Name: 마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 학습하세요 맞춤형 다광현미경 플랫폼을 활용한 마우스 각막과 결막의 라이브 이미징 방법입니다. 이중 형광 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 각막 표면의 세포 핵, 신경 섬유 및 기질 구조를 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

대만 과학기술부(106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089)의 보조금 지원에 감사드립니다. 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), 국립 대만 대학 병원 (NTUH108-T17) 및 창궁 기념 병원, 대만 (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3GG16222, CMRPG3G1622).

모든 동물 실험은 국립 대만 대학과 창궁 기념 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 절차에 따라 수행되었습니다.
1. 다광 현미경 검사법 설정
<ol><li>물 침지 20x 1.00 NA 목표(그림 1A)와직립 현미경을 기반으로 시스템을 구축 합니다.</li>
	<li>Ti 사용: 사파이어 레이저(튜닝 파장 사용)를 흥분 원으로 사용하십시오. EGFP의 경우 880nm, tdTomato의 경우 940nm에서 레이저 출력 파장을 설정합니다(그림1A).</li>
	<li>SHG/EGFP 및 EGFP/tdTomato(그림1A)의분리를 위한 2개의 이색 거울(495nm 및 580 nm)을 포함한다. 관전적으로 밴드패스 필터 434/17nm, 510/84nm 및 585/40nm(그림1A)로SHG 신호, EGFP 및 tdTomato를 분리합니다.</li>
	<li>영상 품질을 최적화하고 광표백 및 조직 손상을 방지하기 위해 레이저 전력을 이미징 각막용약 35mW, 림푸스의 경우 50mW로 설정합니다. 레이저가 광학 시스템을 통과하기 전에 레이저 전력을 측정합니다. 샘플의 정확한 레이저 전력은 약 8-9 mW입니다. 완전한 현미경 디자인은 도 1A에도시된다. 참고: 레이저 전력의 상한은 70mW로 설정되어 사진 표백 및 조직 손상을 방지합니다.</li>
</ol>2. 라이브 이미징을 위한 동물 준비
<ol><li>실험에 8-12주 된 마우스를 사용하십시오. 근육질 주입 50-80 틸타민 HCl의 mg/kg과 졸라제팜 HCl 전신 마취에 대 한. 발가락을 꼬집어 철수 반사에 대한 응답의 부족을 확인합니다. 충분한 마취는 안정적인 호흡 속도 모니터링을 허용하는 것이 중요합니다. 참고: 8주 이상의 나이에 마우스는 안구가 성숙하기 때문에 권장됩니다.</li>
	<li>가열 된 단계에 마취 아래에 마우스를 배치하고 항문에 온도 모니터링 프로브를 삽입합니다. 주의: 히터의 과열과 열사병 유도를 피하기 위해 프로브는 공기에 노출되지 않고 항문 구멍에 완전히 삽입해야합니다.</li>
</ol>3. 안구 표면의 라이브 이미징을 위한 눈 들고
<ol><li>안구 표면의 라이브 이미징의 경우 헤드 홀더와 눈꺼풀을 후퇴시키고 전체 안구 표면을 노출하는 헤드 홀더의 두 부분으로 구성된 맞춤형 입체 마우스 홀더를사용합니다(그림 1B-D).</li>
	<li>외부 청각 고기에 이어 바를 삽입하고 헤드 홀더(그림 1B, D)의3 점 고정을 유지합니다.</li>
