תא גידול

  1. לפני השרשה, הכינו את מערכת ההרדמה ואת האזור הכירורגי במכסה הזרימה המבינארי על-ידי ריסוס כל המשטחים באמצעות מחטא. להכין אספקה סטרילית או חיטוי במכסה הזרימה למינארי כולל את מערכת ההרדמה, משטח החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר, הפתרון יוד polyvidone, a 30 G מזרק המילטון (g., מזרק 705RN, 30 G מחט-20 מ"מ-Point סגנון 4), גזה סטרילית ומטליות כותנה, מנתחים ומכשירי ניתוח סטריליים ומיקרופיפטות סטריליים וטיפים.
  2. לשמור ולפתוח את כלובי המיקרו מבודדים במכסה זרימת החיטוי והרדים עכבר אחד אחרי השני בהתאם למהירות ההשתלת. משך השתלה הוא כ-5 – 10 דקות לטכנאים שעברו ניסויים.
  3. עכברים הרדים על ידי גרימת הראשון עם 4 – 5% isofלאנה. ואז לשמור על ההרדמה על משטח החימום בזמן השתלה עם 3% isofלוריאן. לקבוע את עומק ההרדמה על ידי אובדן של רפלקס הצתה על ידי העכבר.
  4. לאחר עכבר הוא רדימים, להזריק תת-עורי 0.05 mg/ק"ג בופרנורפין כאבים/לאחר הניתוח הקלה בכאב.
  5. מניחים את העכבר בצד ימין (הלחץ הימני לרוחב) על כרית החימום.
  6. לנקות את האזור כירורגי עם תמיסת יוד polyvidone ולעשות חתך 5 מ"מ של העור ברור הסביבה שומן ושרירי עם מספריים קהה לחשוף את הצלעות.
  7. המגון השעיית התאים בריכוז של 1 x 106 תאים לכל 50 ΜL של RPMI בינוני ללא fbs ולטעון 50 μl של ההשעיה עם מזרק המילטון. להימנע בועות האוויר ולנגב את המחט עם 70% אלכוהול כדי למנוע השתלת שאינם אורתוספית של תאים. הומוגון השעיית תא לפני כל זריקה.
  8. לאט להזריק את התאים לתוך החלל הפלאורלי בין הצלעות6 ו 7 עם זווית של 30 ° ועומק של 2 – 3 מ"מ רק תחת השרירים הבינקותיים. הקפד לא להזריק לתוך הריאות על ידי שמירה על המחט רק מתחת לצלעות. המחט צריכה להיות גלויה על ידי שקיפות דרך השרירים (איור 1א).
  9. סגרו את הפצע בעזרת שלושה עד ארבעה תפרים נספגים.
  10. אחסן את העכברים בסביבה מחומם עד שהם מתעוררים.
  11. יום לאחר מכן, חזור על הזרקת בופרינורין. הצג עכברים בהתאם לתכנון ולאישור הניסיוניים.

4. [18F] fdg-הדמיית PET/CT

הערה: כל ההליכים המתוארים להלן חייבים להיות מאושרים על ידי דיור ומתקני דימות בעלי חיים מקומיים. ודא כי חומרים רדיואקטיביים מיובאים, מאוחסנים ומטופלים על פי כללי בטיחות קרינה מקומית (למשל, הפעילות פתרונות מניות, טיפול מוגן במכסה המנוע). ניתן לתחזק את תנאי ה-SPF על-ידי טיפול בבעלי חיים במכסה זרימה למינארי ובאמצעות טעינת מיטת הסורק התואמת SPF (איור 1ב, ג).

