Summary
이 프로토콜에서, 독소루비신로드 AS1411-g-PEI-g-PEG 변형 금 나노 입자는 3 단계 아마이드 반응을 통해 합성된다. 이어서, 독소루비신은 암 치료를 위한 암세포를 표적으로 하기 위하여 장전되고 전달된다.
Abstract
건강한 세포에서 약물 내성 및 독성으로 인해 독소루비신(DOX)의 사용은 임상 암 요법에서 제한적입니다. 이 프로토콜은 아미드 반응을 통해 로드된 aptamer(AS1411) 및 DOX를 탑재한 폴리에틸렌 글리콜(PEI-g-PEG) 중합체 기능성 금 나노입자(AuNPs)로 이식된 폴리(에틸레니민)의 설계를 설명한다. AS1411은 특히 DOX가 건강한 세포 대신 암세포를 표적으로 할 수 있도록 암세포에 표적 뉴클레놀린 수용체와 결합된다. 첫째, PEG는 카박스화되어 1HNMR 분석에 의해 확인된 PEI-g-PEG 중합체를 얻기 위해 분기된 PEI에 이식된다. 다음으로, PEI-g-PEG 공합체 코팅 금 나노입자(PEI-g-PEG@AuNPs)가 합성되고, DOX 및 AS1411은 아마드 반응을 통해 점차적으로 AuNPs에 공유결합된다. 준비된 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 의 직경은 ~39.9nm이며, 제타 전위 -29.3mV로, 나노입자가 물과 세포 배지에서 안정되어 있음을 나타낸다. 세포 세포 독성 연구는 새로 설계된 DOX로드 AuNPs가 암세포 (A549)를 죽일 수 있음을 보여줍니다. 이 합성은 순차적 인 아미데 반응에 의해 달성되는 AuNPs에 PEI-g-PEG 공중 합합체, aptamers 및 DOX의 섬세한 배열을 보여줍니다. 이러한 aptamer-PEI-g-PEG 기능화된 AuNPs는 암 치료에서 표적 약물 전달을 위한 유망한 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
전 세계적으로 주요 공중 보건 문제이기 때문에 암은 치료율이 낮고 재발률이 높고 사망률이 높은 것으로 널리 특징지으며사망률은 1,2. 현재 종래의 항암 방법은 수술, 화학요법 및 방사선 요법3을포함하며, 그 중 화학요법은 클리닉4에서암 환자를 위한 1차 치료법이다. 임상중항암제는 주로 파클리탁셀(PTX)5 및 독소루비신(DOX)6,7을포함한다. 항신성형치료제인 DOX는 암 세포독성 및 암세포 증식 억제의 장점으로 임상화학요법에 광범위하게 적용되어왔다8,9. 그러나 DOX는 심장독성을 10,11로유발하며, DOX의 짧은 반감기는클리닉(12)에서의적용을 제한한다. 따라서, 분해가능한 약물 운반체는 DOX를 적재하고 통제된 방식으로 표적 영역으로 안전하게 방출하기 위해 필요합니다.
나노 입자는 표적 약물 전달 시스템에 널리 사용되어 왔으며 암 치료에 몇 가지 장점이 있습니다 (즉, 크기가 큰 표면 대 부피 비율, 작은 크기, 다양한 약물을 캡슐화하는 능력 및 튜닝 표면 화학 등). 13,14,15. 특히, 금 나노입자(AuNPs)는 광열암치료제(16,17)와같은 생물학적 및 생체 의학 응용 분야에서 널리 사용되고 있다. 촉진 합성 및 일반 표면 기능화와 같은 AuNPs의 독특한 특성은 암치료(18)의임상 분야에서 우수한 전망을 가지고 있다. 또한, AuNPs는 약물 전달 전략을 식별하고, 종양을 진단하고, 많은 연구에서 저항을 극복하기 위해 사용되어 왔다19,20.
