Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Induktion haariger Wurzeln von Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum). Dies kann verwendet werden, um Genfunktionen und die Produktion von sekundären Metaboliten in Tartary Buchweizen zu untersuchen, für jede genetische Transformation angenommen werden, oder für andere Heilpflanzen nach Verbesserung verwendet werden.
Abstract
Tartary Buchweizen (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] besitzt verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten, weil es reichlich sekundäre Metaboliten wie Flavonoide enthält, insbesondere Rutin. Agrobacterium rhizogenes wurden nach und nach weltweit verwendet, um haarige Wurzeln in Heilpflanzen zu induzieren, um Genfunktionen zu untersuchen und die Ausbeute von sekundären Metaboliten zu erhöhen. In dieser Studie haben wir eine detaillierte Methode beschrieben, um A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln bei TB zu erzeugen. Cotyledons und hypokotyledonäre Achse bei 7-10 Tagen wurden als Explanten ausgewählt und mit A. rhizogenes infiziert, die einen binären Vektor tragen, die zufällige haarige Wurzeln induzierten, die nach 1 Woche erschienen. Die erzeugte haarige Wurzeltransformation wurde anhand von Morphologie, Resistenzselektion (Kanamycin) und Reportergenexpression (grünes fluoreszierendes Protein) identifiziert. Anschließend wurden die transformierten haarigen Wurzeln nach Bedarf selbst propagiert. In der Zwischenzeit wurde ein Myeloblastose (MYB) Transkriptionsfaktor, FtMYB116, mit den A. rhizogenes-vermittelten haarigen Wurzeln in das TB-Genom umgewandelt, um die Rolle von FtMYB116 bei der Synthese von Flavonoiden zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von Flavonoid-bezogenen Genen und die Ausbeute von Flavonoid-Verbindungen (Rutin und Quercetin) signifikant (p < 0.01) von FtMYB116gefördert wurden, was darauf hindeutet, dass A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln als wirksames alternatives Werkzeug zur Untersuchung von Genfunktionen und der Produktion von sekundären Metaboliten verwendet werden können. Das in dieser Studie beschriebene detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung haariger Wurzeln kann nach der Anpassung für jede genetische Transformation oder andere Heilpflanzen übernommen werden.
Introduction
Tartary Buchweizen (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) ist eine Art von Dikotyledon aus der Gattung Fagopyrum und der Familie Polygonaceae1. Als eine Art von homologen Lebensmitteln in der chinesischen Medizin hat TB aufgrund ihrer ausgeprägten chemischen Zusammensetzung und ihrer vielfältigen Bioaktivitäten gegen Krankheiten großes Interesse erhalten. TB ist in erster Linie reich an Kohlenhydraten, Proteinen, Vitaminen und Carotinoiden sowie an Polyphenolen wie Phenolsäuren und Flavonoiden1. Verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten von Flavonoiden, einschließlich antioxidative, antihypertensive2, und entzündungshemmende sowie Anti-Krebs und antidiabetische Eigenschaften wurden gezeigt3.
Agrobacterium rhizogenes ist ein Bodenbakterium, das zur Entwicklung von haarigen Wurzelerkrankungen in mehreren höheren Pflanzen, insbesondere Dikotyledonen, beiträgt, indem es Wundstellen4,5infiziert. Dieser Prozess wird durch die Übertragung der T-DNA in das wurzelinduzierende (Ri) Plasmid5,6 eingeleitet und wird häufig von der Integration und Expression eines exogenen Gens aus dem Ri-Plasmid und den nachfolgenden Schritten zur Erzeugung des haarigen Wurzelphäpusten7begleitet. A. rhizogenes-vermittelte transgene Haarwurzeln, als ein leistungsfähiges Werkzeug auf dem Gebiet der Pflanzenbiotechnologie, wurden aufgrund ihrer stabilen und hohen Produktivität und der einfachen Beschaffung in kurzer Zeit am häufigsten eingesetzt. Darüber hinaus zeichnen sich behaarte Wurzeln, die von A. rhizogenes induziert werden, effizient durch ihre plagiotrope Wurzelentwicklung und ein stark verzweigtes Wachstum in einem hormonfreien Medium8aus. Sie können in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden, einschließlich der künstlichen Samenproduktion, der Wurzelknötchenforschung und bei der Untersuchung der Wechselwirkungen mit anderen Organismen wie Mykorrhizapilzen, Nematoden und Wurzelregern7,9. Darüber hinaus wurden haarige Wurzeltransformationskulturen ausgiebig als experimentelles System verwendet, um die biochemischen Wege und chemische Signalisierung zu untersuchen und pflanzliche sekundäre Metaboliten zu produzieren, die als Pharmazeutika, Kosmetika und Lebensmittelzusatzstoffe8,10verwendet werden. Die wertvollen sekundären Metaboliten, einschließlich Indole-Alkaloide, Aconite, Tropanalkaloide, Terpenoide und Flavonoide, synthetisiert in wildartigen haarigen Wurzeln wurden seit mehreren Jahrzehnten in zahlreichen Arten untersucht, wie Ginsenosid in Panax Ginseng11, Coumarine in Ammi majus12, und Phenolverbindungen in TB2,13.