	<li>토폴로지0.4% 옥시부프로카인 염산염의 용액을 식염수에 적용하여 안구 표면을 마취시키기 위해 3분 간 방치한다.</li>
	<li>적절한 수동 눈꺼풀 후퇴로 안구가 튀어나오도록 하십시오. 그렇지 않으면 안구의 허혈과 출혈이 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>눈꺼풀 여백을 따라 눈 홀더의 폴리에틸렌 튜브 루프를 조심스럽게 배치하여 안구 표면을 노출시합니다. 폴리에틸렌튜브(그림 1C,D)의루프로 덮인 팁으로 5번 듀몬트 집게로 구성된 아이 홀더로 안구를 안정시다.</li>
	<li>눈덩이의 말단 집게에 손잡이를 사용하여 나사 집게(도1D).</li>
	<li>매시간 안구 표면의 수분을 유지하기 위해 침지 매체로서 각막 표면에 1.338의 굴절률을 가진 아이 젤을 적용한다. 또한, 매시간 아이 젤을 정기적으로 바르면 이미징 중에 각막이 흐리는 것을 피합니다.</li>
	<li>중앙 각막에서 주변부위(그림 1C,D)로전체 각막 표면을 가로질러 이미징하기 위해 스테퍼 전동 단계에 잠긴 홀더로 안구를 회전시. 주의: 눈 젤의 과잉 및 부족한 양 둘 다 화상 진찰 도중 심상질의 질에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 표면을 촉촉하게 유지하기 위해 매 시간마다 눈 젤을 보충하는 것은 이미징에 중요합니다.</li>
</ol>4. Z-시리얼 이미지 수집
참고: 모든 스택에 첫 번째 및 마지막 슬라이드를 설정하여 떨어지는 모션 아티팩트를 줄입니다.
<ol><li>이미지를 촬영하기 전에 타게팅 필드를 수은 광원으로 이미지화합니다.</li>
	<li>현미경 소프트웨어의 기호를 클릭하여 소프트웨어를 켭니다.</li>
	<li>적절한 PMT 게인 및 디지털 게인을 선택하여 안구 표면의 세포 구조를 시각화합니다.</li>
	<li>첫 번째 슬라이드와 마지막 슬라이드를 설정하여 스택을 획득합니다.</li>
	<li>이미지 해상도 및 z 단계(예: 512 x 512 및 1 μm)를 z 단계로 입력합니다.</li>
	<li>시작 버튼을 클릭하여 z-serial 이미지를 수집합니다.</li>
	<li>같은 지역에서 두 번 라이브 이미지를 획득, SHG / EGFP 신호 수집에 대한 880 nm 여기에서 먼저 EGFP / tdTomato 신호 컬렉션940 nm 여기에서 두 번째. 참고: 두 스택의 조합은 3채널 이미지를 제공합니다. 이미지 해상도 및 스캔 형식 크기는 각각 512 x 512 픽셀과 157 μm x157 μm이었습니다.</li>
</ol>5. 이미지 처리 및 3D 재구성
<ol><li>피지 소프트웨어18에z-시리얼 이미지를로드합니다.</li>
	<li>배경 소음을 줄이기 위해 피지에서 플러그인 중앙값 3D 필터를 선택합니다.</li>
	<li>피지의 포장 비샤프 마스크 필터를 선택하여 이미지를 선명하게 합니다.</li>
	<li>밝기/대비로"자동"을클릭하여 이미지 품질을 자동으로 최적화합니다.</li>
	<li>z-serial 이미지를 내보낼 수 있도록 이미지를 이미지 시퀀스로 저장합니다.</li>
	<li>볼륨 렌더링을 사용하여 3D 재구성을 위해 z-serial 이미지를 상용 소프트웨어(예: Avizo lite)에 로드합니다.</li>
	<li>모든 MPM 이미지에서 EGFP, tdTomato 및 SHG 신호를 각각 의사 녹색, 빨간색 및 시안 색상으로 표시합니다.</li>
	<li>스냅샷으로 3D 구조 사진을 캡처합니다.</li>
</ol>

