Summary
Hier stellen wir eine nicht-radioaktive und nichtinvasive Methode zur Bewertung der de novo Proteinsynthese in vivo vor und beschreiben sie unter Verwendung des Nematoden Caenorhabditis elegans und der Fluoreszenzrückgewinnung nach dem Photobleichen (FRAP). Diese Methode kann mit genetischen und/oder pharmakologischen Screens kombiniert werden, um neuartige Modulatoren der Proteinsynthese zu identifizieren.
Abstract
Die Aufrechterhaltung eines gesunden Proteoms ist für die Zell- und Organismushomöostase unerlässlich. Die Störung des Gleichgewichts zwischen ProteintranslationalKontrolle und Abbau löst eine Vielzahl altersbedingter Krankheiten aus. Der Rückgang der Proteostase-Qualitätskontrollmechanismen ist ein Kennzeichen des Alterns. Biochemische Methoden zum Nachweis der de novo Proteinsynthese sind noch begrenzt, haben mehrere Nachteile und können nicht in lebenden Zellen oder Tieren durchgeführt werden. Caenorhabditis elegans, transparent und leicht gentechnisch verändert, ist ein ausgezeichnetes Modell, um die Proteinsyntheseraten mit bildgebenden Verfahren zu überwachen. Hier führen wir eine Methode zur Messung der de novo Proteinsynthese in vivo durch Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleicharbeiten (FRAP) ein. Transgene Tiere, die fluoreszierende Proteine in bestimmten Zellen oder Geweben exzieren, werden durch eine leistungsstarke Lichtquelle bestrahlt, was zu Fluoreszenzphotobleichungen führt. Die Bewertung der Fluoreszenzrückgewinnung bedeutet wiederum eine neue Proteinsynthese in Zellen und/oder Geweben von Interesse. Daher kann die Kombination von transgenen Nematoden, genetischen und/oder pharmakologischen Interventionen zusammen mit live-imaging von Proteinsyntheseraten Licht auf Mechanismen werfen, die den altersabhängigen Proteostasekollaps vermitteln.
Introduction
Proteinsynthese und Abbau ist wichtig für die Muskelhomöostase. Eine Vielzahl altersbedingter Krankheiten wird durch fehlerhafte Proteinproduktion1,2angezettelt. Um die globalen Protein-Translationsraten zu messen, gibt es biochemische Techniken wie ribosomale simpering, die eine tiefe Sequenzierung von ribosomgeschützten mRNA-Fragmenten zur Überwachung der Expression sowie der neuartigen Proteinsynthese3beinhaltet. Diese Methode ist nicht nur eine indirekte Auslesung von Translationsraten, da eine erhöhte RNA-Assoziation zu Ribosomen nicht notwendigerweise eine erhöhte Translation bedeutet, technische Nachteile wie hohe Kosten und den Bedarf an einer großen Menge an Ausgangsmaterial. Andererseits ermöglichen Proteomik-basierte Methoden eine direkte Proteinquantifizierung durch pulsmetabolische Profilierung, gefolgt von der Massenspektrometrieanalyse4,5. Dies ist jedoch ein semi-quantitativer Ansatz mit begrenzter zeitlicher Auflösung, der nicht einfach in vivo verwendet werden kann. Darüber hinaus kann die Kennzeichnung des Proteins ungleich im Voninteresse habenden Tier/Gewebe verteilt werden. Wichtig ist, dass beide Methoden gewebespezifische bzw. zellspezifische Variationen der Protein-Translationsraten bei ganzen Tieren bzw. Geweben verbergen können.
Caenorhabditis elegans ist ein einfach zu bedienender Modellorganismus, der in großenZahlen6 angebaut werden kann. Darüber hinaus ermöglichen seine genetische Amenabilität und Transparenz eine Live-Bildgebung in vivo. Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zum Nachweis von Proteinsyntheseraten mittels Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleicharbeiten (FRAP). Wir nutzen die transgene Expression fluoreszierender Proteine, entweder im gesamten Organismus oder in bestimmten Geweben/Zellen. Transgene Tiere können entweder GFP mit dem Promotor eines Gens, das weit/global exprimiert ist, oder eines gewebespezifischen Promotors exprimieren, um bestimmte Zelltypen anzusprechen. Diese Technik kann auf einen bestimmten Promotor erweitert werden, um die Proteinsyntheseraten eines bestimmten Proteins zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Sowohl transkriptionale als auch translationale Fusionen zu Fluorophoren können verwendet werden, um die De-Novo-Proteintranslation in mehreren Geweben zu bewerten. Proteinsyntheseraten können für mehrere Proteinfamilien bewertet werden, die in verschiedenen Zellkompartimenten lokalisiert sind, einschließlich Zytoplasma, Mitochondrien und Kern7. Die folgenden Stämme werden verwendet, um globale und neuronale Proteinsyntheseraten zu überwachen, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. Wartung, Synchronisation und Herstellung von transgenen Nematoden zur Überwachung der de novo Proteinsynthese
- Verwenden Sie ein sezierendes Stereomikroskop, um die Entwicklungsstadien und das Wachstum von Wildtyp (Wt) und mutierten transgenen Nematoden zu bewerten.
