Summary
Elektrowetting-basert digital mikrofluidic er en teknikk som benytter en spenningsdrevet endring i den tilsynelatende kontaktvinkelen til en mikrolitervolumdråpe for å lette manipulasjonen. Ved å kombinere dette med funksjonaliserte magnetiske perler muliggjør integrering av flere laboratorieenhetsoperasjoner for prøveforberedelse og identifisering av patogener ved hjelp av enzymkoblede immunosorbentanalyse (ELISA).
Abstract
Elektrowetting er effekten som kontaktvinkelen på en dråpe utsatt for en overflateladning er modifisert. Elektrowetting-on-dielectric (EWOD) utnytter de dielektriske egenskapene til tynne isolatorfilmer for å forbedre ladetettheten og dermed øke elektrowettingeffekten. Tilstedeværelsen av ladninger resulterer i en elektrisk indusert spredning av dråpesom tillater målrettet manipulasjon over en hydrofob overflate. Her demonstrerer vi EWOD-basert protokoll for prøvebehandling og påvisning av fire kategorier av antigener, ved hjelp av en automatisert overflateaktiveringsplattform, via to varianter av en enzym-koblet immunosorbent analyse (ELISA) metoder. ELISA utføres på magnetiske perler med immobiliserte primære antistoffer som kan velges for å målrette mot et bestemt antigen. Et antistoff konjugert til HRP binder seg til antigenet og blandes med H2O2/Luminol for kvantifisering av de fangede patogenene. Antall fullføringstider på mellom 6 og 10 min ble oppnådd, mens minuscule volumer av reagenser ble benyttet.
Introduction
Den foreslåtte metoden tar sikte på å legge til rette for automatisert prøveforberedelse for ELISA med kvantitativ påvisning av antigener ved hjelp av EWOD-basert tilnærming med digital mikrofluidikk (DMF) og magnetoforetisk separasjon. Det har blitt demonstrert for flere biologiske anvendelser at DMF i kombinasjon med magnetoforese er et interessant alternativ til væskehåndteringsapplikasjoner1. Mer spesifikt er påvisning av patogener et implisitt aspekt i mange sektorer, alt fra helsetjenester2 til landbruk og miljø3,4 til nasjonal sikkerhet5. En deteksjonsteknologi som kan håndtere truslene fra patogener, må ha høy gjennomstrømning (f.eks. kort analysetid), effektivitet (lav begrensning av deteksjon – LoD – og høy følsomhet) og spesifisitet (til målpatogentypen) for at den skal være funksjonell6.
Tidligere har EWOD-baserte DMF blitt implementert med hell for Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), påvisning av et antibiotikaresistent patogen (Methicillin-resistente Staphylococcus aureaus eller MRSA), M.pneumonia og C.albicans ved hjelp av et lavt budsjett, trykt kretskortchip og magnetoforese7. Teknikken ble brukt også for påvisning av deoksyribonukkleinsyre (DNA) mutasjoner gjennom pyrosequencing og chemiluminescent deteksjon8. EWOD-baserte plattformer utvider også funksjonaliteten mot immunanalyseapplikasjoner, og muliggjør dermed samtidig prøvegjenoppretting og deteksjon i alle i en enkelt, integrert plattform. For eksempel ble en enkelt EWOD-chip design demonstrert med hell med en DMF-plattform for point-of-care testing for både perlebaserte immunoassays av hjertetroponin I fra en hel blodprøve og som et eget eksperiment RT-PCR for MRSA deteksjon2. Den brikken benytter oljefyller, som forhindrer fordampning av dråpene og letter pålitelig automatisert manipulering av nanoliter volumer. Allsidige bioapplikasjoner ble undersøkt med implementeringen av lignende DMF tilnærminger som dekker kvantitative homogene og heterogene immunoassays9,10 inkludert design av eksperimenter (DoE) studier for analyse parameteroptimalisering11.
Til tross for sine åpenbare fordeler for å behandle intensivering på grunn av miniscule arbeidsvolumer, kan en oljefylt DMF-plattform være utfordrende og krever et visst kompetansenivå for å operere. Oljefylte systemer, fordi de krever forseglet komponent, er ikke ideelle for visse bruksområder på feltet der systemtransportabilitet er viktig. I tillegg ville et oljebasert system være svært vanskelig om ikke umulig å bruke for noen spesifikke applikasjoner som utnytter tørrmaterialesamling på en overflate som foreslått av Zhao og Cho12,Jönsson-Niedziółka et al.13, og Foat et al.14. I motsetning er oljefrie systemer enkle å integrere og har fordelen av å gi enkel chip-to-chip prøveoversettelse. Av disse grunnene ble den foreslåtte metoden utviklet for å gi en EWOD-basert immunanalyse på DMF som ikke ville kreve olje, effektivt forenkle enheten ser ut til å være i drift.
I dette bidraget rapporterer vi om bruk av en skreddersydd, frittstående, helautomatisk DMF-plattform for immunoassays, og vi utdyper protokollen for rask påvisning av biomolekyler, nemlig: proteiner, vegetative bakterier, bakterielle sporer og virus. Kombinasjon av EWOD-chip med magnetiske partikler for automatisert prøvetilberedning og immunnedbør er allerede vist med en ekstra off-line MS-måling15. Nylig har in-field diagnostisk mot meslinger og røde hunder IgG blitt demonstrert i avsidesliggende Northwestern Kenyas befolkning av Wheeler gruppe16. Både Wheelers og vårt system, som kan transporteres, selvstendig, helautomatisk med inkluderte on-chip, sanntidchemiluminescent målinger er uten tvil blant de mest avanserte DMF biodeteksjonssystemer tilgjengelig.