<ol><li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cataract+%26+Refractive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Van Buskirk, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+limbus%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28London%29%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the limbus.</a> Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).</li>
<li>Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+film+mucins%3A+front+line+defenders+of+the+ocular+surface%3B+comparison+with+airway+and+gastrointestinal+tract+mucins%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins.</a> Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).</li>
<li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+imaging+of+the+structural+alterations+in+keratoconus+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).</li>
<li>Konig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+in+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).</li>
<li>Rompolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+coordination+of+stem+cell+commitment+during+epidermal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis.</a> Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li>
<li>Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+fate+determination+ensures+robust+differentiation+in+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle.</a> Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).</li>
<li>Wu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopic+imaging+platform+for+ocular+surface+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging.</a> Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).</li>
<li>Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Intravital+Imaging+of+the+Cornea%2C+Skin%2C+and+Hair+Follicle+by+Multiphoton+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope.</a> Methods in Molecular Biology. , (2019).</li>
<li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Fourier+transform-based+analysis+of+second-harmonic+generation+image+in+keratoconic+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).</li>
<li>Tan, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+fluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy+for+imaging+infectious+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013(2007).</li>
<li>Jester, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+multiphoton+confocal+microscopy%3A+the+new+frontier+in+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Oculur+Surface%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging.</a> Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).</li>
<li>Morishige, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+of+normal+human+and+keratoconus+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).</li>
<li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+non-linear+optical+%28NLO%29+imaging+in+live+rabbit+eyes+using+the+Heidelberg+Two-Photon+Laser+Ophthalmoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope.</a> Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).</li>
<li>Chen, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R26R-GR%3A+a+Cre-activable+dual+fluorescent+protein+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse.</a> PLoS One. 7 (9), 46171(2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiphoton+microscope+platform+for+imaging+the+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye.</a> Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+cornea+visualized+in+the+living+mouse+using+vital+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+confocal+microscopy+and+two-photon+microscopy+in+mouse+cornea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo.</a> Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).</li>
<li>Ehmke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nonlinear+imaging+of+corneal+structures+with+special+focus+on+BALB%2Fc+and+streptozotocin-diabetic+Thy1-YFP+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice.</a> Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).</li>
<li>Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging+Reveals+Ghost+Fibers+as+Architectural+Units+Guiding+Myogenic+Progenitors+during+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).</li>
<li>Mesa, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+Epidermal+Stem+Cell+Self-Renewal+Is+Driven+by+Local+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).</li>
<li>Goh, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+dendritic+cell+responses+to+sterile+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).</li>
<li>Kissenpfennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+function+of+Langerhans+cells+in+vivo%3A+dermal+dendritic+cells+colonize+lymph+node+areas+distinct+from+slower+migrating+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells.</a> Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).</li>
<li>Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal+regulatory+T+cells+display+distinct+migratory+behavior+that+is+modulated+during+adaptive+and+innate+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation.</a> Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).</li>
<li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