Haarige Wurzeln wurden mit A. rhizogenes in 79 Pflanzenarten aus 27 Familien14hergestellt. Zum Beispiel, A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeltransformation wurde in Sojabohnen15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, und Chicorée (Cichorium intybus L.) berichtet 20. TB haarige Wurzeltransformation wurde auch untersucht2. Es gibt nur wenige detaillierte Protokolle zur Entwicklung haariger Wurzeln, die von A. rhizogenes vermittelt werden, die entweder einen binären Vektor tragen oder nicht. Zum Beispiel führten Sandra et al.21 eine Methode zur Herstellung transgener Kartoffelhaarwurzeln ein, die in Wildtrieben getragen werden. Die voll entwickelten haarigen Wurzeln konnten 5-6 Wochen nach der Injektion von A. rhizogenes visualisiert werden, die das gus-Reporter-Gen in die Stamminternoden von Kartoffelpflanzen tragen. Eine andere Studie hatte auch berichtet, dass ein transgenes haariges Wurzelsystem, das von A. rhizogenes induziert wurde, das gusA-Reportergen in Jute(Corchorus capsularis L.) beherbergte. 22. Darüber hinaus erhielten Supaart et al.23 transgene Tabakhaarwurzeln mit A. rhizogenes, die mit dem Expressionsvektor pBI121 transformiert wurden, der das Gen von1-Tetrahydrocannabinolic acid (THCA) Synthase trug, um THCA zu produzieren.
Ein Schrittweise-Prozess für eine effektive Generierung haariger Wurzeltransformation, insbesondere bei TB, wurde jedoch relativ weniger demonstriert. In dieser Studie haben wir ein detailliertes Protokoll mit A. rhizogenes beschrieben, das das Reportergen (GFP), einen selektiven Marker (Kan) und ein Gen von Interesse (b4, ein aus unserer Gruppe identifiziertes, aber unveröffentlichtes Gen aus der grundlegenden Helix-Loop-Helix (bHLH) Familie verwendet, um eine haarige Wurzelgenetische Transformation bei TB zu erzeugen. Das Experiment dauerte 5-6 Wochen, von der Inokulation von Samen bis zur Erzeugung von haarigen Wurzeln, die die Explantation, Infektion, Kokultivierung, Subkulierung und anschließende Vermehrung beinhalteten. Darüber hinaus wurde A. rhizogenes, das ein binäres Plasmid mit dem TB-Transgen des Myeloblastose-Transkriptionsfaktors 116 (FtMYB116) enthält, verwendet, um festzustellen, ob FtMYB116 die Ansammlung von Flavonoiden, insbesondere Rutin, bei TB auf Gen- und Metabolzenebene durch die haarige TB-Wurzeltransformation fördern kann. FtMYB116, ein lichtinduzierter Transkriptionsfaktor, reguliert die Synthese von Rutin unter verschiedenen Lichtbedingungen5. Chalcone-Synthase (CHS), Flavanon-3-Hydroxylase (F3H), Flavonoid-3'-Hydroxylase (F3'H), und Flavonol-Synthase (FLS)24 sind Schlüsselenzyme, die am Stoffwechselweg der Rutin-Biosynthese beteiligt sind. Daher zeigt diese Studie die Überexpression von FtMYB116 bei TB haarigen Wurzeln und die Expression von wichtigen Enzymgenen sowie den Gehalt an Rutin und anderen Flavonoiden wie Quercetin.
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Protocol
Die in dieser Studie verwendete TB wurde bt18 genannt, die aus der Rasse "JinQiao No.2" stammt, die vom Research Center of Small Miscellaneous Grain of Shanxi Academy of Agricultural Science angebaut wurde. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind in Abbildung 1dargestellt.
HINWEIS: Betreiben Sie Explanten-bezogene Manipulationen schnell, und halten Sie die Petrischalen nach Möglichkeit geschlossen, um Welken und Kontaminationen zu vermeiden. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Explant-Inkubationen unter der Bedingung einer 14-h-Licht- und einer 10-h-Dunkelphotoperiode bei 25 °C durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Explanten- oder Bakterienoperationen unter aseptischen Bedingungen in einer laminaren Strömungshaube durchgeführt. Alle Medienzutaten für A. rhizogenes und in vitro Pflanzenkulturen sind in Tabelle 1enthalten. Nach der Einstellung des pH-Werts wurden alle Medien bei 120 °C für 20 min autoklaviert. Verfestigte Medien wurden hergestellt, indem 25 ml Medium in eine Petrischale mit 9 cm Durchmesser gefüllt und verfestigt werden konnten.
VORSICHT: Legen Sie alle genetisch veränderten Bakterien und Pflanzen in den entsprechenden Abfallbehälter. Betreiben Sie alle gefährlichen Chemikalien in einem Rauchschrank und deponieren Sie sie im Gefahrstoffbehälter.
1. Herstellung von TB-Expflanzen
- Herstellung von TB-Samen
- Wählen Sie plump und unbeschädigte TB-Samen(Abbildung 1A1), die bei einer Temperatur von weniger als 20 °C für nicht mehr als 2 Jahre konserviert wurden.
- Die Samen ca. 20 min in Wasser einweichen, damit die Samenschicht leicht abgeschält werden kann (Abbildung 1A2). Verwenden Sie bei Bedarf eine Schere, um einen Schlitz auf den Samen zu schneiden, um das Peeling zu erleichtern.