De to systemene er designet med svært forskjellige bruksområder i tankene. Wheelers system retter seg mot biomarkør for å tillate biomedisinsk diagnostikk på pasienter, mens vårt biodeteksjonssystem er bygget rundt forsvarskrav for direkte påvisning av patogensom tidligere samplet fra luft. Likheten mellom de to er det underliggende prinsippet om dropdropletaktivering, som demonstrerer det brede spekteret av livspåvirkende sektorer som Den EWOD-baserte teknologien kan påvirke. Nemlig kan Den DMF-baserte deteksjonsplattformen og tilhørende EWOD-systemet finne viktig implikasjon i helse (biomedisinsk diagnostisk); militær og sivil beskyttelse (trusseldeteksjon); Agri-tech (avlingovervåking) og arbeidssikkerhet (kontrollert miljøovervåking)
Ytelsen til vår DMF-plattform vurderes mot helautomatisk påvisning av humant serumalbumin (HSA, et globular protein), Escherichia coli (E. coli, en vegetative bakterier), Bacillus atrophaeus (BG, en bakteriell spore) og MS2 (et bakteriofagvirus). Enda viktigere, den foreslåtte DMF-metoden er ekstremt allsidig i den forstand at fangstantistoffene kan byttes for å målrette påvisning av andre antigener forskjellig fra de fire som vurderes i denne artikkelen. Sidestepping antistoff-basert sensing helt, DMF plattformen kan bygge til et potensielt program basert på aptamer biosensing, hvor de magnetiske perlene bære spesifikke aptamers for fangst og / eller deteksjon av nukleotider. Utformingen og realiseringen av de ulike komponentene som utgjør den integrerte, helt selvstendige DMF-plattformen, inkludert høyspenningsbølgeformgeneratoren og drivelektronikken er avslørt andre steder6.
Protocol
1. Foreløpige tiltak som er nødvendige for analysen
MERK (VIKTIG): Alle foreløpige tiltak må utføres i et sterilt miljø for å unngå forurensninger. Natriumazid bør ikke brukes til oppbevaring, da det ville hemme aktiviteten til pepperrotperoksidase (HRP) enzymet.
- Forbered løpebuffer (100 mM HEPES, pH 7.5), ved hjelp av (4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, og tilsett Tween 80 til en konsentrasjon på 0,01% (v / v).
- Immobilisere de primære antistoffene (fange antistoffer) på overflaten av NHS-aktiverte magnetiske mikroperler ved å følge protokollen fra leverandøren. Kort sagt omfatter protokollen Magnetic IP/Co-IP Kit (Materials) følgende trinn.
- Aliquot 0,2 ml perler (2 mg) inn i et plastrør og fjern supernatanten.
- Vask perlene ved å legge til 1 ml iskald 1 mM HCl.
- Bind det valgte antistoffet (Anti-Human Serum Albumin [15C7], Rb anti-BG polyklonal, Rb anti-E.coli MRE 162 polyklonal eller geit anti-MS2 polyklonal), 40 μg/ml i 67 mM Borate Buffer, kovavalent til perlene i 1 t med risting ved 37 °C. Tabell 1 inneholder listen over alle antistoffer som brukes med gjeldende protokoll og antigenpatogenene6.
- Vask de ubundne antistoffene to ganger med 0,8 ml Elution Buffer.
- Slukke reaksjonen med 1 ml slukkebuffer i 1 t.
- Vask perlene én gang med modifisert boratebuffer og én gang med IP Lysis/Wash Buffer.
- Sett perlene på nytt i 0,5 ml IP Lysis/Wash Buffer og oppbevar ved 4 °C til det er nødvendig for bruk.
MERK: For best resultat er en ny gruppe mikroperler koblet til antistoffene dagen før EWOD-isolasjonen og ELISA på chip. Mikroperlene kombinert med det primære antistoffet kan imidlertid lagres ved 4 °C opptil en måned. Bør agglomerasjon oppstå, trykk på hetteglasset for å bryte utfellingen og for å resuspendere perlene i løsningen. - Blokker mikroperlene med det kombinerte antistoffet over natten, ved hjelp av endelig konsentrasjon 4 mg/ml for mikroperlene, i et Blocker Casein (1 % m/v) i 100 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
MERK: Blokkeringstrinnet utføres alltid dagen før biodeteksjonsanalysen kjøres. - Skill perlene fra Blocker Casein ved hjelp av en magnet og fjern supernatanten.
- Resuspend i 1 ml løpebuffer og bland i 1 min.
- Skill perlene ved hjelp av magneten og fjern supernatanten.
- Gjenta de ovennevnte vasketrinnene (1,2,10 og 1,2,11) to ganger.
MERK: Tre vasketrinn er tilstrekkelige til å redusere vedheft et perler til overflaten og for å lette fri bevegelse av dråpet. - Resuspender perlene i løpebufferen ved en konsentrasjon på 2,5 mg/ml. Denne løsningen av mikroperler er klar til bruk med EWOD-brikken.
- Forbered en løsning av neutravidin konjugert pepperrot peroksidase (HRP) og det sekundære biotinylated antistoffet til en endelig konsentrasjon for hver av 1 μg/ml i løpebuffer (brukes til BG-deteksjon6).
