Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가

단백질 합성 및 분해는 유기체 항상성에 필수적입니다. 다양한 연령 관련 질병은 결함이 있는 단백질 생산^1,,2에의해 선동된다. 글로벌 단백질 번역 율을 측정하기 위해, 리보솜 보호 mRNA 단편의 깊은 시퀀싱을 수반하는 리보솜 프로파일링과 같은 생화학적 기술이 있으며, 이는 새로운 단백질 합성^3뿐만아니라 발현을 모니터링한다. 이 방법은, 번역 속도의 간접적인 판독이외에, 리보솜에 대한 증가된 RNA 협회가 반드시 증가된 번역을 의미하지 않기 때문에, 높은 비용 및 다량의 시작 물질의 요구 사항과 같은 기술적 단점이 있다. 한편, 프로테오믹스 기반 방법은 맥박 대사 프로파일링에 의한 직접 단백질 정량화를 허용한 후 질량 분석 분석^4,,5. 그러나, 이것은 생체 내에서 쉽게 사용할 수 없는 제한된 시간적 해상도를 가진 반정적 접근법이다. 더욱이, 단백질의 라벨링은 관심있는 동물/조직에 불평등하게 분배될 수 있다. 중요하 군데, 이 두 가지 방법은 조직별 또는 세포별 변이를 전체 동물 또는 조직에서 각각 은폐할 수 있다.

Caenorhabditis elegans는 대량으로 재배 할 수있는 사용하기 쉬운 모델 유기체입니다^6. 추가적으로, 그것의 유전 편의성과 투명성은 생체 내의 살아있는 화상 진찰을 허용합니다. 이 프로토콜은 광표백 후 형광 복구를 사용하여 단백질 합성 속도를 검출하는 방법론을 설명합니다(FRAP). 우리는 전체 유기체 또는 특정 조직/세포에서 형광 단백질의 형질전환 발현을 이용합니다. 형질전환 동물은 유전자의 프로모터를 사용하여 GFP를 발현할 수 있는데, 이는 광범위/전 세계적으로 표현되거나 특정 세포 유형을 표적으로 하는 조직 별 프로모터이다. 이 기술은 특정 단백질의 단백질 합성 비율을 검토하기 위하여 특정 프로모터로 확장될 수 있습니다.

참고: 형광에 대한 전사 및 번역 융합을 모두 사용하여 여러 조직에서 드 노보 단백질 번역을 평가할 수 있습니다. 단백질 합성 비율은 세포질, 미토콘드리아 및 핵^7을포함하여 다른 세포 구획에서 국소화된 다중 단백질 가족을 위해 평가될 수 있습니다. 다음 균주는 글로벌 및 뉴런 단백질 합성 율을 모니터링 하는 데 사용 됩니다., N2; Ex[p_ife-2GFP, pRF4], ife-2 (ok306); Ex[p_ife-2GFP, pRF4], N2; Ex[p_unc-119GFP, pRF4], edc-3 (ok1427); Ex[p_unc-119GFP, pRF4], N2; Ex[p_sod-3GFP; pRF4]

