Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Kombineret brug af hale vene metastase assays og Real-Time in vivo billeddannelse at kvantificere brystkræft metastatisk kolonisering og byrde i lungerne

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60687
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Summary

Den beskrevne fremgangsmåde kombinerer eksperimentelle hale vene metastase assays med in vivo levende dyr billeddannelse at tillade real-time overvågning af brystkræft metastase dannelse og vækst i tillæg til kvantificering af metastase antal og størrelse i lungerne.

Abstract

Metastase er hovedårsagen til kræftrelaterede dødsfald, og der er begrænsede terapeutiske muligheder for patienter med metastatisk sygdom. Identifikation og afprøvning af nye terapeutiske mål, der vil lette udviklingen af bedre behandlinger for metastatisk sygdom, kræver prækliniske in vivo-modeller. Demonstreret her er en og musemodel for bestemmelse brystkræft metastatisk kolonisering og efterfølgende vækst. Metastatiske kræftceller er stabilt transduceret med virale vektorer kodning Firefly der og zsgreen proteiner. Kandidat gener er derefter stabilt manipuleret i luciferase/ZsGreen-udtrykker kræftceller og derefter cellerne injiceres i mus via den laterale hale vene til at assay metastatisk kolonisering og vækst. En in vivo Billeddannende anordning anvendes derefter til at måle tumor cellernes bioluminescens eller fluorescens i de levende dyr for at kvantificere ændringer i metastatisk byrde over tid. Udtrykket af det fluorescerende protein gør det muligt at kvantificere antallet og størrelsen af metastaser i lungerne ved afslutningen af forsøget uden behov for skæring eller histologisk farvning. Denne tilgang giver en relativt hurtig og nem måde at teste rollen af kandidat gener i metastatisk kolonisering og vækst, og giver en hel del mere information end traditionelle hale vene metastase assays. Ved hjælp af denne tilgang viser vi, at samtidig Knockdown af ja associeret protein (YAP) og transkriptional Co-aktivator med et PDZ-bindende motiv (TAZ) i brystkræft celler fører til reduceret metastatisk byrde i lungerne, og at denne reducerede byrde er resultatet af signifikant forringet metastatisk kolonisering og reduceret vækst af metastaser.

Introduction

Kræft er fortsat den anden førende dødsårsag verdensomspændende1 og metastase er ansvarlig for de fleste af disse dødsfald2,3. En begrænset forståelse af de molekylære mekanismer, der regulerer metastatisk kolonisering og efterfølgende vækst, har imidlertid hindret udviklingen af effektive behandlinger for metastatisk sygdom. Identifikationen af nye terapeutiske mål kræver en analyse for at teste, hvordan rystet udtryk eller funktion af et kandidat-gen påvirker metastase dannelse og vækst. Mens autoktont musemodeller har deres fordele, er de tidskrævende og dyre at generere, hvilket gør dem mere velegnede til målvalidering i stedet for Målsøgning. Transplantations modelsystemer, hvor kandidat genet er rystet i kræftceller in vitro og derefter virkninger på metastatisk potentiale vurderes in vivo, er billigere og højere gennemløb end autoktone modeller. Desuden er virale vektorer for stabil levering af RNAi, crispr/CAS9, og Trans Genes er bredt tilgængelige, hvilket gør det relativt let at forstyrrer næsten ethvert gen eller gener af interesse i en Cancer cellelinjer. Denne fremgangsmåde kan også bruges til at assay rollen af kandidat gener i metastatisk kolonisering og vækst i humane Cancer cellelinjer ved at transplanteres cellerne til immunkompromitterede eller humaniserede mus.

De to typer af assays, der anvendes til at teste metastase dannelse ved transplanterede cancerceller in vivo er spontane metastase assays og eksperimentelle metastase assays. I spontane metastase assays4,5, kræftceller injiceres i mus, lov til at danne en primær tumor, og derefter spontan metastase dannelse og efterfølgende vækst er analyseret. Styrken af denne model er, at cellerne skal fuldføre alle trin i den metastatiske proces for at danne metastatiske tumorer. Men, mange kræft cellelinjer ikke metastaserer effektivt i spontane metastase modeller, og enhver manipulation af de celler, der påvirker primær tumorvækst kan tolerere resultaterne af metastase assay. Eksperimentelle metastase assays, hvor kræftceller injiceres direkte i omløb, anvendes til at undgå disse faldgruber. Almindeligt eksperimentelle metastase assays omfatter hale vene injektion6,7,8 (og påvist her), intrakardiel injektion9, og Portal vene injektion10.

Formålet med protokollen præsenteres her er at give en in vivo eksperimentel metastase assay, der giver en forsker til at overvåge metastase dannelse og vækst i realtid, samt at kvantificere slutpunktet metastase nummer og størrelse i lungerne af samme mus. For at opnå dette, traditionelle eksperimentelle hale vene metastaser assays6,7,8 kombineres med levende dyr billeddannelse, ved hjælp af en in vivo billedenhed9,11,12,13,14. Tumor celler, der stabilt udtrykker både der og et fluorescerende protein injiceres i mus via den laterale hale vene, og derefter anvendes in vivo billedenheden til at måle ændringer i metastatisk belastning i lungerne over tid (figur 1). In vivo Live Animal Imaging-enheden kan dog ikke skelne mellem eller måle størrelsen af individuelle metastaser. Ved afslutningen af forsøget anvendes et fluorescerende stereomicroskop til at tælle antallet og måle størrelsen af de fluorescerende metastaser i lungerne uden behov for skæring og histologi eller Immunhistokemi (figur 1). Denne protokol kan bruges til at teste, hvordan ændring af udtryk eller funktion af et kandidat-gen påvirker metastase dannelse og vækst. Potentielle terapeutiske forbindelser såsom små molekyler eller funktions blokerende antistoffer kan også testes.

For at demonstrere denne tilgang, vi først udført et bevis for koncept eksperiment, hvor den væsentlige replikation faktor, replikation protein a3 (RPA3) er slået ned i metastatisk mus brystkræft celler. Vi viser, at mus injiceret med RPA3 Knockdown celler har betydeligt mindre metastatisk byrde på hvert tidspunkt i forhold til mus injiceres med kontrol celler. Analyse af de metastase-holdige lunger viser, at denne reducerede metastatiske byrde er resultatet af signifikant reduceret metastatisk kolonisering og nedsat vækst af de metastaser, der dannes. For yderligere at demonstrere denne teknik, vi testede, om samtidige knock down af ja associerede protein (YAP) og transkriptional Co-aktivator med en PDZ-bindende motiv (TAZ) hæmmer metastatisk kolonisering eller efterfølgende vækst. YAP og TAZ er to relaterede transkriptionelle Co-aktivatorer, der er de kritiske downstream effektorer af Hippo pathway. Vi15,16 og andre har impliceret Yap og Taz i metastase (revideret i17,18,19), tyder på, at disse proteiner er gode terapeutiske mål. Konsekvent, vi fandt, at mus injiceres med YAP/TAZ Knockdown celler havde signifikant reduceret metastatisk byrde. Analyse af lungerne viste, at YAP/TAZ Knockdown celler dannede mange færre metastaser, og at de metastaser, der gjorde form var mindre. Disse eksperimenter viser, hvordan eksperimentelle metastase assays giver en forsker til hurtigt og billigt at teste rollen af et kandidat-gen i metastase dannelse og vækst. De viser yderligere, hvordan den kombinerede anvendelse af levende animalsk billeddannelse og fluorescerende kvantificering af metastaser i hele lunger gør det muligt for forskeren bedre at forstå trinene under metastatisk kolonisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol omfatter brug af mus og biologisk farlige materialer og kræver godkendelse fra de relevante institutionelle sikkerhedsudvalg. Alle de beskrevne in vivo arbejde her er godkendt af Albany Medical College institutionel dyrepleje og brug udvalg (IACUC).