MERK: For å målrette mot antigenene (tabell 1) ble ulike konsentrasjoner av sekundært biotinylated antistoff, fra 0,5 til 4,0 μg/ml testet. - Bland like volumer av Luminol med hydrogenperoksidløsning like før du kjører analysen
MERK: Luminol brukes til å kvantifisere antall bindende hendelser basert på HRP-enzymet som er bundet kovalent til det sekundære antistoffet som retter seg mot antigenet (f.eks. patogen). Imidlertid kan ulike rapporteringsmolekyler og strategier brukes til deteksjon17 i stedet for chemiluminescence og Luminol.
2. Produksjon og overflatebehandling av EWOD-chipkomponentene
MERK: EWOD-chipen består av en aktiveringsplate med mønstrede kromelektroder for å veksle den tilsynelatende kontaktvinkelen til en dråpe og en dekkplate for å definere dråpehøyden.
- Tegn utformingen av elektrodene og kontaktene i 2D ved hjelp av standard CAD-programvare. Inkluder også avfallsinnsamlingsputen med dimensjoner på 5 x 5 mm2 for å lagre de brukte løsemidlene (figur 1).
MERK: For å manipulere dråpene bruker vi 47 elektroder, hver med dimensjoner på 1,7 x 1,7 mm2. Denne elektrodestørrelsen har plass til dråpevolumer fra 1,5 μL til 3 μL (for et 500 μm gap). Fra erfaring, når du arbeider med en 500 μm gap, er 1,5 μL minimum dråpestørrelse som kan aktiveres. Det tilsvarer omtrent at dråpekonturen (projisert) konturen omskrives til firkanteblokken. Det er imidlertid ikke noen teoretisk grense i størrelse annet enn forårsaket av motstanden (friksjon) av væskens kropp. Likevel anbefales det at volumet ikke overstiger 3 μL for pålitelig aktivering ved hjelp av et 500 μm gap. Elektrodene er adressert av 48-kanals elektronikk.
MERK: Designdimensjonene og størrelsene på putene kan variere avhengig av de tiltenkte volumene og laboratorieenhetens operasjoner (LUOer) som utgjør protokollen. - Send designtegningen til en maskeproduksjonstjeneste for utskrift av krommasken på et glasssubstrat. Tykkelsen på kromlaget er 100 nm.
MERK: Kromlaget på fotomasken som brukes som underlag for EWOD-brikken, er per definisjon ugjennomsiktig. Utformingen av hver av våre elektroder inkluderer et rutenettoppsett for å sikre semi-åpenhet. - Klipp platen til størrelse 56 x 56 mm2 med en presisjon CNC dicing / cutting saw.
- Stick maskeringstape over de elektriske kontaktene for å isolere dem under de to beleggtrinnene.
- Belegge plate krom-glassplate med et dielektrisk lag ved å deponere 6 μm Parylen-C på overflaten. Gorham-prosessen18 brukes med 7,4 g DPX-C i et Parylene Deponeringssystem (Materialtabell).
- Spin-coat amorfe fluoropolymerer (Materialtabell) ved hjelp av en spin-coater ved 1500 o/min i 30 s på toppen av platen og stek den ved 140 °C i 30 min.
MERK: Dette gjør overflaten hydrofob. Man kan validere om belegget er deponert ved å plassere en dråpe vann på overflaten. Kontaktvinkelen mellom dråpeog platen må være i området 110º. - Fjern maskeringsbåndet fra de elektriske kontaktene.
- Spin-coat amorfe fluoropolymerer (Materialtabell) ved hjelp av en spin-coater ved 1500 o/min for 30 s på toppen av 4-in silisiumwafer og bake den ved 140 °C i 30 min.
MERK: Det er viktig at både overflatene av aktuasjons- og dekkplatene er hydrofobe for å lette jevn bevegelse av de diskrete dråpene under analysen.
3. Lasting, montering og drift av EWOD-brikken på DMF-plattformen
MERK: EWOD-brikken opererer ved hjelp av parallellplatekonfigurasjon med et nøyaktig definert gap 0,5 mm mellom aktuasjonsplaten og den ledende, jordede dekkplaten. Denne sandwichenheten er beskrevet i gjeldende avsnitt.
- Fjern lokket fra DMF-plattformen6 og plasser det på benken.
MERK: Et mørkt Faraday-burkammer er nødvendig for å forhindre uværsom togelektroring under påvisning. Det er ingen interlock på lokket, derav plattformen tillater oss å observere dråper bevegelse. - Plasser en ren aktiveringsplate på rotasjonsstadiet, krom vendt oppover. Platen må være på linje med øvre venstre hjørne av innfelt etappe (Figur 2A).
- Klem inn aktiveringsplaten fra toppen ved hjelp av panelet med 47 kontaktpinnene. Dette sikrer platen på plass og forenkler justering med kontaktpinnene.
- Legg 0,5 mm shim og 2 mm polymethylmethacrylate (PMMA) separator på roterende stadium, for å gi et kontrollert gap mellom aktuasjonen og dekkplatene.
MERK: Eventuelt kan fukttransporterende papir plasseres på avfallshåndteringsputen før du aliiterer dråpene før neste trinn. Etter hvert som analysen fortsetter, absorberes avfallet direkte inn i papiret som kan fjernes på slutten av analysen. - Legg dråpene på de foreslåtte lasteputene (figur 1).
- Aliquot fire 2,5-μL dråper fra Running buffer en B-, A-, R-, E-, E-denot pads, en dråpe på hver pute.
- Aliquot 2,5 μL Luminol: H2O 2 (1:1, v /v) oppløsning på D-merket pad.