  1. ניטור התפתחות הגידול ביצוע הדמיה PET/CT, פעם בשבוע, החל ביום 7 לאחר השרשה של H2052/484 תאים. כל בעל חיים מייצג שליטה משלו לאורך זמן.
  2. הימנע ממצוקה של בעלי חיים לפני הדמיה על ידי הובלת עכברים לדיור מתקן הדמיה אם זמין או לשמור אותם קרוב למתקן.
  3. עכברים מהירים עבור 12 – 16 h לפני [18F] FDG-PET/CT אשר מפחית את אותות הרקע. ראה Fueger24 שתיאר את ההשפעה של טיפול בבעלי חיים על [18F] fdg-PET/CT סריקות.
  4. טהרים ולאחסן את המיטה עכברים על פי הכללים המקומיים.
  5. שיא כל הזמנים של מדידות רדיואקטיביות מינונים, זריקות וסריקות PET כדי להיות מסוגל לחשב את רכבי השטח.
  6. עכברים חמים מראש ב -30 ° c במשך 30 דקות לפני ההזרקה של [18F] fdg המפחית את רקמת השומן החום (BAT) מטבוליזם. לדוגמה, לחמם מראש בתאי חימום, באמצעות רפידות חימום או באמצעות מנורות אינפרא-אדום.
  7. הכינו 3 – 4 מינונים MBq של [18F] fdg מתוך פתרון מניות ב 150-200 μl של תמיסת מלח ב 1 מ ל אינסולין מזרקים באמצעות מינון כמקטור. מזרקים לאינסולין יש את היתרון של כמעט ללא נפח מתים יכול למנוע את המדידה של הפעילות הנותרת לאחר ההזרקה.
  8. הרדים עכברים עם isofלאנה כמתואר בשלב 3.3. שוקלים עכברים ולאחר מכן להזריק 3 – 4 MBq [18F] fdg. רטרו מסלולית הזרקה היא שיטה של בחירה שכן הוא מהיר, קל ונמנע בעיות הזרקה הזנב או מתעכב ספיגה של הזרקת הצפק.
  9. לאחר ההזרקה, להשאיר עכברים ער 45 דקות בכלובים שלהם תחת התנאים החמים שיזם בשלב 3.5. אורך של [18F] ספיגת fdg הוא 1 h; 15 דקות הם בדרך כלל מספיק כדי לטעון עכברים על המיטה ולבצע CT לפני PET.
  10. עכברים הרדים עם isof ane כמתואר בשלב 3.3 ולטעון אותם על מיטת הסורק (איור 1B).
  11. להעביר את המיטה לסורק ובעלי חיים בנושא סריקת CT ממורכז על הריאות. לרכוש סריקות ב 80 kVp, 160 μA, 1024 תחזיות במהלך סיבוב 360 מעלות, עם שדה תצוגה של 74 מ"מ (1.6 x הגדלה, דוגמה של רכישת טריומף) (איור 1ג).
  12. להעביר את המיטה למערכת המשנה PET ולהתחיל את הרכישה 1 h אחרי [18F] fdg הזרקת עבור משך של 15 דקות. עם רוב מערכות PET/CT, המיטה ניתן להעביר באופן אוטומטי מ-CT כדי PET כדי לשמור את FOV ממורכז באותו אזור.
  13. להסיר את העכברים מחדר ההדמיה ולאפשר להם להתאושש בכלוב שלהם.
  14. שמרו על עכברים באזור המוקדש לריקבון רדיואקטיבי בהתאם לכללים המקומיים.

