Summary
Syftet med denna teknik är ex vivo visualisering av pulmonell arteriell nätverk av tidiga postnatala och vuxna möss genom lunginflation och injektion av en radio-ogenomskinlig polymer-baserad förening via pulmonell gatan. Potentiella tillämpningar för gjutna vävnader diskuteras också.
Abstract
Blodkärl bildar intrikata nätverk i 3-dimensionell rymd. Följaktligen är det svårt att visuellt uppskatta hur vaskulära nätverk interagerar och beter sig genom att observera ytan av en vävnad. Denna metod ger ett medel för att visualisera den komplexa 3-dimensionella vaskulära arkitekturen i lungan.
För att åstadkomma detta sätts en kateter in i lungartären och vasculaturen spolas samtidigt av blod och kemiskt vidgade för att begränsa resistensen. Lungor sedan blåses upp genom luftstrupen vid ett standardtryck och polymerföreningen infunderas i kärlbädden vid en standardflöde. När hela artärnätet är fyllt och tillåtet att bota, kan lungvasculature visualiseras direkt eller avbildas på en mikro-CT (μCT) scanner.
När den utförs framgångsrikt, kan man uppskatta pulmonell arteriellt nätverk i möss som sträcker sig från tidiga postnatala åldrar till vuxna. Dessutom, medan visat i pulmonal arteriell säng, denna metod kan tillämpas på alla vaskulär säng med optimerad kateter placering och endpoints.
Introduction
Fokus för denna teknik är visualiseringen av pulmonell arteriell arkitektur med hjälp av en polymerbaserad förening hos möss. Medan omfattande arbete har utförts på systemiska vaskulära sängar såsom hjärna, hjärta, ochnjure 1,2,3,4,5, mindre information finns när det gäller framställning och fyllning av pulmonal arteriellt nätverk. Syftet med denna studie är därför att expandera på tidigare arbete6,7,8 och ge en detaljerad skriftlig och visuell referens som utredarna lätt kan följa för att producera högupplösta bilder av pulmonell arteriell träd.
Medan många metoder finns för märkning och bildframställning lungvaskulatur, såsom magnetisk resonanstomografi, ekokardiografi, eller CT-angiografi9,10, många av dessa modaliteter misslyckas med att tillräckligt fylla och / eller fånga de små fartyg, begränsa omfattningen av vad som kan studeras. Metoder som seriell snittning och rekonstruktion ger hög upplösning men är tid/arbetsintensiva11,12,13. Omgivande mjukvävnad integritet äventyras i traditionell korrosiongjutning 10,13,14,15,16. Även djur ålder och storlek blir faktorer vid försök att införa en kateter eller, upplösningen saknas. Polymerinjektionstekniken fyller å andra sidan artärerna till kapillärnivån och när den kombineras med μCT möjliggör oöverträffad upplösning5. Prover från muslungor så unga som postnatal dag 14 har framgångsrikt kastat8 och bearbetats på några timmar. Dessa kan omskannas på obestämd tid, eller till och med skickas för histologisk preparation/elektronmikroskopi (EM) utan att den befintliga mjukvävnaden17 - komprometterar. De viktigaste begränsningarna för denna metod är initialkostnaden för CT-utrustning/programvara, utmaningar med exakt övervakning av intravaskulärt tryck, och oförmågan att förvärva data i längsled hos samma djur.
Detta papper bygger på befintliga arbetet för att ytterligare optimera pulmonal artär injektion teknik och push ålder / storlek relaterade gränser ner till postnatala dag 1 (P1) att ge slående resultat. Det är mest användbart för lag som vill studera arteriella vaskulära nätverk. I enlighet med detta ger vi ny vägledning för kateterplacering/stabilisering, ökad kontroll över fyllnadsgrad/volym och lyfter fram anmärkningsvärda fallgropar för ökad gjutningsframgång. Resulterande kastar kan sedan användas för framtida karakterisering och morphologic analys. Kanske ännu viktigare, detta är den första visuella demonstrationen, till vår kunskap, som går användaren genom denna intrikata förfarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av anstaltsvårds- och användningskommittén (ACUC) vid National Heart Lung and Blood Institute.
1. Förberedelse
- Injicera musen intraperitoneally med heparin (1 enhet / g mus kroppsvikt) och låt den ambulate i 2 min.
- Avliva djuret i en CO2 kammare.
- Ordna musen i en rygg position på en kirurgisk styrelse och säkra alla fyra lemmar till styrelsen med tejp. Använd förstoring för fin dissektion.
2. Exponera lungor och luftstrupe
- Spraya den ventrala sidan av musen med 70% etanol för att minimera hårstörningar.
- Ta tag i bukhuden med tärna och gör ett litet snitt med sax i navelregionen. Skjut in saxspetsarna i det fassiella lagret mellan bukmuskulaturen och huden och börja separera de två skikten. Arbeta rostrally, ta bort huden från buken, bröstkorg, och hals.
- Öppna bukmuskulaturen med sax och skär i laterled på båda sidor tills membranet exponeras.
- Ta försiktigt tag i xiphoidprocessen och lyft lätt bröstkorgen och maximera synen på de caudala lungorna genom det tunna, halvtransparenta membranet. Gör försiktigt ett litet snitt i membranet precis under xiphoidprocessen. Lungorna kommer att kollapsa och dra sig tillbaka från membranet. Dissekera membranet bort från bröstkorgen, var noga med att inte nicka lungparenkymet.
- Lokalisera och bryta den underlägsna vena cava (IVC) och matstrupen där de passerar genom membranet. Använd gasväv för att rensa upp eventuella pooling blod i brösthålan, undvika kontakt med lungorna.