하지만, AuNPs는 표적화 및 접근성 특성과 같은 향상된 투과 및 보존(EPR)을 통해 종양 병변에서 높은 국소 방출을 통해 약물 내성을 극복하기 위해 더욱 맞춤화되어야 합니다. 중합체 기능성 AuNPs는 소수성 항암제의 용용성 향상 및 장기간 순환시간(21,22)과같은 독특한 장점을 나타내었다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌리민(PEI), 히알루론산, 헤파린, 크산탄껌 등 다양한 생체적합성 폴리머가 AuNP 코팅에 사용되어 왔다. 그런 다음 AuNP의 페이로드뿐만 아니라 안정성이 잘향상됩니다(23). 구체적으로, PEI는 1차, 이차 및 고등아민(24)의많은 반복 단위로 구성된 고도로 분진된 중합체이다. PEI는 우수한 용해도, 낮은 점도 및 높은 수준의 기능을 가지고 있으며, 이는 AuNPs코팅에 적합합니다.
한편, 항암제는 하중 효율이 향상되어 암세포에 직접 전달되어야 하며, 1차 및 첨단 전이성 종양 을 치료하기 위한 독성이 낮을 수있다(25). 표적 리간드항은 항암제 표적 전달시스템(26)에큰 잠재력을 가지고 있다. 표적 분자 결합에 대한 선택성은 특이성을 표적으로 하는 항암제를 부여하고 병성 조직에 있는 약 농축을 증가합니다(27). 더 많은 리간드는 항체, 폴리펩티드 및 소분자를 포함한다. 다른 리간드에 비해, 핵산 aptamers는 체외에서 합성될 수 있고 수정하기 쉽습니다. AS1411은 암세포28,29,30에과발현 표적 핵단백질 수용체에 구체적으로 결합하기 위해 안정된 조광 G-테트라머 구조를 형성하는 수정되지 않은 26bp 인포디스터 올리고뉴클레오티드이다. AS1411은 많은 암세포의 증식을 억제하지만 건강한세포(31,32)의성장에영향을 미치지 않는다. 그 결과, AS1411은 이상적인 표적 약물 전달 시스템을 제조하는 데 사용되어 왔다.
본 연구에서는, PEI-g-PEG 공중합체는 아마이드 반응을 통해 합성되고, PEI-g-PEG 공합체 코팅된 금 나노입자(PEI-g-PEG@AuNPs)가 제조된다. 또한 DOX 및 AS1411은 도 1에도시된 바와 같이 준비된 PEI-g-PEG@AuNPs 순차적으로 연결된다. 이 상세한 프로토콜은 연구원이 DOX 및 AS1411로로드된 새로운 PEI-g-PEG@AuNPs 제조와 관련된 많은 일반적인 함정을 피할 수 있도록 돕기 위한 것입니다.
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Protocol
주의: 모든 화학 물질을 사용하기 전에 모든 관련 재료 안전 데이터 시트(MSDS)를 참조해야 합니다. 중합체 및 나노 입자를 준비하는 데 사용되는 화학 물질의 몇 가지는 급성 독성이 있습니다. 나노 입자는 또한 잠재적인 위험이 있습니다. 장갑, 실험실 코트, 후드, 전신 바지, 근접 신발 등 모든 적절한 안전 관행과 개인 보호 장비를 사용해야 합니다.
1. 이중 카복실 폴리에틸렌 글리콜 (CT-PEG)33의 합성
- 1.46 g (14.6 mmol) 수치 안 수 화물 (SA) 및 209 mg (1.71 mmol) 4-디메틸 아미노피리딘 (DMAP)의 100 mL 라운드 바닥 플라스크에 추가합니다.
- 1.1단계에서 사용되는 플라스크에 15mL의 무수스테트라하이드로푸란(THF)을 추가하고 유리 스토퍼에 맞춥니다. 플라스크를 0°C에서 30분 동안 보관하십시오.
- 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 트리에틸라민(TEA)의 1.8mL(12.8mmol)을 새로운 플라스크에 4.28g(4.28mmol)을 추가한다.
- 1.3 단계에서 사용되는 플라스크에 15mL의 무수THF를 추가하고 유리 스토퍼에 맞습니다. 질소 대기 하에서 주사기를 사용하여 1.2 단계에서 사용되는 플라스크로 천천히 용액을 전달합니다.
