Summary
Her gir vi en protokoll for å generere in vitro NMJs fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCer). Denne metoden kan indusere NMJs med moden morfologi og funksjon i 1 måned i en enkelt brønn. De resulterende NMJs kan potensielt brukes til å modellere relaterte sykdommer, for å studere patologiske mekanismer eller å screene narkotikaforbindelser for terapi.
Abstract
Det nevromuskulære krysset (NMJ) er en spesialisert synapse som overfører virkningspotensialer fra motorneuronet til skjelettmuskulatur for mekanisk bevegelse. Arkitekturen til NMJ-strukturen påvirker funksjonene til nevronen, muskelen og gjensidig interaksjon. Tidligere studier har rapportert mange strategier ved å co-culturing motor nevroner og myotubes å generere NMJ in vitro med komplekse induksjonsprosessen og lang kulturperiode, men har slitt med å rekafulere modne NMJ morfologi og funksjon. Vårt in vitro NMJ induksjonssystem er konstruert ved å differensiere menneskelig iPSC i en enkelt kulturrett. Ved å bytte myogen og nevrogen induksjonsmedium for induksjon, inneholdt den resulterende NMJ pre- og post-synaptiske komponenter, inkludert motornevroner, skjelettmuskulatur og Schwann celler i en måneds kultur. Den funksjonelle analysen av NMJ viste også at myotubes sammentrekning kan utløses av Ca++ deretter hemmet av curare, en acetylkolin reseptor (AChR) hemmer, der stimulerende signalet overføres gjennom NMJ. Denne enkle og robuste tilnærmingen fikk den komplekse strukturen til NMJ med funksjonell tilkobling. Denne in vitro human NMJ, med sine integrerte strukturer og funksjon, har lovende potensial for å studere patologiske mekanismer og sammensatt screening.
Introduction
Det nevromuskulære krysset (NMJ) er en spesialisert synapse som overfører signaler fra motornevroner til skjelettmuskler for å kontrollere frivillig muskelbevegelse1,,2. Denne synapsen består av pre- og post-synaptiske deler. I den presynaptiske delen frigjør motorneuronet acetylkolin (ACh) fra synaptiske vesikler ved eksocytose. ACh frigjøres fra synaptiske vesikler for å krysse den synaptiske kløften og binde til AChR på den postsynaptiske delen for å utløse et handlingspotensial for muskelsammentrekning3,4. Enhver funksjonsfeil i denne delikate strukturen kan forårsake NMJ sykdommer, inkludert spinal muskelatrofi (SMA), medfødte myasthenic syndromer (CMS), myasthenia gravis (MG)5,,6,,7, etc. Disse sykdommene skader kvaliteten på pasientenes liv og har dessverre ingen effektive behandlingstilnærminger på grunn av mangel på forståelse av den patologiske mekanismen. I denne studien hadde vi som mål å generere in vitro human NMJ fra humane iPSCer for nøyaktig sykdomsmodellering og for terapeutisk forbindelser screening.
Tidligere studier har vist muligheten for å generere in vitro NMJ ved co-kultur strategier. Motornevronene og skjelettalonene genereres henholdsvis. De to celletypene kan genereres fra menneskelige eller mus primære vevkulturer eller induseres frastamceller 8,,9,,10,,11 og deretter co-kultivert for NMJ formasjon. De videre programmene inkluderer sammenslåing av co-kultivert NMJ til mikrofluidiske 3D-enheter og å bruke optogenetiske enheter for kvantifiserbare funksjonelle analyser12,,13. Disse strategiene tar imidlertid en lang kulturperiode og krever kamp for å få de primære komponentene i NMJ, enten motorneuronen eller skjelett myotuben samtidig. Enda en viktig komponent i NMJ, Schwann-cellen, kan ikke genereres i disse kultursystemene. Det avanserte kultursystemet som inneholder myotube-, motorneuron- og Schwann-cellen er ønskelig, da det kan tilby en pålitelig og robust modell for NMJ-studier.
