이 프로토콜은 이미징을 위해 유충 및 성체 초파리 시신경엽을 준비하는 세 가지 단계인 1) 뇌 절개, 2) 면역조직화학, 3) 장착을 설명합니다. 3단계에 중점을 두었는데, 이는 특정 시신경엽 구조를 시각화하기 위해 뚜렷한 장착 방향이 필요하기 때문입니다.
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방법 논문
Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅)
이 논문에서
요약
초록
초파리 시신경엽( Drosophila optic lobe)은 4개의 신경세포(lamina, medulla, lobula 및 lobula plate)로 구성되어 있으며, 신경 다양성을 생성하고 회로 조립을 주도하는 발달 메커니즘을 탐구하기 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 시신경엽의 복잡한 3차원 구조를 감안할 때, 시신경엽을 분석하려면 시신경엽의 성체 신경세포와 유충 전구세포가 서로에 대해, 그리고 중추 뇌에 대해 어떻게 위치해 있는지 이해해야 합니다. 여기에서는 시신경 이미징을 위한 유충 및 성충 뇌의 절개, 면역 염색 및 장착을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 장착 방향과 시신경엽의 공간 조직 사이의 관계에 특히 중점을 둡니다. 유충의 세 가지 장착 전략(전방, 후방 및 측방)과 성충의 세 가지 장착 전략(전방, 후방 및 수평)에 대해 설명하며, 각 전략은 뚜렷한 시신경 구조를 위한 이상적인 이미징 각도를 제공합니다.
서론
겹눈과 기저 시신경엽으로 구성된 초파리 시각 시스템은 신경 회로 발달 및 기능 연구를 위한 훌륭한 모델이었습니다. 최근 몇 년 동안 특히 시신경엽은 신경 발생 및 회로 배선 1,2,3,4,5,6,7,8과 같은 신경 발달 과정을 연구하는 강력한 시스템으로 부상했습니다. 그것은 4 개의 신경 필로 구성됩니다 : lamina, medulla, lobula 및 lobula plate (후자의 두 개는 소엽 복합체를 구성)1,2,3,4,5,6.
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프로토콜
1. 컨포칼 이미징을 위한 유충 뇌 준비
- 해부
참고: 해부를 시작하기 전에 수정액(인산염 완충 식염수(PBS)의 4% 포름알데히드) 및 PBT(PBS의 0.1-0.3% 트리톤) 용액을 준비하십시오. 수정 용액은 해부 중에 얼음 위에 놓아야 합니다. 이 프로토콜에서는 파라포름알데히드(PFA) 고정제가 사용되지만, 특정 에피토프에 대한 대체 고정 전략(PLP20 또는 PEM21 사용)이 설명되었습니다. 유충 해부를 위해서는 두 쌍의 겸자(Dumont #5 또는 #55s)가 필요합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.- 먼저 해부 접시의 각 웰을 400μL의 1x PBS로 채웁니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 바이알 내부를 기어 다니는 떠돌이 세 번째 별모양 유충을 부드럽게 선택합니다. PBS로 채워진 접시의 첫 번째 우물에 유충을 놓습니다.
- 유충 한 마리를 잡아 중간 우물로 옮깁니다. 자주 사용하지 않는 손을 사용하여 유충의 몸을 우물 바닥에 내려 놓습니다.
- 주로 사용하는 손으로 애벌레 입 고리를 부드럽게 잡고 몸에서 잡아당깁니다. 유충 뇌는 구강 고리 및 기타 부속 조직에 부착되어야 하며 조직을 잡아당....
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결과
프로토콜에 설명된 방향으로 장착된 유충 및 성체 시신경엽의 공초점 이미지는 그림 1 과 그림 2에 나와 있습니다.