- 용액을 0°C에서 2시간 동안 저은 다음 밤새 실온(RT)에서 반응을 계속합니다.
- 회전 증발기(40°C, 0.1 MPa)를 사용하여 반응 용액을 농축하고 THF 용매를 제거한다.
- RT에서, 1.325 g/mL 디클로로메탄(DCM)의 15mL에서 1.6단계에서 반응 용액을 용해한 다음, 강수산물(폴리에틸렌 글리콜 디산)을 얻기 위해 15mL의 콜드 다이틸 에테르(Et2O)를 첨가한다. 필터 용지를 통해 용매를 제거합니다.
참고: 강수 단계는 3배 반복될 수 있습니다. - 48 시간 동안 RT에서 진공 상태에서 침전을 건조시.
2. PEI-g-PEG 합합체 합성
- 305.47 단계에서 CT-PEG의 mg 1.8 과 5 mL 디메틸 설산화물 (DMSO) 플라스크에 하 고 CT-PEG가 DMSO에 완전히 용해 되도록 RT에서 저어.
- DMSO의 5mL에서 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디미드 염산염(EDC)의 49.46 mg을 녹인 다음, 2.1단계에서 사용되는 플라스크에 용액을 추가하고 RT에서 30분 동안 저어줍니다.
- DMSO의 5mL에 29.69 mg의 N-하이드록시시시니미드(NHS)를 용해하고 2.1단계에서 사용되는 플라스크에 용액을 추가한다. 3 시간 동안 RT에서 계속 저어주세요.
- DMSO의 10mL에 폴리에틸렌네이민(PEI)의 28.6 μL을 용해하고 2.1단계에서 사용되는 플라스크에 액액을 드롭방향으로 추가한다. 적어도 3 일 동안 저어주세요.
- 반응형 용액을 2.4단계에서 투석 백(1,000개의 분자량 컷오프[MWCO]으로 전송합니다. 투석 가방을 투석물로 500mL초순수로 1L 비커에 넣습니다. 3 일 동안 12 시간마다 초순수를 변경합니다.
- 다른 투석 가방 (10,000 MWCO)에 2.5 단계에서 솔루션을 전송합니다. 투석 가방을 투석물로 500mL초순수로 1L 비커에 넣습니다. 3 일 동안 12 시간마다 초순수를 변경합니다.
- 회전 증발기(40°C, 0.1 MPa)를 이용하여 2.6단계에서 용액을 농축하고 시료를 동결건조하여 PEI-g-PEG 분말을 획득한다.
3. PEI-g-PEG@AuNPs 합성
- 5 mg의 완고한 PEI-g-PEG(2.7단계)를 5mL의 초순수로 녹여 서 새로운 플라스크에 넣고 유리 스토퍼에 맞춥니다.
- 플라스크에 0.3 mM HAuCl4 용액의 100 mL을 추가하고 RT에서 3 시간 용용액을 저어줍니다.
참고: 솔루션의 색상은 노란색에서 주황색으로 즉시 변경되어야 합니다. - 플라스크에 1 mg /mL NaBH4 용액의 1 mL을 추가하고 RT에서 3 시간 용용액을 저어줍니다.
참고: 반응 솔루션은 즉시 부르고뉴로 바꿔야 합니다. - PEI-g-PEG@AuNPs 용액을 얻기 위해 2.5단계에서 설명된 바와 같이 3일간 투석백(1,000MWCO)을 이용하여 반응 제품을 투석한다.
4. DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 합성
- 2.2 mg / mL DOX 솔루션의 1 mL과 새로운 플라스크에 PEI-g PEG@AuNPs 솔루션 20 mL을 추가하고 유리 스토퍼에 맞게.
- 초순수 1mL에 EDC 0.727 mg을 용해하고 4.1 단계에서 사용되는 플라스크에 EDC 용액을 추가한다.
- 초순수 1mL에 NHS 0.437 mg을 용해하십시오. FLASK에 NHS 솔루션을 추가하고 1 시간 동안 RT에서 저어.