1. 드 노보 단백질 합성을 모니터링하기위한 트랜스 제닉 선충의 유지 보수, 동기화 및 준비

1. 해부 스테레오 현미경을 사용하여 야생 유형 (wt) 및 돌연변이 형선선선선색의 발달 단계와 성장을 평가합니다.
2. 1일차: 벌레 선택을 사용하여 원하는 형광 기자를 운반하는 wt 및 돌연변이 형질전환 동물의 10L4 애벌레를 대장균(OP50)으로 Escherichia 시드한 선충화 성장 미디어(NGM) 플레이트에 선택하여 전송한다(표1).
   1. 분젠 버너의 접촉 부위에 유리를 녹여 유리 파스퇴르 파이펫의 테이퍼 끝에 백금 와이어를 부착하여 웜 픽을 합니다. 그런 다음 모든 도구(예: 핀서 또는 라이트 해머)를 사용하여 백금 와이어의 끝을 주걱 모양으로 평평하게 만듭니다.
   2. 대장균(OP50) E. coli 박테리아의 단일 콜로니를 루리아-베르타니(LB) 액체 배지의 50mL를 함유한 플라스크로 접종하고 흔들리는 인큐베이터에서 37°C에서 10시간 동안 성장한다(200rpm; 표 1). 그런 다음 세균 배양의 200 μL을 가진 NGM 플레이트를 시드. 세균 잔디의 성장을 허용 하기 위해 하룻밤 실온에서 씨앗 접시를 배양.
3. 20°C의 표준 온도에서 선충을 배양하고 성장시다.
4. 5일차: 플레이트에는 형질전환벌레의 혼합된 집단이 포함되어 있습니다. 갓 시드 된 OP50-NGM 플레이트에 각 변형의 15 L4 애벌레를 선택하고 전송합니다.
5. 6일차: FRAP 분석 작업을 수행하고 성인1일째에 단백질 합성률을 모니터링합니다.
6. NGM 플레이트를 포함하는 사이클로헤시미드를 준비하고 긍정적인 컨트롤로 사용하십시오.
   참고: 10 mg/mL의 농도로 물에 희석하여 사이클로헨드의 스톡 솔루션을 준비하십시오. 재고 용액을 4 °C로 유지하십시오.
   1. UV 빛 (222 μW /cm² 강도)으로 15 분 동안 시드 NGM 플레이트를 노출하여 박테리아를 죽입니다.
   2. 식기 부피의 500 μg/mL 최종 농도에 세균 시드 플레이트 위에 사이클로헨시미드를 추가합니다.
   3. 플레이트가 실온에서 30분 동안 건조되도록 허용합니다.
   4. 차량 및 사이클로헤시미드 함유 플레이트에 p_sod-3GFP를 발현하는 트랜스제닉 선충을 전송합니다.
   5. 20°C의 표준 온도에서 2시간 동안 동물을 배양한다.

2. 체세포 조직을 표현하는 트랜스제닉 동물을 이용한 FRAP 분석 기자 p_ife-2GFP 및 p_sod-3GFP

참고: 동물 몸 전체에서 글로벌 단백질 합성 률을 모니터링합니다. 이 전사 기자는 다른 발현 수준을 제시하고 장, 인두 및 바디 월 근육을 포함하여 다중 체세포 조직에서 유비쿼터스로 표현됩니다.

1. 1일 성기 형질전환 동물을 중앙에 20μL OP50 드롭으로 시드한 개별 NGM 플레이트로 선택하고 이송합니다.
2. 뚜껑을 제거하고 각 플레이트를 에피플루오렌스 현미경의 20배 객관적 렌즈 아래에 놓습니다.
3. 포토표백(사전 표백제)전에 참조 이미지를 집중하고 캡처합니다.
4. 10 분 동안 각 샘플을 표백합니다.
   참고: 형광 신호가 표백 전 이미지에 비해 30 ~ 50 % 강도로 담금질 될 때 광표백을 중지합니다. 표백 기간의 빛 강도 및 기간은 검사 중인 특정 불소, 동물 단계 및 세포 또는 조직에 대해 그에 따라 조정되어야 합니다. 다른 표본에 대한, 광 표백의 적절한 범위에 도달하는 데 필요한 조사의 적절한 기간은 실험적으로 결정되어야한다.
5. 포토표백(표백제) 후 이미지를 캡처합니다.
6. 개별 NGM 접시에 동물을 유지하고 복구 할 수 있습니다.
7. 형광 스테레오 현미경에서 적어도 6 시간 동안 각 형광 기자의 회복을 이미지 및 기록합니다.
8. 대안적으로, 형광 현미경(예를 들어, AxioImager Z2)을 사용하여 형광 회복 평가를 수행한다.
9. 다음 3일 동안 운동, 터치 감도, 생식 능력 및 생존을 모니터링하여 동물당 동물 건강을 신중하게 평가합니다. 석광 표백 후 손상의 흔적을 나타내는 선충은 추가 분석에서 제외되었다.

3. 시료를 장착하고 팬 뉴런 세포질 GFP, p_unc-119GFP를 발현하는 형질전환 선충을 사용하여 FRAP 분석기를 수행합니다.