Bemærk: for en protokol oversigt, se skematisk i figur 1.

1. emballering af alle påkrævede retrovira og lentivira

Bemærk: den beskrevne protokol bruger lentiviral eller retrovirale vektorer til stabilt at udtrykke et der enzym og fluorescerende protein samt til at manipulere udtrykket af et kandidat gen. Disse vira er pakket i HEK-293FT celler som beskrevet nedenfor.

  1. Dag 1: plade HEK-293FT celler på 6-brønds plader i 2 mL komplette vækstmedier (10% FBS i DMEM med 1% penicillin/streptomycin og 2 mM L-glutamin), så de er 40-60% flydende på dag 2. Inkuber ved 37 °C, 5% CO2 overnight.
  2. Dag 2: for hver viral vektor, der skal emballeres, transficere en 40-60% flydende godt af hek-293ft celler med antiretroviral eller lentiviral vektor og passende vektorer kodning viral coat og emballage proteiner.
    Bemærk: denne protokol bruger VSVG som coat protein, psPAX2 for lentiviral Packaging og gag-Pol til antiretroviral emballage (Se supplerende tabel 1 for vektor liste).
  3. Foretag en co-transfection blanding for hver brønd som følger:
    1. 4 μl lipidopløsning til transfections (Se tabel over materialer) og 96 μl transfektering buffer og Inkubér i 5 minutter.
    2. Tilsæt 1 μg viral vektor, 0,5 μg coat protein Vector (VSVG), og 0,5 μg emballage protein vektor (psPAX2 eller gag-pol) og Inkuber i 20 minutter.
    3. Tilsæt forsigtigt Co-transfection blandingen fra trin 1.3.2 til HEK-293FT celler belagt i trin 1,1 og Inkubér ved 37 °C, 5% CO2 overnight.
  4. Dag 3: Fjern de transfection-holdige medier fra hver brønd, og tilsæt forsigtigt 2 mL komplette vækstmedier til hver brønd. Inkubere ved 37 °C, 5% CO2 i ca. 24 timer.
  5. Dag 4: Saml den virale supernatanten fra hver brønd ved hjælp af en 3 mL sprøjte og Filtrer gennem et 0,45 μm filter til et 2 mL mikrocentrifuge glas.
  6. Valgfrit: Hvis der ønskes samling af endnu et parti virus, tilsættes forsigtigt 2 mL komplette vækstmedier til hver brønd og Inkuber ved 37 °C, 5% CO2 i ca. 24 timer.
  7. Dag 5 (valgfrit): Saml en anden runde af viral supernatanten som i trin 1,5.
    Bemærk: protokollen kan sættes på pause ved at fryse den virale supernatant.

2. generation af kræftceller, der stabilt udtrykker der og et fluorescerende protein

Bemærk: følgende protokol beskriver, hvordan man først at stabilt mærke 4t1 celler med Firefly der og et fluorescerende protein (zsgreen) ved hjælp af to vektorer med unikke valg gener. Derefter bruges en 3Rd viral vektor til at manipulere ekspression af et kandidat gen. Men, virale vektorer, der samtidig leverer et fluorescerende protein og en genetisk manipulation kan også bruges som et alternativ (som i de repræsentative eksperimenter nedenfor). Andre kræftceller kan anvendes, men celle numrene skal optimeres for trin 2,1 og 2.7.1.

  1. Plade 4T1 celler ved 1,5 x 105 celler/godt i en 12-brønd plade i komplette vækstmedier (10% FBS i DMEM med 1% penicillin/streptomycin og 2 mm L-glutamin) og Inkubér ved 37 °c, 5% Co2 overnight.
  2. Inficere 4T1 celler med viral supernatanten genereret i trin 1 som følger.
    1. Aspirér vækstmediet fra cellerne og tilsæt 500 μl der viral supernatanten og 500 μl fluorescerende protein viral supernatanten til samtidig at inficere cellerne med både der og fluorescerende protein viral supernatants.
    2. Tilsæt 1 μL 8 mg/mL hexadimethrinbromid (Se tabel over materialer).
    3. Cellerne inkubates ved 37 °c, 5% indtil 75-90% flydende (typisk 24-48 timer).
  3. Trypsinize 4T1-cellerne med 500 μL trypsin i 2-5 minutter (cellerne skal frit skylle ned fra bunden af brønden). Alle cellerne overføres til en 6 cm skål i 4 mL markerings medier (komplette vækstmedier, der indeholder passende antibiotika), hvorved trypsin slukkes. Plade en 6 cm parabol af ikke-inficerede kontrol celler i samme udvælgelse medier.
    Bemærk: passende antibiotika koncentration bør bestemmes på forhånd ved at afprøve flere doser. Desuden kan fluorescens-aktiverede celle sortering også bruges til at vælge de fluorescently mærkede celler i stedet for stof valg.
  4. Cellerne inkubates ved 37 °C, 5% CO2 i markerings mediet, og cellerne opdeles, når det er nødvendigt, indtil alle ikke-inficerede kontrol celler er døde (afhængig af selektions genet og celle linjen).
  5. Bekræft, at de inficerede 4T1-celler udtrykker det ZsGreen fluorescerende protein ved hjælp af en grøn excitation (450-490 nm)/emission (500-550 nm) filter indstillet på et inverteret fluorescerende mikroskop ved 50-100x forstørrelse.
  6. Bekræft, at de inficerede 4t1-celler udtrykker der ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt der-aktivitetssæt som følger.
    1. Brug en minimal volumen 1x passiv lyse buffer til at lyse luciferase-udtrykker 4T1 celler og kontrol 4T1 celler, der ikke udtrykker luciferase, forsigtigt ryster i 30 minutter.
    2. Der tilsættes 20 μL celle lysat til en hvid bund 96-brønd plade og derefter 50 μL af luciferaseanalysesreagenset fra luciferaseaktivitetssæt.
    3. Brug en plade læser til at måle luminescens fra cellerne ved alle bølgelængder i spektret ved hjælp af luminescens indstilling.
      Bemærk: protokollen kan sættes på pause ved at nedfryse de stabilt transducerede celler.
  7. Manipuler ekspression af kandidat genet som følger:
    1. Plade 6 x 105 mærket 4T1 celler fra trin 2,6 på en 60 mm skål i 4 ml komplette vækstmedier og inkubere ved 37 °c, 5% Co2 overnight.
    2. Opsug vækstmediet fra hver brønd, og tilsæt 2 mL komplette vækstmedier, der indeholder 4 μL 8 mg/mL hexadimethrinbromid.
    3. 2 mL viral supernatanten tilsættes fra trin 1 til de celler, som er belagt fra trin 2.7.2 og Inkuber ved 37 °C, 5% CO2 overnight.
    4. Trypsinize 4T1-cellerne med 500 μL trypsin i 2-5 minutter (cellerne skal frit skylle ned fra bunden af brønden). Alle cellerne overføres til en 10 cm skål i 10 mL markerings medier (komplette vækstmedier, der indeholder passende antibiotika), hvorved trypsin slukkes. Plade nogle ikke-inficerede kontrolmærket 4T1 celler i samme udvælgelse medier.
    5. Cellerne inkubates ved 37 °C, 5% CO2 i markerings mediet, og cellerne opdeles, når det er nødvendigt, indtil alle ikke-inficerede celler er døde.
    6. Bekræft, at ekspression af kandidat genet ændres ved hjælp af en standardtilgang som Western blot20 eller qPCR21.
    7. Assay luminescens og fluorescens som i trin 2.5-2.6 for at bestemme, hvor ens de er i kontrol og Knockdown celler, da dette kan ændre sig (Se diskussion).
      Bemærk: protokollen kan sættes på pause ved at nedfryse de stabilt transducerede celler.