- 2.5단계에서 설명한 대로 3일간 투석백(1,000MWCO)을 사용하여 반응 제품을 투석하여 DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 솔루션을 획득하였다.
5. AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 합성
- 새로운 플라스크에 DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 용액 20mL및 AS1411(OD = 광학 밀도; 1OD ≈ 33 μg)의 4OD를 추가합니다.
- 초순수 1mL에 28.76 mg의 EDC를 녹이고 5.1단계에서 사용되는 플라스크에 EDC 용액을 추가한다.
- 초순수 1mL에 NHS 17.27 mg을 녹입니다. 5.1 단계에서 사용되는 플라스크에 NHS 솔루션을 추가하고 RT에서 1h에 대한 반응을 저어줍니다.
- AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 획득하기 위해 2.5단계에서 설명된 바와 같이 3일간 투석백(1,000 MWCO)을 사용하여 반응 제품을 투석한다.
6. 샘플 특성화
- 핵 자기 공명(NMR) 튜브에서 클로로폼-d에서 CT-PEG 폴리머(Step 1.8) 및 PEI-g-PEG 중합체(step 2.7)를 각각 용해한다. 14.09 T 초전도 자석과 5.0mm 600 MHz 광대역 Z 그라데이션 고해상도 프로브가 장착된 600 MHz NMR 분광계를 사용하여 샘플을 분석하여 화학구조(34)를확인한다.
- AuNPs, DOX 및 AS1411을 분산시키고, 울트라퓨어워터에서 각각 PEI-g-PEG@AuNPs(3.4단계), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(단계 4.4), 및 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(단계 5.4)를 제조하였다. 그런 다음 UV-vis 분광광계를 사용하여 큐벳으로 옮기고 자외선 가시성 (UV-vis) 스펙트럼을 기록하십시오.
- 알루미늄 호일에 양면 접착제(~2mm x 2mm)를 부착하고 샘플 용액(PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, AS1411 g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs)을 전체 테이프에 균일하게 찍어 보세요. X선 광전자 분광분석기를 사용하여 샘플을 분석합니다.
- PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 솔루션을 각각 초순수수에 분산시한다. 그런 다음, 큐벳으로 옮기고 동적 광 산란을 사용하여 크기 분포를 평가합니다.
- PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, 및 AS1411 g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 용액을 초순수 수분(각 시료당 5mL당 1방울의 샘플). 2 시간 동안 초음파 처리합니다. 구리 그리드를 샘플 솔루션에 담그고 적외선 램프 아래에서 건조시하십시오. 변속기 현미경을 사용하여 형태학을 특성화한다.
- AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPs 20kDa MWCO 투석 카세트에 1 mg을 주입한 다음, 5% 소세럼 알부민(BSA)이 있는 인산완충식살린(PBS)의 80mL에 넣습니다. 37°C에서 저어줍니다.
- 미리 정해진 시점에서 100μL 알리쿼트를 수집하고 신선한 PBS로 대체합니다. UV-vis 분광계를 사용하여 알리쿼트의 DOX 형광 강도를 측정합니다.
7. AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 나노 입자의 CCK-8 분석
- Dulbecco의 수정된 독수리 매체(DMEM)에서 A549 세포를 성장시키는 것은 10% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 연쇄절제술로 37°C에서 95%의 공기와 5% CO2의 가습대기 하에서 보충됩니다. 배양 배지를 2일마다 교체합니다. 세포 증식 및 세포 독성 분석에 대해 5통로에서 세포를 사용하여 준비된 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 나노입자의 세포 독성을 정량적으로 평가한다.
- 각 우물에 1mL의 세포 배지를 함유하고 있는 나노입자 용액 100μL을 추가합니다. 24h 및 48h를 배양한 후, 세포 배양 판에서 배양 매체를 제거한 다음, 300 μL의 신선한 배양 배지와 30 μL의 세포 계수 키트-8(CCK-8) 키트 솔루션을 각 웰에 즉시 첨가한다. 37°C에서 CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 배양한다.
