Summary
高解像度のマイクロコンピュータ断層撮影を用いて、宇宙飛行が眼構造に損傷を与えたかどうかを判断するプロトコルを提示する。プロトコルは、 エキビボ げっ歯類の眼構造のマイクロCT由来測定を示す。我々は、非破壊三次元技術を用いて、宇宙飛行後の眼の形態変化を評価して眼の損傷を評価する能力を実証する。
Abstract
報告によると、宇宙飛行環境への長時間の暴露は、国際宇宙ステーション(ISS)ミッション中および国際宇宙ステーション(ISS)ミッション後に宇宙飛行士の形態学的および機能的な眼科学の変化を生み出すことを示している。しかし、これらの宇宙飛行による変化の根本的なメカニズムは現在知られていない。本研究の目的は、マウス網膜の厚さ、網膜色素上皮(RPE)、脈絡膜及びスクレラ層のマイクロCTイメージングを用いて、眼構造に対する宇宙飛行環境の影響を判定することであった。10週齢のC57BL/6雄のマウスは、35日間のミッションのためにISSに収容され、その後、組織分析のために生きて地球に戻りました。比較のために、地球上の地上管制(GC)マウスは、同じ環境条件とハードウェアで維持された。眼組織サンプルは、スプラッシュダウン後38(±4)時間以内にマイクロCT分析のために採取した。この固定眼のレチナの断面、RPE、脈絡膜、および膜膜層の画像を、マイクロCT撮像取得法を用いて軸方向および矢状のビューに記録した。マイクロCT分析では、GCと比較して、宇宙飛行サンプルで、レティナ、RPE、および脈絡膜層の厚さの断面領域が変化し、スペースフライトサンプルはコントロールと比較して有意に薄い断面および層を示すことを示した。この研究結果から、マイクロCT評価は、眼構造の変化を特徴付ける感受性と信頼性の高い方法であることを示している。これらの結果は、地球の眼構造に対する環境ストレスの影響についての理解を深めることが期待されます。
Introduction
宇宙飛行の微小重力環境では、流体シフトによる頭蓋内圧(ICP)の上昇が、宇宙飛行関連神経眼症候群(SANS)1、2、3、4、5に寄与している可能性がある。1,2,3,4,5実際、宇宙飛行士の40%以上が、NASAツインズ研究7の宇宙飛行対象を含む国際宇宙ステーション(ISS)ミッション6の間および後にSANSを経験しています。SANSの現在の病態生理学には、視神経腫、地球平坦化、脈絡膜および網膜の折り目、過敏性屈折不変、および神経線維層梗塞(すなわち、綿毛の斑点)などの生理学的変化が含まれ、5,88を十分に文書化されている。しかし、被害の発生に寄与する変化や要因の根本的なメカニズムは不明である。SANSをよりよく理解するために、動物モデルは、宇宙飛行に関連する陰部の構造と機能の変化を特徴付けるために利用可能です。
同じ動物に関する以前の調査では、マウスの残り線に35日間の宇宙飛行の影響を報告しました。この結果は、宇宙飛行が眼管炎および眼血管系に重大な損傷を引き起こすということを解明し、細胞死、炎症および代謝ストレスに関連するいくつかのタンパク質/経路が宇宙飛行9の後に有意に変化した。
現在、疾患の発症や進行を監視するために確立された様々な非侵襲的なイメージング技術と、小さなげっ歯類モデルにも広く使用されている様々な環境ストレッサーに対する生理学的応答があります。これらの技術の一つは、解剖学的構造および病理学的プロセスを評価するマイクロCTであり、マウス10と同じくらい小さい生物にうまく使用されている。
マイクロCTは、マイクロサイズの解像度を達成することができ、適切な造影剤,10、11、12、13、14を10,11添加して軟組織の容積分析に高コントラストを提供することができる。,12,1314マイクロCT技術は、検体の幾何学的なプロファイルへの物理的損傷を最小限に抑え、構造間の空間的関係を変化させないため、グロス解剖学、光顕微鏡、組織学検査などの従来の方法に比べて有利である。また、構造の3次元(3D)モデルは、マイクロCT画像12、14,14から再構築することができる。現在までに、宇宙環境への暴露後の視力障害を示す証拠にもかかわらず、動物モデルのデータはほとんどなく、宇宙飛行に関連するレチンの構造と機能の変化をよりよく理解することができます。現在の研究では、マウスをISSに乗せて35日間のミッションで飛行し、マイクロCTを使用してレチナ、RPE、および脈絡膜層の微細構造を定量化することによって、宇宙飛行環境が眼組織構造に及ぼす影響を決定した。
Protocol