5. ניתוחים של [18F] fdg-PET/סריקות CT

  1. סריקת CT בנייה מבוצעת בתנאים שהוזכרו לעיל עם מטריצה של 512 ו voxel בגודל של 0.144 מ"מ (בחזרה מסוננים אלגוריתם הקרנה-FBP, תוכנה מובנית). בנייה משחזור סריקות PET באמצעות 20 איטראציות של האלגוריתם המסודרת לקבוצת משנה-OSEM3D מקסימום -3 ממדים. כיול את התמונות ב-Bq/mL על-ידי סריקת צילינדר פנטום. באופן אוטומטי לרשום את סריקות CT ו PET בהתאם לפתרון התוכנה המובנית שלך.
  2. ניתוח אמצעי לטיפול בריאות באמצעות תוכנת הניתוח (טבלת חומרים).
    1. טעינת נתוני CT כהפניה (Ref) על-ידי לחיצה על הסמל ' פתח נתונים '. לאחר מכן טען נתוני PET כקלט (Inp1) על-ידי לחיצה על סמל הוספת נתונים .
    2. כוונן את סולמות הצבע ("WL") של CT ו-PET כדי להתאים את התמונות לבדיקה חזותית.
    3. בחר 3D roi הכלי מתוך התפריט הנפתח, לחץ על הוספת ROI ולשם את הריאותהקובץ. לחץ על אלגוריתמי פילוח | . שכונה סף הגדרת קלט כרקע וכתמונה כRef. הזן מינימום ומקסימום לפי ערכי צפיפות לריאות העכבר, בדרך כלל-800 ו-300 HU. בדוק את הריאות שניתנו 3D על ידי לחיצה על סמל vtk ולאחזר את עוצמת הקול בטבלה שנוצר על ידי לחיצה על סמל הצג טבלה.
  3. לנתח [18F] קליטה בגידולים על ידי חילוץ ערכי ספיגה מקסימלית סטנדרטי (SUVmax).
    1. להמיר תמונות PET מכויל ב Bq/mL לרכב שטח על ידי בחירת אריתמטיקה מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן להתרבות בסקלר ולהשתמש inp1 כפי שנבחר ו שיטתיות הוא bq/ml כדי להפעיל רכב שטח מחושב כלפי: ג'יפ = (bq/Ml)/(מינון מוזרק (bq)/משקל גוף (
    2. בחר 3D roi הכלי מתוך התפריט הנפתח, לחץ על הוסף ROI ושם את הקובץ גידולים. לחץ על מצב צבע תלת- ממדי | כדור. . בטל את הסימון של 2D בלבד להתאים את גודל הצורה ולהקיף את הגידולים. הקפידו לא לכלול אותות מפריעים שבאים מלב לדוגמה. אחזר ערך SUVmax בטבלה שנוצרת על-ידי לחיצה על סמל ' הצג טבלה '.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מודל הנושא H2052/484
אורתוטופית MPM מודלים על ידי הזרקת פנים-החזה של תאים סרטניים תרבותי, במיוחד H2052/484 תאים קל יחסית ההתקנה. השלבים השונים המתוארים לעיל דורשים רק ידע תרבותי של התאים הצנועים ומצעדי הניתוח נגישים לניסויים בבעלי חיים מאומנים בינוניים. עכברים ותאים ערומים צריך להיות מניפולציות תחת תנאים סטריליים כדי למקסם את התוצאה של מטעי. על ידי בזהירות באמצעות פרוטוקול זה, אשר כרוך הרדמה קצרה וניתוח מינימלי, נתקלנו רק 1 מוות בקרב 266 עכברים שהוזרקו עם קווי תא MPM שונים. אין חזה אוויר או מטעי פנים-ריאתי של תאים סרטניים נצפו בין אלה עכברים 266 בזהירות הזריק כמתואר. באופן ספציפי, שיעור התפתחות הגידול אורתוטופית של קו התאים H2052/484 הוא גבוה מאז 93.8% של עכברים מוזרק שפותחו גידולים (n = 118). H2052/484 גידולים ניתן לזהות על ידי PET/CT הדמיה מ 14 ימים לאחר ההזרקה את המשך החציוני של הניסוי על פי קריטריונים נקודת הקצה שלנו היה 31 ימים בניסוי מייצג21. כפי שתיארנו זה מחקר אחר21, גידולים היו מותאמים לחלל החזה, מופץ באופן חופשי או מוצמד על הריאות, השרירים החזה, קשת אבי העורקים או הבנה המטה הנחותים. . גרורות לא נמצאו