Myogen differensiering 1 (MYOD1) er en velkjent myogen regulator for myogenese14. Den effektive myogen differensieringsmetoden som brukte MYOD1 til å drive iPSC inn i myotubes ble bygget i en tidligere studie15. Derfor induserte vi myorørene ved å overuttrykke MYOD1 i iPSCs15, og høy effektivitet av myogen differensiering ble vist. Interessant, nevronceller dukket opp sammen med myotubes spontant etter dag 10. Utseendet til nevronceller i myogen kultur har ført oss til å utvikle strategien for å generere in vitro NMJ i en enkelt tallerken. Her gir vi en strategi for å generere NMJs ved å overuttrykke MYOD1 i menneskelige iPSCer for myogen og motor neuron induksjon i samme kulturrett. Motornevronene induseres spontant med flere nevrotrofiske faktorer (GDNF, BDNF, NT3 osv.) 8, og i mellomtiden kan Schwann-cellene også induseres16,17. Gjennom interaksjonene mellom myorørene, motornevronene og Schwann-cellene dannes den modne NMJ18. Denne metoden kan generere funksjonell NMJ effektivt, slik at den potensielle studien av patologiske mekanismer og terapeutisk sammensatt screening.
Protocol
1. Tilberedning av ekstracellulære matrise (ECM)-belagte plater
- Fortynn ECM (se Materialse tabell) med iskald 1x PBS til en endelig konsentrasjon på 2 %.
- Tilsett 1 ml ECM til 49 ml 1x PBS i et 50 ml plastrør. Bland godt ved å pipetter opp og ned flere ganger.
- Plasser 1 dekkslipp i hver brønn på en 6-brønns plate. Legg til 1,5 ml 2 % ECM i hver brønn.
- Inkuber brønnplaten med 2 % ECM i 2 timer ved 37 °C.
- Aspirer ECM fra brønnplaten og oppbevar platen ved 4 °C før bruk.
2. Differensiering av iPSCer mot NMJ
- Frø 4 x 105 av iPSCs per brønn på 6-brønnsplaten tilberedt i avsnitt 1. Sørg for å så cellene på dekkglasset forhåndsdeponert i brønnen.
MERK: I denne studien ble 201B7MYOD iPS cellelinje, en gave fra Dr. Sakurai's Lab, brukt15.- Fjern mediet fra iPSCene på 6 cm kulturfatet og vask iPSCene én gang med 1x PBS.
- Tilsett 1 ml celleavløsning i fatet og inkuber i 10 min ved 37 °C.
- Tilsett 3 ml primat embryonisk stamme (ES) cellemedium til parabolen og pipetten 3 ganger forsiktig.
- Samle supernatant, som inneholder frittliggende iPSCer, i en 50 ml plastrør og sentrifuge ved 160 x g ved 4 °C i 5 min.
- Aspirer forsiktig de overnaturante, resuspend iPSCene i 3 ml primat ES-cellemedium med 10 μM Y27632, og telle cellenummeret ved hjelp av et hemocytometer.
- Fortynn iPSC-ene med primat ES-cellemedium og 10 μM Y27632 til en konsentrasjon på 2 x 105 celler/ml. Legg til 2 ml iPSCer på dekkslepet forhåndsdeponert i brønnen som er beskrevet i avsnitt 1.
- Induksjon av iPSCene til NMJ
- På dag 1, 24 timer etter såing av iPSCene til 6-brønnsplaten, fjern kulturmediet og erstatt det med 2 ml fersk primat ES-cellemedium som inneholder 1 μg / ml doxycyklin til hver brønn.
- Endre mediet med 2 ml myogen differensieringsmedium (MDM) (tabell 1) som inneholder 1 μg/ml doxycyklin (endelig konsentrasjon) til hver brønn. Oppdater mediet hver dag fra dag 2 til dag 10.
- Fra dag 11 bytter du medium til 2 ml NMJ medium (tabell 1) til hver brønn. Oppdater mediet hver 3\u20124 dager deretter til dag 30.
- Følg differensiert NMJ etter fase invertert mikroskopi på dag 30. NMJ kan brukes til følgende analyse.
3. Immunofluorescence (IF) farging
- På dag 30, aspirer kulturmediet fra 6-brønnsplaten. Fiks NMJ-kulturen ved å legge til 2 ml 4 % paraformaldehyd til hver brønn i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask prøvene 3 ganger ved å tilsette 2 ml 1x PBS til hver brønn (3 min for hver vask).
- Permeabilize prøvene med 0,1% Triton / PBS i 10 min.
- Gjenta trinn 3.2.
- Blokker prøvene med 0,5 % BSA i 1 time ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 3.2.