- Sterilisation von TB-Samen
- 100–200 geschälte Samen in einen 100 ml sterilisierten konischen Kolben geben.
- Desinfizieren Sie die Samen mit 75% Ethanol für 30 s.
- Ersetzen Sie das Ethanol durch 5% Natriumhypochlorit und desinfizieren Sie es 15 min.
HINWEIS: Die Desinfektion mit Quecksilberbichlorid in einer Konzentration von 1 g/L für 8 min kann als alternativer Sterilisator verwendet werden, um Natriumhypochlorit in jedem Fall einer unzureichenden Sterilisation zu ersetzen.
VORSICHT: Quecksilberbichlorid ist gefährlich und kein umweltfreundliches Material. Betreiben Sie es im umlaufenden Schrank und legen Sie es in den Behälter für gefährliche Abfälle, wenn Quecksilberbichlorid in jedem Fall verwendet wird. - Gießen Sie das Natriumhypochlorit aus.
- Waschen Sie die Samen mit sterilem entionisiertem Wasser 5 mal.
- Die Samen mit einem sterilen bibulösen Papier trocknen lassen.
- Herstellung von TB-Sämlingen
- Bereiten Sie 50 ml Murashige und Skoog (MS) Basalmedium (1962) ergänzt mit 30 g/L Saccharose und 7 g/L Agarpulver (MSSA) (Tabelle 1) in einer 300 ml Pflanzengewebekulturflasche vor.
- Stellen Sie den pH-Wert vor dem Autoklavieren auf 5,8 ein.
- Verteilen Sie 10 Samen gleichmäßig pro Flasche MSSA Medium.
- Die Samen in einem Kulturraum bei 25 °C bei 1 °C unter dem Lichtzustand für 7-10 Tage keimen.
- Herstellung steriler Expflanzen
- Wählen Sie robuste Sämlinge von TB (Abbildung 1C), wenn die 2 Stücke von Kotyledonen entfaltet werden.
- Schneiden Sie die Sämlinge von den Wurzeln ab (Abbildung 1C Rot-Dash-Pfeilspitzen),um den Kontakt mit dem Medium zu vermeiden.
- Legen Sie sie in eine sterile Petrischale.
- Die Hypocotyle in 0,8–1 cm große Segmente schneiden und die Kotyledonen in ca. 0,5 cm stücken scheren.
- Präkultur diese Explants auf MSSA Medium unter der Lichtbedingung für 24 h.
- Übertragen Sie sie in einen 100 ml sterilisierten konischen Kolben, die nun für eine Infektion bereit sind.
2. Vorbereitung von A. rhizogenes für die Transformation
HINWEIS: Der A. rhizogenes-Stamm ACCC10060 wurde freundlicherweise vom Institut für Medizinische Pflanzenentwicklung zur Verfügung gestellt und bei 80 °C konserviert. A. rhizogenes wurde mit dem binären Vektor pK7GWIWG2D (II) transformiert, der eine T-DNA mit dem b4-Gen, das ein GFP als Indikatorgen begleitet, und dem Kan-Resistenzgen als wählbarem Marker beherbergt. Das Gen b4 ist ein Mitglied der Transkriptionsfaktor bHLH Familie, die noch nicht veröffentlicht wurde. Um das Potenzial von TB-Haarwurzeln zu bewerten, wurde A. rhizogenes mit dem binären Vektor pK7WG2D transformiert, der das MYB116-Gen enthält, um seine Wirkung auf die Produktion von sekundären Metaboliten wie Flavonoiden auf der Ebene der Genexpression und durch metabolische Analysen zu untersuchen. Aktivierte A. rhizogenes sollten gleichzeitig mit den Expflanzen gut vorbereitet sein.
- Aktivierung von A. rhizogenes
- Tau A. rhizogenes auf Eis
- Tauchen Sie die Bakterien und linie sie gleichmäßig auf Hefe Mannitol Medium (YEB) ergänzt mit 15 g/L Agar Pulver, 50 mg/L Rifampicin, und 50 mg/L Spectinomycin (YEBARS, pH 7.0).
- Inkubieren Sie die Bakterien bei 28 °C für 12-16 h.
- Wählen Sie eine monoklonale Kolonie und kulturen Sie sie in einer anderen Petrischale in der oben beschriebenen Weise.
- Wählen Sie monoklonale Kolonien und kulturen Sie sie in einem 100 ml sterilisierten konischen Kolben mit 20 ml YEB-Medium, ergänzt mit 50 mg/L Rifampicin und 50 mg/L-Spektinomycin (YEBRS, pH 7,0) bei 28 °C und 200 U/min für 16–18 h, bis der OD600-Wert 2,0 erreicht.
- In einem weiteren 100-ml-Konuskolben, der 20 ml YEBRS-Medium bei 28 °C und 200 U/min bei 4-5 h enthält, bis der OD600-Wert etwa 0,5 erreicht ist, 2%–4% der oben genannten Kultur inkubieren (Abbildung 1D).