ניטור MPM של [18F] fdg-הדמיית PET/CT
אורתודפט MPM היו תחת פיקוח שבועי על ידי הדמיה PET/CT משולב עם מעקב הרדיונפוץ [18F] fdg כי מצטבר גידולים מטבולית מאוד. האורך האנטומי סריקת CT מותר להמחיש את ההשפעה של פיתוח MPM על המבנה של הריאות. פילוח אוטומטי של הריאות בניגוד מאוד על סריקות CT הוא פשוט בשל הצפיפות הנמוכה שלהם לעומת הרקמות המקיפות. 3D ברה לתת סקירה של לוקליזציה של גידולים וכמויות האורך של הריאות ניתן לחלץ (איור 2א). לריאות כרכים מדידות ידי CT ירדו באופן משמעותי במשך הזמן לאחר הזרקת MPM של עכברים עם הדרך (ipl) H2052/484 גידולים (איור 2ב). אכן, גידולים MPM לצמוח בתוך חלל הבטן וליצור לחצים על הריאות, הפחתת כרכים שלהם. ניתוחי מתאם הראו כי אמצעי הריאה היו בקורלציה הפוך את הזמן של ניטור עם מקדם של נחישות R2 של 0.8 (איור 2ג). בסך הכל, נתונים אלה מראים את המהימנות של סריקת CT כדי לפקח על התפתחות מודל MPM זה.

בשילוב עם CT, a [18F] fdg-PET סריקה מספק מידע נוסף וחשוב על מצב חילוף החומרים של גידולים MPM. בעוד לפעמים זה יכול להיות מסובך לפרש CT ו PET סריקות תמונות בעצמם, במיוחד בנקודות בזמן המוקדמות, שילוב של שתי האופנים נותן החוסן נוסף לאבחון. אכן, האורך הנציג [18F] fdg-PET/CT ניטור שבוצעו בין 10 ימים ו 44 ימים של עכבר עם גידולים ipl H2052/484 מראה כי גידולים מתחילים להיות להבדיל 2 שבועות לאחרהשתלה(איור 3a). דוגמה זו מדגישה את הצמיחה ו [18F] fdg avidity של גידולים הממוקמים בפריפריה של חלל החזה ולאורך כלי הלב הגדול (חיצים לבנים). [19] ספיגת FDG בגידולים היה ככמת על ידי חילוץ רכבמקסימום ב rois מצויר מעל גידולים, בעזרת סריקות CT, ומציג משמעותי תלוי זמן מגדילה של מטבוליזם הגלוקוז שלהם (איור 3B). ניתוחי מתאם הראו כי רכב שטחמקסימום היו מתואמים באופן חיובי לזמן ניטור עם מקדם של נחישות R2 של 0.7 (איור 3ג). נתונים אלה להפגין את המהימנות של [18F] fdg-PET סריקות כדי לפקח על גורלם של H2052/484 גידולים הנושא. לבסוף, כרכים לריאות ו [18F] fdg avidity, בהתאמה, מנותח על ידי CT ו PET, לתאם אחד עם השני עם R2 של 0.6 תמיכה בחוזק של מדידות אלה כדי ללמוד MPM אורתודפט לפיתוח גידולים (איור 4).