- Aliquot 2,5 μL Neutravidin konjugert til HRP (1 μg/ml) på F-merket pute.
- Aliquot 2,5 μL biotinylated sekundærantistoff (1 μg/ml) på G-merket pute.
- Aliquot 2,5 μL mikroperler med konjugert primærantistoff (2,5 mg/ml) går inn på I-merket pute.
- Aliquot 2,5 μL av den ukjente prøven på C-merket pute.
MERK: Det foreslåtte lastemønsteret er bare ett eksempel på et eksperimentelt oppsett, men lastemønsteret kan endres for å matche brukernes behov, så lenge disse endringene samsvarer med sekvensen som er definert i programvaren (Tilleggsfil 1).
- Plasser dekkplaten på overflaten av riggen, i tillegg til det runde fordypningsområdet, og skyv den sidelengs inn i fordypningen og på toppen av aktuasjonsplaten (figur 2B).
- Sett den permanente magneten på toppen av dekkplaten og fest den ved å skyve de to låsene (figur 2C).
- Drei fasen med 180° og inspiser visuelt hvis de lastede dråpene fortsatt er på plass (figur 1C).
MERK: Man skal kunne øyeeple posisjonen og formen på dråper gjennom det gjennomsiktige stadiet og baksiden av aktuasjonsplaten (Figur 2D). Analysen er klar til å kjøre hvis runde dråper kunne ses på toppen av lasting elektrode pads. I tilfelle, en dråpe er forskjøvet man kan fjerne magneten og dekkplaten, deretter gjenopprette den fordrevne dråpe med en ren pipette og plassere den igjen på lasteputen. - Kontroller at lasteposisjonen for hver dråpe samsvarer med den programmerte aktiveringssekvensen i programvaren (se Tilleggsfil 1 for detaljer om programvaren).
MERK: For å kunne kontrollere plasseringen av dråpene visuelt, må fotodetektoren demonteres (Figur 2D). - Plasser fotodetektoren som er skjermet "kan" i sporet på det roterende stadiet.
MERK: Fotodeteksjonssystemet dreier seg rundt en fotodiode, som har et stort samlingsområde (10 x 10 mm2)for å maksimere lysoppsamling uten ekstra optikk, pluss en transimpedansforsterker for å minimere støy6. Systemet er imidlertid ekstremt følsomt og kan samle inn minuttsignaler. For å redusere støynivået ble det implementert en rekke elektronikkbaserte strategier (f.eks. fotodeteksjonssystemet ble beskyttet ved å sette det i et Faraday-bur, et metallhus kjent som en skjermet "boks"). - Koble kabelen til fotodetektoren som er vist "kan".
MERK: Når EWOD-brikken er på linje med fotodetektoren, er DMF-plattformen fullstendig montert og er nå klar til bruk. - Plasser lokket over DMF-plattformen og start programsekvensen ved hjelp av programvaregrensesnittet utviklet ved University of Hertfordshire.
MERK: Ekstra programvare brukes til å lese og registrere luminescensen fra dråpet som en funksjon av tid i en CSV-fil (se Tilleggsfil 2).- Kontroller at den programmerte sekvensen (se Tilleggsfil 1) meldinger vises i grensesnittet for å informere operatøren om at "Luminol-dråpene er klar til å samle inn de ekstraherte magnetiske perlene" eller "Registreringsdråpene er klar til å flyttes til deteksjonsstedet." I begge tilfeller er bekreftelse fra operatøren pålagt å fortsette med sekvensen.
4. Drift i visuell modus (Valgfritt for optimalisering av protokoller)
MERK: Hvis ønskelig, for å visualisere hver dråpebasert operasjon, kan analysen betjenes ved å hoppe over trinn 3.10-3.12 og erstatte dem ved følgende operasjoner.
- Start programsekvensen ved hjelp av programvaregrensesnittet.
MERK: Dråpebevegelsen kan observeres mens du opererer i visuell modus, noe som er nyttig under protokolloptimalisering. For det første, for å sjekke reproduserbarheten av den magnetiske separasjonsoperasjonen. For eksempel, hvis mengden perler som brukes er for lav, vil den magnetiske separasjonen ikke forekomme, omvendt, hvis mengden perler er for høy, kan dråpet immobiliseres av perlepelleten. For det andre, for å fastslå påliteligheten til en ny analyse som noen dråpeformulering kan føre til aktiveringssvekkelse som kan oppdages ved observasjon. - Monter fotodetektoren som er skjermet "kan" i spalten på det roterende stadiet, når du blir bedt om det.
- Koble kabelen til fotodetektoren som er skjermet "kan", ved å sette inn pinnene i kontakten.
- Plasser lokket over DMF-plattformen og gjenoppta analysen.
MERK: Bruk tilleggsprogramvaren til å lese og registrere luminescensen fra dråpet som en tidsfunksjon i en CSV-fil (se Tilleggsfil 2)
5. Fjerne flytende avfall og rengjøre brikken
FORSIKTIG: Kontroller at utstyret er slått av og koblet fra strømkilder (datamaskin, hoved) før rengjøring. Bruk hansker, en lab frakk og briller beskyttende glass (PPE) når du fjerner biologiske prøver fra brikken!
- Åpne DMF-plattformlokket for å få tilgang til elektrodene og de brukte løsemidlene på aktiveringsplaten.
- Løsne magnethuset, fjern magneten fra det roterende stadiet og plasser den på benken.
- Fjern dekkplaten, silisiumwaferen, fra spalten med et par pinsett, skyll den med DI-vann, tørk den med trykkluft og legg den i en Petriskål, hvor wafer kan lagres og brukes på nytt.