- Tag 1: Verwenden Sie einen Wurmpick, um 10 L4-Larven von gewandunden und mutierten transgenen Tieren auszuwählen und zu übertragen, die den gewünschten fluoreszierenden Reporter auf Nematode Growth Media (NGM)-Platten tragen, die mit Escherichia coli (OP50) gesät sind (Tabelle 1).
- Machen Sie einen Wurm picken, indem Sie einen Platindraht an das verjüngte Ende einer glasigen Pasteurpipette befestigen, indem Sie das Glas an der Kontaktstelle auf einem Bunsenbrenner schmelzen. Anschließend wird das Ende des Platindrahtes mit einem beliebigen Werkzeug (z. B. Zange oder Leichter Hammer) in eine Spachtelform abgeflacht.
- Eine einzelne Kolonie von E. coli (OP50)-Bakterien in einen Kolben mit 50 ml flüssigem Medium Luria-Bertani (LB) zu impfen und 10 Stunden bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (200 U/min; Tabelle 1). Dann samen NGM-Platten mit 200 L Bakterienkultur. Inkubieren Sie die gesäten Platten bei Raumtemperatur über Nacht, um das Wachstum des bakteriellen Rasens zu ermöglichen.
- Die Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 °C inkubieren und anbauen.
- Tag 5: Die Platten enthalten eine gemischte Population von transgenen Würmern. Wählen und übertragen Sie 15 L4-Larven jeder Sorte auf frisch gesäte OP50-NGM-Platten.
- Tag 6: Führen Sie FRAP-Assay durch und überwachen Sie die Proteinsyntheserate am ersten Tag des Erwachsenenalters.
- Vorbereiten und verwenden Sie Cycloheximid, das NGM-Platten enthält, als Positivkontrolle:
HINWEIS: Bereiten Sie eine Stammlösung mit Cycloheximid vor, indem Sie in Wasser auf eine Konzentration von 10 mg/ml verdünnen. Lagerlösung bei 4 °C halten.- Töten Sie Bakterien, indem Sie die gesäten NGM-Platten 15 Minuten lang mit UV-Licht (222 W/cm2 Intensität) freisetzen.
- Fügen Sie Cycloheximid auf bakteriellen Platten auf 500 g/ml Endkonzentration im Agarvolumen hinzu.
- Teller 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.
- Transgene Nematoden, die psod-3GFP auf Fahrzeug- und Cycloheximid-haltigen Platten exdrücken, übertragen.
- Tiere 2 h bei der Standardtemperatur von 20 °C bebrüten.
2. FRAP-Test mit transgenen Tieren, die somatische Gewebereporter pife-2GFP und psod-3GFP exzessiieren
HINWEIS: Überwachen Sie die globale Proteinsyntheserate im gesamten Tierkörper. Diese Transkriptionsreporter präsentieren unterschiedliche Expressionsniveaus und werden allgegenwärtig in mehreren somatischen Geweben ausgedrückt, einschließlich Darm-, Rachen- und Körperwandmuskeln.
- Pflücken und übertragen Sie 1 Tage erwachsene transgene Tiere auf einzelne NGM-Platten, die mit einem 20-L-OP50-Tropfen in der Mitte gesät sind.
- Entfernen Sie den Deckel und legen Sie jede Platte unter eine 20-fache Objektivlinse eines Epifluoreszenzmikroskops.
- Fokussieren und erfassen Sie ein Referenzbild vor dem Photobleichen (Vorbleichen).
- Photoble jede Probe für 10 Minuten.