참고: 신경 고리가 있는 헤드 부위의 표적 광표백에 의해 범신경 단백질 합성을 모니터링합니다.

1. 아가로즈 패드 2%를 준비합니다.
2. 아가로즈 패드의 중앙에 M9 버퍼 10 μL 방울을 추가합니다.
3. 팬 뉴런 세포질 GFP를 발현하는 5개의 형질선선충을 M9 버퍼한 방울로 옮긴다.
4. 속눈썹을 사용하여 액체를 퍼뜨리시면 됩니다.
   참고: 동물은 Agar에 M9 흡수력으로 인해 2분 이내에 감소된 움직임을 표시합니다.
5. 선충 위치를 변경하여 "속눈썹" 선택을 사용하여 겹치지 않도록 합니다.
6. 시료를 과형 현미경의 40배 객관적렌즈 아래에 놓는다.
   참고: 커버슬립을 사용하지 마십시오.
7. 참조 이미지(사전 표백제)에 초점을 맞추고 캡처합니다.
8. 90초 동안 대상 관심 영역을 포토블리치합니다.
   참고: 형광 신호가 표백 전 이미지에 비해 30 ~ 50 % 강도로 담금질 될 때 광표백을 중지합니다. 표백 기간의 빛 강도 및 기간은 검사 중인 특정 불소, 동물 단계 및 세포 또는 조직에 대해 그에 따라 조정되어야 합니다. 다른 표본에 대한, 광 표백의 적절한 범위에 도달하는 데 필요한 조사의 적절한 기간은 실험적으로 결정되어야한다.
9. 포토표백(표백제) 후 이미지를 캡처합니다.
10. 광표백 선충에 M9 버퍼 10 μL 방울을 추가합니다.
11. 동물이 5 분 동안 회복하도록하십시오.
12. "속눈썹" 선택 또는 파이펫을 사용하여 선충을 중앙에 20 μL OP50 드롭으로 시드된 개별 NGM 플레이트로 전송합니다.
13. 상피 성 피관기 현미경으로 1 시간마다 각 샘플의 이미지를 캡처합니다.
    참고: 광표백 후 복구 시간에 대해 t=0을 계산합니다.

4. FRAP 분석 중에 캡처된 이미지의 데이터 분석

1. 소프트웨어(예: 피지)를 사용하여 획득된 이미지를 분석합니다.
2. 소프트웨어로 이미지를 엽니다.
3. 이미지 및 색상 드롭다운 메뉴를 통해 분할 채널 명령을 선택합니다.
   참고: 녹색 채널 이미지를 유지합니다.
4. Freehand 선택 도구를 사용하여 관심 있는 형광 영역(예: 전신, 머리, 내장)을 수동으로 설정합니다.
5. 드롭다운 분석 메뉴를 통해 측정 명령을 선택하여 각 시간 지점에 대한 관심 영역의 평균 픽셀 강도를 측정합니다.
   참고: 형광 회수의 백분율은 광표백 후 캡처된 참조 이미지를 사용하여 계산됩니다.

5. 통계 분석 보고서

1. 적어도 사용 20 – 25 각 변형 및/또는 조건의 선충.
   참고: 세 가지 생물학적 복제를 수행해야 합니다.
2. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 유의한 P< 0.05를 사용한 통계 분석을 위해 학생 t-테스트(두그룹 간의 비교) 또는 ANOVA(여러 그룹 간의 비교)를 수행합니다.