- Fatta xiphoid en gång och lyft försiktigt. Skär bröstkorgen bilateralt (ungefär vid midaxillary linjen) undvika kontakt med lungorna. Ta bort den främre bröstkorgen helt, vilket gör det slutliga snittet längs sternalvinkeln strax före manubrium.
- Med hjälp av en förfylld spruta, fukta frikostigt lungorna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7.4) för att förhindra uttorkning. Fortsätt denna rutin under hela proceduren.
- Med hjälp av tlys, greppa manubrium och försiktigt höja bort från kroppen. Använd sax, skär 1-2 mm lateralt till manubrium, bryta nyckelben, och ta bort. Detta kommer att exponera brässet under.
- Ta tag i varje lob av brässen, dra isär och ta bort. Upprepa detta förfarande med submandibular körtel. Slutligen, ta bort den muskulösa vävnaden överliggande luftstrupen.
OBS: Efter dissektionen ska hjärtat, stigande aorta (AA), lungartärstammen (PAT) och luftstrupen vara synliga. Se till att de primära arteriella grenarna utanför stammen inte är uppdelade eller skadade.
3. PA kateterisering och blodperfusion
- För att montera Enhet 1, trä 15 cm PE-10 slangar på navet på en 30 G nål och fäst på en 1 mL spruta förfylld med 10-4 M natriumnitrrossid (SNP) i PBS. Prime slangen genom att föra kolven tills all luft rensas från denna enhet ( Bild 1).
FÖRSIKTIGHET: SNP är giftigt vid förtäring. Undvik kontakt med hud och ögon. Tvätta huden noggrant efter hantering. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.- Alternativt monterar du Enhet 2. För möss postnatal dag 7 (P7) och yngre, använd en hemostat för att lossa ytterligare 30 G nål från sitt nav och trä nålen på den öppna änden av slangen i Enhet 1 (Bild 1).
- Istället för en nål, använd böjda skarpa ttråd för att förstå ena änden av en 10 cm längd av 7-0 silke. Penetrera spetsen av hjärtat in från ena sidan och passerar spetsarna av tärnarna genom muskeln och ut ur den andra sidan. Ta tag i silket med en annan uppsättning av tlystningar och dra ungefär en 2 cm längd genom och binda av. Ta resterande 8 cm slutet av suturen, rycka hjärtat caudally, och tejpa slutet till kirurgiska styrelsen.
OBS: Detta kommer att skapa spänningar, ytterligare utsätta de stora fartyg och tjudra hjärtat på plats, vilket möjliggör enklare placering av katetern i lungartären. - Haka spetsarna på böjda tämpningar under både AA och PAT. Dra en 3 cm längd på 7-0 silke tillbaka genom öppningen och skapa en enda kasta lös sutur.
- Använda sax göra en 1-2 mm snitt mot spetsen av hjärtat, genomträngande tunnväggiga högra ventrikeln (RV), för att möjliggöra införandet av katetern (Enhet 1). Före infogningen, bekräfta att det inte finns någon luft i systemet. För in den primade slangen i den högra ventrikeln och försiktigt förväg i semitransparent tunnväggiga PAT.
- Visuellt verifiera att katetern inte har avancerat in i vare sig vänster eller höger pulmonell grenar och inte gränsar pulmonal artär branchpoint. Med hjälp av tejp, säkra den distala delen av slangen till den kirurgiska styrelsen.
OBS: För att identifiera RV: använd forceps för att nypa höger sida av hjärtat. Till skillnad från den vänstra ventrikeln bör den relativt tunna fria väggen på RV lätt fattas. - För möss yngre än P7 fäster du Enhet 2 på en mikromanipulator och introducerar nåländen av enheten i PAT enligt ovan med hjälp av manipulatorn.
- Visuellt verifiera att katetern inte har avancerat in i vare sig vänster eller höger pulmonell grenar och inte gränsar pulmonal artär branchpoint. Med hjälp av tejp, säkra den distala delen av slangen till den kirurgiska styrelsen.
- Dra försiktigt åt den lösa suturen runt båda stora kärlen och kapa suturens 8 cm längd som skapats i steg 3.2 för att återföra hjärtat till en naturlig viloposition. Katetern är nu ordentligt säkrad inom PAT.
- Klipp vänster auricle av hjärtat så att perfusate att avsluta systemet.
- Säkra SNP-innehållande spruta (Enhet 1 eller Enhet 2, storleksberoende) i sprutpumpen och nafsa lösningen med en hastighet av 0,05 mL/min för att spola blodet och maximalt vidgas vasculaturen. Blod/perfusate kommer att gå ut via den klippta auricle. Fortsätt perfusion tills perfusate körs klart (~ 200 μL i en vuxen mus, mindre för yngre djur).
OBS: När man perfusade den låga viskositeten PBS/SNP användes en relativt högre infusionshastighet i intresset att spara tid. Ju mer trögflytande polymer förening infunderas i en långsammare takt för att förhindra överfyllning, bristning, och maximera kontrollen över distala ändpunkter.
4. Trakeostomi och lunginflation
- Konstruera lunginflationsenheten (Figur 2).
- Anslut en flexibel plast 24 G intravenös (IV) kateter (nål bort)/butterfly infusion set till en stopcock, fäst på en öppen 50 mL spruta (ingen kolv). Häng sprutan från ett ringställ.
- Tillsätt 10% buffrad formalin i sprutan. Öppna stopcock, så att formalin att komma in i slangar och rensa all luft från systemet. Stäng stopcock och höj sprutan tills menisken är 20 cm ovanför luftstrupen8.