3. Infektion und Screening von TB-Expflanzen
HINWEIS: Das Ziel dieses Protokolls ist es, genetisch transformierte haarige Wurzeln zu erhalten. Die Wildtypwurzeln wurden als Negativkontrolle verwendet, um die transgene Expression zu bewerten. In diesem Protokoll wurde A. rhizogenes mit dem binären Vektor entweder pK7WG2D transformiert, der das Gen von FtMYB116 oder pK7GWIWG2D (II) mit dem Gen b4 im Voraus trägt.
- Resuspension von A. rhizogenes
- Übertragen Sie die in Schritt 2.1.6 erhaltene Kultur in ein 50-ml sterilisiertes Zentrifugalrohr.
- Drehen Sie bei 4.000 x g für 10 min bei 20 °C.
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das bakterielle Pellet mit MS-Medium, ergänzt mit 30 g/L Saccharose und 300 M Acetosyringon (AS) (MSSAS, pH 5.8) auf OD600 bei 0,2, wieder ab.
- Infektion von Expflanzen
- Infundieren Sie die in Schritt 3.1.3 erhaltene bakterielle Suspension in einen konischen Kolben, der die in Schritt 1.4.6 hergestellten Exaten für 10 min enthält (Abbildung 1E).
- Nehmen Sie die Explants heraus und bposten Sie sie mit einem sterilen bibulösen Papier.
4. Kokultur von Expflanzen mit A. rhizogenes
- Legen Sie ein steriles Filterpapier mit 9 cm Durchmesser auf das MS-Medium, das mit 7 g/L Agarpulver verfestigt wird, ergänzt mit 30 g/L Saccharose und 100 m AS (MSSAAS-Medium, pH 5,2).
- Überlagern Sie die Expflanzen auf dem Filterpapier bei 25 °C für 3 Tage im Dunkeln (Abbildung 1F).
5. Induktion und selektive Kultur
- Platzieren Sie etwa 20 infizierte Explanten auf dem MSSA-Medium, ergänzt durch 500 mg/L Cefotaxim und 50 mg/L Kanamycin (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (Abbildung 1G).
- Inkubieren Sie sie vertikal unter der Lichtbedingung bei 25 °C bei 1 °C. Die haarigen Wurzeln treten etwa 1 Woche nach der Inkubation auf(Abbildung 1H Schwarz-Dash-Pfeilspitzen zeigen das Auftreten haariger Wurzeln an).
HINWEIS: Ersetzen Sie MSSACK Medium bei Bedarf alle 15 Tage.
6. Subkulierende TB haarige Wurzeln
HINWEIS: Dieses Verfahren zielt darauf ab, kräftige haarige Wurzeln zu ernten. Beobachten Sie regelmäßig das Wachstum haariger Wurzeln während der Vermehrung, und entfernen Sie die kontaminierten und inaktivierten in einer rechtzeitigen Weise. Wiederholen Sie bei Bedarf die folgenden Schritte, um haarigere Wurzeln zu propagieren. Es dauert etwa 10 bis 14 Tage von der Subkulesiierung bis zur Ernte.
- Wählen Sie die haarigen Wurzeln, die weißes Aussehen und schnelles Wachstum zeigen.
- Schneiden Sie sie in Stücke von 2-3 cm.
- Sie werden eindeutig auf einer sauberen Bank nummerieren.
- Subkultur sie in einem 100 ml sterilisierten konischen Kolben mit 5 ml MS-Medium, ergänzt durch 30 g/L Saccharose und 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5,8) mit einer Drehgeschwindigkeit von 80 U/min bei 25 °C im Dunkeln, bis sie sich bis zum Boden des Kolbens überbreiten (Abbildung 1I).
7. Identifizierung von transformierten haarigen Wurzeln und Konservierung
HINWEIS: Transformierte haarige Wurzeln können anhand der Aspekte der Morphologie und des Genspiegels identifiziert werden. Die Identifizierung kann auch entsprechend dem haarigen Wurzelgenom und dem Widerstand durchgeführt werden, die in diesem Protokoll nicht abgedeckt sind. Dieses Verfahren konzentriert sich in erster Linie auf die Identifizierung von Reportergenunden und Zielgenen.
- Entfernen Sie tawny und kontaminierte haarige Wurzeln und wählen Sie diejenigen mit weißem Aussehen.
- Bewerten Sie, ob unter einem blau/lichtdualen ultravioletten Transilluminator eine grüne Fluoreszenz vorhanden ist.
- Wählen Sie die haarigen Wurzeln aus, die ein starkes Fluoreszenzsignal in den nummerierten Röhren aufweisen, oder wickeln Sie sie mit einem markierten Tinfoil, nachdem Sie sie mit einem saugfähigen Papier ausgetrocknet haben.
- Lyophilisieren Sie sie in flüssigem Stickstoff, gefolgt von der Lagerung der gesamten Ernte bei 80 °C für weitere Untersuchungen.
- Genidentifikation
- Trituieren Sie 0,1 g der haarigen Wurzeln zu feinem Pulver in flüssigem Stickstoff.
- Bereiten Sie die genomische DNA unabhängiger transgener TB-Linien mit der modifizierten Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Methode25 nach Anweisung des Herstellers des pflanzlichen genomischen DNA-Kits vor.
- Führen Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit 100 ng genomischer DNA-Vorlage und Primern aus, die in Tabelle 2aufgeführt sind.