この研究は、国立衛生研究所(NIH)の実験動物のケアと使用に関するガイドで概説されている勧告に従い、ロマリンダ大学(LLU)と米国航空宇宙局(NASA)の機関動物ケアと使用委員会(IACUC)の両方によって承認されました。この飛行実験に関するより詳細な情報は、9、15,の他の場所で見つけることができます。
1. 飛行および制御条件
注:NASAの9番目のげっ歯類研究実験(RR-9)のために10週齢の雄C57BL/6マウス(n = 20)を含む35日間のミッションで、ケネディ宇宙センター(KSC)でSpaceXによって12番目の商業補給サービス(CRS-12)ペイロードが打ち上げられました。
- SpaceXのドラゴンカプセルを介して地球に戻る前に、マウスはNASAのげっ歯類生息地(RH)に35日間、飛行中に12時間の明暗サイクルで26〜28°Cの周囲温度でISSに乗って住んでいます。
- 地上制御 (GC) マウスを飛行に使用される同じハウジング ハードウェアに配置し、テレメトリ データに基づいて温度や二酸化炭素 (CO2)などの環境パラメータを可能な限り近づけます。
- GCマウスに宇宙ベースの食べ物と同じNASAフードバーダイエットをフィードします。宇宙飛行マウスとGCマウスの両方に、水と食べ物への同じアドリビタムアクセスを提供します。
2. マウスの飛行後評価
- 地球上のスプラッシュダウンから28時間以内に、マウスをロマリンダ大学(LLU)に輸送します。そこに、動物の囲いのハードウェアからマウスを取り除き、生存と健康を評価する。
注:観察の結果、検査員は、すべてのマウスが35日間の宇宙ミッションを生き延び、良好な状態、すなわち顕著な欠陥/異常がないと報告しました。
3. 宇宙飛行後のマウス目の解剖と保存
- スプラッシュダウン(n=20/群)の38(±4)時間以内に、マウスを100%CO2で安2楽死させ、目を集める。
- 右眼のレチナを解剖し、滅菌性の凍結で個別に配置し、液体窒素でスナップ凍結し、使用前に−80°Cに保ちます。
- リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で左目全体を4%パラホルムアルデヒドで24時間固定し、マイクロCTアッセイの場合はリン酸緩衝生理食塩分(PBS)ですすいだ。
4. マイクロCTスキャンのサンプル調製
- 固定後、マウスの目をエタノールで脱水する。固定サンプルのさらにまたは突然の収縮をすべて森林化するには、1時間の50%エタノールから始まり、エタノール溶液の濃度をそれぞれ1時間ずつ増加させる:70、80、90、96および100%のエタノール溶液の段階的なシリーズを使用する。
注:マウスの目はフードチャンバーで取り扱う必要があります。 - ホスホリブジン酸(PMA)染色
注意:PMAが腐食性、発がん性、臓器に有毒であるため、煙フードの使用を含む適切な保護用の個人用機器が必要です。- 染色液を調製:100mLの絶対エタノールで10mgのPMAを調製する。
- マウスの目(10重量%ホスホリブチン酸-PMAは絶対エタノールに溶解)を6日間染色する。
- スキャンする前に、まず絶対エタノールで目のサンプルを洗浄し、次に100%の絶対エタノールで満たされた個々の2 mLプラスチック容器に各目を置きます。スキャン中に安定したサンプルに綿パッドを追加します。
5. マイクロCTスキャンおよび分析
注:SkyScan 1272スキャナ、デスクトップX線マイクロCTシステムは、マウスの目の残性損傷の評価に使用されました
- 柔らかい組織サンプルを適切なサンプルホルダーに取り付けます。X線CT測定中の動きを防ぐには、サンプルのホルダーにしっかりとフィットしていることを確認します(図1)。
- 各サンプルの細心の注意を払って配置した場合、X線でサンプルを個別にスキャンします。
- ソフトウェアを開いた後、サンプルをフレームの中央に配置します。プロトコルでは、フィルタを使用しないし、4 μmでピクセルを増加するマトリックスを設定します。マイクロポジショニングを使用して、サンプルの中心をフレームの中央に保ちます。
- その後、パラメータをチェックして、造影剤を最大化します。キャリブレーションを実行するには、サンプルを取り出し、フラットフィールド補正が80%を超えているか確認します。
- キャリブレーション後、サンプルをスキャンチャンバーに再挿入します。スキャンの場合は、回転ステップ0.400、フレーム平均4、ランダムな動き30を使用し、サンプルを180°回転します。