VARNING: Formalin är brandfarligt, cancerframkallande, akut giftigt vid förtäring, och orsakar hudirritation, allvarliga ögonskador, hudsensibilisering, och könscellsmutsagenitet. Undvik intag och kontakt med hud och ögon. Undvik inandning av ångan eller dimman. Förvaras på avstånd från antändningskällor. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
- Placera två lösa suturer som är underlägsna det cricoid brosk 2-4 mm ifrån varandra.
- Använda sax, gör ett litet snitt i cricothyroid ligament överlägsen suturer.
- För in IV-katetern i öppningen och för fram spetsen bortom de två lösa suturerna.
- Dra åt suturerna runt luftstrupen och öppna stopcock. Låt formalin att komma in i lungorna av gravitationen och vänta på 5 min för lungorna att helt blåsa. Om lungorna följer bröstkorgen under inflationen, ta tag i utsidan av bröstkorgen med trubbiga spetstippar och rör sig i alla riktningar för att hjälpa till att frigöra lober. Ta inte direkt kontakt med lungor.
- Efter 5 min, backa IV-katetern bortom den första suturen och ligate. Upprepa för den andra suturen. Lungorna är nu uppblåsta i ett slutet, trycksatt tillstånd.
5. Gjutning av vasculature
- I ett 1,5 mL rör, förbereda 1 mL av en 8:1:1 lösning8 av polymer:diluent:härdningsmedel och försiktigt invertera flera gånger för att säkerställa god blandning.
- Ta bort kolven från en 1 cc spruta, täck den motsatta änden med ett handskar finger, och häll polymeren förening i sprutan. Sätt försiktigt in kolven, invert, och för fram kolven för att ta bort all luft och bilda en menisk vid spetsen av sprutan.
- Ta bort SNP/PBS-sprutan från nålens nav och droppa ytterligare PBS i navet för att skapa en menisk. Kontrollera noggrant navet för instängd luft, rubba vid behov och reformera menisken. Gå med i navet till sprutan fylld med polymerföreningen.
OBS: Att skapa en menisk i båda ändar minskar avsevärt chansen för luft att komma in i systemet. - Fäst polymeren sammansatta fyllda sprutan till sprutan pumpen och infusera på 0,02 mL/min.
OBS: För mindre lungor, en långsammare takt kan vara till hjälp för att förhindra överfyllning men, är inte nödvändigt. - Övervaka föreningen eftersom den fritt rör sig ner för PE-slangen och notera sprutans volym när den kommer in i PAT. Fortsätt fyllas tills alla lober är helt fyllda ner till kapillärnivån och stoppa sprutpumpen. Kontrollera sprutans volym igen.
OBS: Efter flera körningar kan en uppskattad volym användas för att mäta en ungefärlig endpoint (~35 μL för en vuxen mus och ~5 μL för en P1-valp). Efter pumpen stoppas, kommer det kvarvarande trycket i systemet fortsätter att driva polymerföreningen i lungartärerna. Alla lunglober ska fyllas i liknande takt. - Täck lungorna med en fiberoptisk rengöring torka, frikostigt tillämpa PBS, och låt stommen att sitta ostört i 30-40 min vid rumstemperatur. Under denna period kommer polymerföreningen att bota och härda.
- Ta bort katetern, bryta armarna/nedre halvan av musen, och placera huvud/bröstkorgen i en 50 mL konisk fylld med 10% buffrad formalin över natten.
- Efter fixering, fatta luftstrupen och försiktigt separera hjärt/lungenheten från den återstående bröstkorgen och bröstkorgen. Placera hjärtat/lungblocket i en formalinfylld scintillationsflaska. Kassera resten.
6. Alternativa kärlsängar för gjutning (Tabell 1)
OBS: Varje mål kärlbädd kan kräva olika kateter placeringar, infusionshastighet, och optimala fyllningstider. Således kommer flera djur vara nödvändigt att kasta flera organ.
- För systemiska vaskulära sängar överlägsen eller sämre än membranet följa steg 1,1-2,5 enligt ovan. Se ytterligare anmärkningar om portalsystemet och membran (tabell 1).
- Ta tag i xiphoid processen med en hemostat och skär bröstkorgen bilateralt (ungefär i midaxillary linje) strax före den inre bröst artärer.
- Vik den fortfarande anslutna bröstkorgen över sådan att den vilar på djurets hals/huvud, helt utsätta brösthålan.
- Följ steg 3.1 ovan, ta sedan bort lungorna. När bröstaortan (TA) är synlig, haka spetsarna på böjda tlyck under den, ~ 10 mm överlägsen membranet. Ta tag i en 3 cm längd på 7-0 siden, dra tillbaka genom öppningen under TA, och skapa en enda kasta lös sutur. Upprepa denna procedur ~8 mm ovanför membranet.
- För strukturer som är överlägsna membranet, använd vårsax för att skapa ett litet hål (~30% av den totala omkretsen) på den ventrala delen av TA, ~ 2 mm sämre än de lösa suturer som placeras i steg 6,4.
- För strukturer sämre än membranet, istället skapa ett litet hål ~ 2 mm överlägsen de lösa suturer.
- Beroende på djurens storlek, införa enhet 1 eller 2 i kärlet, förväg bortom lösa suturer, och försiktigt ligate kärlet.
- Följ steg 3,7, ställa in sprutpumpen med en hastighet av 1,0 mL/min och perfusing minst 5 mL. Perfusate kommer att avsluta via IVC.
- Följ steg 5.1 - 5.4 justera infusionshastigheten till 0,05 mL/min, visuellt övervaka målvävnaden i realtid.