- Führen Sie den Amplifikationszyklus wie folgt durch: Vordenaturierung bei 94 °C für 5 min, Denaturierung bei 94 °C für 30 s, Primerglühen bei 55 °C für 30 s und Grundverlängerung bei 72 °C für 30 s. Nach 36 Zyklen und einem letzten Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 min, analysieren Sie die Amplifikationsprodukte auf 1% Agarose-Gelen.
- Färben Sie die Gele mit Nukleinsäurefärbung und visualisieren Sie sie unter UV-Licht.
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Representative Results
Agrobacterium rhizogenes-vermittelte TB haarige Wurzeltransformation
Diese Studie beschreibt das Schritt-für-Schritt-Protokoll, das eingerichtet wurde, um genetisch transformierte haarige Wurzeln mit A. rhizogeneszu erhalten. Es dauerte etwa 5-6 Wochen von der Impfung von TB-Samen bis zur Ernte der identifizierten haarigen Wurzeln, und einige wichtige Schritte sind in Abbildung 1 (A-H) dargestellt. Kurz gesagt, sterilisierte Schalensamen wurden geimpft (Abbildung 1B), um eine schnellere sterile Keimung zu erreichen. A. Rhizogenes (Abbildung 1D) und sterile Explanten sollten im Voraus aktiviert und vorbereitet werden. Es folgen einige wichtige Schritte, darunter die Infektion von Expflanzen mit aktivierten A. rhizogenes (Abbildung 1E), Kokultur (Abbildung 1F) und selektive Kultur (Abbildung 1G). Die infizierten Expflanzen sollten gleichmäßig auf das erstarrte MS-Medium gelegt werden, und zwischen ihnen muss Raum gehalten werden, um die verschiedenen transgenen Linien leicht voneinander zu trennen. Haarige Wurzeln erscheinen mit einer flauschigen weißen Farbe in einer plagiotropen Weise in den Wundstellen der Expflanzen (Abbildung 1H). Die haarigen Wurzeln bilden eine stark verzweigte und eine verzahnte Matrix und können nach Bedarf vermehrt werden (Abbildung 1I). Die geernteten haarigen Wurzeln können verwendet werden, um die Genfunktion oder die Gen- oder Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Alternativ können die tb haarigen Wurzeln massiv vermehrt werden, um sekundäre Metaboliten wie Rutin in ausgewiesenen Bioreaktoren zu ergeben.
Die Methode zur Induzieren transgener haariger Wurzeln bei TB wurde mit einem binären Vektor (pK7GWIWG2D (II)) untermauert, der die Gene GFP und b4 (ein Mitglied der Transkriptionsfaktor-bHLH-Familie, noch nicht veröffentlicht) trägt. bHLH Das Reportergen GFP wurde verwendet, um die transgenen behaarten Wurzeln leicht von den nichttransgenen zu unterscheiden, indem das Signal unter einem blau/leichten Dual-Ultraviolett-Transilluminator visualisiert wurde (Abbildung 2) oder indem das Zielgen identifiziert wurde (Abbildung 3). Die transformierten haarigen Wurzeln zeigten grüne Fluoreszenz, wenn sie unter blauem oder ultraviolettem Licht beleuchtet wurden (dargestellt mit schwarzen Pfeilköpfen in Abbildung 2A), während die untransformierten haarigen Wurzeln nicht die grüne Fluoreszenz zeigten (Abbildung 2B). Die haarigen Wurzeln mit einem hohen GFP-Signal wurden für zwei Wochen propagiert, wie in Abbildung 2Cdargestellt.
Um weiter zu ermitteln, ob der binäre Vektor erfolgreich in das TB-Genom umgewandelt wurde, wurden Gen-Identifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, wurde die pflanzliche genomische DNA der TB-Haarwurzeln für die PCR-Analyse auf Basis der modifizierten CTAB-Methode25vorbereitet. PCR wurde durch Verstärkung der Gene (Kan, GFPund b4), die in Abbildung 3vorhanden war, bzw. durchgeführt. Die Primer sind in Tabelle 2aufgeführt. Das Vorhandensein der 3 Gene in allen transgenen Linien (Abbildung 3,Bahnen 5–11) deutete darauf hin, dass der binäre Vektor erfolgreich in das TB-Genom umgewandelt wurde. Kan und GFP fehlten in den Wildtypwurzeln (Abbildung 3, Spur 3) und der experimentellen Negativkontrolle ( Abbildung3,Lane 4), während b4 in den Wildtypwurzeln nachgewiesen wurde. Diese 3 Gene wurden zweifellos in der Positivkontrolle dargestellt (Abbildung 3,Spur 2), waren aber offenbar in der Negativkontrolle nicht vorhanden ( Abbildung3,Spur 4).
Auswertung des lichtinduzierten Transkriptionsfaktors FtMYB116 bei TB mit dem oben genannten haarigen Wurzelsystem
FtMYB116 wurde durch die Verwendung des oben genannten Protokolls der haarigen Wurzelinduktion ausgedrückt. Dies wurde erreicht, indem das Gen FtMYB116 in den binären Vektor pK7WG2D eingefügt und dann mit A. rhizogenes infiziert wurde, um eine Genüberexpression zu erreichen. Kurz gesagt, haarige Wurzeln von 0,1 g wurden mit flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver trituiert. Total RNA wurde extrahiert, indem die Anweisungen des Herstellers von Pflanzen-RNA-Isolationkit26extrahiert wurden. Dann reverse-transkription PCR und Echtzeit-PCR wurden durchgeführt, um FtMYB116 und Rutin Synthetisierung Signalweg verwandte Gene zu verstärken. Anschließend wurden die regulatorischen Auswirkungen von FtMYB116 auf die rutinsynthesebedingte Genexpression und die Ausbeute von Rutin überprüft.