- 반응 솔루션 200 μL을 7.2 단계에서 96 웰 플레이트로 옮킨다. 마이크로 플레이트 판독기와 함께 570 nm에서 각 웰의 광학 밀도(OD)를 읽습니다.
- 현미경으로 24 h 및 48 h에서 세포의 형태를 관찰하십시오.
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Representative Results
1 H NMR 분광법은 CT-PEG 중합체 및 PEI-g-PEG 중합체(도2)의성공적인 합성을 확인하기 위해 사용되었다. 도 2a는 δ = 3.61 ppm 및 carboxyl 양성자 신호에서 메틸렌 양성자 신호가 δ = 2.57 ppm에서 CT-PEG 폴리머의 성공적인 합성을 확인함을 나타낸다. 도 2b는 δ = 2.6 ppm 및 peI의 양성자 신호에서 PEG의 메틸렌 양성자 신호가 δ = 1.66 ppm에서 PEI-g-PEG 합체의 합성을 확인한다는 것을 보여준다.
UV-비스 분광법은 AuNPs(도3)에제조된 중합체의 성공적인 기능화를 결정하기 위해 수행되었다. UV-vis 스펙트럼에서, 대역의 존재는 ~523 nm, 507 nm 및 260 nm에서 AuNPs, DOX 및 AS1411의 표면 플라스몬 공명 (SPR) 피크에 해당합니다(그림3a). PEI-g-PEG@AuNPs UV-vis 스펙트럼 ~360 nm의 밴드는 , ~532 nm의 UV-vis 스펙트럼에서 DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPs 의 UV-vis 스펙트럼에서 -546 nm- PEI-g-PEG-co-m의 성공적인 합성을 확인한다. 또한 DOX 및 AS1411이 기능성 AuNP에 점진적으로 로드되었는지 확인합니다(그림3b).
X선 광전자 분광법(XPS)은 AuNPs(도4)에서공합체의 화학적 결합을 조사하는 데 사용되었다. PEI-g-PEG@AuNPs XPS 스펙트럼은 C1s, O1s, N1s 및 Au4f 피크를 보여주었으며 AuNP와 PEI-g-PEG 공중합체(그림4a)의연결을 나타냈습니다. DOX가 PEI-g-PEG@AuNPs(그림 4b)에더 접목되었기 때문에 DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs XPS 스펙트럼에 약간의 변화가 있었습니다. 더욱이, AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 대한 P2p 피크의 출현은 주로 DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsAS1411의 성공적인 접목 때문이었다. 준비된 나노입자의 크기 분포는 DLS(도5)를사용하여 분석하였다. PEI-g-PEG@AuNPs 비교하여, 평균 수분 직경은 DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 약간 증가하고 AS1411이 접목되면 더욱 증가했습니다.
TEM은 나노입자의 형태를 결정하는 데 사용되었고, 이미지는 모든 나노입자가 응집없이 균일한 것으로나타났다(도 6). AuNPs 의 표면에 있는 공중합체 사이 상호 작용 때문에, AuNPs의 거리는 점차적으로 증가했습니다. 셀 생존성 시험은 준비된 DOX 전달 시스템의 표적 특성을 결정하기 위해사용되었다(도 7 및 도 8). CCK-8결과(도 7)는1) AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs 통해 배양 후 A549 세포 수가 감소하는 것으로 나타났으며, 2) 나노입자의 농도증가로 세포 수가 감소하였다. 무료 DOX 그룹에 비해, 세포 수가 증가하여 독성이 감소되었음을 나타냅니다.
광학 현미경 영상(도8)과함께, 결과는 나노입자를 첨가하지 않고 대조군에 비해 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(도8a-d)로배양한 후 세포 수가 감소하는 것을 보여준다(그림 8e,f). 또한, PBS에서 준비된 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs에서 DOX 방출 프로파일을 조사하였다(그림9). 그 결과 기능성 나노입자로부터 DOX의 지속적인 방출이 A549 세포의 감소를 일으켰으며, 누적 DOX 방출은 72h에서 약 63.5%± 3.2%였다.