Figure 1
איור 1: העכבר העירום אורתוקנושא xהשתל המודל. (א) הזרקה של תאי MPM אנושיים לתוך חלל הגוף השמאלי, כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול. (ב, ג) עכברים מורדם וטעונים במיטת PET/CT במכסה זרם למינארי ולאחר מכן מועברים לסורק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צמיחת הגידול של הנושא H2052/484 MPM מודל בפיקוח על ידי CT. (א) נציג 3d שחזורים של סריקות CT מראה H2052/484 MPM ipl גידולים והשפעתם על נפח הריאות (סמנכ ל) בזמן שונות ימים לאחר השרשה. ראשי חץ לבנים להראות מיקום של גידולים ipl MPM. (ב) לכינור עלילה המציגה את מסלול הזמן המייצג של אמצעי הריאות (VL), n = 6. בדיקת ANOVA בכיוון אחד עם סטטיסטיקה של Tukey השוואות מרובות מצוינים. אותיות מציינות הבדלים משמעותיים בין דגמים עם a, b, c, d, e, f המציין בהתאמה D10, D16, D23, D29, D36 ו-D44. ערכי p מקבילים: x, p < 0.05; xx, p < 0.01; xxx, p < 0.001; xxxx, p < 0.0001. (ג) מתאם בין הפחתת נפח הריאה הקשורים לפיתוח ipl MPM וזמן לאחר ההזרקה. רגרסיה ליניארית מותווית כקו בצבע עבה וכלי SD קשורה כקווים שחורים מקווקווים. גרפים וניתוחים סטטיסטיים בוצעו עם תוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מטבוליזם הגידול של המודל MPM ipl ואחריו [18F] Fdg-micropet/CT. (א) מייצגPET/CT סריקות המציגה גידולים ipl MPM. PET/CT תמונות להראות פרוסות טרנס-צירית של אזור החזה המכיל את [18F] fdg-avid גידולים, עם CT (בקנה מידה אפור) מתן מידע אנטומי ו PET (מכויל בצבע מדומה בקנה מידה) מראה את המיקום ואת האינטנסיביות של גידול גבוה ומיצוי הגלוקוז איבר. ימים שלאחר ההזרקה מצוינים. CT: חלון mediastinal CT; [19] FDG-PET/CT: התמונה התמזגו של סריקות PET ו-CT. ראשי חץ לבנים מציגים גידולים ipl MPM. L = ריאה, H = לב, בת = רקמת שומן חום. (ב) כינור עלילה מציג מסלול זמן נציג של רכב שטחמקסימום המקושרים לחילוף החומרים MPM, n = 6. בדיקת ANOVA בכיוון אחד עם סטטיסטיקה של Tukey השוואות מרובות מצוינים. אותיות מציינות הבדלים משמעותיים בין דגמים עם a, b, c, d, e, f המציין בהתאמה D10, D16, D23, D29, D36 ו-D44. ערכי p מקבילים: x, p < 0.05; xx, p < 0.01; xxx, p < 0.001; xxxx, p < 0.0001. (ג) מתאם בין הגידול של רכבמקסימום ב-ipl MPM גידולים וזמן לאחר ההזרקה. רגרסיה ליניארית מותווית כקו בצבע עבה וכלי SD קשורה כקווים שחורים מקווקווים. גרפים וניתוחים סטטיסטיים בוצעו עם תוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הקורלציה בין פיתוח MPM במעקב על ידי נפח הריאה ופעילות הגידול מטבולית. הקשר בין רכב שטחמירבי לבין נפח הריאה (VL) המוצג כרגרסיה ליניארית המותווה כקו בצבע עבה וכלי SD קשורה כקווים שחורים מקווקווים. גרפים וניתוחים סטטיסטיים בוצעו עם תוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נייר זה מתאר מודל מקורי של הנושא האורתוגרף של MPM H2052/484 תאים מוזרק בחלל הפלאורלי של עכברים athymic ושיטת ניטור על ידי בעלי חיים קטן PET/CT הדמיה. מודל זה יכול להיות מיושם עם טיפול בינוני בעלי חיים וכישורי ניתוח ומציג שיעור התפתחות טובה מאוד. זה מאפשר חלון ניסיוני גדול של כ 10 שבועות בעכברים מטופל וזיהוי האורך לא פולשני של גידולים מוקדם ככל 2 שבועות לאחר ההזרקה.

אורתוטופית מודלים להסתמך על השרשה של תאים חיים או רקמות ישירות לתוך הסביבה הראשונית של הגידול. ההבדל העיקרי בין מודלים MPM בשימוש תת עורית או הצפק ומודלים הפנים שוכנת המיקרוסביבה שלהם. אכן, מיקרו הסביבה של גידולים מכיל סוגים מרובים של תאים סטרומה (פיברותקיעות, leucocytes, מקרופאגים) בנוסף לתאים סרטניים25. אלה תאים סטרומה להפריש גורמי הצמיחה ציטוקינים לתרום מיקרוסביבה הגידול לווסת את צמיחת הגידול. מיקרוסביבה הגידול משתנה עם האתר האנטומי מציע כי השתל אורתוקאנואל לפתח ולהגיב באופן שונה לטיפול מאשר תת עורית 125. לכן, כמו אורתובנושא xenografts מוקפים מיקרוסביבה דומה לזו שנמצאו בחולים MPM, התנהגותם ואת התגובה לטיפול צריך לשקף בצורה טובה יותר את המצב הקליני17,19.