Abbildung 4A zeigt die relative Expression von FtMYB116 in den transgenen Linien von TB haarigen Wurzeln. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte die relative Expression von FtMYB116 einen deutlichen Anstieg aller 3 unabhängigen transgenen Linien. Abbildung 4B und Abbildung 4C veranschaulichen die Förderung der Biosynthese von Rutin und Quercetin auf metabolischer Ebene durch FtMYB116 Überexpression. Der Gehalt an Rutin und Quercetin im Transgenen war signifikant(p < 0,01) erhöht im Vergleich zu denen in der Wild-Typ, erreichen 40 bzw. 0,5 mg/g FW, die 8 mal diejenigen in der Wild-Typ waren. Die relativen Genausdrücke von CHS, F3H, F3'Hund FLS in allen 3 transgenen Linien waren bemerkenswert höher als die in der Kontrollgruppe (Abbildung 4D). Zusammen bestätigten diese Ergebnisse, dass die in dieser Studie beschriebene Strategie erfolgreich genutzt werden könnte, um eine haarige Wurzeltransformation bei TB zu erzeugen und die Genexpression und die metabolische Ausbeute sekundärer Metaboliten zu untersuchen.
Abbildung 1: Prozesse zur Induzinieren von A. rhizogenes-vermittelten transgenen behaarten Wurzeln bei TB. Repräsentative Bilder kritischer Stadien werden angezeigt: (A1) und (A2) stellen vor und nach dem Abschälen der Saatschichten dar; (B) stellt jeweils 10 Samen dar, die in einer Gewebeflasche geimpft sind, die MSSA-Medium enthält; (C) bezeichnet die Sämlinge von TB bei 7–10 Tagen nach der Impfung, und die Rotstrichpfeilspitzen zeigen die Schnittpunkte an; (D) und (E) weisen auf die Herstellung von A. rhizogenes (OD600 = 0,5) bzw. die Infektion von Expflanzen hin; (F) und (G) symbolisieren die Kokultivierung mit aktivierten A. rhizogenes auf MSSAAS-Medium bzw. selektive Kultivierung auf MSSACK-Medium; haarige Wurzeln entstehen aus (H), wie die Schwarz-Dash-Pfeilspitzen zeigen; und (I) zeigt die Ausbreitung der haarigen Wurzelbildung; die Schwarz-Dash-Pfeilspitzen zeigen die induzierten haarigen Wurzeln an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Transformation des binären Vektors, der das GFP-Reportergen trägt. (A) bezeichnet die induzierten haarigen Wurzeln nach selektiver Kultur, die unter dem blau/leichten Dual-Ultraviolett-Transilluminator untersucht wurde. (B) und (C) stellen Wildwurzel bzw. Vermehrung transformierter haariger Wurzeln dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: PCR-Verstärkung von Genen (Kan, GFPund b4) aus genomischer DNA, die aus wildtyper Wurzel und haarigen Wurzeln von TB in 7 unabhängigen transgenen Linien isoliert ist. (A): Kan, (B): GFP, (C): b4. Spur 1: molekulare Größenmarker (weiße Pfeilspitze zeigt 750 bp), Spur 2: Plasmid (binärer Vektor pK7GWIWG2D (II) mit Kan, GFPund b4 Genen) als positiver Schutz, Spur 3: Wildtypwurzel, Spur 4: gereinigth. H2O als Negativkontrolle, und Bahnen 5–11: die 7 unabhängigen transgenen Linien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Relative Expression von FtMYB116 in den transgenen Linien von TB haarigen Wurzeln. (A) und die promotorische Wirkung der Überexpression von FtMYB116 auf die Biosynthese von (B) Rutin und (C) Quercetin (Diese Zahl wurde von Dong et al.5) modifiziert. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und dreimal durchgeführt. "**" zeigt einen signifikanten Unterschied bei p < 0.01 mit Student es t-test an. (D) Expression von Genen im Zusammenhang mit Flavonoid-Synthesewegen in transgenen Linien. Die relative Ausdrucksebene wurde auf die der Aktinsteuerung normalisiert. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt , Standardabweichung (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Medien | Mittlere Inhaltsstoffe | ||
| MSSA | Murashige und Skoog (MS) mit Saccharose in 30 g/L und Agarpulver in 7 g/L, pH 5,8 | ||
| YEBARS | Hefe Mannitol Medium (YEB) mit Agarpulver bei 15 g/L, Rifampicin bei 50 mg/L und Spektinomycin bei 50 mg/L, pH 7,0 | ||
| YEBRS | YEB mit Rifampicin bei 50 mg/L und Spectinomycin bei 50 mg/L, pH 7,0 | ||
| MSSAS | MS-Medium mit Saccharose bei 30 g/L und Acetosyringon (AS) bei 300 m, pH 5,8 | ||
| MSSAA | MS-Medium mit Saccharose bei 30 g/L, Agarpulver bei 7g/L und AS bei 100 x M, pH 5,2 | ||
| MSSACK | MS-Medium mit Saccharose bei 30 g/L, Agarpulver bei 7 g/L, Cefotaxam bei 500 mg/L und Kanamycin (kan) bei 50 mg/L, pH 5,8 | ||
| MSSK | MS-Medium mit Saccharose bei 30 g/L und Kan bei 50 mg/L, pH 5,8 | ||
Tabelle 1: Medien und ihre Inhaltsstoffe.