여기에 제시된 절차를 이용하여, 다음과 같은 체세포 기자, pife-22GFP, psod-3GFP 및 punc-119GFP를 표현하는 야생형 및 돌연변이 형 선충을 각각의 프로토콜에 따라 단백질 합성 율을 평가하는 데 사용되었다. 특히, ife-2 프로모터를 이용하여 체세포 조직 전반에 걸쳐 세포질 GFP를 발현하는 야생형 및 ife-2 돌연변이 벌레는 포토블리싱 직후, 5시간 후 회복 후에 비교되었다. 대표적인 이미지와 정량화는 야생형 동물이 완전히 회복되는 반면 ife-2 돌연변이체는 회복 능력을 감소시켰다는 것을보여준다(그림 1A). 따라서, 야생형 벌레는 광표백 후 드노보 단백질 생합성을 개시하는 반면, mRNA 번역 개시인 IFE-2가 부족한 벌레는 그렇게 할 수 없으며, 형광 회복의 속도가 생체내에서단백질 합성의 속도를 나타낸다는 것을 나타낸다. 더욱이, mRNA 번역의 특정 억제제인 사이클로헤시미드는 단백질 번역 억제를 위한 양성 대조군으로 사용될 수 있다. 실제로, 소드-3 프로모터하에서 세포질 GFP를 발현하는 사이클로헤시미드 처리형 형질전환동물은, 광표백시 형광을 회복하지않는다(도 1B).

우리는 또한 mRNA 처리 바디 (P 바디)가 단백질 번역8의비율에 어떻게 영향을 미치는지 검출하기 위하여 이 방법을 적용했습니다. GFP 팬-뉴런을 발현하는 야생형 및 edc-3(ok1427) 돌연변이 선충은 헤드 부위의 표적 광표백시 회복 능력에 대해 검사하였다. 형광 회복은 EDC-3 결핍동물에서 야생형(도1C)에비해 훨씬 느립니다. 이는 EDC-3-매개 mRNA 회전율이 새로운 단백질 합성을 방해하고 궁극적으로 단백질 번역 개시9를억제한다는 것을 나타낸다.

도 1: C. elegans에서드 노보 단백질 합성의 생체 평가. (A) IFe-2의프로모터 하에 세포질 GFP를 발현하는 야생형 및 IFE-2 결핍선충 모두에서 FRAP 분석. 트랜스제닉 동물은 전체 동물 광표백을 받습니다. GFP 신호는 초기 강도의 30-50%로 감소됩니다. 형광은 광표백(사전 표백제) 전에 기록되며, 광표백 기간이 끝난 후(10분; 표백제) 및 5시간 후 회복이 가능합니다. (B)사이클로헤시미드 치료는 sod-3의발기인하에서 세포질 GFP를 발현하는 형질전환 동물의 형광 회복을 억제한다. 트랜스제닉 동물은 전체 동물 광표백을 받습니다. GFP 신호는 초기 강도의 30-50%로 감소됩니다. 형광은 광표백 기간(10분)의 끝에 따라 광표백(사전 표백제) 전에 기록됩니다. 표백제) 및 5시간 사후 복구(A, B: AxioImager Z2 현미경; 목표 렌즈: 20x, 수치 조리개 0.8; 고출력 광원, HBO 100; 100 와트 수은 아크 램프; 여기/방출 필터 세트, 자이스 세트 38 엔다우 GFP 시프트 무료). 스케일 바, 500μm. (C)EDC-3 결핍 선충 디스플레이 는 뉴런 세포에서 드 노보 단백질 합성 율을 감소시켰다. 야생형과 에드C-3(ok1427) 동물의 형광 신호는 광표백(pre-bleach)과 포토표백 기간(90초; 표백제)에 따라 광표백(pre-bleach)전에 측정된다. 트랜스제닉 동물은 머리 부위(신경 고리)에서 광표백을 받습니다. GFP 신호는 초기 강도의 30-50 %로 감소 (AxioImager Z2; 객관적인 렌즈: 40 x, 숫자 조리개 0.75; 형광 조명 소스의 30 % 발광 힘 (FI 조명 시스템 X 인용 120 XL FL PC, 120W 금속 할로겐 램프) 완전히 개방). 형광 회복의 평균 픽셀 강도는 1시간 간격으로 측정됩니다. 20마리의 동물은 3개의 독립적인 실험각각에서 균주당 정량화되었다. 데이터는 S.E.M., ***P&05, 페어링되지 t않은 t-test를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 사용 시약에 권장하는 레시피입니다. 제시된 프로토콜에 사용되는 모든 시약 레시피는 여기에 설명되어 있습니다.

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.