그림 1: PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP, AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP 합성의 회로도 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: (a)합성 CT-PEG 폴리머 및 (b) PEI-g-PEG 합합체의 1 H NMR 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: (a) AuNPs, DOX 및 AS1411및 (b) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 및 AS1411 g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs UV-vis 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: (a) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 및 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 크기 분포.
d.nm = 나노 입자의 평균 직경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: (a) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 의 TEM 이미지.
스케일 바 = 50 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 24h 및 48h에 대해 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(220 μg/mL 및 110 μg/mL)로 배양한 후 A549 세포의 570nm(OD570)의광학 밀도 값.
나노 입자를 추가하지 않고 무료 DOX 및 세포를 가진 세포는 대조군으로 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 220 μg/mL(a,b) 및 110 μg/ml(c,d)로 배양한 후 A549 세포의 광학 현미경 이미지 또는 나노입자를 대조군(e,f)으로 추가하지 않고 배양(상단 패널) 및 48(48h). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 72hPBS에서 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 에서 DOX의 릴리스 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
1H NMR스펙트럼(도 2)은CT-PEG 중합체 및 PEI-g-PEG 중합체의 성공적인 합성을 확인합니다. PEG와 PEI의 분자량은 각각 1,000및 1,200이었습니다. 또한, EDC/NHS 촉매 시스템은 아미드 반응을 통해 PEI-g-PEG 합합체를 합성하는 데 사용되었습니다. PEG와 PEI의 분자량이 PEI-g-PEG 합합체를 합성하기 위해 변경되면 반응 시간과 촉매 시스템을 재평가해야 합니다. 또한, AUNPs에 대한 PEI-g-PEG 공중합체 코팅에 대한 반응 조건은 주로 PEG-g-PEI 공중합체의 분자 중량 및 구조가 AuNPs의 코팅 효율 및 직경에 영향을 미칠 수 있기 때문에 더욱 조정될 필요가 있다. 그 후, 기능성 AuNPs의 형태도 변경될 수 있다. PEI 폴리머로부터의 아미노산그룹의 수는 최종 PEI-g-PEG 중합체 합성의 구조에 영향을 미칠 수 있으며, PEI와 CT-PEG 사이의 크로스링크 작용은 필연적으로 발생할 것이다. 따라서 2.4 단계는 신중하게 수행되어야하며 PEI 솔루션은 드롭 바이 드롭을 천천히 추가해야합니다. 합성 반응 후, 투석(단계 2.5 및 2.6)은 교차 연결 된 중합체 및 비반응성 중합체를 제거하기 위해 작동될 필요가 있다.
또한, DOX 및 AS1411은 아미드 반응을 통해 PEI-g-PEG@AuNPs 순차적으로 기능화되고, EDC/NHS 촉매 시스템이 사용된다. 여기에 각 반응(4.3단계 및 단계 5.3)에 대해 3일이 필요합니다. 그러나 반응 시간이 3일 미만이 면 기능화 효율이 저하됩니다. 3일 이상 필요한 경우 동일한 결과가 발생했습니다. 화학 적 EDC, NHS 및 연결되지 않은 DOX 또는 AS1411투석 치료를 통해 제거 할 수 있음을 주목해야한다 (단계 4.4 및 단계 5.4). UV-vis 스펙트럼 및 XPS는 나노 입자에 대한 중합체의 성공적인 기능화를 조사하는 효과적인 방법이며, 일관된 결과를얻었다(도 3 및 도 4).