- 測定を繰り返す場合は、測位ジグを使用します。述べたように、位相コントラストの強化により、50keVで密閉されたマイクロフォーカスX線管(タングステン陽極)で生成されたX線から4μm程度の物体の詳細を検出し、積分時間は90分で80mAとすることができる。
注: このセクションで、最高の画質で概要 CT スキャンを生成するための取得パラメータを選択します。 - スキャン後、ソフトウェア(NReconなど)を使用してデータを再構築します。
- ヒストグラムを調整し、すべてのサンプルに同じ範囲(0 ~ 0.24)を使用します。対象領域の再構築は円であり、縮尺やラベルは使用されませんでした。
- スキャン中のアーチファクトを低減するには、ビーム硬化補正20、平滑化補正1、リングアーチファクトリダクション6、ミスアライメント補正の変更を行いません。再構成後、試料が対象領域内にあることが確認された。
- 眼の視神経とレンズに平行な平面を使用して画像を再配置します。
- スキャン後、ソフトウェア(DataViewerなど)を使用して、3つのビューすべてで再構築された画像を視覚化します。
注:このソフトウェアを使用すると、画像は、標準化された分析を実行するために、視神経と眼のレンズに平行な平面を使用して再配置することができます。 - 記述分析
- ソフトウェアの測定ツール(例えば、CTAn)を使用して構造を測定します。分析対象領域を区切るために、光神経を使用します。計算により、プロトコルは中央スライスを使用して測定を実行しました。この評価は記述分析(図2 および 図3)によって行われた。
- 網膜、網膜色素上皮(RPE)、脈絡膜、およびsclera層の測定を矢状体(図2)および軸方向図(図3)で行う。平均を計算するために、各構造の3つの測定値を取ります。
Representative Results
上記のプロトコルに従った後のマイクロCTスキャンを用いて、レチナ、RPE、脈絡膜、および皮膜層の平均厚さを記録した(図1)。この技術は、3つの異なる見解で目の多平面的な再建を示した。解析中、観測者はサンプル全体をスクロールして、サンプルの真ん中で分析を標準化することができました。
マイクロCT分析では、矢状および軸方向の図(図2および図3)で目の断面領域が示され、線形測定を行った。RPEおよび脈絡膜層は、GC群と比較した場合、宇宙飛行群において有意または低い傾向であった(図3)。
図1:軟部組織のマイクロCT手順。(A) 軟部組織サンプル(マウスアイ)。(B)試料をリン酸緩衝液(PBS)中の4%ホルムアルデヒドに固定した。固定後、マウスの目をエタノールで脱水した。固定試料のさらなる急激な収縮を防ぐために、1時間の50%エタノールと以下のエタノール溶液をそれぞれ1時間用いて、エタノール溶液の等級シリーズを使用した:70、80、90、96および100%。(C)マウスの目をホスホニル化酸(PMA)で6日間染色し、絶対エタノールで洗浄し、次いで、絶対エタノールで満たされた個々の2mLプラスチック容器に入れた。(D) マウスの眼の眼の腎障害を評価するために、デスクトップX線マイクロCTシステムスキャナを用いた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:地上コントロールマウスの矢状図。画像の右側の目の層は、上から下へ、網膜(0.077 mm)、網膜顔料層(RPE、0.038 mm)、脈絡膜(0.041mm)、スクレラ(0.059 mm)にアノート化されます。この図は、オーバービーら15から取られた. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:地上コントロールマウスの軸図。画像の右側の目の層は、上から下へ、網膜(0.144 mm)、網膜顔料層(RPE、0.051 mm)、脈絡膜(0.041mm)、スクレラ(0.073 mm)にアノート化されます。この図は、オーバービーら15から取られた. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:宇宙飛行群及び制御群における微量CTで測定した、レチナル層、RPE層、および脈絡膜層の平均厚さ。グループあたり5つのレティナにわたって数が平均された。値は、標準誤差(SEM)±平均厚みとして表されました。平均の SEM は誤差範囲でマークされます。地上管(GC)群と比較して、宇宙飛行(FLT)群における断面厚さが有意に低い「*」と表記されている(p< 0.05)。この図は、オーバービーら15から取られた. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