מודלים רבים קדם קליניים בחקר הסרטן לסבך עכברים חיסוני כדי להבטיח הצלחה האדם מבע. עכברים ערומים אין בעלי בלוטת התימוס בוגרת וחסר חלק חיוני של הגידול מיקרוסביבה26. למרות שעכברים עירומים לא בעלי בלוטת התימוס בוגרת ולכן הם לקויה בתאי T, הם הציגו לימפוציטים B בוגרים, נויטרופילים, מונוציטים ו מקרופאגים לתוך הסביבה שלהם מיקרואופלאני בניגוד ליותר מתירני ועכברים SCID מאוד לקויה26. בשלבים המוקדמים של פיתוח MPM, לתאי T לרגולציה יש תפקיד מדכא חשוב. עם זאת, בשלבים מתקדמים יותר, תאים מיאלואיד כולל נויטרופילים ו מקרופאגים להחליף תאים Treg; בפונקציה זו, התפקיד המדכא של תאי T רגולציה חשוב רק בשלבים המוקדמים של MPM פיתוח23,27. כתוצאה מכך, למרות שמחקרים הכרוכים בתגובה חיסונית מלאה (לדוגמה, טיפולים חיסוניים הכרוכים בתגובת T) לא ניתן ללמוד במודל המוצג כאן, אנו מתארים כי מודל זה אורתובנושא שומר את כל האינטרס שלה כדי להעריך טיפולים חדשים או כלים אבחון חדש של MPM.

בנקודת מבט מתודולוגיים, ישנם שלבים קריטיים כדי לזכור כדי למקסם את ההתפתחות של גידולים MPM בתוך פלאורלי. לפני יצירת מודלים עכברים, יש גישה לתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי (פחות מ 80% השטף, בהתאם קווי התא) ו 8 כדי 10 חודשים הסתגלות עכברים. אכן, הזרקת עכברים קטנים הצעיר הוא קשה והוא יכול לגרום זריקות חוץ רחמי ולשנות את ההישרדות. במהלך תהליך ההשתלה יש לנקוט אמצעי זהירות סטנדרטיים, ומספריים בוטים יש להשתמש בהם במיוחד כאשר הם מונעים להימנע מדימום, דבר שעלול להוביל למוות של בעלי חיים. הבחירה של המזרק (למשל, המודל המתואר כאן) והפרוטוקול המוצג כאן מאפשרים הזרקה מדויקת ועדינה של נפח קטן של בינוני המכיל תאי גידול כדי להבטיח הזרקה בתוך הגוף (30 ° זווית, 2 – 3 מ"מ עומק).

ניטור אורכי של מודלים אורתוטופית MPM ניתן לבצע רק באופן לא פולשני על ידי טכניקת הדמיה. PET/CT הוא שיטה מומלצת בפרקטיקה קלינית כדי לאבחן MPM וכתוצאה מכך שימש במחקר זה20,21. לעומת הדמיה אופטית בשימוש נרחב, PET/CT הדמיה כרוכה בשימוש של תרכובות רדיואקטיביות ולכן עדין יותר להתקנה בגלל הבטיחות, לוגיסטיקה של מכשירי רדיו והעלות שלה28. עם זאת, PET/CT הדמיה אינו מסתמך על שינוי גנטי של תאים סרטניים ומספק ברזולוציה גבוהה טומוגרפית, מידע אנטומי ומולקולרי. דימות אופטי הוא גם מהיר יותר מאשר PET/CT אך מערכת הדמיה המוצגת במאמר זה כרוכה במיטה 3 עכברים ועל 20 עכברים ניתן לסרוק ליום, אשר היא תפוקה סבירה בהתחשב במידע שנאסף. השימוש במעקב הקליני הזמין ביותר [18F] fdg מצדיק כוח טרנסלtional גבוה למחקר שבוצע עם טכניקה זו29. למרות [18F] fdg-בדיקת מחמד קריאות וניתוחים עשויים לדרוש ניסיון כלשהו בגלל ספיגה גבוהה של הלב המקיף ורקמות השומן החום, השילוב שלה עם אבחון CT מזקק. במהלך [18F] fdg PET/CT ניסויים, הצום ומחמם עכברים, כמו גם ביצוע זמן ספיגה של [18F] fdg של 1 h יכול לשפר באופן משמעותי את ההדמיה של גידולים מאז לסרוק את התנאים מאוד השפעת PET ניגודים כפי שתוארה כבר24. מחקרים נוספים על מודלים פרה הנושא מעורבים אחרים קלינית משומשים מכשירי רדיו כמו [18f] fluor, מחלקה (FLT) או [18f] Fluoromisonidazole (fmiso יסו), אשר מפקחת על התפשטות והיפוקסיה בהתאמה, יכול לספק מידע נוסף על כגון מודלים מהימנים אורתוטופית MPM29.