제어 소프트웨어가 있는 이 맞춤형 MPM 이미징 플랫폼은 피부10,모낭10 및 안구 표면9,,10 (도 1A)을포함한 마우스 상피 기관의 인탈 이미징에 사용되었습니다. 맞춤형 시스템은 프로젝트 시작부터 다양한 실험을 위한 광학 부품을 유연히 변경하는 데 사용되었습니다. 이 이미징 방법론은 상용 MPM 제품에 다재다능합니다. 이 프로토콜은 MPM 이미징 플랫폼에 의한 마우스 안구 표면의 인트라인탈 이미징을 위한 상세한 방법을 설명합니다. 입체 마우스홀더(도 1B)를사용하여 안구 표면 전체에 걸쳐 서로 다른 영역을 시각화할 수 있었습니다. 정확한 포지셔닝 기능을 통해 지정된 영역의 측두세포 동적 변화를 모니터링할 수 있습니다.
<p...

각막과 결막을 포함한 안구 표면 구조는 외부 장애로부터 다른 더 깊은 안구 조직을 보호합니다. 눈의 투명한 전면 부분인 각막은 눈안으로 빛을 지시하고 보호 장벽으로 반응하는 굴절 렌즈로 기능합니다. 각막 상피는 각막의 가장 바깥쪽 층이며 피상 세포, 날개 세포 및 기저 세포의 뚜렷한 층으로 구성됩니다. 각막 스트로마는 정교하게 포장된 콜라주누우스 라멜라에 각질 세포가 내장되어 있습니다. 각막 내피, 평평한 육각 세포의 단일 층은 펌핑 기능1을통해 상대적으로 탈수 된 상태에서 각막 스트로마를 유지함으로써 각막의 투명성을 유지하는 데 중요한 역할을한다. 림푸스는 각막과 결막 사이의 경계를 형성하고, 각막 상피 줄기 세포2의저수지이다. 혈관이 높게 한 결막은 점액과 눈물3을생성하여 눈을 윤활하는 데 도움이됩니다.
각막 표면 구조의 세포 역학은 기존의 조직학적 분석 또는 생체 내 세포 배양에 의해 연구되며, 이는 생체 내 세포 역학을 적절히 시뮬레이션하지 못할 수 있다. 비침습적 라이브 이미징 접근법은 그러한 격차를 해소할 수 있습니다. 고해상도, 최소한의 광손상 및 심층 이미징 깊이를 포함하는 장점으로 인해 MPM은,,4, 5,56,67,8의다양한 생물학적연구에서강력한 양식이되었습니다. 각막 이미징의 경우, MPM은 세포 내 NAD(P)H에서 유래한 본질적인 자동 형광으로부터 세포 정보를 제공합니다. 펨토초 레이저 스캐닝 하에서 비중심형 I 콜라겐 섬유로부터 유래된 제2 고조파 생성(SHG) 신호는 추가 염색 절차 없이 콜라주기누우스 기질 구조를 제공한다9. 이전에는 동물 및 인간 각막9,,,10, 11,12,,13,14,1115의이미징을 위해,MPM을악용했습니다.
특정 세포 집단에서 형광 단백질을 나타내는 형질 전환 마우스 라인은 개발, 조직 항상성, 조직 재생 및 발암 발생을 포함한 세포 생물학의 다양한 연구에 널리 사용되어 왔다. 우리는 각막9,10,모낭 10및표피10MPM에 의하여 생체 내 화상 진찰을10 위한 형광 단백질로 표지된 형질 마우스 균주를 이용했습니다. TdTomato와 EGFP로 태그된 세포막을 가진 이중 형광 마우스 변형은 두 개의 마우스 균주에서 사육됩니다: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J,#021847)16 및 mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-t., 1.#007676 1.17 R26R-GR 형질전환 마우스 라인은 H2B-EGFP 융합 유전자 및 mCherry-GPI 앵커 신호 융합 유전자를 포함하는 이중 형광 단백질 리포터 생성을 포함하며, Gt(ROSA)26Sor 궤적에 삽입된다. mT-mG 형질균은 세포막 표적 tdTomato 및 EGFP 형광 크레 리포터 마우스이다. Cre 재조합 전에, tdTomato 형광 발현을 가진 세포막 단백질은 각종 세포에서 널리 존재한다. 이 형질전환 마우스 변형은 우리가 Cre 흥분없이 tdTomato핵-EGFP 및 막을 시각화 할 수 있습니다. 두 암컷 (R26R-GR+/+)및 한 남성 (mT-mG+/+)형질 전환 마우스실험에 대 한 충분 한 마우스를 생산 하기 위해 함께 사육 되었다. R26R-GR+/-;mT-mG+/- 유전자형, 이중 형광 마우스 균주를 가진 그들의 자손은 이 연구에서 사용되었습니다. 앞서설명한9,10,이 이중 형광 기자 마우스 균주는 이전에 설명한 바와 같이 하나의 형광 기자 마우스 라인과 비교하여, 이 이중 형광 기자 마우스 균주는 이미징 시간의 50% 감소 된 취득을 우리에게 제공합니다.
이 작품에서, 우리는 우리의 화상 진찰 플랫폼 및 이중 형광 형질 전환 마우스를 사용하여 단계별로 안구 표면의 생체 내 화상 진찰을 위한 상세한 기술 프로토콜을 기술합니다.