HINWEIS: Stoppen Sie die Photobleiche, wenn das fluoreszierende Signal auf 30 – 50% Intensität im Vergleich zum Vorbleichen abgeschreckt wird. Die Lichtintensität und die Dauer der Bleichzeit sollten entsprechend an das spezifische Fluorophor, das Tierstadium und die zu untersuchende Zelle oder das zu untersuchende Gewebe angepasst werden. Die angemessene Dauer der Bestrahlung, die erforderlich ist, um ein angemessenes Ausmaß der Photobleichung zu erreichen, sollte für verschiedene Proben experimentell bestimmt werden. - Erfassen Sie ein Bild nach dem Photobleichen (Bleaching).
- Halten Sie die Tiere in einzelnen NGM-Platten und lassen Sie sie sich erholen.
- Bild und aufzeichnung die Wiederherstellung jedes fluoreszierenden Reporters alle 1 Stunde für mindestens 6 Stunden an einem Fluoreszenz-Stereomikroskop.
- Alternativ können Sie eine fluoreszierende Rückgewinnungsbewertung mithilfe eines Epifluoreszenzmikroskops (z. B. AxioImager Z2) durchführen.
- Bewerten Sie sorgfältig die Tiergesundheit pro Tier, indem Sie ihre Fortbewegung, Berührungsempfindlichkeit, Fortpflanzungsfähigkeit und Überleben in den nächsten 3 Tagen überwachen. Nematoden, die Nach der Photobleiche Anzeichen von Schäden zeigten, wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
3. Montage der Proben und Durchführung von FRAP-Assay mit transgenen Nematoden, die panneuronal zytoplasmatisches GFP, punc-119GFP
HINWEIS: Überwachen Sie die panneuronale Proteinsynthese durch gezielte Photobleaching im Kopfbereich, in dem sich der Nervenring befindet.
- Bereiten Sie 2% Agarose-Pads vor.
- Fügen Sie in der Mitte des Agarose-Pads einen 10-L-Tropfen M9-Puffer hinzu.
- Transfer 5 transgene Nematoden, die panneuronal zytoplasmatisches GFP exdrücken, in einen Tropfen M9-Puffer.
- Verwenden Sie eine Wimper, um die Flüssigkeit zu verbreiten.
HINWEIS: Tiere zeigen reduzierte Bewegungen innerhalb von 2 Minuten aufgrund der M9-Absorption in den Agar an. - Ändern Sie die Nematodenposition, um Überlappungen zu vermeiden, indem Sie eine "Wimpern"-Auswahl verwenden.
- Platzieren Sie die Probe unter einer 40-fachen Objektivlinse eines Epifluoreszenzmikroskops.
HINWEIS: Verwenden Sie keinen Deckzettel. - Fokussieren und erfassen Sie ein Referenzbild (Vorbleichen).
- Photoble den Zielbereich von Interesse für 90 Sekunden.
HINWEIS: Stoppen Sie die Photobleiche, wenn das fluoreszierende Signal auf 30 – 50% Intensität im Vergleich zum Vorbleichen abgeschreckt wird. Die Lichtintensität und die Dauer der Bleichzeit sollten entsprechend an das spezifische Fluorophor, das Tierstadium und die zu untersuchende Zelle oder das zu untersuchende Gewebe angepasst werden. Die angemessene Dauer der Bestrahlung, die erforderlich ist, um ein angemessenes Ausmaß der Photobleichung zu erreichen, sollte für verschiedene Proben experimentell bestimmt werden. - Erfassen Sie ein Bild nach dem Photobleichen (Bleaching).
- Fügen Sie einen 10-L-Tropfen M9-Puffer auf photobleached Nematoden hinzu.
- Lassen Sie die Tiere für 5 Minuten erholen.
- Verwenden Sie die "Wimpern" Pick oder eine Pipette, um die Nematoden auf einzelne NGM-Platten mit 20 L OP50 Tropfen in der Mitte gesät zu übertragen.
- Erfassen Sie alle 1 Stunde ein Bild jeder Probe unter einem Epifluoreszenz-Stereomikroskop.
HINWEIS: Zählen Sie t=0 für die Erholungszeit nach dem Photobleichvorgang.
4. Datenanalyse der Bildaufnahme während des FRAP-Assays
- Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder mit Software (z. B. Fidschi).
- Öffnen Sie Bilder mit der Software.