- Bruk en mikropipette til å flytte væskeavfallet fra puten uten å berøre overflaten.
- Rengjør overflaten ved å transportere av væsken fra aktuasjonsplaten ved hjelp av absorberende papir (filtermateriale).
MERK: Å holde overflaten intakt vil øke levetiden til aktuasjonsplaten, som tillater flere bruksområder. - Rengjør aktiveringsplaten ved å feie forsiktig overflaten av elektrodene med en ren DI vanndråpe ved hjelp av en ren pipette. Fjern deretter dråpet med flettet papir (filtermateriale).
FORSIKTIG: Kast vev, papirer, pipettertips og hansker som er forurenset med biologisk materiale i bioavfallsbeholderen. - Bruk aktiveringsplaten for en annen analyse eller fjern den fra DMF-plattformen for lagring eller resirkulering.
Representative Results
Aktiveringsspenningspåvirkning ble undersøkt for å belyse hva de optimale forholdene var for å utføre analysene. En dråpe fra bufferen ble drevet på ulike aktiveringsspenninger og bevegelsen ble registrert. Funnene viste (Figur 3) en korrelasjon mellom roten gjennomsnittlig kvadrataktiveringsspenning (Vrms)og gjennomsnittlig hastighet. Imidlertid ble levetiden til en aktiveringsplate redusert når høye verdier forV-rms ble brukt. Basert på disse resultatene ble 105 Vrms valgt som standard aktiveringsspenning, 120 Vrms ble funnet å fungere best for H2O2/ Luminol dråpe og 165 Vrms ble implementert for utvinning LUO. Disse spenningene ble inkludert i den automatiserte programmeringssekvensen (Tilleggsfil 1).
To immunoassays (Figur 4) ble testet med hell ved hjelp av EWOD-brikken med DMF-plattformen for fire forskjellige patogener (tabell 1). EWOD-chipen gjorde det enklere å bevege dråpene fra lasteputene til blandeområdet og til slutt til avfallet. Det var to grunnleggende LUOer som ble gjentatt gjennom hele protokollen for å fullføre ELISA. Den første var utvinning LUO; kort beskrevet her, ble dråpesom inneholdt de suspenderte perlene drevet til separasjonsstedet midt i blandesonen, magneten ble aktivert automatisk for å nærme seg brikken og å samle de magnetiske perlene i en pellet (Figur 5). Deretter ble dråpene flyttet mot avfallsputen, og la perlene på aktuasjonsplaten, og dermed avslutte ekstraksjonen LUO. Miksing var den neste nøkkelen LUO som fant sted på EWOD-chipen. Analyteprøven med en ukjent konsentrasjon av patogener ble flyttet til perlene ved elektrowetting. Deretter ble perlene resuspendert ved å flytte dråpemed klumpete perler over blandeområdet (10 pads totalt). Disse to LUOene var avgjørende da de la til rette for en miniatyrisert, rask og reproduserbar prøvebehandling med påfølgende påvisning av patogener i 6 til 10 min. Figur 6 viser hele sekvensen av LUOer fra en immunoassay oppnådd med EWOD-chipen.
For å møte de ønskede automatiseringsnivåene kan variasjoner i protokollen innføres. For eksempel ble perlene skilt fra antigenet utarmet dråpe, som deretter ble overført til avfallsplaten, og gjentok den grunnleggende ekstraksjonen LUO. På dette stadiet kan protokollen forgrene seg avhengig av om deteksjonsantistoffet ble konjugert til HRP allerede, effektivt ved hjelp av åtte LUOer totalt for påvisning av de forskjellige antigenene (figur 7A-C). I disse tilfellene ble dråpemed deteksjonsantistoffet brakt til perlene og deretter blandet av aktivering. Alternativt kan det å binde deteksjonsantistoffet til Neutravidin-HRP-konjugatet utføres sekvensielt in situ på EWOD-chipen, da det ble demonstrert for kvantifisering av E. coli (Figur 7D). Begge protokollene, den åtte- og ti-trinns ELISA (Figur 4), ga reproduserbar påvisning av antigener.
Inkubasjonstider og konjugatkonsentrasjoner var varierte for å finne eksperimentelt de optimale forholdene for analysen (figur 7A). Det ble funnet at inkubasjonstiden på 160 s og konjugatkonsentrasjon på 2 μg/ml oppnådde det beste signalet til støyforholdet med en 36% økning av signalstyrke og nesten ingen endring i bakgrunnsstøynivået. Alle tallene og dataene som ble brukt i representasjonsresultatdelen ble endret fra et tidligere arbeid6.
| Primær / Fange antistoff | Deteksjon antistoff | Antigen |
| Anti-Human Serum Albumin [15C7] (anti-HSA, Abcam ab10241) | Hest Reddik Peroxidase (HRP) merket anti-HSA [1A9] (Abcam ab24438) | Human Serum Albumin (HSA, Abcam) |
| Rb anti-BG polyklonal | Biotinylated Rb anti-BG polyklonal | B. globigii (BG) sporer |
| Rb anti-E.coli MRE 162 polyklonal | Biotinylated Rb anti-E.coli 162 MRE polyklonal | E. coli MRE 162 |
| Geit anti-MS2 polyklonal | Biotinylated Rb anti-MS2 polyklonal | MS2 bakteriofavirus |
Tabell 1: Antigener og antistoffer testet med denne protokollen. Fire typer patogene antigener ble brukt til å demonstrere egenskapene til EWOD-brikken med DMF-plattformen.