לבסוף, זה מודל הטרנסלמטריקה רלוונטי בשילוב עם הדמיה לא פולשנית הוא באופן מושלם בקנה אחד עם קונספט 3r: Reduce מספר בעלי החיים, rגדר להפחית את הכאב ואי נוחות ו Rגדר ניסויים בבעלי חיים עם חלופות22. אכן, בתוך אותה קבוצה של בעלי חיים, מעקב טיפולי ותגובה יכולים להיות מנוטרים באופן בלתי פולשני המאפשר מדידות האורך במהלך הניסויים, ובכך לצמצם את מספר בעלי החיים הנדרשים לכל ניסוי. יתר על כן, כמו כל חיה מייצגת שליטה משלה לאורך זמן, הדמיה לא פולשנית גם להגדיל במידה רבה את הכוח הסטטיסטי הפחתת מספר בעלי החיים הדרושים כדי לקבל נתונים אמינים16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי Ligue Genevoise הסרטן (כדי V.S.-B.) ועל ידי המרכז להדמיה ביו-רפואית (CIBM) של אוניברסיטאות ובתי חולים של ז'נבה ולוזאן (כדי D.J.C., הגיניקולוגית ו S.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-mice bed Minerve bed for mice imaging
Athymic Nude-Foxn1n nu/nu Envigo, Huntingdon, UK 6907F immunodeficient mouse
Betadine Mundipharma Medical Company, CH 111131 polyvidone iodine solution
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 14190094 Buffer for cell culture
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories, Pasching, Austria A15-101 cell culture medium supplement
Insulin syringes BD Biosciences, San Jose, CA, USA 324826 syringe for cell injection
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140122 antibiotics for cell culture medium
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 61870010 basal cell culture medium
Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) Alloga SA, CH 700320 opioid analgesic product
Triumph PET/SPECT/CT Trifoil, Chatsworth, CA, USA imaging equipment
Trypsin ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 25050014 enzymatic cell dissociation buffer
Virkon S 2% Milian, Vernier, CH 972472 disinfectant
Vivoquant Invicro, Boston, MA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grishman, E., Cohen, S., Salomon, M. I., Churg, J. Renal lesions in acute rheumatic fever. The American Journal of Pathology. 51 (6), 1045-1061 (1967).
  2. Mossman, B. T., Gee, J. B. Asbestos-related diseases. The New England Journal of Medicine. 320 (26), 1721-1730 (1989).
  3. Pass, H. I., et al. Asbestos exposure, pleural mesothelioma, and serum osteopontin levels. The New England Journal of Medicine. 353 (15), 1564-1573 (2005).
  4. Allen, L. P., Baez, J., Stern, M. E. C., Takahashi, K., George, F. Trends and the Economic Effect of Asbestos Bans and Decline in Asbestos Consumption and Production Worldwide. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (3), (2018).
  5. LaDou, J., et al. The case for a global ban on asbestos. Environmental Health Perspectives. 118 (7), 897-901 (2010).
  6. Soeberg, M., Vallance, D. A., Keena, V., Takahashi, K., Leigh, J. Australia's Ongoing Legacy of Asbestos: Significant Challenges Remain Even after the Complete Banning of Asbestos Almost Fifteen Years Ago. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (2), (2018).
  7. Glynn, M. E., Keeton, K. A., Gaffney, S. H., Sahmel, J. Ambient Asbestos Fiber Concentrations and Long-Term Trends in Pleural Mesothelioma Incidence between Urban and Rural Areas in the United States (1973-2012). Risk Analysis. 38 (3), 454-471 (2018).
  8. Zhao, J., et al. Epidemiology and trend analysis on malignant mesothelioma in China. The Chinese Journal of Cancer Research. 29 (4), 361-368 (2017).
  9. Chernova, T., et al. Long-Fiber Carbon Nanotubes Replicate Asbestos-Induced Mesothelioma with Disruption of the Tumor Suppressor Gene Cdkn2a (Ink4a/Arf). Current Biology. 27 (21), 3302-3314 (2017).
  10. Fukushima, S., et al. Carcinogenicity of multi-walled carbon nanotubes: challenging issue on hazard assessment. The Journal of Occupational Health. 60 (1), 10-30 (2018).
