여기서, 우리는 선충 표백 후 선충근 및 형광 회복을 활용하여 생체 내에서 드 노보 단백질 합성을 평가하는 비방사성 및 비침습적 방법을 소개하고 설명합니다(FRAP). 이 방법은 단백질 합성의 새로운 변조기를 확인하기 위하여 유전 및/또는 약리학 스크린과 결합될 수 있습니다.
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방법 논문
Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
건강한 프로테아메를 유지하는 것은 세포와 유기체 항상성에 필수적입니다. 단백질 번역 제어와 저하 사이의 균형의 왜곡은 연령 관련 질병의 무리를 선동. 프로테오스타증 품질 관리 메커니즘의 감소는 노화의 특징입니다. 드 노보 단백질 합성을 검출하는 생화학적 방법은 여전히 제한되어 있으며, 몇 가지 단점이 있으며 살아있는 세포 나 동물에서 수행 할 수 없습니다. 투명하고 쉽게 유전자 변형되는 Caenorhabditis elegans는 이미징 기술을 사용하여 단백질 합성 속도를 모니터링하는 훌륭한 모델입니다. 여기서, 우리는 광표백 후 형광 회복을 이용한 생체 내 드 노보 단백질 합성을 측정하는 방법을 소개하고 설명한다(FRAP). 특정 세포 또는 조직에서 형광단백질을 발현하는 형질전환 동물은 광표백의 결과로 강력한 광원에 의해 조사된다. 차례로, 형광 회복의 평가는 관심의 세포 및/또는 조직에 있는 새로운 단백질 합성을 의미합니다. 따라서, 단백질 합성 비율의 살아있는 화상 진찰과 더불어 형질 전환선색선골, 유전 및/또는 약리학적 인 내정간섭의 조합은 나이 의존적인 proteostasis 붕괴를 중재하는 기계장치에 빛을 비출 수 있습니다.
서론
단백질 합성 및 분해는 유기체 항상성에 필수적입니다. 다양한 연령 관련 질병은 결함이 있는 단백질 생산1,,2에의해 선동된다. 글로벌 단백질 번역 율을 측정하기 위해, 리보솜 보호 mRNA 단편의 깊은 시퀀싱을 수반하는 리보솜 프로파일링과 같은 생화학적 기술이 있으며, 이는 새로운 단백질 합성3뿐만아니라 발현을 모니터링한다. 이 방법은, 번역 속도의 간접적인 판독이외에, 리보솜에 대한 증가된 RNA 협회가 반드시 증가된 번역을 의미하지 않기 때문에, 높은 비용 및 다량의 시작 물질의 요구 사항과 같은 기술적 단점이 있다. 한편, 프로테오믹스 기반 방법은 맥박 대사 프로파일링에 의한 직접 단백질 정량화를 허용한 후 질량 분석 분석4,,5. 그러나, 이것은 생체 내에서 쉽게 사용할 수 없는 제한된 시간적 해상도를 가진 반정적 접근법이다. 더욱이, 단백질의 라벨링은 관심있는 동물/조직에 불평등하게 분배될 수 있다. 중요하 군데, 이 두 가지 방법은 조직별 또는 세포별 변이를 전체 동물 또는 조직에서 각각 은폐할 수 있다.
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프로토콜
참고: 형광에 대한 전사 및 번역 융합을 모두 사용하여 여러 조직에서 드 노보 단백질 번역을 평가할 수 있습니다. 단백질 합성 비율은 세포질, 미토콘드리아 및 핵7을포함하여 다른 세포 구획에서 국소화된 다중 단백질 가족을 위해 평가될 수 있습니다. 다음 균주는 글로벌 및 뉴런 단백질 합성 율을 모니터링 하는 데 사용 됩니다., N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2 (ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3 (ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. 드 노보 단백질 합성을 모니터링하기위한 트랜스 제닉 선충의 유지 보수, 동기화 및 준비
- 해부 스테레오 현미경을 사용하여 야생 유형 (wt) 및 돌연변이 형선선선선색의 발달 단계와 성장을 평....