Figur 1: Utformingen av EWOD-platen. (a) Skjematisk notasjon av EWOD-aktuasjonsplaten med kontakter (firkanter, topp) som er koblet (linjer) til elektrodene (firkanter, bunn). Hver pute er tildelt et nummer og kan løses fra programvarekoden (Supplementary File 1). Lasting elektrode pads er preget av piler og betegnet av en stor bokstav over eller under hver pute. En viktig funksjon for DMF-plattformen er blandesonen bestående av ti pads (nr. 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47). Som en visuell veiledning er blandesonen merket med et rødt rektangel. (b) Mikrograf av pads ' microgrid design. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Komponenter og nøkkeltrinn for den digitale mikrofluidiske systemenheten (DMF). (A) Fest EWOD-aktiveringsplaten, legg shim på det roterende stadiet og legg dråpene. (B) Plasser dekkplaten. (C) Monter magnetetuiet, fest låsene og roter trinnet 180°. (D) Den automatiserte magneten peker nedover. Inspiser plasseringen og formen på dråpene, kontroller at de trykte kretskortet (PCB)-pinnene er på linje med kontaktene på EWOD-brikken, koble fotodetektoren og plasser den i fotodetektorsporet. Etter at du har koblet kontrollelektronikken til en datamaskin, er systemet klart til å kjøre analysen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Gjentatt bruk av aktuasjonsplatene og virkningen på aktiveringsspenningen. Den gjennomsnittlige hastigheten på en dråpe fra løpebufferen tegnes inn som en funksjon av aktiveringsspenningen (blå sirkler) og standardavviket fra tre uavhengige målinger (N = 3). Her indikerer antall analyser per plate (grå stenger) økt forfall av overflaten ved høyere spenninger. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Diagram over immunoassays testet med EWOD. Hver sirkel i dette diagrammet representerer et volum på 2,5 μL lastet på EWOD-brikken. Den første protokollen (på venstre side) viser åtte LUOer ved hjelp av premixed antistoff-HRP konjugat; mens den andre protokollen omfatter ti LUOer, separat tilsetning av det biotinylated deteksjon antistoff, perle ekstraksjon og påfølgende binding av Neutravidin-HRP konjugat. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Magnetisk perleekstraksjon. Denne prosessen er delt inn i (a-c) aktivere dråpemed suspenderte magnetiske perler til den magnetiske separasjonsstedet midt i blandesonen (pad Nr. 33), (d, e) magneten beveger seg i posisjon med fokus på perlene, (f, g, h) perler holdes på plass av den magnetiske kraften mens dråpet aktiveres bort av EWOD mot avfallsputen (pad nr. 41). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Komplett immunanalysesekvens ved hjelp av EWOD, som viser reagensene, prøvelasting og laboratorieenhetsoperasjoner. Hver rad inneholder en sekvens med eksempelbilder fra de karakteristiske operasjonene på en dråpe. Operasjonene er delt inn i kolonner. Blanding utføres ikke for perlene i suspensjon, presentert av en svart ødelagt linje. Dråperetninger indikeres av blå piler, perlene er uthevet i et av bildene med en oransje pil. Den grå boksen (nederst til høyre) skiller de to bildene som representerer bevegelse og posisjon i registreringsområdet, den ødelagte sirkelen fremhever registreringsområdet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Kalibreringskurver fra immunoassays utført på EWOD-chip med DMF-plattformen. Som tidligere rapportert6 er utgangsspenninger (mV) versus konsentrasjoner vist for: (A) Humanserumalbumin, som brukes til å studere effekten av konjugatkonsentrasjonen [C] og inkubasjonstiden, tinc,målt fra blanding av perlene med kjent analyte til ekstraksjonen LUO, (B) B. atrophaeus (BG spore) viser reproduserbarheten av immunoassay, (C) MS2 bakterieophage immunoassay, og (D) ti-LUOer protokollresultater for E. coli. Forkortelser: kolonidannende enheter (cfu), plakkdannende enheter (PFU), antall uavhengige eksperimenter (N), laboratorieenhetdrift (LUO). Figur endret fra forrige publikasjon6. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1: Komplett sekvens for å kjøre DMF-plattformen for automatisert ELISA-analyse med Neutravidin-HRP som konjugat. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: GUI for chemiluminescence måling og et eksempel fra en måling med programvaren vises. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
EWOD immunoassay-protokollen er fleksibel og kan omfatte et variert antall laboratorieenhetsoperasjoner (f.eks. fange antigen, blanding, inkubasjon, perleekstraksjon, vasking) avhengig av reagenstype, stabilitet og brukskrav definert av analyseprotokollen. Som et bevis på prinsippet, i den nåværende artikkelen, vurderes to immunoassay-protokoller som viser implementering av åtte eller ti LUOer (figur 4) med EWOD-chipen beskrevet. Slik miniatyrisering fortjener fra mikroliter, diskrete volumer av reagenser/analyte som øker effekten av ELISA ved å redusere både forbruket av reagenser, tiden som kreves per operasjon, i hovedsak den totale eksperimentelle tiden (6 til 10 min). Videre er analysen automatisert med tidsriktig manipulering av dråpene som reduserer variasjoner og forbedrer presisjonen til immunoassay17. I sitt nåværende format innebærer eksperimentet manuell håndtering av dråper i begynnelsen av hver analyse, som er et punkt for videre diskusjon i neste avsnitt.