<table><tbody><tr><td>AVIZO Lite 소프트웨어</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>버전 : 2019.3.0</td></tr><tr><td>대역 통과 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-434 / 17 FF01-500 / 24 FF01-585 / 40</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirrors</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Galvano</td><td>Thorlabs</td><td>GVS002</td><td></td></tr><tr><td>Jade BIO 제어 소프트웨어</td><td>SouthPort Corporation</td><td>Jade BIO</td><td></td></tr><tr><td>옥시 부 프로카인 염산염</td><td>시그마</td><td>O0270000</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>하마 마츠</td><td>H7422A-40</td><td></td></tr><tr><td>폴리 에스 틸렌 튜브</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>입체 식 마우스 홀더</td><td>Step Technology Co., Ltd</td><td>000111</td><td></td></tr><tr><td>Ti: 사파이어 레이저</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai-Tai DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>정립 현미경 Olympus</td><td></td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Vidisic Gel</td><td>Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH</td><td>D13581</td><td></td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td>VR-2831</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

기존의 조직학적 분석 및 세포 배양 시스템은 생체 내 생리학적 및 병리학적 역학을 완전히 시뮬레이션하기에 충분하지 않습니다. 다광 현미경 검사법 (MPM)은 생체 내 세포 수준에서 생물 의학 연구를위한 가장 인기있는 이미징 양식 중 하나가되었으며, 장점은 고해상도, 깊은 조직 침투 및 최소한의 광독성을 포함합니다. 우리는 맞춤형 마우스 눈 홀더와 생체 내 안구 표면을 이미징하기위한 스테레오 탁스 스테이지가있는 MPM 이미징 플랫폼을 설계했습니다. 이중 형광 단백질 리포터 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 다광형광 신호 외에도 제2 고조파 생성(SHG)을 동시에 획득하면 콜라주기스트롬 아키텍처의 특성화가 가능합니다. 이 플랫폼은 각막과 결막을 포함하여 전체 안구 표면에 정확한 위치가 있는 인트라베이티 이미징에 사용할 수 있습니다.

이 라이브 이미징 플랫폼을 사용하여 마우스 안구 표면은 셀룰러 수준에서 시각화할 수 있습니다. 안구 표면에 개별 단일 세포를 시각화하기 위해, 우리는 세포막에서 발현된 핵 및 tdTomato에서 발현된 EGFP를 가진 이중 형광 형질 형질 형질 성 생쥐를 고용했습니다. 콜라겐이 풍부한 각막 스트로마는 SHG 신호에 의해 강조되었다.
각막 상피에서, 피상 세포, 날개 세포 및 기저세포(그림 2)가시각화되었다. 이중 형광 형질 전환 마우스에서, 우리는 각막과 사지 상피(도 2)에서피상층으로 기저 층에서 단일 세포를 매핑 할 수 있었습니다. 육각형 피상 세포가 관찰되었다(도 2의백색 화살촉). 핵 크기와 핵간 간격은 바깥층을 향한 기저층에서 각막 상피(그림2)에서증가하였다....