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결과
여기에 제시된 절차를 이용하여, 다음과 같은 체세포 기자, pife-22GFP, psod-3GFP 및 punc-119GFP를 표현하는 야생형 및 돌연변이 형 선충을 각각의 프로토콜에 따라 단백질 합성 율을 평가하는 데 사용되었다. 특히, ife-2 프로모터를 이용하여 체세포 조직 전반에 걸쳐 세포질 GFP를 발현하는 야생형 및 ife-2 돌연변이 벌레는 포토블리싱 직후, 5시간 후 회복 후에 비교되었다. 대표적인 이미지와 정량화는 야생형 동물이 완전히 회복되는 반면 ife-2 돌연변이체는 회복 능력을 감소시켰다는 것을보여준다(그림 1A). 따라서, 야생형 벌레는 광표백 후 드노보 단백질 생합성을 개시하는 반면, mRNA 번역 개시인 IFE-2가 부족한 .......
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토론
단백질 합성 변조는 유기체 항상성에 필수적입니다. 노화 하는 동안, 글로벌 뿐만 아니라 특정 단백질 합성 혼란. 최근 연구에 따르면 단백질 번역 균형이 노화와 노화를 직접 제어하는 것은 단순히 노화 과정의 부산물이 아니라는 사실을 보여줍니다. 특히, 진핵 개시인자 4E(eIF4E)와 같은 번역 기계류의 핵심 성분은 번역 개시 시 mRNA 캡핑을 용이하게 하고, 따라서 캡 의존성 단백질 번역의 속도를 용이하게 하고, 산화 스트레스를 유도하고 노화 과정을 가속화한다1. 더욱이, mRNA 처리체, P바디와 상호작용하고 mRNA 절충의 비율을 증가시키는 뉴런 특이적 EDC-3도 노화 공정8을가속화한다. 구체적으로, EDC-3 억제는 IFE-2 분리를 P 체체로 분리하여 궁극적으로 단백질 번역 수준을 감소시키고, 뉴런 노화를 지연시키는9를허용한다.
FRAP는 생.......
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공개 사항
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
비디오 녹화 및 편집에 대한 차니오타키스 M. 및 쿠나키스 K. 감사드립니다. K.P.는 그리스 연구 혁신 재단(HFRI)과 연구 기술 총무사(GSRT)의 보조금으로 지원받고 있습니다. N.T.는 유럽 연구 위원회 (ERC – GA695190 – MANNA), 유럽 위원회 프레임 워크 프로그램 및 그리스 교육부의 보조금으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 한천 | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose 패드 2% | |||
| 염화칼슘 탈수물(CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| 콜레스테롤 | SERVA 전기영동 | 17101.01 | |
| 시클로헥시미드 | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| 해부 실체현미경 | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427); 예[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | 20 °에서 동물 유지; C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| 형광 해부 실체 현미경 | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri 접시 (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306); 예[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | 동물을 20 °에서 유지 관리; C | |
| 이미지 분석 소프트웨어 | 피지 | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB 액체 매체 | |||
| M9 버퍼 | |||
| 황산마그네슘 (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| 현미경 슬라이드 (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel 소프트웨어 패키지 | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| em>N2; 예 < / em> [pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | 20 °에서 동물 유지; C | |
| N2; 예 < / em> [psod-3< / em>< / sub>GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | 20 °에서 동물 유지 C | |
| N2; 예 < / em> [p unc-119 < / em>< / sub>GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | 20 °에서 동물 유지 관리; C, | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| 선충 성장 배지(NGM) 한천 플레이트 | |||
| , 니스타틴 원액 | , 시그마-알드리치 | N3503 | |
| 펩톤 | BD, 박토 | 211677 | |
| 인산염 완충액 | |||
| 염화나트륨(NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| 한천 플레이트 준비를 위한 표준 장비(오토클레이브, 페트리 접시 등) | |||
| 웜 유지 관리를 위한 표준 장비(백금 와이어 픽, 인큐베이터 등). | |||
| 통계 분석 소프트웨어 | GraphPad Software Inc., 미국 | GraphPad Prism 소프트웨어 패키지 | |
| 스트렙토마이신 | 시그마-알드리치 | S6501 | |
| UV 크로스링커 | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| 웜 픽 |
참고문헌
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quali....
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