この研究の結果は、GC群、特に眼のレチナ、RPE、および眼の脈絡膜層と比較した場合、その厚さの減少によって証明されるように、マイクロCT技術を用いた宇宙飛行マウスアイの構造変化があったことを示した。マイクロCTは、操作を必要とせずに変更を特徴付けるための効率的で非破壊的な技術を提供します。PMA染色の使用は、再構成後に明確な3D断層画像を得るためにマイクロCT画像の品質を高め、物理的に標本の構造を変更する必要がある。これらの画像の追加の利点は、関心のある領域全体をデジタルで表示し、それによってアクセシビリティと発見の再現性を高めることです。この研究の間に作られたマイクロCT画像を通して、標的検体は各層の厚さの決定のために、レチナ、RPE、脈絡膜、および皮膜層のような複数の構造の分化を示した。
プロトコル内の重要なステップは、サイズとテクスチャに起因するサンプルの操作です。試料の取り扱いは、調製時に試料に圧力をかけることなく慎重に行う必要があります。マイクロCTには、解像度とパラメータの標準化された値の欠如といういくつかの制限があります。スキャン中、マイクロCTスキャナは多様な画像処理アルゴリズムを持つ場合があります。しかし、グレースケールの校正は、問題を克服するために追求されるかもしれません。スキャン後、画像の再構築は、組織と実行される分析に基づく必要があります。画像の品質は、断層図法、設定、試料サイズ、および調製方法16、17に依存するので、17それは重要であり得る。
いくつかのタイプの正常および病理学的組織の研究における応用に成功するため、マイクロCTイメージング機能は、他の分析のための容積データをコンパイルするために将来の研究で使用されるべきである。したがって、本研究の目的に基づいて、二次元測定を使用することは許容されたが、総3D構造のセグメンテーションは、検体全体の正確な輪郭を提供することも有益であり得る。非破壊的な技術のすべての利点を持っていても、マイクロCTは免疫検査などの他の方法を置き換えるものではなく、必要に応じてその後の構造学分析を補完し、可能にします。
長期の宇宙飛行状態は、SANSとして定義された宇宙ミッション中および後に宇宙飛行士に一連の構造的および機能的な眼の変化を生み出す。調査結果には、高眼圧シフト、地球平坦化、脈絡膜/レチナルフォールド、コットンウールスポット19が含まれる。宇宙飛行士の光コテレンス断層撮影(OCT)の点では、神経線維層の肥厚の発見とは対照的に、この動物のマイクロ-CT研究では、レチナおよび脈絡膜層の薄化が明らかになった。これらの結果は予想外でした。この不一致は、交じわの要因が原因である可能性があります。マウスはヒトに比べてセファラード液シフトが限られている。この流体シフトの欠如は、重力の変化に対する異なる応答を呼び起こした可能性があります。第二に、マウスは、スプラッシュダウン後38時間以内に解剖され、再適応のための急性応答はまた、レチナおよび脈絡膜の形態学的変化に寄与する可能性がある。この可能性の確認は、宇宙飛行中およびミッション後の長期にわたるさらなる測定を必要とする。
この研究の結果は、宇宙飛行条件、特に重力の変化が、眼の急性および短期的な応答を誘発する可能性があることを示している。眼の眼の急性変化が、眼の機能と宇宙飛行による構造変化のメカニズムに及ぼす影響を調べるには、さらなる調査が必要である。
Disclosures
すべての著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、NASA宇宙生物学助成金#NNX15AB41GおよびLLU基礎科学科によって支えられた。チェ・ソンシン、デニス・リーブソン、レベッカ・クロッツは、宇宙飛行研究の成功に大きく貢献し、彼らの支援に大いに感謝しています。著者らはまた、NASAバイオ標本共有プログラムグループ全体の大きな支援に感謝したいと考えています。
また、マイクロCTサービス歯科研究センターにも感謝したいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
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