Et kritisk skritt i den gjeldende DMF-metoden er å dispensere dråpene på overflaten av EWOD-brikken. Vanligvis brukes en mikropipette med en engangsspiss til å måle det nøyaktige volumet og til å laste det. Det kan imidlertid bli utfordrende å immobilisere dråpet på den hydrofobe overflaten av aktiveringsplaten på grunn av interaksjoner mellom dråpeog den ladede overflaten av engangsspissen. Som et resultat kan dråpet skyte opp etter den ytre overflaten av spissen i stedet for å forbli på platen. For å unngå dette må mikropipetten holdes i oppreist stilling, vinkelrett på chipoverflaten, uten å berøre den, så kan dråpet dispenseres på lasteputen ved å bringe den i kontakt med overflaten. Hvis dråpet holder seg til pipettespissen, returner den til lagerløsningen, bytt spissen og sett en ny dråpe på nytt. I en videre utvikling av dagens konseptbevissystem kan automatisk levering av dråpe ses.
Et annet kritisk skritt, før du kjører analysen, lukker lokket på parallellplateenheten. Som nevnt tidligere i protokollen, må lokket slokks på toppen av aktuasjonsplaten. Lokkets hydrofobe overflate forhindrer forvrengning og forskyvning av dråpene som sitter på aktiveringsplaten. For å garantere jevn bevegelse av dråpe, anbefales det sterkt å bruke uberørt aktiveringsplate, riktig lasting av dråper og chipmontering. Gjenbruk av aktuasjonsplatene er mulig; Antall sykluser avhenger imidlertid av aktiveringsspenningene (figur 3) og analyte/reagensavsetning på overflaten, også kjent som biofouling. Den presenterte plattformen benyttet krom trykt EWOD chip, som kan brukes på nytt pålitelig for påfølgende målinger opptil fire ganger ved driftsspenning på 120 V og mellomliggende plate rengjøring etter hvert eksperiment. Platene ble resirkulert, for å redusere kostnadenper eksperiment, ved å dekontaminere (børsting overflaten med ufortynnet rengjøringsmiddel før grundig sinsing) biofouled amorfe fluoropolymerer (Table of Materials) belegg og spin-belegg en frisk en på toppen av platen. Aktiveringsplateresirkulering krever imidlertid manuell håndtering, kostbare reagenser (amorfe fluoropolymerer (Materialtabell)) og spesialutstyr (spin-coater). Alternative EWOD-brikker undersøkes med kostnadseffektive underlag som papir19,acetatfilmer eller trykte kretskort (PCB)20,21. Slike engangsforbruksvarer kan legge til rette for pålitelig og rimelig bruk av DMF-plattformen og kan gi midler til å sidestille biofouling problemet.
Biofouling er den viktigste begrensningen av EWOD for biologiske anvendelser22,23. Tidligere studier på DMF har identifisert to mekanismer som bidrar til biofouling, nemlig passiv adsorpsjon på grunn av hydrofobe interaksjoner, og en elektrostatisk drevet adsorpsjon som manifesterer seg når et elektrisk felt brukes24. Funnene i den nåværende artikkelen er i samsvar med denne teorien da det ble dokumentert at aktuasjonsplatens gjenbruk av høy aktuasjonsspenninger reduseres ved høy aktuasjonsspenninger. En mulig forklaring er at proteiner adsorb lett på Fluoropolymer-belagt (Teflon-lignende) overflater og de aggregerer raskere på fouled i forhold til uberørte overflater24. Som en konsekvens er proteinrelaterte analyser på DMF vanskelig å kvantifisere og kan oppleve tap av analyte, krysskontaminering og redusert presisjon17. Det verste scenariet er når en kritisk mengde proteinadsorber dermed gjør enheten ubrukelig. For å minimere biofouling, ulike tilnærminger har blitt undersøkt fra å minimere oppholdstiden til dråpepå brikken, gjennom belegg23, til tilsetningsstoffer (dvs. overflateaktive stoffer eller pluronic syre) inn i biomaterial-laden dråper6,22. Derfor er et viktig aspekt av immunoassay analysen på EWOD å velge anti-biofouling strategier som er kompatible med den spesifikke protokollen for hånden.
Den automatiserte DMF-plattformen er designet for å utføre en enkelt sandwich ELISA-test per kjøring mens du bruker mikrolitervolumer for både reagenser og analyte. Når det er nødvendig, eksisterer konvensjonelle sandwich ELISA-sett basert på pre-belagte 96-brønn- eller 384-brønnplater som i kombinasjon med hjelpelaboratorieutstyr resulterer i høyere gjennomstrømning per løp; basert på kun reagenser pris, omtrentlig kostnad per analyse/brønn er henholdsvis 6,04 USD (580 USD/96) og 0,33 USD (2×580 USD/384). Dette gjør de konvensjonelle ELISA-metodene ideelle for et stort antall prøver behandlet vanligvis av opplært teknisk personell ved sentraliserte laboratorieanlegg. Men på avsidesliggende steder viste den detaljerte kostnadsanalysen av ELISA for miljøovervåking at når kapitalkostnader (dvs. laboratoriedriftskostnader, tilbakevendende kostnader, utvalgstransport, forsyninger og personell) var inkludert den faktiske prisen per ELISA var 60 USD hvorav 34 USD var for forsyninger per prøve25. I motsetning er den foreslåtte DMF-plattformen bærbar, krever minimum opplæring for å operere og med forhåndsbelagte perler kan gi prøve-til-svar-analyse i løpet av minutter. Derfor kan den presenterte teknologien distribueres til point-of-need steder og komplementanalyser ellers tilgjengelig i sentraliserte laboratorier.