여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

이 프로토콜은 이중 형광 형질 전환 마우스 모델에서 마우스 안구 표면의 전체 구조의 라이브 이미징을 위해 다중 필터 현미경을 사용합니다. 사용자 정의 다광 현미경 플랫폼과 이중 형광 형질 전환 마우스의 조합은 안구 표면의 실시간 시각화 및 구조를 가능하게한다. 다광현미경을 설정하려면, 물 침지 20X, 1.00 NA 목표를 선택하고 티타늄 사파이어 레이저를 직립 현미경의 여기원으로 설정합니다.EGFP의 경우 레이저 출력 파장을 880나노미터, tdTomato의 경우 940나노미터로 설정합니다. SHG EGFP 및 EGFP tdTomato분리를 위한 두 개의 이색 거울을 포함하고 434-17, 510-84 및 585-40 나노미터 대역 패스 필터를 사용하여 SHG EGFP 및 tdTomato 신호를 관전적으로 분리한다. 눈 홀더를 설정하려면 마취 된 8-12 주 된 마우스에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후 가열 된 현미경 단계에 마우스를 배치하고 온도 모니터링 프로브를 삽입합니다.마우스를 사용자 정의 스테레오탁스 마우스 홀더에 넣고 외부 청각 고기에 이어 바를 삽입합니다. 3점 고정을 사용하여 헤드 홀더를 확보하고 0.4%의 옥시부프로카인 염산염 및 식염수 용액을 안구 표면에 적용합니다. PE 튜브 루프와 숫자 다섯 듀몬트 집게의 쌍의 팁을 커버.3분 후 수동 눈꺼풀 후퇴를 수행하여 눈알 돌출을 확인하고 눈꺼풀 여백을 따라 PE 홀더 튜브 루프를 조심스럽게 배치하여 안구 표면을 노출시합니다. 그리고 홀더의 손잡이를 사용하여 포셉으로 안구를 안정시합니다. 그런 다음 각막 표면을 1.338의 굴절률로 아이 젤로 덮습니다.각막 표면의 Z 직렬 이미징의 경우 수은 광원을 사용하여 타겟팅 필드를 이미지화하고 현미경 소프트웨어를 엽니다. 안구 표면의 셀룰러 구조를 시각화하기 위한 적절한 사진 승수 및 디지털 이득을 선택하고 이미지 스택을 수집할 수 있도록 첫 번째 및 마지막 슬라이드를 설정합니다. 이미지 해상도를 512x 512픽셀로 설정하고 Z 단계를 하나의 마이크로미터로 설정합니다.그런 다음 SHG EGFP 신호 수집을 위한 880나노미터 의 흥분으로 하나의 라이브 이미지를 획득하는 Z 직렬 이미지를 수집하기 시작하고 각 영역 내의 EGFP tdTomato 신호 수집을 위한 940나노미터 의 라이브 이미지를 수집합니다. 이미지 전반에 걸쳐 스테퍼 전동 스테이지 홀더를 사용하여 안구를 회전하여 각막 표면 전체를 이미징할 수 있습니다. 모든 이미지가 획득되면 Z 직렬 이미지를 피지에 로드하고 중앙값 3D 필터 플러그인을 선택합니다.배경 노이즈를 제거한 후, 선명한 마스크 필터 패키지 피지를 선택하여 이미지를 선명하게 하고 자동 밝기 대비를 클릭하여 이미지의 품질을 자동으로 최적화합니다. 처리 후 이미지를 직렬 이미지 시퀀스로 저장하고 이미지 시퀀스를 적절한 3D 재구성 소프트웨어 프로그램으로 내보냅니다. 모든 다광현미경 이미지에서 EGFP tdTomato 및 SHG 신호를 각각 의사 그린, 레드 및 시안으로 제시한 후 스냅샷으로 3D 구조 이미지를 캡처합니다.다광 현미경 검사는 이중 형광 형형 형질 전환 마우스의 각막 상피에서 피상적 날개와 기저 세포의 시각화를 허용합니다. 기저 층에서 단일 셀은 단일 육각형 모양의 피상 세포뿐만 아니라 피상층으로 매핑될 수 있다. tdTomato 신호의 세포질 발현에 의해 드러난 바와 같이, 골기 장치 및 내피성 망상을 포함한 세포 내 혈관 계통이 풍부한 막 단백질이 날개 세포 내에 흩어져 있다.콜라주 기질 내, 스텔레이트 모양의 coratesites는 이 마우스에 있는 EGFP 형광을 표적으로 하는 막에 의해 설명됩니다. 대학 기질에 내장 된 coratesites는 내피 세포 내에서 보다 더 느슨하게 간격. 또한, 각막 스트로마 내의 얇은 분기 신경은 또한 tdTomato 신호를 표적으로 하는 멤브레인에 의해 시각화될 수 있고 각막 내피 세포 단층은 벌집 패턴에 연결된 비교적 균일한 육각형을 나타낸다.림팔 상피는 상피 세포의 1 ~ 2 층으로 구성됩니다. 이중 형광 기자 형질 변형은 또한 결막 내의 모세 혈관의 이미징을 가능하게하여 혈관 내피를 설명하는 모세 혈관의 3D 아키텍처의 재구성을 용이하게합니다. 부상 없이 적당한 압력으로 안구를 안정화하는 것은 부족하거나 과도한 압력이 이미지 품질을 손상시킬 수 있기 때문에 양질의 이미지를 획득하는 데 중요합니다.이 NVivo 화상 이미징 플랫폼은 안구 표면 아래 구조의 시각화를 위해 수정할 수 있으며 다양한 안과 질환의 내부 연구에 적용 될 수 있습니다.