그림 1은 전방, 후방 및 측방 방향으로 위치한 유충 뇌의 개략도와 대표적인 공초점 절편을 보여줍니다. 전방 장착 방향에서는 OPC 상피(DE-Cadherin), 수질 신경아세포(deadpan>βgal) 및 층판 뉴런(Dachshund)이 뇌를 감싸는 세포 띠로 표면에 나타납니다(그림 1B,D). OPC는 전사 인자 6,11,12의 차등 발현에 의해 등쪽/배쪽 축.......
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토론
이 프로토콜에서는 유충 및 성체 초파리의 뇌를 면역염색하고 여러 방향으로 장착하는 방법을 설명합니다. 유충과 성충의 뇌를 염색하는 방법은 이전에 설명되었지만22,23,24,27,28 특정 시신경 구조를 최적으로 시각화하기 위한 장착 전략은 주목을 덜 받았다 28. 여기에 설명된 프로토콜은 연구자들에게 장착 방향과 시각화된 시신경 엽 구조 간의 관계에 대한 더 큰 이해를 제공할 것으로 예상됩니다.
이 프로토콜에 설명된 방향 외에도 성충 및 유충 시신경 시각화의 대체 각도는 시신경엽을 중앙 뇌에서 분리함으로써 달성할 수 있습니다. 시신경.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
Bsh 항체의 부분 표본을 공유해 주신 Claude Desplan에게 감사드립니다. DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up 및 Bruchpilot 단클론 항체는 NIH의 NICHD에 의해 만들어지고 아이오와 대학교 생물학과, 아이오와 시티, IA 52242에서 유지 관리되는 발달 연구 하이브리도마 은행에서 획득되었습니다. 이 연구는 T.E.에게 수여된 NSERC 디스커버리 그랜트(NSERC Discovery Grant)의 지원을 받았습니다. U.A.는 NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship의 지원을 받습니다. PV는 온타리오 대학원 장학금의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Bioshop | PBS405 | |
| 37% 포름알데히드 | Bioshop | FOR201 | |
| Alexa Fluor 488 (염소) 보조 | Invitrogen | A-11055 | 1:500 사용 |
| Alexa Fluor 555 (마우스) 보조 | Invitrogen | A-31570 | 1:500 사용 |
| Alexa Fluor 647 (기니피그) 보조 | Invitrogen | A-21450 | 1:500 사용 |
| Alexa Fluor 647 (rat) secondary | Invitrogen | A-21247 | 1:500 |
| 커버 슬립 | VWR | 48366-067 | |
| 해부 겸자 - # 5 | Dumont | 11251-10 | |
| 해부 겸자 - # 55 | Dumont | 11295-51 | |
| 해부 접시 | Corning | 722085 | |
| 드라이 와이프 | Kimbery Clark | 34155 | |
| 염소 항-Bgal 1차 항체 | Biogenesis | 1:1000 | |
| 사용 기니피그 항-Bsh 1차 항체 | :500에 | Claude Desplan | |
| 기니피그 항-Vsx1 1차 항체 | Erclik et al. 2008 | 1:1000에 사용 | |
| 실험실 필름 | Parafilm | PM-996 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Sarstedt | 72.706.600 | |
| 현미경 슬라이드 | VWR | CA4823-180 | |
| 마우스 anti-dac primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | mabdac2-3 | 1:20 |
| 마우스 anti-eya 1차 항체 | DSHB | eya10H6 | 1:20 |
| 마우스 anti-nc82 1차 항체 | DSHB | nc82 | 1:50 |
| 마우스 anti-svp primary antibody | DSHB | Seven-up 2D3 | 1:100 |
| Polymer Clay | 사용 가능 모든 유형의 점토 사용 | ||
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | 1:1000 |
| Rat anti-DE-Cadherin 1차 항체 | DSHB | DCAD2 | 1:20 |
| Slowfade 마운팅 배지 | Invitrogen | S36967 | Vectashield 장착 매체(cat# H-1000)도 사용할 수 있습니다 |
| Triton-x-100 | Bioshop | TRX506 |
참고문헌
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Research. 258, (1989).
- Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. Prolif....
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