I den representative resultatdelen ble den automatiserte DMF immunoassay-plattformen brukt til direkte påvisning av patogener for forsvarsbruk. Andre mulige bruksområder for DMF-plattformen omfatter, men er ikke begrenset til, biodiagnostisk, kontinuerlig overvåking og automatisert prøvetaking. Potensielt kan DMF påvirke ulike sektorer fra omsorgssted for personlig helsetjenester, samt kontrollert miljøovervåking for beskyttelse av pasienter fra luftbåren sykehuservervet infeksjon, for å beskjære overvåkingssystem for landbruk og matproduksjon.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne anerkjenne bidraget fra våre kolleger fra Microfluidic & Microengineering Research Group for deres arbeid med mekanisk design og systemintegrasjon. Forfatterne vil gjerne takke Dstl Porton Down for deres uvurderlige støtte og økonomiske bidrag, til tidligere og pågående prosjekter som videreutvikler DMF-teknologien og dens applikasjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
| Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
| Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
| B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
| CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
| Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
| E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
| Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
| Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
| Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
| MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
| Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
| Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
| Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
| SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
| Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
| Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
| SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
| Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |
References
- Kokalj, T., Pérez-Ruiz, E., Lammertyn, J. Building bio-assays with magnetic particles on a digital microfluidic platform. New Biotechnology. 32 (5), 485-503 (2015).
- Sista, R., et al. Development of a digital microfluidic platform for point of care testing. Lab on a Chip. 8 (12), 2091-2104 (2008).
- Starodubov, D., et al. Compact USB-powered mobile ELISA-based pathogen detection: design and implementation challenges. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies VIII. 8024, 80240 (2011).
- Delattre, C., et al. Macro to microfluidics system for biological environmental monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 36 (1), 230-235 (2012).
- Gooding, J. J. Biosensor technology for detecting biological warfare agents: Recent progress and future trends. Analytica Chimica Acta. 559 (2), 137-151 (2006).
- Coudron, L., et al. Fully integrated digital microfluidics platform for automated immunoassay; A versatile tool for rapid, specific detection of a wide range of pathogens. Biosensors and Bioelectronics. 128, 52-60 (2019).
- Hua, Z., et al. Multiplexed Real-Time Polymerase Chain Reaction on a Digital Microfluidic Platform. Analytical Chemistry. 82 (6), 2310-2316 (2010).
- Zou, F., et al. real-time chemiluminescent detection of DNA mutation based on digital microfluidics and pyrosequencing. Biosensors and Bioelectronics. 126, 551-557 (2019).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital microfluidic magnetic separation for particle-based immunoassays. Analytical Chemistry. 84 (20), 8805-8812 (2012).
- Vergauwe, N., et al. A versatile electrowetting-based digital microfluidic platform for quantitative homogeneous and heterogeneous bio-assays. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (5), (2011).
- Choi, K., et al. Automated digital microfluidic platform for magnetic-particle-based immunoassays with optimization by design of experiments. Analytical Chemistry. 85 (20), 9638-9646 (2013).
- Zhao, Y., Cho, S. K. Microparticle sampling by electrowetting-actuated droplet sweeping. Lab on a Chip. 6 (1), 137-144 (2006).
- Jonsson-Niedziołka, M., et al. EWOD driven cleaning of bioparticles on hydrophobic and superhydrophobic surfaces. Lab on a Chip. 11 (3), 490-496 (2011).
- Foat, T. G., et al. A prototype personal aerosol sampler based on electrostatic precipitation and electrowetting-on-dielectric actuation of droplets. Journal of Aerosol Science. 95, 43-53 (2016).
- Seale, B., et al.
- Ng, A. H. C., et al. A digital microfluidic system for serological immunoassays in remote settings. Science Translational Medicine. 10 (438), 6076-6088 (2018).
- Wild, D., Davies, C. Immunoassay fundamentals. The Immunoassay Handbook: Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques. , 1-26 (2013).
- Gorham, W. F. A New, General Synthetic Method for the Preparation of Linear Poly-p-xylylenes. Journal of Polymer Science Part A-1: Polymer Chemistry. 4 (12), 3027-3039 (1966).
- Soum, V., et al. Affordable fabrication of conductive electrodes and dielectric films for a paper-based digital microfluidic chip. Micromachines. 10 (2), (2019).
- Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. Low-cost, rapid-prototyping of digital microfluidics devices. Microfluidics and Nanofluidics. 4 (4), 349-355 (2008).
- Jain, V., Devarasetty, V., Patrikar, R. Study of Two-Dimensional Open EWOD System using Printed Circuit Board Technology. Global Journal of Researches in Engineering: Electrical and Electronics Engineering. 17 (6), (2017).
- Luk, V. N., Mo, G. C. H., Wheeler, A. R. Pluronic additives: A solution to sticky problems in digital microfluidics. Langmuir. 24 (12), 6382-6389 (2008).
- Latip, E. N. A., et al. Protein droplet actuation on superhydrophobic surfaces: A new approach toward anti-biofouling electrowetting systems. RSC Advances. 7 (78), 49633-49648 (2017).
- Yoon, J. Y., Garrell, R. L. Preventing biomolecular adsorption in electrowetting-based biofluidic chips. Analytical Chemistry. 75 (19), 5097-5102 (2003).
- Dalvie, M. A., et al. Cost analysis of ELISA, solid-phase extraction, and solid-phase microextraction for the monitoring of pesticides in water. Environmental Research. 98 (1), 143-150 (2005).