AuNPs, DOX 및 AS1411의 특징적인 UV-vis 밴드와는 달리 PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, AS1411 g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 각 피크의 겹침으로 인해 관찰하기가 어렵습니다. 또한 DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 제조하는 다른 방법을 수행했습니다(DOX-g-PEI-G-PEG를 먼저 합성하고, AuNPs에 기능화의 성취); 그러나, 이러한 접근법을 이용한 금 나노입자는 DOX 적재효율(35,36)을낮게 유도하였다. 따라서, 이 작품에서 DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 합성하는 방법은 충분한 DOX 로딩 효율뿐만 아니라 추가 방출 프로파일을 보장한다는 점에 유의해야 한다. 실험이 금 나노 입자의 DOX 로딩 효율을 고려하지 않으면 AS1411 g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 획득하는 다른 방법이 있습니다. 여기에는 먼저 아미드 반응을 통해 DOX-g-PEI-g-PEG 또는 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG의 합성이 포함된 다음 금 나노 입자에 대한 기능화를 포함합니다. 따라서, 여기에서 사용되는 방법은 얻어진 중합체뿐만 아니라 조직 공학과 같은 다양한 의료 응용 분야에 적용될 수 있다.
준비된 나노입자의 크기 분포 및 형태는 DLS 및 TEM에 의해 조사될 수 있다. DLS데이터(도 5)는수분 직경 나노입자가 서로 다른 코팅과 다르며, 각 시료에 대해 하나 이상의 피크가 나타나는 것을 보여준다. PEI-g-PEG(도1)의구조에 관해서는 DLS의 정상적인 분포 곡선이 관찰되지 않는다. 나노 입자는 DLS 테스트 중에 초순수수에 분산되어 있으며, 다른 부피 비율이 사용되며, 나노 입자 표면의 중합체 간의 상호 작용으로 인해 다중 피크가 여전히 존재한다는 점에 유의해야합니다. 따라서, TEM 이미지는 나노입자의 형태를 확인하기 위해 사용된다. PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs 의 TEM 이미지가 도 6에도시되어 있다.
금 나노 입자표면의 다양한 구성 요소에 기초하여 나노 입자 사이의 거리가 바뀝니다. 게다가, 물에 분산된 제조된 나노입자는 제타 전위 시험(-29~50mV)에 따라 안정된다(시간 테스트 후 상이한 나노입자에 대한-29~50mV). DOX 및 AS1411(프로토콜의 섹션 4 및 5)의 추가 기능화는 금 나노 입자의 직경에 영향을 미치지 않습니다. UV-vis는 모든 테스트 방법을 사용하지 않고 나노 입자에 로드된 DOX 및 AS1411을 확인하는 효과적인 방법이라는 결론을 내릴 수 있다.
암세포에 대한 표적 특성은 제조된 AS1411 및 DOX 장전 AuNP의 상이한 농도로 배양된 A549 세포를 사용하여 조사되었으며 나노입자를 대조군으로 첨가하지 않고 조사하였다. 동시에, A549 세포 생존가능성에 대한 무료 DOX의 효과도 테스트하였다(도7 및 도 8). 나노입자를 첨가하지 않고 군에 비해, 준비된 AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs A549 세포의 감소로 이어집니다. 그러나 나노입자의 농도가 감소(100 μg/mL) 동안, 세포는 자유 DOX 군에 비해 24h에서 더 나은 활성을 보여준다. 이는 주로 PEI-g-PEG 중합체가 우수한세포적합성(37)을 가지는 PEI 중합체의 비특이적 독성을 교전시키기 때문이다.
마지막으로, APtamer AS1411의 표적 특성으로 인해, 얻어진 나노입자는 건강한 세포 대신 암세포에 축적된다. aptamer가 인식되면 DOX는 암세포를 죽이기 위해 방출됩니다. PBS에서 AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs 에서 DOX의 릴리스 프로필이 기록되었다(그림9). 이 프로토콜은 다단계 아마이드 반응을 통해 공중합체 변형 된 AuNPs에 이식 된 aptamers 및 DOX를 준비하기위한 접근 방식을 보여줍니다. 합성된 나노 입자는 암 치료 응용 프로그램에 대한 잠재력을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 투자되었다 (31700840); 허난성의 주요 과학 연구 프로젝트 (18B430013, 18A150049). 이 연구는 XYNU의 젊은 학자를위한 난후 학자 프로그램에 의해 지원되었다. 저자는 그의 도움이 작품에 대한 XYNU생명과학대학의 학사 학생 제보 Qu에게 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 장비 사용에 대한 XYNU의 분석 및 테스트 센터를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
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