- Wählen Sie den Befehl Kanäle teilen über das Dropdown-Menü Bild und Farbe aus.
HINWEIS: Behalten Sie das Grüne Kanalbild bei. - Verwenden Sie das Freehand Selection Tool, um den fluoreszierenden Bereich manuell einzustellen (z. B. Ganzkörper, Kopf, Darm).
- Wählen Sie den Befehl Messung über das Dropdown-Menü Analysieren aus, um die mittlere Pixelintensität des Interessenbereichs für jeden Zeitpunkt zu messen.
HINWEIS: Der Prozentsatz der Fluoreszenzwiederherstellung wird anhand der Referenzbilder berechnet, die nach dem Photobleichen aufgenommen wurden.
5. Statistische Auswertung melden
- Verwenden Sie mindestens 20 – 25 Nematoden jeder Sorte und/oder Bedingung.
HINWEIS: Es sollten drei biologische Repliken durchgeführt werden. - Führen Sie den Studenten-t-Test(Vergleich zwischen zwei Gruppen) oder ANOVA (Vergleich mehrerer Gruppen) für statistische Analysen mit P < 0,05 als signifikant mit statistischer Analysesoftware durch.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mit dem hier vorgestellten Verfahren wurden Wildtyp und mutierte transgene Nematoden, die die folgenden somatischen Reporter, pife-2GFP, psod-3GFP und punc-119GFP ausdrückten, zur Beurteilung der Proteinsyntheseraten nach den jeweiligen Protokollen verwendet. Insbesondere wildartige und ife-2-mutierte Würmer, die zytoplasmatisches GFP in ihrem gesamten somatischen Gewebe exzättierten, wurden mit dem ife-2-Promotor vor, unmittelbar nach der Photobleiche und 5 Stunden nach der Wiederherstellung verglichen. Repräsentative Bilder und Quantifizierung zeigen, dass sich Wildtiere vollständig erholen, während ife-2-Mutanten die Erholungskapazität verringert haben (Abbildung 1A). So initiieren Wild-Typ-Würmer de novo Proteinbiosynthese nach Photobleichung, während Würmer ohne mRNA-Translationinitiationsfaktor IFE-2 dazu nicht in der Lage sind, was darauf hindeutet, dass die Rate der Fluoreszenzrückgewinnung die Rate der Proteinsynthese in vivo7veranschaulicht. Darüber hinaus kann Cycloheximid, ein spezifischer Inhibitor der mRNA-Translation, als positive Kontrolle zur Proteintranslationsinhibition eingesetzt werden. Tatsächlich erholen cycloheximidbehandelte transgene Tiere, die unter dem Sod-3-Promotor zytoplasmatisches GFP exdrücken, ihre Fluoreszenz beim Photobleichen nicht wiederher (Abbildung 1B).
Wir haben diese Methode auch angewendet, um zu erkennen, wie mRNA-Verarbeitungskörper (P-Körper) die Rate der Proteintranslation beeinflussen8. Wilde Typ und edc-3 (ok1427) mutierte Nematoden, die GFP pan-neuronal exzessizieren, wurden auf ihre Erholungsfähigkeit bei gezielter Photobleichung im Kopfbereich untersucht. Fluoreszenzerholung ist viel langsamer bei EDC-3 Mangeltieren im Vergleich zu wildArt(Abbildung 1C). Dies deutet darauf hin, dass der EDC-3-vermittelte mRNA-Umsatz die neuartige Proteinsynthese behindert und letztlich die Proteintranslationsinitiierung unterdrückt9.