- Inkuber prøvene med de primære antistoffene ved 4 °C over natten. Fortynningen av antistoffer er som følger: Holme 1 (1 μg/ml), myosintung kjede (MYH) (1/300), nevrofilamenter (NF) (1 μg/ml), S-100 (1/300), synaptisk vesikkikkelprotein 2 (SV2) (1 μg/ml), Tuj1 (1/1000).
- Gjenta trinn 3.2.
- Inkuber prøvene med sekundære antistoffer ved romtemperatur i 1 time. Konsentrasjonen av de sekundære antistoffene som brukes er som følger: anti-mus IgG 488 konjugert (0,1 μg/ ml), anti-kanin IgG 488 konjugert (0,1 μg / ml).
- Gjenta trinn 3.2.
- Inkuber prøvene med aBTX-647 (0,5 μg/ml) for AChR-farging og med DAPI (1 μg/ml) for kjernefarging.
- Gjenta trinn 3.2.
- Plukk opp dekkslipsen med et par tang fra 6-brønnsplaten og monter den i 50% glyserol / PBS-løsning på et mikroskopsklie.
4. Skanne elektronmikroskopi (SEM)
- Fiks NMJ-kulturen med 4 % paraformaldehyd og 1 % glutaraldehyd tilberedt i 0,1 M kaliumfosfatbuffer ved romtemperatur i 1 time.
- Vask prøvene 3 ganger ved å senke dem ned i 0,1 M kaliumfosfatbuffer ved romtemperatur (10 min for hver vask).
- Dehydrere prøvene med stigende konsentrasjoner av etanol (50%, 70%, 90%, 95% og 100% to ganger). Senk prøvene i hver konsentrasjon av etanol i 10 min.
- Tørk prøvene med en kritisk punkttørker (-30 °C, 0,1 Torr).
- Belegg prøvene med Pt (platina) ioncoater (30 mA i 3 min; tykkelsen på Pt er ca 20 nm).
- Følg prøvene fra SEM ved 5 kV.
5. Overføring elektron mikroskopi (TEM)
- Bruk en celleskraper til å høste vevet fra NMJ-kulturplaten. Form vevet til en liten pellet (3 mm3) med et barberblad og lim ved gelasjon for å danne et gelinnpakket stykke. Fest det gelinnpakkede stykket med 2 % paraformaldehyd og 2 % glutaraldehyd tilberedt i 0,1 M kaliumfosfatbuffer ved 4 °C over natten.
- Vask prøvene 3 ganger ved å senke dem ned i 0,1 M kaliumfosfatbuffer (15 min for hver vask) ved romtemperatur.
- Postfix prøvene med 1% osmium tetroxide tilberedt i dobbel destillert H2O i 1 t ved romtemperatur.
FORSIKTIG: Dette trinnet må gjøres i en kjemisk hette. - Gjenta trinn 5.2.
- Dehydrere prøvene med stigende konsentrasjoner av etanol (50%, 70%, 90%, 95% og 100% to ganger). Senk prøvene i hver konsentrasjon av etanol i 10 min.
- Aspirer 100% etanol. Infiltrer prøvene med stigende volumforhold av epoksyharpiks til 100% etanolblandinger (1:3, 1:1 og 3:1). Rør hver blanding forsiktig ved 10 o/min i 1 time ved romtemperatur.
- Bytt epoksy-etanolblandingen med ren epoksyharpiks og ager forsiktig ved 10 o/min i 4 timer ved romtemperatur.
- Etter 4 timer, oppdater epoksyharpiksen med fersk epoksyharpiks og agiterer forsiktig ved 10 o/min over natten ved romtemperatur.
- Bygg inn prøvene i innebygging kapsler med fersk epoksyharpiks og kurere prøvene i en ovn ved 65 °C over natten.
- Ultramikrotomi
- Klipp enkelt prøveblokkene under et dissekeringsmikroskop for riktig retning.
- Finsnkjær de grovt trimmede blokkene med en glasskniv på en ultramikrotom for å oppnå glatte overflater.
- Forbered 70 nm ultratynne seksjoner fra de godt trimmede blokkene med en diamantkniv. Hent de ultratynne seksjonene med 200 mesh karbonformvarbelagte kobbernett.
- Beis de ultratynne delene som inneholder gitter med mettet uranylacetat tilberedt i dobbeltdestillert H2O i 30 min og vask gitteret 3 ganger med dobbelt destillert H2O (10 min for hver vask).