OBS: Infusionsvolym kommer att vara organ och djur ålder specifika. Volymen kan begränsas ytterligare genom att ligting arteriell grenar leder till icke-mål kärl sängar (dvs, hjärna, lever, njure, tarm). - Följ 5.6 ta sedan bort målvävnad och placera i formalin.
7. Provfäste, skanning, och rekonstruktion för mikro-CT
- Använda paraffinfilm, skapa en plan yta på skanningsbädden och centrera det våta provet på denna yta (Bild 3A).
OBS: Om rörelseartefakt upptäcks kan provet kräva ytterligare stabilisering. - Lätt tält/täckprov med ytterligare paraffinfilm för att förhindra uttorkning. Var särskilt noga med att inte vila paraffinfilmen på provet som orsakar deformation till vävnaden (Figur 3B).
- Skanna provet med hjälp av inställningar som beskrivs i tabell 2 och standardisera dessa parametrar inom ett givet experiment.
OBS: Detta är experiment / slutpunkt beroende. Standardisera de valda parametrarna för hur lätt jämförelsen mellan prover. - Överför de rekonstruerade skanningarna för efterbearbetning och analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En framgångsrik rösterna kommer att uppvisa enhetlig fyllning av hela pulmonell arteriellt nätverk. Vi visar detta i C57Bl/6J möss som varierar i ålder: Postnatal dag P90 (Figur 4A), P30 (Figur 4B), P7 (Figur 4C), och P1 (Figur 4D). Genom att styra flödeshastigheten och visuellt övervaka fylla i realtid uppnåddes tillförlitliga ändpunkter för den mest distala vaskulaturen (figur 5A).
Vanliga utmaningar är skador på lungorna, ofullständig fyllning, underfyllning eller överfyllning, wedging katetern, och djurstorlek.
Om det uppstår skador på lungan/luftvägarna kommer små läckor att förhindra lungorna från att hålla tryck (Bild 5B,C). I avsaknad av fullständig inflation blir det svårt att göra korrekta kvantitativa och rumsliga jämförelser över prover. För att minimera risken för lungparenkymet, undvik att skära för nära lungorna när du tar bort bröstkorgen och håller lungorna fuktiga med PBS under hela proceduren för att undvika uttorkning och anslutning till omgivande strukturer. Om en lob klibbar bröstkorgen under inflationen, försiktigt grepp utsidan av bröstkorgen (bort från lungan) med tuppar och flytta den i en riktning för att befria lober. Alternativt kan ett trubbigt instrument, såsom en spatel, med en slät kant användas för att lyfta eller driva den uppblåsta lungan bort från bröstkorgen. När blåsa lungorna, följa föreslagna tryckparametrar och undvika över-inflation eftersom detta kan leda till bristning i luftvägarna. Slutligen, ta inte bort lungor från brösthålan förrän efter fixering är klar. Luftstrupen, lungor, och hjärtat bör tas bort i block från de återstående delarna av brösthålan.
Patchy (Figur 5D) eller ofullständig (Figur 5E) fyllning kan uppstå från en "luftsluss", i vilken luft införs i kärlsystemet via katetern, blockerar nedströms flöde av föreningen. För att minimera risken för en luftsluss, vaksamt rensa luft från spetsen av katetern före insättning (Steg 3.4) och under sprutan övergången från SNP / PBS till polymer förening. Om fyllningen förblir ojämn eller ofullständig, kan det vara en indikation på ökad vaskulär resistens som ett resultat av fokala/långa segmentstenos eller tortuositet. Blodproppar kan också leda till ofullständig fyllning och undviks enkelt genom att heparin används före ingreppet.
Felaktig injektionsvolym leder till underfyllning eller överfyllning. Underfyllning sker när för lite förening förs in i vasculaturen (Bild 5F). Alternativt kan överfyllning, eller införa för mycket polymerförening för snabbt orsaka antingen arteriell bristning (Figur 5G) eller, mer vanligt, venös transitering (Figur 5H). Båda problemen kan lindras genom att använda en sprutpump. Utredarna bör noggrant följa den föreslagna hastigheten och volymbegränsningar eller fastställa sina egna priser baserat på deras specifika modell och optimering. Övervakning polymer förening perfusion i realtid under förstoring är kritisk, och fyllning av små arterioles /kapillärer bör användas som en endpoint.
För att föra katetern för långt ner i lungstammen kan orsaka spetsen att kila in i en lungartär gren och skapa en obalans i flödet. Som ett resultat, fylls den ena sidan snabbare än den andra (Figur 5I), vilket ofta leder till överfyllning i ena lungan och underfyllning i den andra. Medan kateter wedging är den mest sannolika orsaken i detta scenario, "luftsluss" och brist på heparin kan också vara bidragande faktorer.
Slutligen presenterar mindre djur sin egen uppsättning ytterligare hinder. Yngre djur kräver stadiga händer och små misstag är mindre förlåtande. Instrument av hög kvalitet, som är särskilt utformade för mikrokirurgi, blir viktigare vid tidiga postnatala tidspunkter. Användning av en micromanipulator bistår kraftigt i inte bara placering men förhindra kateter förskjutning. Det är också viktigt att utnyttja sprutan pumpen på små djur för att exakt kontrollera och hantera endpoints.
Medan specifikt visas för pulmonell vasculature, kan detta förfarande enkelt tillämpas på systemiska mål vaskulär sängar samt (Tabell 1). Förutom de utmaningar som anges ovan, att välja rätt ingångspunkt är avgörande. Gjutning via bröst aorta ger utmärkt resultat för de flesta kärlsängar. Det bör dock noteras att sätta in katetern som proximal till målplatsen som möjligt och ligating icke-mål vasculature bistår i flöde och volymkontroll. Dessa förfiningar i kombination med lämplig direkt övervakning av distala vaskulära effektmått (Figur 6A-F) och standardinfusionshastigheter optimerar fyllningen. Många exempel av sådan rollbesättningmetoder finns i litteraturen och är för talrikt för färdigt att referera. Ytterligare detaljer kan dock finnas i organspecifik text som dessa 4,5,77,18,19,20,21.