Abbildung 1: In-vivo-Bewertung der de novo-Proteinsynthese in C. elegans. (A) FRAP-Analyse sowohl bei Wildtyp als auch bei IFE-2-Mangelnematoden, die zytoplasmatisches GFP unter dem Promotor von ife-2exzessieren. Transgene Tiere werden einer ganztierischen Photobleichung unterzogen. Das GFP-Signal wird auf 30-50% der Anfangsintensität reduziert. Die Fluoreszenz wird vor der Photobleaching (Vorbleiche) nach dem Ende der Photobleichzeit (10 min; Bleichmittel) und 5 Stunden nach der Erholung aufgezeichnet. (B) Die Cycloheximid-Behandlung hemmt die Fluoreszenzrückgewinnung von transgenen Tieren, die zytoplasmatisches GFP unter dem Promotor von Sod-3exdrücken. Transgene Tiere werden einer vollwertigen Tierphotobleichung unterzogen. Das GFP-Signal wird auf 30-50% der Anfangsintensität reduziert. Fluoreszenz wird vor dem Photobleichmittel (Vorbleichen) nach dem Ende der Photobleichzeit (10 min; Bleichmittel) und 5 Stunden nach der Wiederherstellung (A, B: AxioImager Z2 Mikroskop; Objektivlinse: 20x, numerische Blende 0,8; Hochleistungslichtquelle, HBO 100; 100 Watt Lichtbogenlampe; Anregungs-/Emissionsfiltersätze, Zeiss Set 38 Edow GFP shift frei) aufgezeichnet. Schuppenstäbe, 500 m. (C) EDC-3-Mangelnematoden zeigen verringerte De-Novo-Proteinsyntheseraten in neuronalen Zellen. Fluoreszenzsignal sowohl von Wildtyp als auch von edc-3(ok1427) Tieren, die panneuronal zytoplasmatisches GFP exdrücken, wird vor der Photobleichung (Vorbleiche) sowie nach der Photobleichzeit (90sec; Bleichmittel) gemessen. Transgene Tiere werden im Kopfbereich (Nervenring) einer Photobleiche unterzogen. Das GFP-Signal wird auf 30-50% der Anfangsintensität reduziert (AxioImager Z2; Objektivlinse: 40x, numerische Blende 0,75; 30% Leuchtkraft der Leuchtstoff-Beleuchtungsquelle (FI-Beleuchtungssystem X-Cite 120 XL FL PC, 120W Metallhalogenidlampe) und vollständig geöffnete Iris). Die durchschnittliche Pixelintensität der Fluoreszenzwiederherstellung wird in Zeitintervallen von einer Stunde gemessen. In jedem der drei unabhängigen Experimente wurden 20 Tiere pro Stamm quantifiziert. Die Daten stehen für den Mittelwert S.E.M., ***P < 0,05, ungepaartert-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reagenz | Rezept | |
| 2% Agarose Pads | 1. Wiegen Sie 0,5 g o Fagrose in einem zylindrischen Glasbecher | |
| 2. 25 ml M9-Puffer hinzufügen | ||
| 3. Erhitzen Sie in einer Mikrowelle, bis sie kurz vor dem Kochen ist. Herausnehmen, mit einer Pipettenspitze rühren und wieder kochen. Wiederholen Sie dies, bis die Agarose aufgelöst ist. | ||
| 4. Legen Sie einen leeren Mikroskopschlitten auf die Bank. | ||
| 5. Legen Sie einen Tropfen (ca. 50 l) frischer 2% Agarose-Lösung in die Mitte des Schlittens. | ||
| 6. Nehmen Sie ein zweites Mikroskop-Dia und legen Sie es auf den Agarose-Tropfen. Drücken Sie vorsichtig nach unten, um den Tropfen abzuflachen. | ||
| 7. Lassen Sie die Agarose 30 Sekunden lang aushärten und entfernen Sie das obere Mikroskop vorsichtig. | ||
| 8. Gehen Sie sofort mit der Probenvorbereitung fort, da die Agarose-Pads innerhalb von ca. 5 Minuten zu trocknen beginnen. | ||
| Tipp: Lassen Sie das obere Mikroskopschlitten als Abdeckung, um die Feuchtigkeit länger zu erhalten (ca. 1 Stunde). So können mehrere Agarose-Pads während der Experimente schnell vorbereitet und eingesetzt werden. | ||
| LB flüssiges Medium | 1. 10 g Bactotryptone, 5 g Bacto-Hefe-Extrakt, 5 g NaCl in 1 L destilliertem Wasser und Autoklaven auflösen. | |
| M9-Puffer | 1. 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4und 5 g NaCl in 1 L destilliertem Wasser und Autoklaven auflösen. | |
| 2. Abkühlen lassen und 1 ml 1 M MgSO4 (steril) hinzufügen. | ||
| 3. M9-Puffer bei 4 °C aufbewahren. | ||
| Nematode Wachstumsmedium (NGM) Agarplatten | 1. 3 g NaCl, 2,5 g Bactopepton, 0,2 g Streptomycin, 17 g Agar mischen und 900 ml destilliertes Wasser hinzufügen. Autoklaven. | |