- Videre kontrasterer de ultratynne delene med Reynolds blysitrat19 (2,5%) i 5 min og vask med kokt H2O forkjølt til romtemperatur 3 ganger (10 min for hver vask). Sett flere natriumhydroksidpellets rundt fargeområdet for å hindre CO2-nedbør på seksjonene.
- Følg de ultratynne delene med TEM ved 70 kV.
6. Muskel sammentrekning og curare behandling
- For å utløse myotube-sammentrekningen, legg til 25 mM CaCl2 i kulturmediet i trinn 2.3. Bevegelsen av myotubes kan observeres i 1 \ u20122 min.
- Plasser 6-brønnsplaten på scenen av et omvendt mikroskop. Ta opp en film av myotube sammentrekning av live celle mikroskopi.
- For å stoppe myotube-sammentrekningen, legg curare til kulturmediet (300 ng / ml). Ta deretter opp filmen som trinn 6.2.
- Åpne filmfilen med bevegelsesvektoranalyseprogramvare, og klikk deretter på Motion Analysis-knappen for å analysere filmen.
MERK: Myotubes sammentrekning vises som tidsbevegelse grafikk. Filmene er fargekodet for å vise bevegelseshastigheten til myotubes. De fargekodede gnistrende signalene indikerer bevegelsene til myorørene der den røde fargen viser den raskeste bevegelseshastigheten og blå farge viser den tregeste bevegelseshastigheten.
Representative Results
Ved hjelp av vår differensieringsstrategi viste kulturen pre- og post-synaptiske komponenter i NMJ på dag 30. NMJ-komponentene ble indusert og godt utviklet i en enkelt brønn, og deres morfologi og steder i NMJ ble demonstrert av IF-mikroskopi (figur 1). Flytdiagrammet i figur 1A oppsummerer tidsforløpet for NMJ-differensieringsprogresjonen. Fargingen av nevrofilamenter (NF), synaptiske vesikler (SV2) og AChR (figur 1B,C) indikerer nevronene. De enkle fargebildene av NF og SV2 er vist i supplerende figur 1. Alfa-bungarotoxin farging indikerer AChR (Figur 1C). Det sammenslåtte bildet viser de relative plasseringene til en motorneuron og AChR i NMJ (figur 1D, E). Det andre settet med IF-farging indikerer motorneuronet ved Tuj1 og Holmen 1 (figur 1G,H) og postsynaptiske myotuber av myosin tung kjede (figur 1I). Schwann-cellene ble også merket med S-100 antistoff i NMJ-kulturen (Supplerende figur 2).
For ytterligere å bekrefte identiteten til NMJ-komponentene, brukte vi SEM for detaljert morfologisk analyse. Modne NMJ morfologi med utvidede axon terminaler, aksoner og muskelfibre er vist i figur 2A,B. TEM ble utført for å avsløre den modne ultrastrukturen til NMJ-komponentene, inkludert den presynaptiske axonterminalen med synaptiske vesikler og den postsynaptiske delen, som er atskilt av synaptisk kløft (figur 2C \ u2012E). Koblingsfolder indikeres av den gule stiplede linjen, som markerer krysset mellom nevron- og muskelfibrene (figur 2C). De modne axonterminalene som inneholder synaptiske vesikler er vist i figur 2D,E (gule piler). De morfologiske resultatene viser at NMJ-komponentene var godt indusert og modnet.
For å evaluere funksjonen til in vitro NMJ utførte vi bevegelsesanalyse ved å stimulere motorneuronet med CaCl2 for å utløse myotubesammentrekninger. Resultatene viste at Ca2+ kan utløse muskelsammentrekninger. Sammentrekningene kan bli avbrutt av curare. NMJ viste fremtredende bevegelsessignaler som forsvant med curare behandling (Figur 3). Denne effekten bekrefter at motorneuronsignalene ble overført gjennom NMJ for å utløse muskelsammentrekning. Samlet demonstrerte IF-mikroskopi-, SEM- og TEM-dataene den romlige fordelingen, morfologien og modenheten til NMJ-komponentene i in vitro NMJ generert av protokollen beskrevet ovenfor. Bevegelsesanalyse validerte funksjonen til in vitro NMJ, noe som innebærer at den potensielle anvendelsen av å utvikle terapeutiske strategier.
Figur 1: Flytskjema for NMJ-induksjon og IF-bilder av NMJ-kulturen. (A) Et strømningsdiagram for NMJ differensieringsprogresjonen. (B\u2012F) Påvisning av NMJ-komponenter, nevrofilamenter (NF), synaptiske vesikler (SV2) og AChR. De hvite pilene i panel D angir NMJ. (G\u2012K) Pre- og post-synaptiske komponenter i NMJ. Tuj1 og Islet1 indikerer motorneuron, og myosin tung kjede (MYH) indikerer myotuben. a-BTX, alfa-bungarotoxin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: SEM- og TEM-bilder av modne NMJ. (A)Den romlige fordelingen av NMJ-komponenter viser aksionterminalen forankret på overflaten av muskelfiberen (Mf). (B) En høyere forstørrelse av NMJ viser axonterminalene. (C) Ultrastrukturen til en modnet NMJ med pre-synaptisk axon terminal (røde pilspisser) og synaptiske vesikler (Sv), synaptisk kløft (Sc) og postsynaptiske deler (røde piler). Koblingsfolder (jf) indikeres av den gule stiplede linjen. Øks, øks. (D, E) De høye forstørrelsesbildene viser synaptiske vesikler i axonterminaler (gule piler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Myotubes sammentrekningsanalyse av in vitro NMJ. Myotubes sammentrekning ble utløst med 25 mM CaCl2 løsning (grønn linje). Sammentrekningene ble hemmet etter behandlet med curare (gul linje). Vennligst se også Supplerende Film 1 og Supplerende Film 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende Film 1: Myotubes sammentrekning utløst av Ca++. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Supplerende Film 2: Den mye svakere sammentrekningen av myotubes etter curare behandling er vist. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Supplerende figur 1: De enkle fargebildene av nevrofilamenter (NF, hvite piler) i NMJ-kulturen. De enkle fargebildene av synaptiske vesikler (SV2, hvite piler) i NMJ-kulturen. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur 2: Schwann-cellene merket med S-100 antistoff i NMJ-kulturen. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
| Myogen differensieringsmedium (MDM) | MEM-alfa | 500ml (500 ml) |
| 100mM 2-ME | 1117μL | |
| Doxycycline | 1μg/ml | |
| KSR (andre) | 56ml (endelig til 10%) | |
| Penn/Strep | 2,5 ml | |
| Totalt | 560ml (560 ml) | |
| 100mM 2-mercaptoetanol | 2-mercaptoetanol | 7μL |
| d.d. vann | 993μL | |
| Totalt | 1000μL | |
| NMJ-medium | Nevrobasal medium (NB) | 500ml (500 ml) |
| B27 Leilighet | 1x (lager på 50x) | |
| BDNF (andre | 10ng/ml | |
| GDNF | 10ng/ml | |
| N2 (andre) | 1x (lager på 100x) | |
| Nt3 (andre personer) | 10ng/ml | |
| Penn/Strep | 2,5 ml | |
Tabell 1: Formel av medium.
Discussion
Tidligere studier har rapportert metoder for NMJ formasjon in vitro med sofistikerte metoder som krever langsiktig kultur8,10,12,13,20. Disse prestasjonene leder utviklingen av in vitro NMJ. De kompliserte metodene hindret imidlertid tilgangen til NMJ-studier. Vår protokoll unngår co-kultur for å generere NMJs effektivt og robust i en enkelt brønn. Tre celletyper i NMJ ble observert i vårt induksjonssystem, inkludert myorørene, motornevronene og Schwann-cellene18. I tillegg ble moden morfologi og funksjon verifisert.
Basert på vår forrige studie er den første celletettheten en kritisk faktor for NMJ-dannelse, og ulike celletettheter induserer ulike antall NMJs i kulturen18. En lav celletetthet (< 1 x 104/cm2) induserte et lavt antall nevroner, noe som er ugunstig for NMJ-dannelse. Selv om det ville ta mye mer tid og ressurser å forberede en høyere tetthet av celler (> 1 x 105/ cm2),anbefaler vi at celletettheten er mellom 1,5 x 104/ cm2 og 5 x 104/ cm2 ved hjelp av vår protokoll. NMJ generert av denne protokollen er et heterogent vev med flere celletyper som er nærmere å etterligne fysiologiske forhold. Myotubes er funnet å jevnt distribuere på en kulturrett, men motornevronene vises tilfeldig, hvorav fenomenet resulterer i ujevnt fordeling av NMJs i en kultur. Denne NMJ er egnet for kvalitative studier i stedet for analysen som krever homogene kultursystemer. Vi brukte også andre cellelinjer, eq., H9 (ES cellelinje)18 og A11 (iPS cellelinje, data som ikke vises) for å generere NMJ ved denne protokollen. NMJ kan genereres i morfologi og funksjon. Kulturtilstanden må likevel optimaliseres for ulike cellelinjer.
Den kjemisk utløste myotubes sammentrekning og curare-avhengige hemming bekreftet at vår in vitro NMJ var funksjonell og kan potensielt brukes for praktiske analyser. Spontane muskelsammentrekninger ble observert tilfeldig ved 3\u20124 uker med kultur, men det kunne unngås ved å forlenge kulturtiden til så lenge som to måneder18.
Ulike strategier har blitt publisert for å generere in vitro NMJ av ulike modningsstadier, men in vitro NMJ generert i vårt system viste den betydelige modenheten, da vi kan observere overgangen av gamma til epsilon underenheter av AChR under kulturen18. Modenhet er en viktig faktor for sykdomsmodellering med in vitro NMJ21. Til slutt er en in vitro NMJ med integrerte strukturelle komponenter, modenhet og funksjon til potensiell bruk for terapeutisk utvikling.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Sakurai for vennlig å gi 201B7MYOD. Elektronmikroskopistudien ble støttet av Keiko Okamoto-Furuta og Haruyasu Kohda (Divisjon for elektronmikroskopisk studie, Senter for anatomiske studier, Graduate School of Medicine, Universitetet i Kyoto). Monoklonalt antistoff ble utviklet av HHMI / Columbia University, hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank, opprettet av National Institute Child Health and Human Development of the NIH, og opprettholdt ved Institutt for biologi, University of Iowa. Vi takker også Shiori Oshima, Kazuhiro Nakagawa og Eriko Matsui for bevegelsesvektoranalyse. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI, tilskuddsnummer 16H05352 og 20H03642 (til MKS); iPS Cell Research Fund (til CYL og MKS); Mochida Memorial Foundation for medisinsk og farmasøytisk forskning (til MKS); Takeda Science Foundation (til MKS); og et stipend fra The Program for Intractable Diseases Research ved hjelp av sykdomsspesifikke iPS-celler, som ble hjulpet av Japan Agency for Medical Research and Development (17935400 til CYL og MKS, og 17935423 til MKS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
| B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
| BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
| Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
| Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
| Doxycycline | Takara | 631311 | |
| ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
| GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
| Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
| Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
| iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
| live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
| Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
| N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
| Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
| SEM | Hitachi | S-4700 | |
| TEM | Hitachi | H7650 | |
| Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
| Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
| Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
| Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
| Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
| Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
| S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
| Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
| Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |
References
- Hong, I. H. K., Etherington, S. J. Neuromuscular Junction. eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W.
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Slater, C. R. The Structure of Human Neuromuscular Junctions: Some Unanswered Molecular Questions. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2183 (2017).
- Comley, L. H., Nijssen, J., Frost-Nylen, J., Hedlund, E. Cross-disease comparison of amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy reveals conservation of selective vulnerability but differential neuromuscular junction pathology. Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1424-1442 (2016).
- Shigemoto, K., et al. Muscle weakness and neuromuscular junctions in aging and disease. Geriatrics & Gerontology International. 10, 137-147 (2010).
- Abicht, A., Müller, J., Lochmüller, H.
- Faravelli, I., et al. Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives. Stem Cell Research & Therapy. 5 (4), 87-100 (2014).
- Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
- Yoshida, M., et al. Modeling the early phenotype at the neuromuscular junction of spinal muscular atrophy using patient-derived iPSCs. Stem Cell Reports. 4 (4), 561-568 (2015).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system for studying mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. 143 (13), 2464-2477 (2016).
- Uzel, S. G. M., et al. Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units. Science Advances. 2 (8), 1501429 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), 61540 (2013).
- Furlan, A., Adameyko, I. Schwann cell precursor: a neural crest cell in disguise. Developmental Biology. 444, 25-35 (2018).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. Schwann Cell Precursors; Multipotent Glial Cells in Embryonic Nerves. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12 (69), (2019).
- Lin, C. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2019).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Bucchia, M., Merwin, S. J., Re, D. B., Kariya, S. Limitations and Challenges in Modeling Diseases Involving Spinal Motor Neuron Degeneration in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 61 (2018).