Efter gjutning kan prover bearbetas för μCT-scanning (Bild 7A,B). För efterbearbetning, en kommersiell programpaket (se Tabell över material) fram en 3D-volym rendering av pulmonell vaskulär träd presenteras som stillbilder ( Figur7C), eller filmer. Ytterligare statistiska analyser som utforskar vaskulära egenskaper som segmentlängd och antal, tortuositet, ordning (generering eller rang), volym och arkadlängd kan också utföras. Förutom μCT-scanning kan de gjutna proverna också rensas för att erhålla bruttobilder eller bearbetas och skäras för histologisk analys8.
Bild 1: Kateter och nålinställning. Sprutor visas med bifogade slangar och nålar (Unit1 och Unit2). Infälld: närbild av nål och slangar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Inställning av lunginflation. Ringstativ, klämma, en spruta fylld med formalin, och slangar med en kateter bifogad. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Micro-CT provpreparering förskansa. (A) Här var preparatet centrerat på en paraffinfilmbas, (B) Här centredes provet och täcktes på parafilmbasen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Kärlgjutna lungor i varierande utvecklingsstadier från 3 månader till 1 dag gamla. Dorsalvy av lungor, (A) P90, (B) P30, (C) P7, och (D) P1 Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Exempel på ideal fyllning och vanliga fel vid polymerföreningsinfusion. (A) När slutpunkten fylls nåddes observerades ett robust och fint kärlnät. (B) Helt uppblåsta formalinperfunderade lungor representeras av en vit streckad linje, (C) Visas Underinflerade/tömda lungor. Detta observerades på grund av att en komprometterad pulmonell luftvägarna. Den ursprungliga uppblåsta positionen representeras av en vit streckad linje och den tömda positionen representeras av en svart prickad linje, (D) Ojämn fyllning: lobens vaskulatur förblir ofylld medan andra områden var helt fyllda, (E) Ofullständig fyllning: polymeren förening misslyckades med att tränga hela sektioner av lungan, (F) Underfyllning: polymeren förening misslyckades med att fylla distala vasculature, (G) Rupture: pilen pekar på polymerföreningen extruderade från vaskulara, (H) Venous fyllning: notera pilen pekar på de arteriella segmenten helt fyllda och sträcker sig in i venous systemet. Vener och venules var av betydligt större kaliber, (I) Kateter kil: Här katetern var shunted in i en artär förhindra vasculature av rätt lober från att fylla helt medan vänster lob var överfylld. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 6. Kärlgjutning och effektmått i ytterligare organ. (A) Njure: punktat utseende polymer förening i glomerulus förutsatt att endpoint. (B) Lever: notera de små kärl som syns vid organets kanter. (C) Mage: små fartyg var synliga och fullt fyllda. (D) Tjocktarmen: Småkärl är lätt identifierbara och fyllda. (E) Membran: muskeln här är tunn och genomskinlig med små fyllda fartyg uppenbara. (F). Brain: små kärl var synliga i cortex. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7. CT-bilder och 3D-volym rendering av polymer förening fyllda lungor. (A) En enda gråskalad rekonstruerad lungskiva, (B) Detta var en maximal intensitetsprojektion av en datortomografi framställd av polymerfyllda lungor, (C) En 3D-volymåtergivning av den vaskulära arkaden genererades med hjälp av kommersiellt tillgänglig programvara (se Table of Materials). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Mål Arteriell Vaskulär Säng | Placering av kateter | Infusionsriktning | Infusionshastighet | Anteckningar |
| Hjärnan | Bröst aorta som pekar kranialt | Retrograd in i halspulsådern | .05ml/min | Cannulate bröst aorta, flip mus till benägna position, öppen hårbotten, och visuellt övervaka utvecklingen av polymer genom skalle. |
| Membran | Vänster Ventrical | Anterograde in i inre bröstkorg, phrenic, och intercostal | .05ml/min | Öppna ett fönster i sidan av bröstkorgen, lämnar majoriteten av bröstkorgen och membranet intakt. Cannulate vänster ventrical, klipp höger atrium, och övervaka framsteg från caudal sidan av membranet. |
| Musculature för övre extremitet | Bröst aorta som pekar kranialt | Retrograd i brachiocephalic och vänster subclaian | .02ml/min | För att optimera lem flöde, binda av halspulsådern och ta bort lem huden för att möjliggöra visuell övervakning av polymer transitering i lem muskulatur. |
| Njure | Bröst aorta som pekar caudally | Anterograde in i njurartärer | .05ml/min | Den inre vasculature fylls blint. För att undvika venös transitering, sluta injicera när polymer är synlig i ett enhetligt punktat mönster över njure. |
| Portal System | Portal åder | Anterograde in i portalsystem | .02ml/min | Vik försiktigt lever upp för att exponera portalen ven. |
| Nedsatt | Bröst aorta som pekar caudally | Anterograde in i den leverartären | .05ml/min | Tie off portal ven före infusion för att undvika venous transitering från tarmen som rinner in i levern. |
| Mage/ Tarm | Bröst aorta som pekar caudally | Anterograde in i celiacen, överlägsen mesenterier och/eller underlägsen mesenterier | .05ml/min | Vissa regioner i tarmen levereras av flera artärer och kan fylla vid olika tidpunkter. För att undvika venös transitering, binda av artärer som inte krävs för områden av intresse och visuellt övervaka polymerens framsteg. |
| Intra-abdominal fett kuddar | Bröst aorta som pekar caudally | Anterograde men fartyget beror på fett pad studeras | .05ml/min | Fett kuddar levereras av flera artärer och kan fylla vid olika tidpunkter. För att undvika venös transitering, binda av artärer som inte krävs för exakt område av intresse och visuellt övervaka utvecklingen av polymeren. |
| Nedre delen muskulatur | Infrarenal aorta som pekar caudally | Anterograde in i lårbensartärerna | .02ml/min | Ta bort lem huden för att möjliggöra visuell övervakning av polymer transitering i lem muskulatur. |
Tabell 1. Gjutning alternativa vaskulära sängar.