3. optimering af in vivo eksperimentel design

  1. Optimer passende celle nummer og varighed af forsøget for den ønskede metastatiske byrde som følger.
    1. Udvid fluorescerende og bioluminescerende 4t1 celler fra trin 2,6 i komplette vækstmedier, så overskydende celler er tilgængelige på den ønskede dag for injektion.
    2. Forbered cellerne til hale vene injektioner som beskrevet i trin 4,2. For at bestemme det optimale celle nummer til injektioner, resuspension cellerne i flere forskellige koncentrationer i 100 μL 1x PBS.
      Bemærk: Vi anbefaler at teste en række cellenumre/mus fra 25.000 op til 500.000.
    3. Opbevar celle suspensionerne på is indtil injektion.
    4. Hver fortynding af 4T1-celler fra trin 3.1.2 til 3-4-mus indsprøjtes via den laterale hale vene beskrevet i trin 4,3 (se nedenfor).
    5. Returner musen til sit bur og overvåge i 15 minutter for at sikre en fuld helbredelse. Mus skal kontrolleres for tegn på smerte eller angst 3x ugentligt.
    6. Overvåg mus for metastase dannelse og vækst i 3-6 uger (cellelinje og musestamme afhængig) ved hjælp af en in vivo levende dyr billedbehandling enhed (Se trin 5 og 6).
      1. Euthanize mus 3-6 uger efter hale vene injektion i henhold til standard institutionelle retningslinjer.
      2. Forbered lungerne og Vurder metastase størrelse og nummer, der er beskrevet i trin 7.
      3. Vælg den passende tid for metastaser til at vokse for den ønskede metastatisk byrde (Se diskussion).

4. hale vene injektion af mærkede cancerceller

Bemærk: trin 4.2.4 er optimeret til 4T1-celler, som vokser i syngeneiske BALB/c-mus. Hvis andre kræft cellelinjer og muse stammer anvendes, antallet af celler injiceres, og længden af analysen bør først optimeres.

  1. Udvid 4T1 cellelinjer genereret i trin 2 på 2 15 cm retter i komplette vækstmedier, så overskydende celler er tilgængelige på dagen for injektion.
  2. Forbered cellerne til hale vene injektion som følger:
    1. Aspirer medierne og skyl celle pladerne med 1x PBS.
    2. Trypsinize cellerne med 5 mL trypsin pr. 15 cm plade i 2-5 minutter (cellerne skal frit skylle ned fra bunden af brønden). Overfør alle cellerne til et konisk rør. Vask de resterende celler fra vævskultur skålen med nok komplette vækstmedier til at slukke for trypsin og tilsæt vask til samme koniske rør.
    3. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celle tæller for at bestemme det samlede celle nummer.
    4. Cellerne centrifugeres ved 122 x g i 3 minutter, Aspirér supernatanten, og cellerne opslæmmes i 1x PBS ved den ønskede koncentration. Her injiceres 2,5 x 104 celler i hver mus i 100 μl PBS, så resuspension cellerne ved 2,5 x 105 celler/ml. Opbevar celle suspensionerne på is indtil injektion.
      Bemærk: det er vigtigt at begrænse mængden af tid mellem trypsinisering af cellerne og hale vene injektion til ca. 1 time.
  3. Injicer 4T1 celler fra trin 4.2.5 i mus via den laterale hale vene som følger:
    1. Arbejder i en hætte på dyret facilitet, forsigtigt, men grundigt blande cellerne ved at invertere røret eller ved hjælp af en 1 mL sprøjte for at sikre, at de er ensartet resuspenderet. Sørg altid for, at cellerne resuspenderes, inden sprøjten pålæsses.
    2. Ilæg en 1 mL luer-Lock-sprøjte med cellesuspension, og Udvis overskydende luftbobler. Placer en 1/2 tommer, 30-gauge nål på sprøjten med facet op og udvise luftbobler.
    3. Placer forsigtigt musen i en gnaver fastholdelses.
    4. De laterale hale vener skal være synlige og dilaterede. Hvis ikke, skal du forsigtigt klemme bunden af halen og dyppe halen i varmt ledningsvand for at sprede venerne.
      Bemærk: dilatation af venerne kan også opnås ved at placere muse buret under en varmelampe og/eller på toppen af en varmepude.
    5. Brug en spritserviet til at rengøre halen. Indsæt nålen i halen vene, facet side opad, og Injicer 100 μL cellesuspension.
      Bemærk: Hvis nålen er indsat korrekt i venen, skal den let glide lidt frem og tilbage, og der bør ikke være modstand, når stemplet skubbes. Vellykkede injektioner bør også resultere i en "flush", hvor den blå farve af venen bliver hvid i et par sekunder efter injektionen.
  4. Fjern langsomt nålen og brug en steril gaze, lægge pres på injektionsstedet for at stoppe enhver blødning.
  5. Returner musen til sit bur og overvåge i 15 minutter for at sikre fuld restitution. Mus skal kontrolleres for tegn på smerte eller angst 3x ugentligt.
  6. Overvåg mus for metastase dannelse og vækst i 3-6 uger (cellelinje og musestamme afhængig) ved hjælp af en in vivo levende dyr billedbehandling enhed (Se trin 5 og 6).

5. overvågning af den metastatiske byrde ved fluorescens med en in vivo levende animalsk billedbehandlings anordning

Bemærk: Undlad at afbilde dyret for fluorescens med aktivt luminescerende signal.