| Primer | Sequenz (5'-3') | |
| GFP-F | CCACAAGTTCAGCGTGTCCG | |
| GFP-R | AAGTTCACCTTGATGCCGTTC | |
| b4-F | AAATCTTTTCCCTGTGG | |
| b4-R | ATGCCATCATTGCCAAG | |
| Kan-F | ATTCGGCTATGACTGGGCAC | |
| Kan-R | TGAATCCAGAAAAGCGGCCA | |
Tabelle 2: Primersequenz.
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Discussion
TB wurde in mehreren Studien im Zusammenhang mit sekundären Metaboliten auf genetischen und metabolischen Ebenen1,2,5,27,28verwendet. Haarige Wurzelkultur, als eine einzigartige Quelle für die Metabolitenproduktion, spielt eine zentrale Rolle in metabolischen Engineering29 und kann verwendet werden, um Stoffwechselwege durch Einfügen der verwandten Gene zu ändern. Kim et al.2 führten zunächst die Etablierung von TB-haarigen Wurzelkulturen durch A. rhizogenes-vermittelte Transformation ein, um die Produktion von Phenolverbindungen zu erreichen. Der Gehalt an Rutin, den sie bei den TB haarigen Wurzeln erhielten, war mehr als 10-mal höher als der der wilden Wurzeln. In der vorliegenden Studie führte die Einführung von FtMYB116 zu einer höheren Expression von Rutin-bezogenen Genen und steigerte die Produktion von Rutin in den haarigen TB-Wurzeln. Diese Technik wurde bestätigt, geeignet für phänotypische Charakterisierung und Expression von phenylpropanoid-bezogenen Genen wie FtF3H und FtFLS in TB behaarten Wurzeln5,30,31. Zhang et al.32 verwendeten TB haarige Wurzeln, um die Produktion von Rutin zu untersuchen, indem sie eine Reihe von FtMYB-Transkriptionsfaktoren überexzätierten. Zhou et al.33 beobachteten eine Abnahme des Rutingehalts aufgrund der Überexpression von FtMYB11 bei TB haarigen Wurzeln. Diese Ergebnisse zeigen zusammen mit unseren Ergebnissen die machbaren Auswirkungen der haarigen Wurzeltransformation auf die Wechselwirkung zwischen FtMYB-Transkriptionsfaktoren und Rutin-Biosynthese-bezogenen Genen.
Obwohl es nur begrenzte Daten über ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Induktion von TB-Haarwurzeln gibt, beschreiben wir hier in dem Schritt-für-Schritt-Protokoll zum ersten Mal, um transgene TB-Haarwurzeln in effizienter und stabiler Weise mit A. rhizogenes zu erhalten, die einen binären Vektor tragen. Während dieser experimentellen Prozesse müssen zahlreiche Faktoren sorgfältig berücksichtigt werden, um die optimal induzierten haarigen Wurzeln zu erhalten. Erstens ist die Auswahl von Expflanzen ein bestimmender Faktor. TB-Sorten sind dafür bekannt, die Morphologie haariger Wurzeln und die Produktion von Phenolverbindungen zu beeinflussen. Thwe et al.30 veranschaulichten, dass die Genexpression im biosynthetischen Phenylpropanoid-Signalweg und der Gehalt an Phenolverbindungen zwischen TB-Sorten variierten. Sie fanden auch haarige Wurzeln in einer Sorte, die aufgrund ihres Anthocyangehalts13tief rötlich-lila war. In unserer Studie wurden 2 gerade entfaltete Kotyledonen und Hypocotyle als Exmodule ausgewählt. Dies liegt daran, junge und zarte Blätter bevorzugen eine hohe haarige Wurzelinduktionsrate2,30, während stark differenzierte und alte Pflanzenzellen die haarige Wurzelinduktion negativ beeinflussen. Zweitens hat der Stamm von A. rhizogenes einen signifikanten Einfluss auf die haarige Wurzelinduktion. Verschiedene Bakterienstämme weisen unterschiedliche Transformierungsfähigkeiten in Bezug auf Morphologien und Induktionseffizienz haariger Wurzeln auf, die durch die verschiedenen Plasmide, die von den Stämmen34bewacht werden, beleuchtet werden können. Aye et al.35 verglichen die Auswirkungen mehrerer A. rhizogenes Stämme (R1000, R1200, 15834, LBA9402 und A4) auf TB haarige Wurzelinduktion und Phenylpropanoid-Biosynthese und fand heraus, dass die vielversprechendste Sorte für die haarige Wurzelproduktion bei TB R1000 war. Dieser Befund wurde von Kim et al.2 unterstützt. Dennoch zeigte der Stamm ACCC10060, der in der Studie von Aye et al. ausgeschlossen wurde, aber in unserer Studie verwendet wurde, eine zufriedenstellende Infektionseffizienz. Das flauschige weiße Aussehen haariger Wurzeln, die mit unserem Protokoll erhalten wurden, stimmt mit den haarigen Wurzeln überein, die in Salvia miltiorrhiza36erzeugt wurden, wobei derselbe Stamm ACCC10060 mit dem binären Vektor pK7GWIWG2D (II) verwendet wurde, um das Zielgen zum Schweigen zu bringen. Drittens spielen die Entkeimung einschließlich der Vorbehandlung von Materialien und eine Konzentration von Cefotaxim in der selektiven Kultur auch eine wichtige Rolle bei der haarigen Wurzelinduktion. Eine unvollständige Desinfektion in jedem Schritt könnte zum Scheitern der haarigen Wurzeltransformation führen. Darüber hinaus hat die bakterielle Konzentration einen signifikanten Einfluss auf die Produktion transformierter Wurzeln. Hohe Konzentrationen können die Pflanzenzellen durch Wettbewerbshemmung reduzieren, während niedrige Konzentrationen zu geringer Verfügbarkeit führen können4.
Darüber hinaus spielen Kulturbedingungen wie das Wachstumsmedium, angemessene Präkultivierungs- und Kokultivierungszeit sowie andere biotische oder abiotische Faktoren eine wichtige Rolle bei haarigen Wurzelinduktionen. Huang et al.37 empfahl 1/2 MS-Medium, das Saccharose in einer Konzentration von 30 g/L für die Kokultivierung enthält, um maximale TB-Haarwurzeln zu erreichen. Dies erklärt sich durch das hohe Salzmedium, das für die haarige Wurzelbildung geeignet ist, während ein niedriges Salzmedium eine übermäßige bakterielle Multiplikationbevorzugt 34. AS ist eine Art von phenolischer Verbindung, die A. rhizogenes-vermittelte Transformation in einer Reihe von Pflanzenarten durch die Transkription der Vir-Region von Agrobacterium34,38, und vir könnte effektiv in einem Medium mit einem pH-Wert von < 5,739,40induziert werden. Daher empfehlen wir ein Cokulturmedium mit pH 5,2, ergänzt mit 100 M AS. Huang et al.37 berichteten, dass TB haarige Wurzeln nach Tag 24 von weiß und hellgelb braun wurden. Daher subkultivierten sie behaarte Wurzeln alle 24 Tage; Wir empfehlen jedoch, alle 14 Tage zu subkulieren, um eine Bräunung haariger Wurzeln zu vermeiden. Darüber hinaus scheinen Umweltbedingungen wie Licht, Hormone, Temperatur und UV-Strahlung die Expression von flavonoiden Biosynthese-bezogenen Genen durch hochstimulierende oder deprimierende Signaltransduktion41,42zu beeinflussen. Die vorherige Studie hat die Bedeutung von weit-rotem Licht bei der Überwachung der rutinbezogenen Genexpression bei TB-Haarwurzeln5gezeigt.
Die a. rhizogenes-vermittelteTransformation hat den Vorteil, dass jedes exogene Gen von Interesse, das in einen binären Vektor eingefügt wird, auf den transformierten haarigen Wurzelklon34 übertragen werden kann, um Überexpression, Funktionsverlust über RNA-Silencing43oder die Entdeckung neuer metabolischer Gene durch Transkriptomanalysen zu erreichen5. Haarige Wurzeln haben großes Potenzial, sekundäre Metaboliten, rekombinante Proteine und sogar Antikörper zu produzieren44. Dies ist in erster Linie auf ihr einfaches und schnelles Wachstum in hormonfreiem Medium, weniger teuer, keine Notwendigkeit für die Regeneration in komplette Pflanzen21, und die relativ hohe Ausbeute von sekundären Metaboliten im Vergleich zu denen aus dem Ausgangspflanzenmaterial31. Diese Wurzeln können auch von der ursprünglichen Explantation getrennt werden, um langfristige, stabile und charakterisierte Wurzelklone zu etablieren, die ihre biosynthetische Kapazität und Phänotypen beibehalten. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse bietet dieses Protokoll eine schnelle, unterschiedliche und effiziente Methode zur Herstellung transformierter haariger Wurzeln, um die Produktion von sekundären Metaboliten zu untersuchen, und legt eine Referenz für haarige Wurzelinduktion in anderen Pflanzen vor. Das Potenzial, haarige Wurzelkulturen zu erforschen, um massive Erträge bioaktiver Verbindungen zu erzeugen, hängt jedoch vom geeigneten Bioreaktorsystem ab, bei dem bestimmte Parameter wie die Sauerstoffzufuhr betroffen sein müssen4,8. Dieses Protokoll beschränkt sich auf die Produktion von sekundären Metaboliten, die in haarigen Wurzeln gewonnen werden, und zur Untersuchung des visualisierten Phänotyps funktioneller Gene wie der Varianz der Farbe und des Inhalts sekundärer Metaboliten; die phänotypischen Veränderungen in der gesamten Pflanze unabhängig von der Gewinnung von regenerierten Pflanzen aus den haarigen Wurzeln konnten in dieser Studie jedoch nicht bewertet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den Grundlagenforschungsfonds der zentralen öffentlichen Wohlfahrtsforschungsinstitute ZXKT17002 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
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