| CT-inställningar | |
| kVp | 90 |
| MålMaterial | Volfram |
| Makt | 8w |
| Filtrering | Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm |
| Projektion nummer | 6424 |
| Detektorn Storlek | Platt CMOS - 2944 x 2352 pixlar |
| Synfält (FOV) | 36 mm |
| Voxel Storlek | 72 μm |
| Spatial upplösning | voxel storlek x 1,5 |
| FörvärvStid | 14 min |
| Återuppbyggnad | FBP och kommersiell algoritm |
| Binning | 1x1 |
Tabell 2. μCT Scanning Parametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utförda på rätt sätt, ger denna metod slående bilder av pulmonell arteriell nätverk, vilket möjliggör jämförelse och experiment i gnagare modeller. Flera kritiska steg på vägen säkerställer framgång. Först måste utredarna heparinisera djuret i det förberedande stadiet för att förhindra att blodproppar bildas i lungvaskulaturen och kamrarna i hjärtat. Detta möjliggör fullständig arteriell transitering av polymer förening. För det andra, när punktering membranet och ta bort bröstkorgen, var noga med att skydda lungorna från oavsiktliga skador, skärsår eller skada. Varje läcka i luftvägarna kommer att förhindra fullständig inflation och göra jämförelser mellan prover felaktiga. För det tredje, tjudra hjärtat vid spetsen hjälpmedel kateter placering. Fjärde, användning av en stark vasodilaterande såsom SNP kommer att bistå i både avlägsnande av blod och fullständig fyllning av arterioler och kapillärer5,8. Femte, när du placerar katetern i PAT, var noga med att inte begrava spetsen i bifurkation. Detta kommer att orsaka en obalans i flödet, växling polymer förening till antingen vänster eller höger sida, vilket ger en ojämlik tryckgradient. För det sjätte, användning av en spruta pump gör det möjligt för användaren att kontrollera hastigheten och titer volymen till både mus stam och ålder. Slutligen, lämna hjärta / lungor knutna till resten av brösthålan, fixa över natten, och ta bort följande dag. Lungorna kommer att vara väl fast och potentialen för deflation på grund av oavsiktliga hacks under separation kommer att minimeras.
Medan denna metodik uppnår de önskade resultaten, alternativa tekniker kan vara till hjälp för vissa användare. Till stöd i placeringen av katetern kan en mikromanipulator vara anställd. Vi valde en version med en liten profil och magnetisk bas för att minimera intrång i ett redan begränsat arbetsområde samtidigt som en stabil bas (om du använder en magnetisk bas se till att placera en stålplåt under arbetsutrymmet för att tillåta magneten att engagera). Detta gör det möjligt för användaren att exakt placera spetsen av katetern i PAT i en vinkel som följer den naturliga banan i artären. Dessutom är katetern säker och löper mindre risk att rubbas. Ett annat alternativ är användningen av en trumpetad kateterspets8. Även om det inte är trivialt att skapa, är en trumpetad kateter mycket säkrare och mindre benägna att av misstag glida ut ur PAT. Ändra förhållandet mellan polymer:spädningsvätska förändrar viskositeten och den lätthet med vilken små fartyg fylls. Beroende på målet vasculature och experimentella endpoints detta kan vara en värdefull hänsyn. Dödshjälp via CO2 kan orsaka lungblödning hos en liten andel djur och är stamberoende22. Överväg en alternativ dödshjälp protokoll bör denna inverkan experimentella slutpunkter. Vid uppblåsning av lungorna, användning av formalin aids fixering av organet på plats vid det givna trycket. En fysiologiskt neutral buffert kan ersättas om perifera kärl skulle behöva fyllas i ofixerat tillstånd. Om infusionshastighet och kontroll är av mindre betydelse för ett givet experiment, är perfusion för hand också möjlig. Handinsprutning kräver övning och realtidsövervakning under förstoring för att undvika överfyllning eller kärlbristning8. Slutligen bör vävnadsfäste/-villkor, skanningsparametrar och minimal efterbearbetning som vi anställde för detta papper bara tjäna som utgångspunkt. Olika skannrar, vävnader, experimentella slutpunkter/användarbehov kan kräva alternativa parametrar.
Medan de vaskulära bilderna som genereras från denna teknik är imponerande, finns det begränsningar. I första hand är ovanstående metod suboptimal för mätning av kärlkaliber på grund av oförmåga att övervaka och kontrollera intravaskulärt tryck under infusionen. Andra grupper har lyckats något ta itu med dessa tryck oro i systemisk vasculature genom att övervaka körtryck4,23, men sådana farhågor förstärks ytterligare på den pulmonell sidan på grund av den relativt tunna pulmonell gatan väggar som är lätt distensible med små förändringar i tryck24 och oförmåga att exakt mäta och statiskt kontrollera pulmonell intravaskulär tryck.