| 2. Auf 55-60 °C abkühlen lassen. | ||
| 3. Fügen Sie 1 ml Cholesterin-Stammlösung, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml Nystatin-Stammlösung, 25 ml sterilen 1 M Phosphatpuffer, pH 6,0 und destilliertes steriles Wasser bis 1 L hinzu. | ||
| 4. Pipette 10 ml Medium pro Petrischale und erstarren lassen. | ||
| 5. Bewahren Sie die Platten bei 4 °C auf, bis sie verwendet werden. | ||
Tabelle 1: Empfohlene Rezepturen für verwendete Reagenzien. Hier werden alle im vorgestellten Protokoll verwendeten Reagenzienrezepturen beschrieben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Proteinsynthesemodulation ist für die Muskelhomöostase unerlässlich. Während des Alterns wird die globale und spezifische Proteinsynthese gestört. Jüngste Studien zeigen, dass das Protein-Translation-Balance-Gleichgewicht die Seneszenz direkt steuert und das Altern nicht nur ein Nebenprodukt des Alterungsprozesses ist. Insbesondere Kernkomponenten der Übersetzungsmaschinerie wie der eukaryotische Initiationsfaktor 4E (eIF4E), der die mRNA-Kappung während der Translationsinitiierung und damit die Rate der cap-abhängigen Proteintranslation erleichtert, induziert oxidativen Stress und beschleunigt den Alterungsprozess1. Darüber hinaus beschleunigt neuronspezifisches EDC-3, das mit mRNA-Verarbeitungskörpern, P-Körpern interagiert und die Rate der mRNA-Deapping erhöht, auch den Alterungsprozess8. Insbesondere ermöglicht die EDC-3-Unterdrückung die IFE-2-Sequestrierung in P-Körper, wodurch letztlich der Proteintranslationsspiegel reduziert wird, was die neuronale Alterung9verzögert.
FRAP ist eine Technik, die ursprünglich entwickelt wurde, um Proteindynamik, Lokalisierung, Wechselwirkungen und Aktivität mit nicht-invasivem Fluoreszenz-Tagging mit Live-Bildgebung in vivo zu untersuchen, was es zu einem leistungsstarken Werkzeug macht, um Proteinsyntheseraten in Echtzeit8,10zu untersuchen. Es gibt jedoch einige wichtige Schritte, die Aufmerksamkeit und Fehlerbehebung erfordern. Wir bieten alternative Lösungen für diese potenziellen Hindernisse oder Einschränkungen, die während des experimentellen Verfahrens auftreten.
Ein Problem betrifft die Wurmbewegung, da der Wurm der Lichtquelle beim Photobleichen entweichen kann. Dieses Problem kann teilweise durch die Verwendung von transgenen Tier ausdrücken das Rol-6(su1006) Allel, das Tiere in einer sinusförmigen Weise bewegen bewirkt. Auf diese Weise kann die Photobleschung von Tieren kontinuierlich durchgeführt werden. Darüber hinaus kann der Experimentator der Bewegung des Wurms folgen, der sich außerhalb der Sichtebene viel langsamer bewegt. Dennoch können Agar-Pads auch als Alternative zur voll immobilisierenden Tiere verwendet werden.
Die optimale Dauer der Photobleaching ist ein zusätzlicher kritischer Faktor, der während der Experimente bestimmt und stabil gehalten werden sollte. Unzureichende Photobleichungen durch ungezielte Photobleichungen oder kurze Dauer können auftreten. Dies kann übertroffen werden, indem (a) das Vergrößerungsziel und die numerische Blende, (b) die Lichtintensität und/oder (c) die Photobleichdauer erhöht werden.
Wenn keine signifikante Fluoreszenzwiederherstellung erkannt wird, gibt es potenzielle Parameter, die geändert werden können. Wenn die Photobleiche übermäßig ist, reduzieren Sie die Photobleichdauer, wenn Probenschäden aufgetreten sind. Schäden am Wurm können durch die Beobachtung von Lebensmerkmalen wie Berührungsempfindlichkeit, Fortbewegung, Eiablage, Rachenpumpen und Fortpflanzungsfähigkeit beurteilt werden. Wenn die Kinetik der Proteintranslationserholung langsam ist, lassen Sie eine längere Erholungsphase zu. Die Proteinsynthese-Wiederherstellung variiert zwischen verschiedenen Proteinfamilien und hängt von der Reporterfusionslänge7ab.