  1. Hvis kun Imaging bioluminescens, springe til trin 6.
  2. Tænd in vivo Live Animal Imaging-enheden.
  3. Indstil in vivo Live Animal Imaging anæstesi system i henhold til producentens retningslinjer for at levere mellem 1,5% og 2% isofluran til anæstesi kammeret og billed kammeret.
  4. Anæstetize mus med fluorescently mærkede metastaser fra trin 4 ved at placere dem i et anæstesi kammer og levere 1,5-2.5% isofluran.
  5. Åbn billed softwaren (Se tabel over materialer) og login.
  6. Klik på knappen Initialiser , og vent på, at maskinen initialiseres.
  7. Skift synsfelt til D.
    Bemærk: synsfelt C kan også bruges, hvis der er behov for en nærmere visning af en mus, men dette begrænser antallet af mus, der kan afbildet samtidigt.
  8. Når softwaren har angivet, at kameraet har nået den korrekte temperatur, skal du klikke på knappen Imaging Wizard , vælge fluorescens og derefter vælge det relevante filterpar i rullemenuen.
    Bemærk: Hvis den anvendte fluoroforet ikke er en mulighed, skal du vælge input ex/EM og angive den krævede excitation og emission.
  9. Placer musen i kammeret som beskrevet i trin 3.2.4.
  10. Klik på Hent sekvens.
  11. Efter billeddannelse skal du returnere musen til sit bur og overvåge i 15 minutter for at sikre fuld helbredelse.
  12. Gentag trin 5,2 og trin 5.7-5.9 med mindst én mus, der ikke indeholder metastaser. Bemærk: denne mus vil blive brugt til at kvantificere og subtrahere baggrunds signalet under analysen (trin 8).
  13. Billede 2-3 gange ugentligt i eksperimentets varighed.

6. overvågning af den metastatiske byrde ved bioluminescens med en in vivo levende animalsk billedbehandlings anordning

  1. Tænd in vivo Live Animal Imaging-enheden, og Opsæt programmet på følgende måde.
    1. Åbn billed softwaren (Se tabel over materialer) og login. Klik på knappen Initialiser , og vent på, at maskinen initialiseres. Skift synsfelt til D.
      Bemærk: synsfelt C kan bruges til at se nærmere på billedet af hele muse legemet; Dette begrænser dog antallet af mus, der kan afbildet på én gang.
    2. For første gangs brug skal du redigere eksponeringsindstillingerne på følgende måde: Klik på Rediger | Indstillinger | Erhvervelse | Automatisk eksponering og ændre den maksimale eksponeringstid fra standard 60 sekunder til 300 sekunder og klik på OK.
      Bemærk: Undlad at ændre andre parametre under fanen automatisk eksponering.
  2. Set-up anæstesi systemet i henhold til producentens retningslinjer for at levere mellem 1,5% og 2% isofluran til anæstesi kammeret og billed kammeret.
  3. Sørg for, at kameraet har nået den rette temperatur, før du fortsætter til trin 6,4.
  4. Anesthetize metastase-holdige mus fra trin 4 ved at placere dem i en anæstesi kammer og levere 1,5-2.5% isofluran.
  5. Forbered mus til bioluminescens Imaging som følger.
    1. Ilæg en 1 mL sprøjte med D-luciferin (30 mg/mL i D-PBS), og tilsæt derefter en 1/2 tommer 30-gauge kanyle til sprøjten, og pres luftbobler ud.
    2. Måle og registrere massen af bedøvet mus.
    3. Hold musen fast ved at klemme i nakken ved hjælp af tommelfingeren og markør fingrene og greb halen mellem Pinkie fingeren og bunden af hånden. Vend musen i en 45 graders vinkel, hvor hovedet peger nedad.
    4. Indsæt nålen, facet side op, i musens venstre side intraperitoneal (IP) plads. Bekræft indtastning i IP-rummet ved at trække en lille lydstyrke tilbage. Der bør ikke være farve i bunden af nålen, når du trækker tilbage i IP-rummet.
    5. Injicer den passende mængde D-luciferin for en dosis på 150 mg/kg.
    6. Umiddelbart efter D-luciferin administration, starte en timer og placere musen fladt på ryggen i billedenheden med næsen i næse keglen og sikre, at 1.5-2.5% isofluran administreres. Placer skillevægge mellem hver mus, hvis du afbilde flere mus. Sørg for, at musene er placeret så fladt som muligt (dvs. ikke hælder til den ene side).
    7. Klik på felterne luminescerende og fotografi , og klik derefter på Hent i kontrolpanelet anskaffelse.
  6. Kontinuerligt erhverve bioluminescerende billeder indtil peak signalet er opnået og bruge billedet med peak bioluminescerende signal til analyse.
  7. Efter billeddannelse skal du returnere musen til sit bur og overvåge i 15 minutter for at sikre fuld helbredelse.
  8. Billede 2-3 gange ugentligt i eksperimentets varighed.

7. kvantificering af antallet og størrelsen af metastaser

Bemærk: den tid, metastaser får lov til at vokse, bør bestemmes for hver cellelinje og musestamme, og vil blive påvirket af antallet af injicerede celler.

  1. Euthanize musene i henhold til standard institutionelle retningslinjer.
  2. Isoler og fjern lungerne fra hver mus og skyl i 1x PBS for at fjerne overskydende blod.
  3. Adskil lungerne forsigtigt i lobes.
  4. Erhverve billeder af zsgreen metastaser i lapper ved 10x i lyse Mark og fluorescens ved hjælp af et fluorescerende stereoskop med en gfp bredbånds filter (excitation 470/40x).
    Bemærk: Bevar den samme forstørrelse og lysstyrke for alle prøver. Den anvendte forstørrelse kan variere afhængigt af størrelsen, antallet og lysstyrken af metastaser samt synsfeltet for det anvendte mikroskop.
  5. Brug billedanalyse software til at kvantificere størrelsen og antallet af metastaser fra billederne.
    Bemærk: protokollen til billedanalyse er software afhængig og kan optimeres med tumorer fra trin trin. Alternativt tælle antallet af metastaser i hver lunge manuelt ved hjælp af fluorescerende stereoskop. Protokol kan sættes på pause her og trin 8 kan gøres på ethvert tidspunkt efter alle in vivo billeder er blevet indsamlet.

8. behandling og analyse af data fra de billeder, som er erhvervet med in vivo Live Animal Imaging device