En andra begränsning till denna metod är att det förblir en postmortem, enda tidspunkt experiment, begränsa dess nytta i studier som kräver verkligt fysiologiska förhållanden eller en tidskurs. Andra, levande djuråtgärder, såsom CT-lungangiografi (CTPA) eller kontrastförstärkt μCT (CE-CT) erbjuder möjligheten till funktionella och morfologic åtgärder. Upprepade skanningar/longitudinella studier samt mätningar på olika punkter i hjärt/lungcykeln, kan utforskas10,25,26,27,28. Dessa metoder kan användas på ett tillförlitligt sätt, förutom ekokardiografi, för att mäta den arteriella kaliber. Både CTPA- och ekokardiografimått är dock för närvarande begränsade till bedömningen av den proximala vaskulaturen. För ekokardiogram är bedömningen begränsad till pulmonell stammen medan CTPA tillåter tillräcklig beräkning av grenen pulmonell arter kaliber potentiellt 1-2 order ytterligare, men upplösning är begränsad, dölja distala delar av vasculature7. Strålning dosering är också ett bekymmer som bör övervakas noggrant när du använder CT särskilt i multi-scan longitudinella studier29,30. För någon av dessa program kan μCT-utrustning, scantid och analysprogramvara vara dyra och kräva specialiserad personalutbildning. Djurbildningshärdningsfaciliteter vid vissa institutioner kan lätta på denna börda.
Som ett alternativ till denna förening, vissa grupper utnyttja traditionella tekniker korrosion gjutning åtföljs av mjukvävnad avlägsnande31,32. Dessa metoder ger resultat som liknar denna polymer förening, men slutprodukten är spröd, vilket leder till potentiella artefakt15. Dessutom eliminerar avlägsnandet av mjukvävnad potentialen för framtida histologi33. Ett annat alternativ är att låta mjukvävnaden vara intakt och utföra ett uppföljningssteg vari mjukvävnaden "rensas" vilket gör provet praktiskt tagetgenomskinligt 34,35. Vävnadsclearing ger användaren viss förmåga att se djupare inom ett prov, men förblir på det hela taget sämre än μCT eftersom det inte kan ge samma 3D-visualisering. Seriell histologic snittning och matris tomografi är metoder som erbjuder exceptionellt hög upplösning. Även om denna teknik öppnar dörren för nya spännande möjligheter, är arbetsbelastningen exponentiellt högre och inte särskilt gynnsam för stora kohorter11,12. 3D-röntgen histologi är en icke-förstörande strategi som par både μCT och traditionell histologi eller ens EM36,37,38. Det tar en mer hög nivå syn på patologi genom att utnyttja μCT att globalt identifiera och exakt scout regioner av intresse som sedan följs upp med rutinmässig histologi39. Ersätta lägre upplösning kontrastmedel (eller i vissa fall ingen kontrast) med polymer förening i vasculature kan tjäna till att höja båda teknikerna när det är möjligt. En annan icke-förstörande metod som är beräkningsintensiv ännu, potentiellt förbättrar kontrasten, är fashämtning μCT imaging40,41. Denna metod kan vara värdefull när den används på bullriga data där kontrasten är svag eller inte möjligt42. Polymerföreningen som används i denna teknik, dock inte lider av denna begränsning. Med detta sagt kan fashämtning vara användbart där polymerföreningen eventuellt späds ut, till exempel i distal vaskulatur43. Slutligen har stereologi varit en standard i lung kvantitativa strukturella analys för år44. Den använder slumpmässig, systematisk provtagning på tvärsnitt av vävnad för att göra 3-D-slutsatser om man antar att de valda proverna är tillräckligt representativa. Medan ett kraftfullt verktyg, det har potential att leda till fel och partiskhet. Kombinera CT imaging med stereologi, dock håller stort löfte45.
Den skisserade metoden är relativt okomplicerad och med utbildning en framgång på >90% är uppnåeligt. När behärskar, det möjliggör fullständig och tillförlitlig gjutning av lungvasculature. I fixativ, vävnad och polymer förbli stabil på obestämd tid för framtida skanningar, potentiella histologi, eller EM46,47. Vi har visat att denna teknik kan användas i djur så unga som P1 genom vuxen ålder och tror embryonala gjutning, via lungartären, är inom räckhåll. Det bör noteras att denna teknik kan tillämpas på praktiskt taget alla andra vaskulär säng genom att helt enkelt ändra kateterns ingångspunkt och bestämma lämpliga endpoints.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Denna forskning stöddes delvis av NHLBI Intramural Research Program (DIR HL-006247). Vi vill tacka NIH Mouse Imaging Facility för vägledning inom bildförvärv och analys.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
References
- Vasquez, S. X., et al. Optimization of microCT imaging and blood vessel diameter quantitation of preclinical specimen vasculature with radiopaque polymer injection medium. PLoS One. 6 (4), 19099 (2011).
- Hong, S. H., et al. Development of barium-based low viscosity contrast agents for micro CT vascular casting: Application to 3D visualization of the adult mouse cerebrovasculature. Journal of Neuroscience Research. 98 (2), 312-324 (2019).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3740 (2012).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2(+) bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
- Kim, B. G., et al. CXCL12-CXCR4 signalling plays an essential role in proper patterning of aortic arch and pulmonary arteries. Cardiovascular Research. 113 (13), 1677-1687 (2017).
- Counter, W. B., Wang, I. Q., Farncombe, T. H., Labiris, N. R. Airway and pulmonary vascular measurements using contrast-enhanced micro-CT in rodents. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (12), 831-843 (2013).
- Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. Journal of Surgical Research. 207, 115-122 (2017).
- Schuster, D. P., Kovacs, A., Garbow, J., Piwnica-Worms, D. Recent advances in imaging the lungs of intact small animals. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 30 (2), 129-138 (2004).