  11. Robinson, B. W., Musk, A. W., Lake, R. A. Malignant mesothelioma. The Lancet. 366 (9483), 397-408 (2005).
  12. Ricciardi, S., et al. Surgery for malignant pleural mesothelioma: an international guidelines review. The Journal of Thoracic Diseases. 10, Suppl 2 285-292 (2018).
  13. Hiddinga, B. I., Rolfo, C., van Meerbeeck, J. P. Mesothelioma treatment: Are we on target? A review. The Journal of Advanced Research. 6 (3), 319-330 (2015).
  14. Kim, J., Bhagwandin, S., Labow, D. M. Malignant peritoneal mesothelioma: a review. Annals of Translational Medicine. 5 (11), 236 (2017).
  15. Ampollini, L., et al. Immuno-chemotherapy reduces recurrence of malignant pleural mesothelioma: an experimental setting. The European Journal of Cardiothoracic Surgery. 35 (3), 457-462 (2009).
  16. de Jong, M., Essers, J., van Weerden, W. M. Imaging preclinical tumour models: improving translational power. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 481-493 (2014).
  17. Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. The American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
  18. Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8 (1), 2886 (2018).
  19. Gengenbacher, N., Singhal, M., Augustin, H. G. Preclinical mouse solid tumour models: status quo, challenges and perspectives. Nature Reviews Cancer. 17 (12), 751-765 (2017).
  20. Kanemura, S., et al. Metabolic response assessment with 18F-FDG-PET/CT is superior to modified RECIST for the evaluation of response to platinum-based doublet chemotherapy in malignant pleural mesothelioma. The European Journal of Radiology. 86, 92-98 (2017).
  21. Truong, M. T., Viswanathan, C., Godoy, M. B., Carter, B. W., Marom, E. M. Malignant pleural mesothelioma: role of CT, MRI, and PET/CT in staging evaluation and treatment considerations. Seminars in Roentgenology. 48 (4), 323-334 (2013).
  22. MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: a contemporary approach to replacement, reduction and refinement. The British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
  23. Colin, D. J., et al. Experimental Model of Human Malignant Mesothelioma in Athymic Mice. The International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
  24. Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. The Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
  25. Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Molecular Therapy. 22 (1), 18-27 (2014).
  26. Belizário, J. E. Immunodeficient mouse models: An overview. The Open Immunology Journal. 2, 79-85 (2009).
  27. Jackaman, C., Yeoh, T. L., Acuil, M. L., Gardner, J. K., Nelson, D. J. Murine mesothelioma induces locally-proliferating IL-10(+)TNF-alpha(+)CD206(-)CX3CR1(+) M3 macrophages that can be selectively depleted by chemotherapy or immunotherapy. Oncoimmunology. 5 (6), 1173299 (2016).
  28. James, M. L., Gambhir, S. S. A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications. Physiological Reviews. 92 (2), 897-965 (2012).
  29. Kenny, L. M., Aboagye, E. O. Clinical translation of molecular imaging agents used in PET studies of cancer. Advances in Cancer Research. 124, 329-374 (2014).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 154 סרטן Pleura מזותליומה אורתוגרפט Xenotransplantation שתלת עכבר Athymic לא פולשני הדמיה PET/CT הדמיה
השרשה וניטור על ידי PET/CT של מודל אורתוטופית של מזותליומה של האדם בעכברים האטורי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colin, D. J., Bejuy, O., Germain,… More

Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice. J. Vis. Exp. (154), e60272, doi:10.3791/60272 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter