Method Article

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

DOI:

10.3791/60944

⸱

May 17th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center, National Taiwan University, 4Department of Dermatology, National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine, Chang Gung University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.

Abstract

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기존의 조직학적 분석 및 세포 배양 시스템은 생체 내 생리학적 및 병리학적 역학을 완전히 시뮬레이션하기에 충분하지 않습니다. 다광 현미경 검사법 (MPM)은 생체 내 세포 수준에서 생물 의학 연구를위한 가장 인기있는 이미징 양식 중 하나가되었으며, 장점은 고해상도, 깊은 조직 침투 및 최소한의 광독성을 포함합니다. 우리는 맞춤형 마우스 눈 홀더와 생체 내 안구 표면을 이미징하기위한 스테레오 탁스 스테이지가있는 MPM 이미징 플랫폼을 설계했습니다. 이중 형광 단백질 리포터 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 다광형광 신호 외에도 제2 고조파 생성(SHG)을 동시에 획득하면 콜라주기스트롬 아키텍처의 특성화가 가능합니다. 이 플랫폼은 각막과 결막을 포함하여 전체 안구 표면에 정확한 위치가 있는 인트라베이티 이미징에 사용할 수 있습니다.

Introduction

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각막과 결막을 포함한 안구 표면 구조는 외부 장애로부터 다른 더 깊은 안구 조직을 보호합니다. 눈의 투명한 전면 부분인 각막은 눈안으로 빛을 지시하고 보호 장벽으로 반응하는 굴절 렌즈로 기능합니다. 각막 상피는 각막의 가장 바깥쪽 층이며 피상 세포, 날개 세포 및 기저 세포의 뚜렷한 층으로 구성됩니다. 각막 스트로마는 정교하게 포장된 콜라주누우스 라멜라에 각질 세포가 내장되어 있습니다. 각막 내피, 평평한 육각 세포의 단일 층은 펌핑 기능1을통해 상대적으로 탈수 된 상태에서 각막 스트로마를 유지함으로써 각막의 투명성을 유지하는 데 중요한 역할을한다. 림푸스는 각막과 결막 사이의 경계를 형성하고, 각막 상피 줄기 세포2의저수지이다. 혈관이 높게 한 결막은 점액과 눈물3을생성하여 눈을 윤활하는 데 도움이됩니다.

각막 표면 구조의 세포 역학은 기존의 조직학적 분석 또는 생체 내 세포 배양에 의해 연구되며, 이는 생체 내 세포 역학을 적절히 시뮬레이션하지 못할 수 있다. 비침습적 라이브 이미징 접근법은 그러한 격차를 해소할 수 있습니다. 고해상도, 최소한의 광손상 및 심층 이미징 깊이를 포함하는 장점으로 인해 MPM은

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Protocol

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모든 동물 실험은 국립 대만 대학과 창궁 기념 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 절차에 따라 수행되었습니다.

1. 다광 현미경 검사법 설정

  1. 물 침지 20x 1.00 NA 목표(그림 1A)와직립 현미경을 기반으로 시스템을 구축 합니다.
  2. Ti 사용: 사파이어 레이저(튜닝 파장 사용)를 흥분 원으로 사용하십시오. EGFP의 경우 880nm, tdTomato의 경우 940nm에서 레이저 출력 파장을 설정합니다(그림1A).
  3. SHG/EGFP 및 EGFP/tdTomato(그림1A)의분리를 위한 2개의 이색 거울(495nm 및 580 nm)을 포함한다. 관전적으로 밴드패스 필터 434/17nm, 510/84nm 및 585/40nm(그림1A)로SHG 신호, EGFP 및 tdTomato를 분리합니다.
  4. 영상 품질을 최적화하고 광표백 및 조직 손상을 방지하기 위해 레이저 전력을 이미징 각막용약 35mW, 림푸스의 경우 50mW로 설정합니다. 레이저가 광학 시....

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Results

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이 라이브 이미징 플랫폼을 사용하여 마우스 안구 표면은 셀룰러 수준에서 시각화할 수 있습니다. 안구 표면에 개별 단일 세포를 시각화하기 위해, 우리는 세포막에서 발현된 핵 및 tdTomato에서 발현된 EGFP를 가진 이중 형광 형질 형질 형질 성 생쥐를 고용했습니다. 콜라겐이 풍부한 각막 스트로마는 SHG 신호에 의해 강조되었다.

각막 상피에서, 피상 세포, 날개 세포 및 기저세포(그림 2)가시각화되었다. 이중 형광 형질 전환 마우스에서, 우리는 각막과 사지 상피(도 2)에서피상층으로 기저 층에서 단일 세포를 매핑 할 수 있었습니다. 육각형 피상 세포가 관찰되었다(도 2의백색 화살촉). 핵 크기와 핵간 간격은 바깥층을 향한 기저층에서 각막 상피(그림2)에서증가하였다........

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Discussion

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제어 소프트웨어가 있는 이 맞춤형 MPM 이미징 플랫폼은 피부10,모낭10 및 안구 표면9,,10 (도 1A)을포함한 마우스 상피 기관의 인탈 이미징에 사용되었습니다. 맞춤형 시스템은 프로젝트 시작부터 다양한 실험을 위한 광학 부품을 유연히 변경하는 데 사용되었습니다. 이 이미징 방법론은 상용 MPM 제품에 다재다능합니다. 이 프로토콜은 MPM 이미징 플랫폼에 의한 마우스 안구 표면의 인트라인탈 이미징을 위한 상세한 방법을 설명합니다. 입체 마우스홀더(도 1B)를사용하여 안구 표면 전체에 걸쳐 서로 다른 영역을 시각화할 수 있었습니다. 정확한 포지셔닝 기능을 통해 지정된 영역의 측두세포 동적 변화를 모니터링할 수 있습니다.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

대만 과학기술부(106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089)의 보조금 지원에 감사드립니다. 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), 국립 대만 대학 병원 (NTUH108-T17) 및 창궁 기념 병원, 대만 (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3GG16222, CMRPG3G1622).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AVIZO Lite 소프트웨어Thermo Fisher Scientific버전 : 2019.3.0
대역 통과 필터SemrockFF01-434 / 17
FF01-500 / 24
FF01-585 / 40
Dichroic mirrorsSemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
GalvanoThorlabsGVS002
Jade BIO 제어 소프트웨어SouthPort CorporationJade BIO
옥시 부 프로카인 염산염시그마O0270000
PMT하마 마츠H7422A-40
폴리 에스 틸렌 튜브BECTON DICKINSON427401
입체 식 마우스 홀더Step Technology Co., Ltd000111
Ti: 사파이어 레이저Spectra-PhysicsMai-Tai DeepSee
정립 현미경 OlympusBX51WI
Vidisic GelDr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbHD13581
ZoletilVirbacVR-2831

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A.

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