- Samarage, C. R., et al. Technical Note: Contrast free angiography of the pulmonary vasculature in live mice using a laboratory x-ray source. Medical Physics. 43 (11), 6017 (2016).
- Grothausmann, R., Knudsen, L., Ochs, M., Muhlfeld, C. Digital 3D reconstructions using histological serial sections of lung tissue including the alveolar capillary network. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (2), 243-257 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bussolati, G., Marchio, C., Volante, M. Tissue arrays as fiducial markers for section alignment in 3-D reconstruction technology. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (2), 438-445 (2005).
- Preissner, M., et al. Application of a novel in vivo imaging approach to measure pulmonary vascular responses in mice. Physiological Reports. 6 (19), 13875 (2018).
- Junaid, T. O., Bradley, R. S., Lewis, R. M., Aplin, J. D., Johnstone, E. D. Whole organ vascular casting and microCT examination of the human placental vascular tree reveals novel alterations associated with pregnancy disease. Scientific Reports. 7 (1), 4144 (2017).
- Bolender, R. P., Hyde, D. M., Dehoff, R. T. Lung morphometry: a new generation of tools and experiments for organ, tissue, cell, and molecular biology. American Journal of Physiology. 265 (6), Pt 1 521-548 (1993).
- Savai, R., et al. Evaluation of angiogenesis using micro-computed tomography in a xenograft mouse model of lung cancer. Neoplasia. 11 (1), 48-56 (2009).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. American Journal of Pathology. 184 (2), 431-441 (2014).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. Journal of Surgical Research. 184 (1), 365-373 (2013).
- Zhang, H., Jin, B., Faber, J. E. Mouse models of Alzheimer's disease cause rarefaction of pial collaterals and increased severity of ischemic stroke. Angiogenesis. 22 (2), 263-279 (2019).
- Faight, E. M., et al. MicroCT analysis of vascular morphometry: a comparison of right lung lobes in the SUGEN/hypoxic rat model of pulmonary arterial hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (2), 522-530 (2017).
- Fisher, S., Burgess, W. L., Hines, K. D., Mason, G. L., Owiny, J. R. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (6), 811-815 (2016).
- Munce, N. R., et al. Intravascular and extravascular microvessel formation in chronic total occlusions a micro-CT imaging study. JACC Cardiovascular Imaging. 3 (8), 797-805 (2010).
- Shifren, A., Durmowicz, A. G., Knutsen, R. H., Faury, G., Mecham, R. P. Elastin insufficiency predisposes to elevated pulmonary circulatory pressures through changes in elastic artery structure. Journal of Applied Physiology. 105 (5), 1610-1619 (2008).
- Sonobe, T., et al. Imaging of the closed-chest mouse pulmonary circulation using synchrotron radiation microangiography. Journal of Applied Physiology (1985). 111 (1), 75-80 (2011).
- Ritman, E. L. Micro-computed tomography of the lungs and pulmonary-vascular system. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (6), 477-480 (2005).
- Dinkel, J., et al. Intrinsic gating for small-animal computed tomography: a robust ECG-less paradigm for deriving cardiac phase information and functional imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 235-243 (2008).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Ford, N. L., Thornton, M. M., Holdsworth, D. W. Fundamental image quality limits for microcomputed tomography in small animals. Medical Physics. 30 (11), 2869-2877 (2003).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Molecular Imaging. 3 (3), 149-158 (2004).
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--standard method for studying microvessels. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 48 (3), 257-261 (2007).
- Polguj, M., et al. Quality and quantity comparison study of corrosion casts of bovine testis made using two synthetic kits: Plastogen G and Batson no 17. Folia Morphologica (Warsz). 78 (3), 487-493 (2019).
- Verli, F. D., Rossi-Schneider, T. R., Schneider, F. L., Yurgel, L. S., de Souza, M. A. Vascular corrosion casting technique steps. Scanning. 29 (3), 128-132 (2007).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Albers, J., Markus, M. A., Alves, F., Dullin, C. X-ray based virtual histology allows guided sectioning of heavy ion stained murine lungs for histological analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7712 (2018).
- Katsamenis, O. L., et al. X-ray Micro-Computed Tomography for Nondestructive Three-Dimensional (3D) X-ray Histology. American Journal of Pathology. 189 (8), 1608-1620 (2019).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Wen, H., et al. Correlative Detection of Isolated Single and Multi-Cellular Calcifications in the Internal Elastic Lamina of Human Coronary Artery Samples. Scientific Reports. 8 (1), 10978 (2018).
- Zamir, A., et al. Robust phase retrieval for high resolution edge illumination x-ray phase-contrast computed tomography in non-ideal environments. Scientific Reports. 6, 31197 (2016).
- Yu, B., et al. Evaluation of phase retrieval approaches in magnified X-ray phase nano computerized tomography applied to bone tissue. Optics Express. 26 (9), 11110-11124 (2018).
- Bidola, P., et al. Application of sensitive, high-resolution imaging at a commercial lab-based X-ray micro-CT system using propagation-based phase retrieval. Journal of Microscopy. 266 (2), 211-220 (2017).
- Norvik, C., et al. Synchrotron-based phase-contrast micro-CT as a tool for understanding pulmonary vascular pathobiology and the 3-D microanatomy of alveolar capillary dysplasia. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (1), 65-75 (2020).
- Weibel, E. R. Lung morphometry: the link between structure and function. Cell and Tissue Research. 367 (3), 413-426 (2017).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Sarhaddi, D., et al. Validation of Histologic Bone Analysis Following Microfil Vessel Perfusion. Journal of Histotechnology. 35 (4), 180-183 (2012).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