  1. Åbn alle billedfiler for hver mus i billed softwaren.
    Bemærk: Brug billedet med det maksimale bioluminescerende signal til analyse
  2. Sørg for, at enhederne er i Radiance for bioluminescerende data og effektivitet for fluorescerende data ved at klikke på pilen øverst til venstre i billedvinduet og ændre den til den relevante enhed.
  3. Brug billedet fra det sidste tidspunkt til at oprette et interesseområde (ROI) på følgende måde.
    1. Klik på ROI Tools i vinduet værktøjs palet . Indsæt et INVESTERINGSAFKAST ved at klikke på pilen og vælge 1.
    2. Klik på kanten af ROI og flytte den over brystet af musen. Juster størrelsen af ROI, så det dækker brystet af musen og udelukker ikke signal.
  4. Klik på mål ROIs, og Kopiér eller skriv det rå tal i et Excel-ark.
    Bemærk: for bioluminescerende data vælges den totale flux (fotoner/sekund), som er summen af alle udstrålingen i Roi. Da metastaser ikke nødvendigvis vokser ensartet, foretrækkes den totale flux over gennemsnitlig udstråling, fordi den måler summen af den metastatiske byrde. På samme måde bør den samlede virkningsgrad (emissions lampe (fotoner/sekund)/excitation Light (fotoner/sekund)) anvendes i stedet for gennemsnitlig effektivitet for fluorescerende data.
  5. Højreklik i billedfilen for at kopiere det ROI, der bruges i trin 8,3, og Indsæt det i alle billedfiler.
    Bemærk: ved kvantificering af fluorescerende billeder, kvantificere den samme region på en mus, der blev afbildet uden metastase. Brug dette signal som baggrunds signal, og træk det fra hvert fluorescerende metastase-indeholdende muse billede erhvervet.
  6. Flyt indsatte ROIs over det samme område, der er valgt i trin 8.3.4 for hvert billede, og Gentag trin 8,4.
  7. Afbilde og analysér de rå data på følgende måde (Se supplerende tabel 2).
    1. Gør en log10 omdannelse af rå data for hver mus ved hjælp af den angivne formel(supplerende tabel 2) og plot som i figur 2D og figur 4F. Log10 transformation linearizes vækstkurven, som har tendens til at være geometrisk og minimerer heteroscedasticitet.
    2. Ved hjælp af lineær regression beregnes hældningen af den monterede linje til loggen10 transformerede data for hver mus plottet i trin 8.7.1 (supplerende tabel 2). Se formlen i supplerende tabel 2 for at tilpasse linjen og beregne hældningen i ét trin.
    3. Plot de numeriske værdier af skråningerne som i figur 2E og figur 4G. Brug en elevs t-test eller en-vejs ANOVA (for mere end 2 grupper) på skråningerne for at bestemme Statistisk signifikans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at demonstrere ovenstående fremgangsmåde udførte vi et proof of concept-eksperiment, hvor en kritisk Replikerings faktor, RPA3 blev slået ned i en metastatisk mus brystkarcinom cellelinje (4t122). Mens protokollen beskriver mærkning cellerne med både der og fluorescerende proteiner forud for genetisk manipulation, vi brugte en modificeret tilgang, fordi RNAi vektorer også levere zsgreen (figur 2a). For det første var 4t1 celler stabilt transduceret med en lentiviral konstruere kodning Firefly der og hygromycin resistens (Phage-der-IRES-hygro). Efter valget af hygromycin blev der udført en luciferaseanalyse for at bekræfte et stabilt udtryk af Firefly der (figur 2a). Derefter blev 4t1-luciferasecellerne stabilt transduceret med retrovirale vektorer, der udtrykker zsgreen og enten en kontrol miR30-baseret shrna, eller en miR30-baseret shrna tidligere vist sig effektivt at målrette mus RPA316,23,24. Cellerne blev derefter injiceret i musene via den laterale hale vene og in vivo bioluminescerende signal blev målt to gange om ugen for at overvåge den metastatiske byrde (figur 2B, C). Log10 transformeret signal for hver mus blev afbildet som metastatisk byrde over tid (figur 2D) og skråningerne af hvert plot blev bestemt (figur 2E). Disse data viser hastigheden af ændringen i metastatisk byrde er signifikant reduceret med RPA3 Knockdown sammenlignet med kontrol celler. Selv om forskellene er slående, giver disse data alene ikke os mulighed for at afgøre, om den reducerede metastatiske byrde er resultatet af mindre metastaser eller på grund af langsommere vækst af metastaser. Derfor blev de ZsGreen-mærkede metastaser i lungerne også analyseret i slutningen af forsøget. Mus injiceret med RPA3 Knockdown celler havde næsten ingen metastaser i lungerne, mens kontrol musene havde talrige store metastaser (figur 3). Desuden var de metastaser, der dannes fra RPA3 Knockdown-celler, klart mindre end kontrol 4T1-metastaser (figur 3A). I overensstemmelse med vores manuelle tæller (figur 3B), har billedanalyse-softwaren talt betydeligt mindre metastaser i RPA3 Knockdown-musene (figur 3C). Desuden blev den totale metastaserende byrde i lungerne (summen af områderne for hver metastase i millimeter) også drastisk reduceret med RPA3 Knockdown (figur 3D). Endelig var størrelsen af de individuelle metastaser, der dannes i RPA3-Knockdown-musene, generelt meget mindre end i kontrol musene (figur 3E). Ud over de store metastaser i kontrol musene, vi observere talrige små metastaser så godt, men kan ikke afgøre, om disse er tumorceller, der seedede lungerne og ikke vokser, eller hvis de er tumorceller udgydt fra en af de større metastaser, der re-seedede lungerne i en ny placering (figur 3E). Kollektivt disse data viser, at RPA3 er nødvendig for metastase dannelse af 4T1 celler. Disse fund blev forventet, fordi vores tidligere arbejde viste, at RPA3 banke ned celler havde signifikant reduceret evne til at danne metastaser i lungerne efter hale vene injektion16. Dette eksperiment viser imidlertid, hvordan brugen af levende animalsk billeddannelse og fluorescerende kvantificering af metastase antal og størrelse kan anvendes til at afgøre, om ændringer i metastatisk byrde skyldes forskelle i metastatisk kolonisering eller vækst.

For at demonstrere hvordan denne tilgang kan bruges til at besvare et mere biologisk relevant spørgsmål, spurgte vi, om YAP og TAZ er nødvendige for metastatisk kolonisering og efterfølgende vækst i denne syngeneiske model af brystkræft. Udtryk og aktivitet af Yap eller Taz er steget i mange kræftformer sammenlignet med normale væv, og dette er prædiktiv for dårlig patient udfald25,26,27,28,29. Derudover har flere undersøgelser involveret Yap, Taz, eller teader, de kritiske Yap/Taz-bindende partnere, i metastase15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. I betragtning af disse data brugte vi vores tilgang til at teste, om YAP og TAZ er nødvendige for metastase dannelse og vækst. Til dette bruger vi en antiretroviral vektor, der udtrykker tandem miR30-baserede shRNAs rettet mod både YAP og TAZ. Som vist reducerer denne tandem shRNA effektivt YAP og TAZ protein ekspression og transkriptional aktivitet i 4T1 celler (figur 4A, B). 4t1-luciferaseceller blev stabilt transduceret med en zsgreen-udtrykker version af denne tandem Yap/Taz shrna vektor eller en kontrol miR30-baseret shrna (figur 4C) og derefter analyseret af hale vene injektioner i og Balb/C mus. Som vist i figur 4var den hastighed, hvormed den metastatiske byrde steg, signifikant hurtigere i de mus, der blev injiceret med kontrol celler sammenlignet med de mus, som INJICERES med Yap/Taz-Knockdown-celler (figur 4D-F). Signifikant færre metastaser dannet i mus injiceres med YAP/TAZ Knockdown celler sammenlignet med mus med kontrol celler, om tælles manuelt (figur 5A, B) eller ved hjælp af billedanalyse software (figur 5C). Ikke alene var der mange flere metastaser i kontrol musene, men de var generelt større (figur 5E). Konsekvent blev den metastatiske byrde i lungerne (totalt metastase område i mm) også drastisk reduceret med YAP/TAZ Knockdown (figur 5D). Det er vigtigt at bemærke, at når metastaser er store og tætte sammen, kan softwaren være ude af stand til at skelne mellem forskellige metastaser. Dette var tilfældet for et par metastaser i kontrol mus (mus 3 og mus 7). Således er det vigtigt at kontrollere produktionen af billedanalyse software for at sikre, at det er præcist måling af området af enkelt tumorer. Det er også derfor, det er vigtigt at optimere antallet af celler injiceres og længden af forsøget. Kollektivt, disse data viser, at YAP og TAZ er forpligtet til at opretholde den hastighed, hvormed metastatisk byrde stiger i en syngeneisk murine model af metastatisk brystkræft, og at dette skyldes den manglende evne til metastaser til dannelse og reduceret vækst af de få metastaser, der gjorde form.