a-custom-multiphoton-microscopy-platform-for-live-imaging-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina.  J. Vis. 특급 (2021). 이 동영상은 이광자 현미경을 사용한 in vivo 망막 이미징 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스는 머리를 고정하고, 눈 윤활제를 바르고, 눈 위에 커버슬립을 놓아 이미징을 준비합니다. 형광 단백질을 발현하는 망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 정렬을 위해 상피형광(epifluorescence)을 사용하여 먼저 시각화됩니다. 마지막으로, 이광자 이미징이 사용되어 망막 신경절의 고해상도 시각화가 가능합니다.

마우스 망막의 Two-Photon In Vivo 이미징

출처: Maruoka, H., et. al. 깨어 있는 쥐의 미세아교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징.J. Vis. Exp. (2022) 이 비디오는 시각적 자극 중 깨어 있는 쥐의 신경 활동과 미세아교세포 역학을 이미징하기 위한 이광자 현미경 절차를 보여주며 칼슘 과도 및 세포 상호 작용을 강조합니다.

깨어 있는 쥐에서 미세아교세포의 역학과 신경 활동의 동시 이미징(Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse)

출처: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 형질전환 마우스 망막의 원뿔 광수용체에서 칼슘 역학을 모니터링하기 위해 이광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 망막 절편을 준비하고, FRET 기반 칼슘 바이오센서를 이미징하고, 형광 변화를 분석하여 배경 조명 및 빛 자극 하에서 칼슘 수치를 정량화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 망막 원뿔 광수용체의 칼슘 역학을 모니터링하기 위한 이광자 현미경 검사

세포 외 기질은 상처 치유, 염증과 종양 발생시 상당한 개조를 겪는다. 우리는 섬유의 역학뿐만 아니라 표면 형광 또는 이광자 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 메쉬 형상의 매트릭스 성분을 시각화하는 신규의 intravital 면역 형광 현미경 방식을 제시한다.

표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

이 기사에서는 R26R-Confetti 마우스를 사용하여 다중 색상 계통 추적 실험을 설계하고 수행하는 원칙을 설명합니다. 당사는 다른 관심 조직에 대해 변형될 수 있는 각막 상피 세포를 추적하기 위한 특정 프로토콜을 제공합니다.

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

이 프로토콜 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 등 어떻게 고해상도 이미징 기술을 설명 하 고 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy에 정보를 얻기 위해 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하 여 작은 설치류에 이용 될 수 있다 망막 두께 microglial 각각 유통, 셀.

Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

여기, 선물이 쥐에서 안 neovascularization 레이저 유도의 형태학 변화의 후속에서 경도 vivo에서 화상의 유용성.

Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

우리는 경내 주입 후 눈에 리포좀의 스파티오 측두분포를 비침습적으로 연구하기 위해 광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사(CLM)의 사용을 위한 프로토콜을 제시한다.

광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사를 사용하여 안구 약물 전달 시스템의 생체 내 측두 체 이미징

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

본 프로토콜은 이미지 정량화 방법을 사용하여 접안 렌즈의 주변 구조를 시각화하기 위한 새로운 전체 마운트 이미징을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 렌즈 마이크로스케일 구조와 렌즈 발달/기능 간의 관계를 더 잘 이해하기 위한 연구에 사용할 수 있습니다.

Whole Mount Imaging을 통해 Peripheral Lens 구조, 세포 형태 및 조직을 시각화하고 정량화할 수 있습니다.

학습하세요 맞춤형 다광현미경 플랫폼을 활용한 마우스 각막과 결막의 라이브 이미징 방법입니다. 이중 형광 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 각막 표면의 세포 핵, 신경 섬유 및 기질 구조를 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

더 많은 동영상 탐색