Die Aktivität des Promotors könnte die Kinetik der Proteinsynthese beeinflussen. Wenn der Promotor während der Wiederherstellung inaktiv ist, ändern Sie den verwendeten Promotor. Die Aktivität des Veranstalters kann bei Stressbedingungen wie Fotoschäden geändert werden. Verwenden Sie stabile Aktivitätspromotoren, um entweder global (z. B. let-858, ife-2, sod-3) oder gewebespezifisch (z. B. Körperwandmuskeln; myo-3, unc-54; pharynx: myo-2; panneuronal: unc-119, rab-3; mechanosensorische Neuronen: mec-4; Darm: vha-6, ges-1) Protein-Translationsraten.
Wenn eine unzureichende Protein-Translationshemmung durch Cycloheximid auftritt, würde eine Erhöhung der Vorinkubationszeit der Nematoden dieses Problem überwinden. Ein Vorbehalt, der berücksichtigt werden sollte, ist die Verwendung von transgenen Würmern, die Proteine überexzättragen. Die Verwendung von CRISPR/Cas9-generierten transgenen Nematoden, die die fluoreszierenden markierten Proteine auf physiologischer Ebene ausdrücken, liefert ein genaueres Bild der Proteinkinetik und des Umsatzes.
Die gesamten nachgewiesenen Proteinwerte sind das Ergebnis ihres Proteinabbaus und ihrer Syntheseraten. Der Proteinabbau tritt ausnahmslos auf Basalebene in allen eukaryotischen Zellen auf. Daher sind die Proteinfluoreszenz-Rückgewinnungsraten, die in diesem Protokoll gemessen werden, nicht absolut, sondern relativ zu den verglichenen Bedingungen. Im Wesentlichen wird die Fluoreszenzerholung in Gegenwart von Proteinabbau gemessen. Daher wird angenommen, dass alle Bedingungen nach dem Photobleichen gleiche Proteinabbauraten aufweisen. Um die absoluten Proteinübersetzungsraten zu messen, sollten Proteinabbau-defizide mutierte Wurmstämme verwendet werden. Insbesondere können Mutationen in Genen wie rpn-10 des Proteasoms oder Lgg-2 für die Autophagie als Steuer verwendet werden11. Alternativ können RNAi-Knockdown von proteasomalen und autophagischen Proteinen durchgeführt werden. Zusätzlich können autophagische Substrate wie SQST-1::GFP verwendet werden, um den Beitrag des autophagischen Abbaus unter den experimentellen Bedingungen zu erkennen, die ausgewählt wurden12.
In beiden experimentellen Umgebungen ist diese FRAP-Technik nicht-radioaktiv, nicht-invasiv, die de novo Proteinsyntheseraten in vivo in verschiedenen Geweben in C. elegans de novo detektieren. Es ermöglicht live Bildgebung vor und während der Photobleaching in einer in vivo Einstellung und anschließende Überwachung der Tiere für ihre gesamte Lebensdauer. Die Störung der Translationsinitiierung verlangsamt die Alterung, wodurch die Messung der globalen Proteinsyntheseraten durch FRAP als direktes Auslesen des Alterungsprozesses verwendet werden könnte. Dieses Protokoll kann optimiert und in größerem Maßstab verwendet werden, um Gene und/oder Chemikalien im Zusammenhang mit dem Alterungsprozess oder altersbedingten Krankheiten zu untersuchen. Alternativ können die Gesamt- oder spezifischen Proteinabbauraten durch Photobleichen unter verschiedenen genetischen Hintergründen unter Verwendung desselben Protokolls in Kombination mit Cycloheximid gemessen werden. Da die Proteintranslation durch Cycloheximid gehemmt wird, wird die Rate des Proteinabbaus nachgewiesen. Dieses Protokoll wird dazu beideratochen, die Proteinabbaupfade in genetischen Modellen von Proteinaggregationskrankheiten besser zu verstehen13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Chaniotakis M. und Kounakis K. für die Videoaufnahme und -bearbeitung. K.P. wird durch ein Stipendium der Hellenischen Stiftung für Forschung und Innovation (HFRI) und des Generalsekretariats für Forschung und Technologie (GSRT) finanziert. N.T. wird durch Zuschüsse des Europäischen Forschungsrats (ERC – GA695190 – MANNA), der Rahmenprogramme der Europäischen Kommission und des griechischen Bildungsministeriums finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N.
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