Figure 1
Figur 1: skematisk af protokollen. Alle nødvendige vira er først pakket i HEK-293FT celler. De ønskede celler til studiet er derefter samtidig inficeret med der og fluorescerende vira, der hver udtrykker et unikt pattedyr stof valg gen. Inficerede celler er derefter udvidet i de relevante medier, der indeholder begge stoffer til at vælge for stabilt transducerede celler udtrykker både der og det fluorescerende protein. Udtryk for begge etiketter er bekræftet som beskrevet i protokollen. De mærkede celler er derefter transduceret med en tredje virus a indeholder genetisk manipulation (miR30 shRNA) og en tredje unikke stof udvælgelse gen. Efter udvælgelse med det tredje stof injiceres cellerne i musene via den laterale hale vene. Metastatisk byrde overvåges i mus gennem hele eksperimentet med et in vivo Live Animal Imaging System. Ved afslutningen af forsøget, er mus euthanized, og billeder af hele lungerne er taget ved hjælp af en fluorescerende dissekere mikroskop, og derefter bruges til at måle antallet og størrelsen af metastaser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: luciferase-baseret in vivo Live Animal Imaging viser, at RPA3 Knockdown reducerer brystkræft metastatisk byrde. A) skematisk angivelse af, hvordan cellerne blev genereret til denne in vivo-undersøgelse. 4t1-cellerne blev stabilt transduceret med en lentivirus-kodning af der og hygromycin-resistens. Inficerede celler blev udvalgt med 600 μg/ml hygromycin B i en uge, og derefter blev luciferaseaktivitet målt i forældre-eller 4t1-luciferaseceller ved hjælp af et der-reporter-kit og plade læser (n = 1 eksperiment med replikat brønde i gennemsnit). 4T1-Luciferaseceller blev derefter inficeret med retrovirus, der leverer ZsGreen og miR30 shRNAs rettet mod enten mCherry (Control) eller mRPA3. Valget af puromycin (2,5 μg/mL) i 3 dage blev anvendt til at vælge til stabil integration af virusset. (B-E) 4t1-luciferaseceller stabilt udtrykker zsgreen og Control (sh-mcherry) eller mRPA3 (sh-mRPA3-431) shrnas blev sprøjtet ind i mus og afbildet for bioluminescens på de angivne dage som beskrevet i protokollen. B &Amp; C) Bioluminescent billeder for en repræsentativ mus i hver gruppe på den angivne dag efter injektion (D) plot af loggen10 transformerede der signal målt for hver mus i løbet af eksperimentet. (E) punktplot med gennemsnitlig (fast linje) for skråningerne af hver mus i D (n = 6 for sh-Control og 8 for sh-mRPA3-431). Statistisk signifikans blev afprøvet ved hjælp af en elevs t test; * p ≤ 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kvantificering af fluorescerende metastaser afslører, at RPA3 Knockdown forhindrer metastatisk kolonisering og efterfølgende vækst af brystkræft celler. (A) fluorescerende (venstre) og lysfelt (højre) billeder af repræsentative lapper fra hver mus injiceret i figur 2 21 dage efter injektion. Asterisker (*) indikerede grønne autofluorescerende bronkier. (C-E) Billedanalyse software (Se tabel over materialer) blev brugt til at identificere og måle objekter ved hjælp af en intensitets tærskel på 25 til 100 og en størrelses tærskel på 0,01 mm2 til uendeligt. B &Amp; C) Punktplot med den gennemsnitlige (massive bar) af det samlede antal af metastaser i lungerne af hver mus, når tælles (B) ved billedanalyse software (C). D) det samlede område (mm) af lungerne, der blev målt med billedanalyse software, afbildes som en metastatisk byrde med middelværdien angivet med en solid bar. E) størrelsen af hver metastase afbildes for hver mus. Kontrol mus er indikeret af de blå prikker og mRPA3 Knockdown mus af de røde prikker. Bemærk, at skala bjælken er adskilt ved 1 mm for at gøre det lettere at visualisere størrelsen og antallet af små metastaser (n = 6 sh-Control, 8 sh-mRPA3-431). Statistisk signifikans blev afprøvet ved hjælp af en elevs t test; p = 0,06; * * p ≤ 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Yap/Taz Knockdown reducerer brystkræft metastatisk byrde. (A & B) 4t1-celler, der stabilt udtrykker miR30-baseret kontrol (mcherry) eller tandem Yap/Taz shrnas (sh-mYAP1/mTAZ6), blev analyseret af Western blot Analysis (A) eller transficeret med en Yap/Taz-tead der reporter konstruere og analyseret for Yap/Taz-tead transkriptional aktivitet som beskrevet tidligere15,16 (B) (n = 5 for kontrol og 4 for YAP1/TAZ6). C) skematisk angivelse af, hvordan cellerne blev genereret til in vivo-studiet. 4T1-Luciferaseceller blev inficeret med retrovira, der leverer ZsGreen og enten en miR30 shRNA målretning mCherry (Control) eller tandem miR30 shRNAs rettet mod både mYAP og mTAZ. Inficerede celler blev valgt i Puromycin (2,5 μg/mL) i 3 dage. 4t1-luciferaseceller, der stabilt udtrykker zsgreen og Control (sh-mcherry) eller Yap/Taz (sh-mYAP1/mTAZ1) shrnas blev derefter sprøjtet ind i mus og afbildet for bioluminescens ved på de injicerede dage. (D &Amp; E) Bioluminescent billeder for en repræsentativ mus i hver gruppe på den angivne dag efter injektion. (F) plot af loggen10 transformerede der signal målt for hver mus i løbet af eksperimentet. (G) punktplot med gennemsnitlig (massiv stang) for skråningerne af hver mus i F (n = 7 for sh-Control og 8 for sh-mRPA3-431). Middelværdien er angivet med en fast linje. Statistisk signifikans blev afprøvet ved hjælp af en elevs t test; p = 0,06; #, p ≤ 0,01; ***. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Yap og Taz er nødvendige for metastatiske brystkræft celler at kolonisere lungerne. (A) fluorescerende (venstre) og lysfelt (højre) billeder af repræsentative lapper fra hver mus injiceret i figur 4 21 dage efter injektion. (C-E) Billeder blev behandlet med billedanalyse software som beskrevet i figur 3. B &Amp; C) Punktplot med den gennemsnitlige (massive bar) af det samlede antal af metastaser i lungerne af hver mus, når tælles manuelt (B) eller ved billedanalyse software (C). D) det samlede areal af alle metastaser (mm) blev målt med billedanalyse software og afbildet som en metastatisk byrde med middelværdien (solid bar). E) størrelsen af hver metastase afbildes for hver mus. Kontrol mus er indikeret med de blå prikker og sh-mYAP1/mTAZ6 Knockdown mus af de røde prikker. Bemærk, at skala bjælken er adskilt ved 1 mm for bedre at visualisere størrelsen og antallet af små metastaser (n = 7 sh-Control, 8 sh-mYA1/mTAZ6). Middelværdien er angivet med en fast linje. Statistisk signifikans blev afprøvet ved hjælp af en elevs t test; * p ≤ 0,05, * *, p ≤ 0,01; **. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende tabel 1: tabel over vektorer. Alle vektorer er angivet og nye vektorer er beskrevet. Standard molekylær biologi teknikker blev brugt til at klone nye vektorer og sekvenser for nyligt beskrevne 97-Mer shRNA er inkluderet. Citater henviser til: [1]53, [2]16, [3]54venligst klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: eksempel på in vivo Live Animal Imaging databehandling og analyse. Regneark, der viser, hvordan rådataene fra in vivo Live Animal-billeder konverteres til analyse som beskrevet i trin 6,7 og 6,8. Rå data erhvervet fra in vivo Live Animal Imaging omdannet ved hjælp af en log10 transformation. Ændringen i metastatisk byrde beregnes for hver mus ved at beregne hældningen genereret af log10 transformerede data. Eksempler herpå er luciferaseanalysen fra figur 2. Kolonnerne er farvekodede for at angive, hvilke data der blev brugt til at generere hver enkelt hældnings værdi, og formlerne er indlejret i regnearket. Dobbeltklik på brønden vil afsløre den formel, der bruges til at behandle dataene. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin i metoden
Det er afgørende at optimere antallet af injicerede celler (trin 3) for en given cellelinje og musestamme, da dette i høj grad kan påvirke antallet af metastaser, der dannes, og længden af eksperimentet. Hvis der injiceres for mange celler, eller hvis metastaser vokser for længe, kan det være svært at tælle metastaser, hvilket gør det vanskeligt at vurdere virkningerne af den genetiske manipulation. Men, hvis for få celler injiceres, få eller ingen metastaser kan dannes. Således bør et foreløbigt eksperiment gøres ved hjælp af forskellige antal celler til at bestemme det optimale antal og længden af tid, at metastaser vokse. For at sikre et konsistent antal metastaser inden for en gruppe, er det vigtigt at injicere lige mange levedygtige celler i hver mus. Da cellerne kan bosætte sig i både røret og sprøjten, skal cellerne forsigtigt resuspenderes før pålæsningen af sprøjten, og celle suspensioner bør ikke efterlades i sprøjten for længe (trin 4.3.2). Cellelevedygtighed nedsætter jo længere cellerne er i suspension, så mængden af tid mellem trypsinisering og injektion af cellerne bør ikke være mere end en time (trin 4.2.5). Luftbobler og store klumper af celler bør ikke injiceres, da disse kan forårsage fastsidning, der dræber musen. Desuden kan tegne celler op gennem nålen forskyde dem, så sprøjten skal indlæses uden nålen. For at bekræfte, at der blev injiceret et relativt lige antal celler, kan der tages levende animalske billeder i vivo kort tid efter injektionen (figur 2B, figur 4D).

Nøjagtig og konsistent kvantificering af det bioluminescerende signal er vigtigt og afhænger af, at cellerne tager op og metaboliserer D-luciferin. Dette kan påvirkes af mange variabler, herunder, dosis af D-luciferin, timing af injektion, musens kropstemperatur, hvordan bedøvet musen er, når injiceres, og hvordan en mus er placeret i anæstesi kammeret før billeddannelse. Derfor er det vigtigt at holde disse trin konsekvente for alle mus og billedbehandlings sessioner. Vi brugte en varmepude til at opretholde konsekvent mus kropstemperatur mens i anæstesi kammeret. Da signalet skal trænge ind i vævet for både bioluminescerende og fluorescerende detektion, er det også afgørende at holde muse positionen konsistent for hvert billede (fladt på ryggen virker bedst til billeddannelse af lungerne). Kvantificering af fluorescerende billeder fra in vivo levende dyr Imaging bør altid ske ved hjælp af effektivitet% enheder, da dette giver mulighed for passende sammenligning mellem billeder. Ligeledes bør total flux (fotoner/sekund) altid anvendes ved kvantificering af bioluminescerende billeder. Til analyse af den metastatiske byrde konverterer log10 transformation vækstkurven (før maksimum signalet nås) til et lineært plot, som var nødvendigt for hældnings analysen.

Ændringer og fejlfinding af metoden
I den præsenterede protokol en population af celler først stabilt er transduceret med et fluorescerende protein og luciferase, så at befolkningen er transduceret med enten en kontrol vektor eller en vektor rettet mod genet af interesse. Dette sikrer, at begge cellepopulationer har lignende fluorescerende protein og der udtryk. Men, som et alternativ, virale vektorer, der samtidig leverer to af disse komponenter kunne udnyttes. Faktisk brugte vi i de repræsentative eksperimenter ZsGreen, der udtrykker retrovirale vektorer til at udtrykke shRNAs i 4T1-luciferaseceller. Det anbefales, at ekspression af der og fluorescerende protein bliver analyseret i alle celle grupper, efter at det pågældende gen af interesse er ændret. Forskellige udtryks niveauer mellem grupper kan komplicere fortolkningen af dataene, så det er bedst, hvis de forskellige grupper har samme udtryk for både det fluorescerende protein og luciferase. Desuden kan røde blodlegemer være Auto-luorescent og kan gøre det vanskeligt at visualisere de fluorescerende metastaser i lungerne. Hvis dette er tilfældet, kan røde blodlegemer ryddes fra lungerne ved PBS perfusion under eutanasi for at reducere Auto-luorescerende baggrund (passende eutanasi teknikker og retningslinjer bør følges). Selv om forskellene mellem kontrol og Knockdown grupper i vores repræsentative eksperimenter er dramatiske, er den iboende mus-til-mus variabilitet, der ofte findes i in vivo metastase assays, tydeligt i kontrol musene (figur 3b og figur 5b). Når denne variation er høj, kan det gøre det vanskeligt at bestemme størrelsen af den Knockdown effekt. En alternativ tilgang, der kan bruges til at reducere denne variabilitet, er at mærke kontrol cellerne og Knockdown-cellerne med forskellige fluorescerende proteiner og særskilte luciferaseenzymer og derefter blande de to populationer i lige store mængder og injicere blandingen. For eksempel, kontrol celler stabilt udtrykker tomat og renilla der kunne blandes med Knockdown celler, der udtrykker zsgreen og Firefly der. In vivo Live Animal Imaging enheder kan skelne renilla der fra Firefly der, og tomat fra zsgreen, så enten fluorescens eller luminescens kan bruges til selvstændigt at kvantificere hver cellepopulation. Faktisk, Dual der Imaging af 4t1 celler vokser som primære tumorer i levende dyr er blevet påvist ved hjælp af en in vivo levende dyr billedbehandling enhed4. Det er dog vigtigt at bemærke, at der kan være overlap i fluorescerende signal, således at et spektral udblande trin (Se producentens retningslinjer) bør medtages i denne fremgangsmåde. Desuden bør renilla der og Firefly der være afbildet separat med en tilstrækkelig tidsforsinkelse, der gør det muligt for det første der signal ikke længere kan påvises før billeddannelse den anden. Brug af særskilte fluorophorer gør det stadig muligt at kvantificere antallet og størrelsen af metastase i lungerne16. For at teste metastatisk kolonisering og vækst i andre organer ud over lungerne denne protokol kan ændres og anvendes til intrakardiel og Portal vene injektioner9,10.

Metodens begrænsninger
Ved hjælp af en in vivo levende dyr billeddannelse enhed til at erhverve realtid metastatisk byrde i forbindelse med fluorescently mærket cancerceller giver en kraftfuld metode til at assay metastatisk kolonisering og efterfølgende vækst; der er dog begrænsninger i denne fremgangsmåde. Nogle gener kan være nødvendige for medfødte celle proliferation snarere end specifikke roller i metastase. Der kan foretages in vitro-celle sprednings analyser før in vivo-forsøget for at afgøre, om genet forstyrrer in vitro-vækst. Når du afbilder et levende dyr, skal det bioluminescerende eller lysstofrør signal fra metastaser være stærkt nok til at passere gennem vævet. Desuden påvirker de optiske egenskaber (dvs. absorption og spredning) af vævet også detektion55. Excitation lyskilde skal være i stand til at passere gennem væv til at begejstre fluorescently mærket cancerceller og bioluminescens har en større dynamikområde end fluorescens. Selv om fluorescens kan anvendes til levende dyr billeddannelse, bioluminescens foretrækkes til påvisning af signal i indre organer. Desuden kan nogle immunkompetente muse stammer afvise celler, som udtrykker fluorescerende proteiner. Faktisk konstaterede vi, at celler, der udtrykker tomat, gfp eller mcherry, blev afvist eller ned reguleret fluoroforet, når de voksede i Balb/c-mus (data ikke vist og15). Men som påvist her (figur 3 og figur 5) og tidligere15,16, er zsgreen-mærkede celler detekterbare i disse mus. I tilfælde, hvor det fluorescerende protein udtryk bliver målbart, kan en anden metode til at kvantificere den relative metastatiske kolonisering være at anvende qPCR til at kvantificere enten det fluorescerende gen eller et andet gen i den integrerede virale vektor15. Selv om en in vivo Live Animal Imaging-enhed giver dig mulighed for at detektere ændringer i metastatisk belastning, tillader det ikke en at afgøre, om disse ændringer skyldes ændret størrelse eller antallet af metastaser. Det giver heller ikke geografisk information om placeringen af metastaser. Desuden kan styrken af signalet påvirkes af, hvor dybt i vævet det er.

Betydningen af metoden og potentielle fremtidige anvendelser
Der er mange måder, hvorpå denne tilgang kan ændres for at få flere eller forskellige oplysninger. En række kræft cellelinjer, herunder humane Cancer cellelinjer eller patient afledte xenografter kunne anvendes i denne analyse. Andre musemodeller kan også anvendes, herunder transgene eller Knockout mus designet til at teste, hvordan målretning proteiner lavet af stromale celler påvirker metastatisk kolonisering og vækst af de injicerede cancerceller. Hvis der skal testes flere kandidat gener, kan denne fremgangsmåde være multiplexed, fordi in vivo Live Animal Imaging-enheder kan detektere og skelne mellem en lang række fluorophorer. Dette vil reducere antallet af mus, der kræves, og øge antallet af mål, der kan testes. In vivo levende dyr Imaging kan også kombineres med X-ray eller CT9 Imaging til at give en hel del mere geografisk information om placeringen af metastaser. Endelig, denne fremgangsmåde kan ændres til at assay mere specifikke skridt inden for metastatisk kolonisation kaskade. For eksempel kan de trin, der er involveret i tumor celle såning (intravaskulær overlevelse, ekstravasation, og post ekstravasation overlevelse) skelnes ved at kvantificere antallet af tumorceller i lungerne på flere tidspunkter inden for de første 3 dage efter injektion (som gjort her16). I dette tilfælde kan lungerne også farves med vaskulære markører og afbildet ex vivo at bestemme procentdelen af kræftceller, der har ekstravasated på hver gang punkt56,57.

Sammenfattende giver brugen af Real-Time in vivo levende animalsk billeddannelse af fluorescerende og lysende viser cancerceller efter hale vene injektion en mere detaljeret analyse af, hvordan et kandidat gen eller gener påvirker metastatisk kolonisering og efterfølgende vækst. Denne fremgangsmåde er hurtigere og billigere end autoktont musemodeller og undgår nogle af de forbehold af spontane metastase modeller. Brugen af både fluorescens og luminescens som et middel til at detektere og kvantificere metastaser giver forskerne uafhængige udlæsninger, der forbedrer tilliden til resultaterne og giver mulighed for fleksibilitet i det eksperimentelle design. Brugen af fluorescens for at kvantificere metastase størrelse og antal undgår behovet for tidskrævende og potentielt bekostelig histologisk behandling og analyse og giver mulighed for yderligere brug af hele vævet. Protokollen kan bruges med en række forskellige teknikker til at manipulere med ekspression eller funktion af kandidat genet, såsom RNAi, transgenekspression eller CRISPR/CAS-medieret redigering, og kan også bruges til at teste små molekyler, funktions blokerende antistoffer eller andre potentielle terapeutiske forbindelser. Som nævnt ovenfor, flere enkle modifikationer kan gøres for at forbedre analysen og give yderligere oplysninger. Denne tilgang er en ideel måde at identificere og teste Pro-metastaserende gener, der har terapeutisk potentiale til behandling af kræft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Emily Norton for at hjælpe med virusinfektioner og kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker også Ryan Kanai for hjælp til at erhverve billeder af lungerne og Kate E. Tubbesing for at få hjælp til billedanalyse af de grønne metastaser i lungerne. Vi takker dyreforsknings facilitetens personale for deres støtte og for hjælp til forberedelsen af denne video. Dette arbejde blev støttet af en Susan G. Komen Career Catalyst Grant, der blev tildelt J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. , Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
  2. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  4. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  5. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  6. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  7. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  9. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  10. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  11. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  12. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  13. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  14. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  16. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
  17. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
  18. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  19. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
  20. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  21. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  22. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  23. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
  24. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
  25. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119 (2015).
  26. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  27. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529 (2011).
  28. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
  29. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  30. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
  31. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
  32. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
  33. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
  34. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647 (2016).
  35. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
  36. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
  37. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
  38. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
  39. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
  40. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
  41. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
  42. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
  43. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
  44. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
  45. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
  46. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
  47. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
  48. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
  49. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310 (2017).
  50. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
  51. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
  52. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
  53. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  54. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
  55. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  56. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
  57. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).

Tags

Kræftforskning 4t1 celler og musemodel metastase metastatisk kolonisering brystkræft mus levende dyr billeddannelse hale vene metastase Yap Taz
Kombineret brug af hale vene metastase assays og Real-Time in vivo billeddannelse at kvantificere brystkræft metastatisk kolonisering og byrde i lungerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, J. S. A., Feustel, P. J.,… More

Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter