Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

מתח כרוני משנה התנהגות בחירה הקשורה למאמץ במשימת מחסום Y-מבוך בעכברים

Published: August 13, 2020 doi: 10.3791/61548
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Psychology, Behavioral and Systems Neuroscience Area, The State University of New Jersey, 2Graduate Program in Neuroscience, Rutgers, The State University of New Jersey

Summary

משימת מחסום Y-maze היא מבחן התנהגות הבוחן את המוטיבציה לבזבז מאמץ עבור תגמול. כאן, אנו דנים בבדיקת לחצים כרוניים מרובים מאומתים היטב כולל קורטיקוסטרון כרוני ומתח תבוסה חברתית עם התנהגות זו, כמו גם את הרומן כרוני לא מפלה לחץ תבוסה חברתית (CNSDS), אשר יעיל בנקבות.

Abstract

הפרעות במצב הרוח, כולל הפרעת דיכאון גדולה, יכול להיות מואצת על ידי מתח כרוני. משימת מחסום Y-maze היא מבחן בחירה הקשור למאמץ המודד מוטיבציה לבזבז מאמץ ולקבל תגמול. בעכברים, חשיפה ללחץ כרוני משפיעה באופן משמעותי על המוטיבציה לעבוד עבור תגמול ערך גבוה יותר כאשר תגמול ערך נמוך יותר זמין באופן חופשי בהשוואה לעכברים ללא לחץ. כאן אנו מתארים את הפרדיגמה הכרונית של ממשל קורטיקוסטרון, המייצרת שינוי בתגובה מאמץ במשימת מחסום Y-maze. במשימת המבוך Y, זרוע אחת מכילה 4 כדורי מזון, בעוד הזרוע השנייה מכילה רק 2 כדוריות. לאחר עכברים ללמוד לבחור את זרוע תגמול גבוה, מחסומים עם גובה גדל בהדרגה לאחר מכן נכנסים לזרוע תגמול גבוה על הפעלות מבחן מרובות. למרבה הצער, רוב פרדיגמיות מתח כרוניות (כולל קורטיקוסטרון ותבוסה חברתית) פותחו בעכברים זכרים והם פחות יעילים בעכברים נשיים. לכן, אנו דנים גם בלחץ תבוסת חברתית כרונית (CNSDS), פרדיגמת מתח שפיתחנו היעילה בעכברים זכרים ונשים. תוצאות חוזרות עם לחצים כרוניים מרובים בעכברים זכר ונקבה בשילוב עם שימוש מוגבר במשימות התנהגות רלוונטיות לתרגום יסייעו לקדם את ההבנה כיצד מתח כרוני יכול לזרז הפרעות במצב הרוח.

Introduction

הפרעות במצב רוח כגון דיכאון וחרדה נפוצות מאוד בחברה של היום. עשרות שנים של עבודה חיפשו ללא הרף טיפולים משופרים ומודלים מכרסמים רלוונטיים כדי ללמוד הפרעות מורכבות אלה1. מתח כרוני הוא גורם תורם להפרעות במצב הרוח כמו דיכאון2. לכן, פרדיגמים מתח כרוני כגון מתח תבוסה חברתית כרונית (SDS) וממשל קורטיקוסטרון כרוני (CORT) פותחו בעכברים זכרים, כעת הם בשימוש נרחב כדי להעריך את ההשפעות הנוירוביולוגיות וההתנהגותיות של חשיפה ללחץ כרוני. הבדיקות ההתנהגותיות הנפוצות ביותר להערכת השפעות מתח כרוניות כוללות משימות הקשורות להתנהגות הימנעות, כגון מבוך מוגבה בתוספת, שדה פתוח, והאכלה מודחקת חדשנית, או עם יעילות נוגדת דיכאון, כגון מבחן שחייה כפוי. עם זאת, התנהגויות אלה אצל מכרסמים ללא ספק חסר פנים, וחשוב מכך, תוקף חזוי ירלוונטיות תרגום להפרעות אנושיות כגון דיכאון.

פרדיגמת מתח כרונית פופולרית, מתח מתון כרוני בלתי צפוי (CUMS), אומת בהרחבה באמצעות התנהגויות כגון העדפת סוכרוז3. CUMS מפחית העדפה לפתרון סוכרוז 1% בהשוואה למים ומפורש היסטורית כהתנהגות הקשורה לאהדוניה4,5. עם זאת, הפחתה זו העדפת סוכרוז אינו נצפתה בבני אדם עם הפרעת דיכאון גדולה6,7. בנוסף, העדפת סוכרוז אינה מאפשרת לחקור את המוטיבציה לתגמול מאמץ.

לאחרונה, כמה מחקרים הסיטו את המיקוד להתנהגויות אחרות הקשורות מוטיבציהותגמול 8,9. משימות אלה יש ערך תרגום מבטיח כי הערכות התנהגות דומות יחסית ניתן לבצע הן בבני אדם והן מכרסמים. כאן, אנו מתארים את הפרדיגמה CORT ו-SDS ואת השפעותיהם במשימה התנהגותית מחסום Y-מבוך המודד מוטיבציה להפעיל מאמץ לגמול. לאחר מכן אנו דנים בפרדיגמת מתח כרונית חדשה שפיתחנו, לחץ תבוסת חברתית כרונית לא מפלה (CNSDS), אשר יעיל בעכברים זכר ונקבה.

ניהול קורטיקוסטרון כרוני (CORT) היא פרדיגמה שנועדה לחקות מתח כרוני ללא חשיפות מתח בפועל. הפעלה של ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-יותרת הכליה על ידי תוצאות מתח בשחרור אנדוגני של קורטיזולסטרואידים יותרת הכליה בבני אדם 10,,11,,12 ו קורטיקוסטרוןבעכברים 13,14. משלוח של קורטיקוסטרון דרך מי השתייה של עכברים זכרים בוגרים במשך 4 שבועות לפחות גורם לתגובות התנהגותיות לא ממחלה במשימות הימנעות כגון שדה פתוח, מבוך מוגבה בתוספת מבוך,וחידוש מודחק האכלה 10,11,12,13,14,15,16., מעניין, CORT משפיע גם על עיבוד תגמול במשימות אינסטרומנטליות16,17,18,19. הפרדיגמה CORT המתוארת כאן מייצרת ריכוז סרום עקבי של מתחת 100 ng/mL CORT, שהוא יותר מחמש פעמים פחות מזה המיוצר על ידי לחץ אקוטי כגוןשחייה כפויה 15. לכן, ניהול CORT כרוני לא סביר לגרום היפרקורטיזולמיה. בעוד CORT כרוני יעיל רק בעכבריםזכר 20, הוכחנו לאחרונה כי היא מייצרת שינוי חזק בתגובה מאמץ במשימת מחסום Y-מבוך21. למיטב ידיעתנו, זה היה אחד המחקרים הראשונים לבחון את ההשפעות של מתח כרוני על התנהגות בחירה הקשורה למאמץ בעכבריםזכרים 21. מחקר קודם אחד הוכיח לראשונה את ההשפעה של לחץ ריסון חריף על קבלת החלטות מבוססות מאמץבחולדות 22. בהתנהגויות בחירה הקשורות למאמץ, בעל חיים בוחר או להפעיל מאמץ עבור תגמול בעל ערך גבוה או לקבל תגמול בעל ערך נמוך יותר הזמין באופן חופשי יותר. בבני אדם, ההוצאה על מאמץ עבור משימת תגמולים (EEfRT), הוא משחק מחשב שפותח כדי להיות מקביל למשימות בחירה הקשורות למאמץ בעכברים23. דיכאון תוצאה של תגובות לא מופרך ב EEfRT (הסבירות מופחתת של בחירת משימות קשות עבור תגמולים בעלי ערך גבוה). לכן, משימות בחירה הקשורות למאמץ מכרסמים מעניינות במיוחד בשל הרלוונטיות התרגום שלהם.

מתח תבוסת חברתית כרונית (SDS) הוא אחד המודלים הלחץ הקדם-לילי נחוץ יותר בעכברים זכרים. זהו פרוטוקול של 10 ימים שבו גדול, אגרסיבי מגדל בדימוס CD-1 זכרים לתקוף עכברים ניסיוניים, בדרך כלל C57BL/6J, ב 5 דקות מפגשיםיומיים 24. זה מייצר פנוטיפ התנהגותי לא מפנק חזק בתת קבוצה של עכברים ניסיוניים. בדיקת אינטראקציה חברתית משמשת כדי לשכבות עכברים לאוכלוסיות עמידות או רגישות ללחץ התבוסה, ומספר מחקרים השתמשו במאפיין ייחודי זה של SDS כדי לחקור את מנגנוני המעגל המולקולרי והנוירי הבסיסי הסתמכות מתח ורגישות. כאן אנו מתארים את פרטי פרדיגת CORT ואת יישומה למשימה ההתנהגותית של מחסום Y-maze. אנו דנים גם באפקטים SDS במשימת מחסום Y-maze. משימת מחסום Y-maze מבוססת על משימת מחסום T-מבוך, אשר משמש בעיקר חולדות כדי למדוד מוטיבציה לבזבז מאמץ עבור תגמולים גבוהים או נמוכים נוכח בשתיזרועותהמבוך 8,9,25. משימה זו יושמה גם כדי ללמוד תגובה מאמץ בעכברים מנוהל קפאין או דופמין אנטגוניסטים בעכברים26. מכרסמים יכולים גם לבזבז מאמץ גדול יותר על ידי טיפוס על מחסומים של גובה הולך וגדל בהדרגה בזרוע אחת של המבוך עבור ערך תגמול גבוה יותר, בדרך כלל 4 כדורי פרס, או לבזבז באופן משמעותי פחות מאמץ בזרוע השנייה של המבוך כדי לקבל רק 2 כדוריפרס 9. פרדיגמות תבוסה חברתית של 10 ימים לייצר פנוטיפ חזק ללא תקלות בעכברים רגישים משך כ 30 ימים, אז שינינו את המשימה מחסום Y-מבוך כדי לאמן מהר יותר ולבדוק בעלי חיים על מנת להשלים את כל הניסויים בתוך מסגרת זמן זו 30 יום24. לכן, כאן אנו גם מפרטים פרוטוקול משימה התנהגותית מחסום Y-maze המכיל אימונים מרוכזים ומפגשי מבחן מחסום יחיד כדי למדוד מוטיבציה לבזבז מאמץ לתגמול בעכברים כרוניים חשופי מתח.

למרבה הצער, הן קורטיקוסטרון כרוני ולחץ תבוסת חברתית כרונית פותחו בעכברים זכרים והם פחות יעילים בעכברים נקבה. זה מאוד בעייתי כמו נשים נוטים יותר מאשר גברים להיות מאובחנים עם הפרעות במצב רוח כגון דיכאון1. התאמות חכמות SDS אפשרו שימוש בעכברים נקבה אבל דורשים ניתוחים קשים אואיסוף שתן מייגע 26,27. לאחרונה תיארנו שינוי פשוט בפרדיגמת SDS, הנקראת מתח תבוסת חברתית כרונית (CNSDS). CNSDS מאפשר ריבוד רגיש וגמיש של עכברים זכר ונקבה ניסיוניים28. הן עכברים רגישים נקבה וזכר חשופים CNSDS להראות הימנעות מוגברת של זרועות פתוחות במבוך מוגבה פלוס של המרכז בשדה פתוח ולהציג השהיה מוגברת לאכול בהאכלה מודחקת חידוש. CNSDS הוא גם יעיל יותר מאשר שינויים אחרים SDS, כמו שני המינים משולבים במפגשי תבוסה. התוצאה היא תשואה מוגברת של עכברים ניסיוניים ללא עלייה בזמן ומאמץ הקשורים הנדרשים כדי להשלים את הפרוטוקול. לכן, אנו מסכמים את כתב היד הזה עם מצגת מעמיקה של פרדיגמת מתח כרונית שפותחה לאחרונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים אלה נערכו בהתאם להנחיות NIH לטיפול בבעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש המוסדיים בבעלי חיים באוניברסיטת רטגרס.

1. קורטיקוסטרון כרוני (CORT)

  1. הקצה עכברים באופן אקראי לקבוצות טיפול. לחלק באופן אקראי עכברים זכר בוגר C57BL/6J לתוך רכב וקבוצות קורטיקוסטרון (CORT).
    1. עכברי רכב בית בכלובים נפרדים, ועכברי CORT באחרים, כמו הטיפול שלהם מועבר דרך בקבוק המים של הכלוב.
    2. תייגו כרטיסי מים מיוחדים כדי למקם בכלוב המ מודיע לצוות הטיפול בבעלי חיים כי בקבוקי המים מכילים פתרונות הדרושים לניסוי.
  2. להפוך את פתרון הרכב על ידי המסת 3.375 גרם של בטא-ציקלודקסטרין לתוך 750 מ"ל של מי ברז במיכל זכוכית בגודל 1 L בורג העליון.
    1. מלא בקבוקי מים כלוב רכב עם פתרון זה. ודא שהבקבוק אינו דולף כדי למדוד את הצריכה הנוזלית.
    2. תייגו את המכל וחסנו בטמפרטורת החדר על המדף במעבדה. השתמש בתמיסת הרכב כדי למלא בקבוקי כלוב במשך כשבוע.
    3. למלא בקבוקי רכב לאורך כל השבוע. למלא בקבוקי כלוב 1x-2x במהלך השבוע במידת הצורך. תחליף לבקבוק טרי פי 1 בשבוע בתחילת השבוע או בסוף השבוע.
      הערה: לאחר שבוע, בטא-ציקלודקסטרין יתחיל לכסות את החלק הפנימי של בקבוק המים והופך את הפתרון מעונן.
    4. לפקח על כמות הנוזלנצרך פעמיים בשבוע ולהקליט. לשקול כל בקבוק בהתאמה להקליט, להיזהר לא לשפוך כל נוזל. למלא ולהחזיר כל בקבוק.
      הערה: כלוב של 5 עכברים ישתה 80-120 מ"ל של נוזל ב 3-4 ימים.
  3. להפוך את פתרון CORT על ידי המסת ראשון 3.375 גרם של בטא-ציקלודקסטרין לתוך 750 מ"ל של מי ברז במיכל זכוכית בגודל 1 L בורג העליון. לאחר מכן להוסיף 26.25 מ"ג של קורטיקוסטרון.
    1. תמיסת CORT Sonicate כדי להמיס CORT לתוך המים. מניחים את המיכל באמבט מים מנקה אולטראסוניות. Sonicate ב 40 kHz במשך כ 30 דקות או עד corticosterone מומס נוזל נראה ברור.
      הערה: homogenizers אולטראסוניות (טיפ בסגנון) יעילים גם להמסת CORT.
    2. מלא בקבוקי מים לכל כלובי CORT עם פתרון. מיכל תווית ולאחסן בטמפרטורת החדר על המדף במעבדה. פתרון CORT יכול לשמש למילוי בקבוקי כלוב במשך כשבוע.
      הערה: השתמשו בבקבוקי מים מזכוכית חומה או בבקבוקי פלסטיק אטומים, מכיוון ש-CORT רגיש לאור.
    3. לפקח על כמות הנוזלנצרך פעמיים בשבוע ולהקליט. שקול את כל כלי הרכב ועכברי CORT מדי שבוע כדי להשוות את הנוזל הנצרך למשקל של עכברים בתוך כל כלוב.
    4. כדי לקבוע את נפח הנוזל הנצרך (mL/g/day), השתמש במשוואה הבאה:
      (כלוב נפח שתה ב 3-4 ימים האחרונים) / (משקל גוף ממוצע של עכברים בכלוב) X מספר ימים מאז רכב או בקבוק CORT כבר מחדש מלא)
      הערה: כלוב ממוצע של n = 5 זכר בוגר C57BL/6J עכברים לצרוך בממוצע 0.25 – 0.30 מ"ג / g/day, אשר בדרך כלל נשאר עקבי באמצעות ליביתום אד ותקופות זמן ללא מזון. ריכוזים אלה לגרום מינונים משוערים של 24 מ"ג/ק"ג/יום בטא-ציקלודקסטרין, ו 9.5 מ"ג/ק"ג/יום CORT15,16.
  4. לחץ תבוסה חברתית (SDS)
    1. השתמש בפרוטוקולי לחץ תבוסת חברתית סטנדרטיים כמתוארלעומק במקום אחר 24,29.
  5. משימת מחסום Y-מבוך
    1. מניעת מזון למשימת מחסום Y-maze
      1. יום לאחר השלמת בדיקת האינטראקציה החברתית, שקול את כל העכברים בקרה וניסיוני. זה יהיה משקל הגוף שלהם האכלה חופשית.
        הערה: בכאן, אנו משתמשים ב"בקרה" ו"ניסיונית" כדי להתייחס הן לבקרת SDS והן לעכברים ניסיוניים של SDS, כמו גם לעכברים המנוהלים על-ידי רכב ו-CORT בפרדיגמות SDS ו-CORT המתאימות.
      2. כדי למנוע מהעכברים, הסר רק את האוכל של המעבדה מהצד C57BL/6J של כל כלוב.
      3. לשקול את כל העכברים, כמו גם את כמות האוכל מעבדה כי יינתן מדי יום, על מנת לשמור כראוי על משקל הגוף על כ 90% של משקל האכלה חופשית לאורך כל הבדיקות.
        הערה: כמות המזון הנמסר בכלוב הביתי של כל עכבר או עכבר תהיה תלויה במשקל הגוף המשתנה ובכמות כדורי הגמול הנצרכת בכל יום של אימון או בדיקות במבוך Y.
      4. לבסס היכרות עם כדורי הפרס. לזרוק כף קטנה של 20 מ"ג של כדורי מזון מבוססי תבואה (Bio-Serv) לתוך הכלוב הביתי. זה יהיה לבסס היכרות עם הכדורים ולהניע את העכברים לצרוך אותם ב-Y-מבוך באימונים קבועים ואימונים ראשוניים.
  6. Y-מבוך 2 מנואם
    1. לבנות מבנה Y-מבוך של לבן אטום 3/16 "רוחב פרספקס, עם שלוש זרועות מדידה 26 ס"מ אורך, 20 ס"מ גובה, ו 7 ס"מ רוחב.
    2. השתמש במחיצות המחליקות בין חריצים במבוך Y כדי לאפשר לחוקר לסגור את תיבת ההתחלה שבה העכברים ממוקמים בתחילה, או להכיל את העכבר לתוך כל זרוע לאחר שהם בחרו ונכנסו לזרועות השמאליות או הימניות של מבוך Y.
    3. צור מספר מחסומים 10, 15 ו-20 ס"מ גבוהים Y-מבוך מתוך רשת התיל עבור הצד האנכי, ועם פרספקס בזווית של כ- 45° בצד האחורי בזווית. זה מאפשר לעכברי C57BL/6J לאחוז ולטפס על צד רשת התיל האנכית של כל מחסום, ולאחר מכן לחצות את הצד הזוויתי פרספקס של המחסום.
      1. הוסף שלבים דקים בצד הזוויתי כדי לאפשר משיכה גדולה יותר.
  7. Y-מבוך מגורים
    1. לתכון את כל העכברים בקרה וניסיוניים ל-Y-מבוך.
      1. יום לאחר מניעת מזון, מניחים מספר גדול של 20 כדורי מזון מ"ג מבוססי תבואה (למשל, Bio-Serv) בכובע של צינור צנטריפוגה 50 מ"ל והמקום בקצוות של כל זרוע של מבוך Y. כובעים אלה משמשים ככלי קיבול מזון קטנים לעכברים, והעכברים ילמדו בקלות לאכול את כדורי המזון.
      2. מקם כל עכבר בתיבת ההתחלה של מבוך Y עם המחייצה תיבת התחלה במקום.
      3. לאחר מספר שניות, הסר את המחייצה, ואפשר לכל עכבר לחקור את מבוך ה-Y למשך 15 דקות. כמות זמן זו מאפשרת לעכבר לחקור כראוי את כל זרועות המבוך ולבסס היכרות עם ההתניות.
        הערה: עכברים מסוימים אינם רשאים לצרוך כדורי מזון ביום זה של מגורים.
    2. ביום שלמחרת, להשלים 15 דקות 2-מבוך מגורים באמצעות הליך זהה.
      1. שימו לב לעכברים שלא אכלו כדוריות. לעכברים האלה, זרוק עוד סקופ קטן של כדורים לתוך הכלובים הביתיים שלהם.
  8. אימון בחירה כפויה של מבוך Y
    1. ציין את הגמול הגבוה (HR) ואת זרוע התגמול הנמוך (LR) עבור כל עכבר.
      1. הקצה עכברים באופן אקראי הן בקבוצות בקרה והן בקבוצות ניסיוניות, הזרוע השמאלית כזרוע התגמול הגבוה (HR) והיד הימנית כזרוע התגמול הנמוך (LR), או להיפך. לפיכך, 4 כדורי יהיה זמין בכל משפט בצד שמאל, זרוע HR, ו 2 כדורי זמין בצד ימין, זרוע LR, או ההפך.
      2. איזון נגדי של זרועות LR ו-HR ייעודיות אלה הן בקבוצה בקרה והן בקבוצה ניסיונית, כך שכמחצית מכל קבוצה הייתה זרוע שמאל כזרוע משאבי אנוש, ולמחציתן הייתה הזרוע הימנית כזרוע משאבי אנוש.
    2. ניסויי בחירה כפויה
      1. לאחר 2 ימים של מגורים Y-מבוך, יש עכברים להתחיל 3 ימים של 10 ניסויים של אימון בחירה כפויה.
      2. עבור כל ניסוי בחירה כפויה, מקם את העכבר בתיבת ההתחלה ולאחר מכן הסר את המחיצה, ואפשר לעכבר 60 s להזין את הזרוע השמאלית או הימנית ולצרוך את הכדורים הזמינים. עבור כל בלוק ניסיון בחירה כפויה את הזרוע הנגדית עם המחיצה, מכריח את העכבר לבחור את הזרוע השנייה. עבור ניסיון בחירה כפויה של משאבי אנוש, חסום גישה לזרוע LR, או להיפך.
      3. הסר את העכבר לאחר המשפט וחדש את כדוריות השונות שנאכלו.
      4. ניסויים חלופיים לבחירה כפויה עבור כל עכבר בכל יום אימון, כך שעכברים משלימים 5 HR ו- 5 LR לניסויים בבחירה כפויה.
        הערה: ניסויים בבחירה כפויה מאמנים את העכברים לשייך יד אחת לתגמול הגבוה יותר והשנייה עם הפרס הנמוך יותר.
      5. המקם את העכבר בחזרה לתוך הכלוב הביתי שלו ולאחר מכן להפעיל לא יותר מ 3-5 העכברים הבאים על מנת לשמור על מרווח בין משפט 5 דקות עבור כל עכבר.
  9. אימון בחירה חופשית מבוך Y
    1. ניסויים בבחירה חופשית
      1. התחל כל מפגש בחירה חופשית עם ניסיון בחירה כפויה של משאבי אנוש ו- LR. לכן, עכברים יחוו להיות נאלץ לתוך כל זרוע לפני תחילת 10 ניסויים בחירה חופשית.
      2. מקם כל עכבר בתיבת ההתחלה והסר את המחייצה. לאחר שהעכבר בחר זרוע וחצה אותה עד הסוף שבו ממוקמת הספל המכיל את הכדורים, הנח את מחיצת הזרוע במקום בצד זה, ותנעל את העכבר עד שהוא נצרך את הכדורים.
      3. הסר את העכבר בחזרה לכלוב הבית שלו והריץ את 3-5 העכברים הבאים המשמשים במחזור זה כדי לאפשר מרווח זמן של 5 דקות בין ניסיון.
    2. הקלט את הנתונים הבאים: השהיה לבחירת זרוע, בחירת זרוע והשעיה כדי להגיע לגביע כדורי.
      1. הקלט איזו זרוע העכבר נכנס וחוצה באופן מלא לגביע כדורי. כמו כן להקליט את ההשעיה כדי לבחור את הזרוע ולהגיע לגביע כדורי.
      2. שקול כל ניסיון שבו עכבר אינו בוחר זרוע או אינו צורך את כל 4 או 2 כדורי כמשפט שהושמט.
    3. 70% קריטריון בחירה חופשית
      1. רטו איזו זרוע נבחרת עבור כל 10 הניסויים בבחירה חופשית מדי יום.
      2. לאחר שעכבר בחר את זרוע משאבי האנוש ב- 7 מתוך 10 הניסויים ביום אימון בחירה חופשית (70% קריטריון), הזז את העכבר למפגשי בדיקות מחסום.
        הערה: המשך באימון בחירה חופשית עד שכל העכברים יגיעו לקריטריון זרוע ה-HR בשיעור של 70% כדי להבטיח אפליה נאותה של זרועות משאבי אנוש ו-LR ושעכברים יפגינו העדפה שווה לזרוע משאבי האנוש.
  10. בדיקת מחסום מבוך Y
    1. הפעלת בדיקת מחסום של 10 ס"מ
      1. מניחים את מחסום ה-10 ס"מ באמצע הדרך במורד זרוע משאבי האנוש במבוך Y.
      2. התחל עם מספר ניסויים בבחירה כפויה עבור שתי הזרועות. עכברים עמידים לטיפוס על המחסום יכולים להיות מתבקשים עם חתיכת פרספקס ארוכה ודקה.
        הערה: מניסיון, אנו ממליצים על לפחות 2 ניסויים לבחירה כפויה עבור זרועות HR ו- LR בתחילת כל מפגש בגובה מחסום חדש. אנו ממליצים להקליט ניסויים היכן שיש צורך להנחות את העכבר לטפס מעל המחסום אם זה הופך להיות נחוץ. עכברים בדרך כלל ללמוד לטפס על מחסום 10 ס"מ, שהוא לא כל כך גבוה שהם לא יכולים לעמוד ולראות על זה, בתוך 1-2 ניסויים. המחסום יצטרך להיות מונח בצד השני עבור עכברים עם הזרוע היריבה כזרוע משאבי אנוש המיועדת.
      3. מקם כל עכבר בתיבת ההתחלה, הסר את המחיץ ואפשר לעכבר לחצות את המבוך ולבחור זרוע ל- 10 ניסויים בבחירה חופשית המכילה את מחסום 10 ס"מ בזרוע משאבי האנוש.
      4. אם העכבר בוחר בצד משאבי אנוש, הוא יטפס מעל המחסום כדי לקבל את הפרס הגדול יותר, 4 כדורי. אחרת, הוא יבחר את זרוע LR ופשוט יחצה את רצפת המבוך עבור הפרס הנמוך יותר, 2 כדוריות.
      5. הקלט את הזרוע שנבחרה ואת ההשעיה כדי לבחור זרוע ולהגיע לגביע הכדורי עבור כל הניסויים. באופן דומה לסובב 4-6 עכברים סה"כ מחזור, כדי לשמור על מרווח בין ניסיון של 5 דקות.
        הערה: ספריי 70% אתנול במבוך Y ולנגב יבש באופן עקבי ובין כל עכבר.
    2. הפעלת בדיקת מחסום של 15 ס"מ
      1. ביום שלמחרת להשלים את כל השלבים המפורטים כאמור לעיל (שלב 1.10.1), אך עם מחסום 15 ס"מ גבוה בזרוע HR.
    3. הפעלת בדיקת מחסום של 20 ס"מ
      1. ביום שלמחרת להשלים את כל השלבים המפורטים כאמור לעיל (שלב 1.10.1), אך עם מחסום 20 ס"מ גבוה בזרוע HR.
        הערה: מניסיון, על ידי גובה מחסום 20 ס"מ רוב העכברים SDS רגישים או CORT ניסיוני (ואפילו כמה עכברי בקרה) יזיזו את תגובותיהם לזרוע LR, כפי שהם לא מוטיבציה מספיק כדי לטפס על מחסום גבוה 20 ס"מ. כמו כן, מתאם פרספקס ייתכן שיהיה צורך להשתמש כדי למנוע מעכברים לטפס מראש מחסום זה אל הקצוות של קירות מבוך Y. איננו ממליצים לבנות מבוך Y גבוה יותר, כפי שזה הופך להיות קשה יותר עבור הנסוי למלא את הכדורים בכל ולהסיר את העכברים לאחר כל ניסוי.
    4. מפגש מבחן אפליה תגמול
      1. כדי להבטיח שעכברים ניסיוניים ובקרה יציגו מנופים נאותים ודומים של אפליה בתגמול, ערכו בדיקת אפליה.
      2. בצע את כל השלבים לעיל (שלב 1.10.1) אך מקם מחסום של 10 ס"מ בזרוע LR. עכשיו, שתי הזרועות מכילות מחסומים של 10 ס"מ, והעכברים יצטרכו לטפס מעל או כדי להשיג את פרס 4 או 2 כדורי.
      3. הקלט השהיה ובחירה בזרוע עבור כל 10 הניסויים.
        הערה: מכיוון שעכברים יצטרכו לבזבז את אותו מאמץ כדי להשיג גמול, עכברים צריכים לבחור את זרוע משאבי האנוש ברוב הניסויים. כדי לבחון השהיות לבחירת זרוע משאבי אנוש ו- LR, חשב השהיה ממוצעת של זרוע משאבי אנוש והשעיה ממוצעת של זרוע LR עבור כל עכבר בודד. לאחר מכן, השווה השהיה לבחירת שתי הזרועות באמצעות ANOVA מעורב דו-מבין, עם SDS (בקרה, SDS-רגיש, SDS-גמיש) כגורם בין הנושאים, וזרוע (זרוע HR, זרוע LR) כגורם בתוך הנושאים.

2. מתח תבוסת חברתית כרונית לא מפלה (CNSDS)

  1. מסך להתנהגות אגרסיבית בעכברי CD-1
    1. הכן זכר אחד ועכבר C57BL/6J אחד בכלוב הביתי של כל תקליטור-1 למשך 180 שניות או עד שה-CD-1 יתקוף את שני העכברים. עכברים אלה C57BL6/J לא צריך להיות נאיבי, ולא ישמש בניסויים נוספים. במהלך שלב הקרנה תוקפני זה, לא cohouse עכברים C57BL/6J עם עכברי CD-1.
      1. הקלטה של ההמהיה כדי לתקוף את שני עכברי C57BL/6J עבור כל תקליטור-1.
      2. בחר את כל התוקפים CD-1 לתקוף הן זכר ונקבה C57BL/6J עכברים בתוך 60 שניות על הפעלות רצופות מתוך סך של 3 הפעלות הקרנה. אחרים יכולים לשמש לדיור מוגן בכלובים ביתיים.
        הערה: אזהרה חשובה של תבוסה חברתית היא הנוכחות של פציעה כתוצאה של תוקפנות פיזית. כל עכבר בהקרנה ושלבים ניסיוניים יש לבדוק פצעים ולטפל עם כלורו-הקסאן חיטוי אם נגעים בעור קטן נוכח. יש להסיר כל עכבר עם פצע שרוחבו יותר מ-1 ס"מ מהניסוי.
  2. הקצה עכברים לקבוצות בקרה וניסיוניות.
    1. אסוף את כל העכברים הנאיביים זכר ונקבה C57BL/6J, כמו גם מוקרנים זכר בדימוס CD-1 מגדלים, כמו גם זכרים CD-1 לשימוש בדיור מוגן.
      1. הקצה באופן אקראי עכברים זכר ונקבה בוגרים C57BL/6J כדי לשלוט או תנאים ניסיוניים. כל זכר ונקבה יהיו מזווגים לכל מפגשי התבוסה החברתית בקבוצה הניסיונית CNSDS. זכרים ונקבות בקבוצת בקרת CNSDS יסתובבו בכל יום.
      2. הקצה זכרים CD-1 לשימוש במפגשי תבוסה חברתית או להיות באירוח משותף עם זכרים ונקבות ניסיוניים לאחר כל מפגש, אשר יהיה לסירוגין מדי יום עבור כל זוג של עכברים זכר ונקבה C57BL/6J.
  3. לחץ כרוני לא מפלה תבוסה חברתית (CNSDS)
    1. הבא את כל העכברים לחדר תבוסה חברתי ייעודי, כולל כל זכרי CD-1, עכברי CNSDS Control זכר ונקבה C57BL/6J, ועכברים ניסיוניים של CNSDS C57BL/6J.
      1. ליישר 4-6 כלובים של זכרים CD-1 עם C57BL / 6J זכרים ונקבות עם כלובים CD-1 בחזית ו C57BL / 6J כלובים מאחור.
      2. ציין עם תגי זיהוי כלוב איזה עכבר מותקף ולאחר מכן שותה יחד עם איזה CD-1 כדי להבטיח את הארגון של כל העכברים.
        הערה: לאחר אתחול ניסויים ביום הראשון, עכברים ניתן לסובב עבור הנותרים 9 מפגשי תבוסה כך שכל זוג זכר ונקבה C57BL/6J מסובבים כלוב אחד שמאלה עבור כל מפגש. הדבר מאפשר אינטראקציה חדשה עם תקליטורי CD-1 חדשניים בכל הפעלה.
    2. הליך קבוצתי ניסיוני של CNSDS
      1. מקום זכר בוגר אחד ועכבר C57BL/6J בוגר אחד לתוך הכלוב הביתי של כל זכר תוקפני CD-1 למפגש תבוסה חברתית של 5 דקות.
      2. שיא השהיה התקפה ותדירות של התקפה עבור שני זכר ונקבה ניסיוני C57BL / 6J עכברים.
      3. לאחר 5 דקות, הסר עכבר C57BL/6J זכר והמקום בכלוב של זכר CD-1 המשותק במקום, המופרד על ידי מחסום פרספקס ברור ומחורר. הפרד את ה-CD-1 ועכבר C57BL/6J עם מחסום פרספקס ברור ומחורר דומה. לסירוגין אם זכר או נקבה C57BL/ 6J העכבר שיהיה עם התוקפן CD-1 בכל יום.
        הערה: לאחר כל אינטראקציה יומית של 5 דקות, כל עכבר ייבחן לפציעות ופצעים שטופלו אם פחות מ-1 ס"מ. כל פצע גדול מ- 1 ס"מ יגרום להסרת המתת חסד מיידית של העכבר. לכן, עכברים ניסיוניים זכר ונקבה הם בשותף עם התוקפן CD-1 במשך 5 ימים עם הרומן CD-1 לא בשימוש במפגש ההתקפה במשך 5 הימים הנותרים. מחסומי פרספקס ברורים ומנוקבים מונעים אינטראקציה פיזית אך מאפשרים מגע חושי עם תוקפן CD-1 ב-24 השעות שבין המפגשים. שפות הנרתיק ניתן לבצע על כל העכברים הנשיים כ 30 דקות לאחר תבוסה בכל יום כמתואר קודםלכן 28.
    3. הליך קבוצת בקרה של CNSDS
      1. מקם נקבה שליטה אחת בכלוב הבית של עכבר אחד C57BL/ 6J זכר שליטה.
      2. לאחר 5 דקות, עכברים נפרדים ולהוות מפריד פרספקס ברור, מחורר בין העכברים.
      3. החזירו עכברים לחדר המושבה והניצו על מדף נפרד ככלובים ניסיוניים של CNSDS. בחדר המושבה יש לנו מדפים ייעודיים שבהם עכברים לחוצים שוזמנו בנפרד מעכברים אחרים בחדר המושבה. בנוסף, ניתן לראות את ההשפעות בעכברים שאינם לחוצים אם הם היו עדים לתוקפנות המתרחשת, כפי שניתן לראות בפרדיגמהתבוסה חברתית עקיפה 30
      4. שים לב לכל התקפה או התנהגות הרכבה במהלך כל אינטראקציה של בקרה.
    4. שליטה בעכברים זכר ונקבה יוכנסו conspecific חדש בימים הבאים כפי שנעשה בקבוצות מסורתיות בקרת מתח תבוסה חברתית. השלם 10 ימים רצופים של בקרת CNSDS ומפגשים ניסיוניים.
      1. לאחר השלמת 10ו הסופי בקרה או מושב CNSDS ניסיוני, לשתף את כל העכברים ולשמור על דיור משותף זה לאורך כל הבדיקות ההתנהגותיות. כל כלוב יכלול 2 עכברים המופרדים משני צדי המחיץ פרספקס כדי לאפשר חשיפה חושית. עכברי שליטה שוחסנים בעכברים אחרים לשליטה במין השני, בעוד עכברים ניסיוניים נמצאים במקום עם עכברים ניסיוניים ממין נגדי.
      2. כל נקבה C57BL/6J בקרה היא בשותף עם זכר C57BL / 6J בקרה זה אינטראקציה עם במפגש10, עם ברור, מפריד פרספקס ממוקם לתוך הכלוב להפריד בין שני העכברים.
      3. כ-24 שעות לאחר התבוסה הסופית, הפעל בדיקת אינטראקציה חברתית סטנדרטית כדי לקבוע אם CNSDS מפחית את ההתנהגות החברתית עם עכבר CD-1 חדשני בהשוואה לשליטה, ולשכב עכברים "גמישים" או "רגישים" ללחץ24,29.
    5. בדוק בקרת CNSDS ועכברים ניסיוניים זכר ונקבה בהתנהגויות אחרות, כולל המשימה מחסום Y-maze, ולשכב את קבוצת CNSDS לקבוצות CNSDS-עמיד CNSDS ו- CNSDS רגיש.
  4. בדיקת אינטראקציה חברתית
    1. כיוונון ראשוני עבור בדיקת אינטראקציה חברתית
      1. 24 שעות לאחר מפגש התבוסה האחרון של CNSDS, ערכו בדיקת אינטראקציה חברתית.
      2. קח את כל העכברים בקרה וניסיוניים, כמו גם זכר CD-1 רומן לא בשימוש בפרדיגמה CNSDS, לחדר התנהגות נפרד כדי להפעיל בדיקת אינטראקציה חברתית.
      3. הגדר תא שדה פתוח סטנדרטי (75 ס"מ על 75 ס"מ) מתחת למצלמת הקלטה המחוברת לתוכנה למעקב התנהגותי (לדוגמה, את'ויז'ן) הפועלת במחשב ייעודי.
      4. הקימו ניסוי חדש עם אזור אינטראקציה חברתית של 24 ס"מ על 24 ס"מ סביב מיכל אינטראקציה (מיכל פרספקס קטן ומחורר שמודד כ-10 ס"מ על 10 ס"מ על 10 ס"מ) שימקם את הרומן CD-1 לאורך קיר אחד של השדה הפתוח, בשני מתוך 2 ניסויים רצופים של 2.5 דקות. כך, אזור אינטראקציה ברוחב 7 ס"מ מקיף את המיכל המכיל את עכבר CD-1 החדשן.
    2. הפעלת עכבר במבחן האינטראקציה החברתית
      1. מקם כל עכבר בפינה רחוקה של השדה הפתוח למשך ניסיון של 2.5 דקות ללא הווה CD-1 והתחיל את תוכנת ההקלטה.
        הערה: זכור שיש לשים את הגורם המכיל של האינטראקציה במרכז קיר אחד של השדה הפתוח ולא להכיל עכבר CD-1 עבור ניסיון ראשון זה.
      2. לאחר 2.5 דקות, הסר את העכבר בחזרה לכלוב הביתי שלו. נקה את השדה הפתוח עם 70% אתנול.
      3. מקם את הרומן CD-1 זכר לתוך קוביית פרספקס מחוררת שנייה לאורך אמצע קיר אחד של השדה הפתוח.
      4. שוב, מקם את העכבר בפינה של השדה הפתוח למשך ניסיון שני של 2.5 דקות, כעת עם ה-CD-1 הנוכחי, והתחיל את תוכנת ההקלטה.
      5. הסר את העכבר והמקם אותו בחזרה בכלוב הבית שלו. הסר את התקליטור-1 והחזר אותו לכלוב הביתי שלו. נקה את השדה הפתוח עם 70% אתנול.
    3. הפעל את בקרת CNSDS הנותרת ועכברים ניסיוניים וחשב את יחס האינטראקציה.
      1. חזור על הליך זה עם כל העכברים האחרים כדי לכמת את הזמן שהושקע באזור האינטראקציה הן במשפט 1 והן במשפט 2 עבור כל בקרת CNSDS ועכבר ניסיוני.
      2. כדי לחשב יחס אינטראקציה, השווה את הזמן שהושקע באזור האינטראקציה החברתית במשפט 2 (CD-1 הנוכחי) לעומת במשפט 1 (CD-1 נעדר), באמצעות המשוואה הבאה:
        יחס אינטראקציה = (זמן באזור אינטראקציה במשפט 2)/(זמן באזור אינטראקציה במשפט 1)
    4. שכבות עכברים כמו "CNSDS-גמיש" או "CNSDS רגיש". לעכברים עמידים יש יחס אינטראקציה של > 1.0, בעוד שלעכברים רגישים יש יחס אינטראקציה של <=1.0.
      1. באמצעים התנהגותיים הבאים כגון משימת מחסום Y-maze או בדיקות התנהגות אחרות, לחלק את העכברים הניסיוניים CNSDS לתוך פנוטיפים אלה CNSDS עמיד ו- CNSDS רגישים.
      2. לכן, עבור נקבות, ANOVAs חד-כיוון יכול לנוהל בין בקרת CNSDS, CNSDS ניסיוני-גמיש, ו- CNSDS ניסיוני רגישים קבוצות, עם השוואות פוסט הוק כדי לקבוע הבדלים בין קבוצות במידת הצורך.
      3. להשוואות בין הבדלי מין, נהל ANOVAs דו-מבין עם CNSDS (בקרה, עמיד, רגיש) ומין (זכר, נקבה) כגורמים בין נושאים. השתמש בהשוואות שלאחר ההוק במידת הצורך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CORT כרוני היה מנוהל במשך 4 שבועות ואחריו אימון מחסום Y-מבוך ובדיקות (איור 1A). בחבורה נפרדת, פרדיגמת SDS של 10 ימים באה באופן דומה לאחר אימון ובדיקות במשימת מחסום Y-maze (איור 1C), כדי לקבוע את ההשפעה של פרדיגמות מתח כרוניות אלה על התנהגות בחירה הקשורה למאמץ בעכברים זכרים. CORT כרוני ו-SDS שניהם מופחתים משקל גוף ממוצע בהשוואה לעכברי רכב ועכברים בקרת SDS כפי שנקבע על ידי t-בדיקות(טבלה 1). עכברים אלה גם צרכו פחות אוכל מעבדת כלוב ביתית מרושעת לאורך כל הבדיקות(טבלה 1).

בcohort CORT, ANOVA מעורב עם CORT כגורם בין הנושאים ושבוע כמו בתוך נושאים גורם מצביעים על רכב ועכברים המנוהלים על-ידי CORT צרכו נפח דומה של נוזל על פני 4 שבועות של טיפול בתוספת 3 שבועות של בדיקות התנהגות (7 שבועות בסך הכל)(איור 1B). בקוהורטה SDS, שליטה וזכרים ניסיוניים השלימו 10 ימים של פרוטוקול SDS, והוערכו עבור רגישות לפרוטוקול SDS באמצעות בדיקת אינטראקציה חברתית שבה הזמן בילה אינטראקציה עם זכר CD-1 רומן הושווה לזמן באזור האינטראקציה ללא CD-1הנוכחי 24. ANOVA חד-דרך ציינה כי SDS מייצרת פנוטיפ לא מופרך בעכברים רגישים (60%), בהשוואה לעכברים עמידים (40%) או עכברי בקרה אינם חשופים ל- SDS (איור 1D). באופן ספציפי, עכברים רגישים ל-SDS מציגים הפחתה בזמן שהושקע באזור האינטראקציה המכיל עכבר CD-1 חדשני, בהשוואה לעכברים עמידים ל-SDS ולשלוט בהם.

לאחר מכן, אימנו הן את ה-CORT (עכברים ניסיוניים ועכברים בקרה) והן את ה-SDS (רגישים ובקרה) במשימת מחסום Y-maze(איור 2A). מדדנו את מספר הניסויים שעכברים בקרה וניסיוניים יבזבזו מאמץ לטפס על מחסום עבור פרס של 4 כדורים, לעומת בחירת הזרוע השנייה של מבוך ה-Y שהכילה רק 2 כדוריות אך לא הציגה מחסום לטפס עליה. עבור SDS, ANOVA מעורב דו-דרך, עם SDS (בקרה, SDS-רגיש, SDS-גמיש) כגורם בין נושאים, זרוע (זרוע HR, זרוע LR) כמו גורם בתוך הנבדקים שימש כדי לבחון תגובה מאמץ במבוך Y. עבור CORT כרוני, ANOVA מעורב דו-דרך, עם ניהול CORT (רכב, CORT) כגורם בין נושאים, זרוע (HR, זרוע, זרוע LR) כגורם בתוך נושאים. הן CORT כרונית SDS הפיק שינוי בתגובה מאמץ כאשר גובה המחסום גדל ל 15 ס"מ ו 20 ס"מ (איור 2B ו איור 2C). אף אחד מהם לא זז בתגובה כאשר רק מחסום של 10 ס"מ היה בזרוע משאבי אנוש. יתר על כן, במפגש אפליה תגמול לאחר הבדיקה, כל העכברים הגיבו באופן דומה עבור זרוע HR כאשר מחסום 10 ס"מ הוצב הן נשק HR ו LR. לבסוף, ANOVAs דו-דרךי עם CORT או SDS כגורם בין נושאים זרוע HR או LR כגורם בתוך נושאים לחשוף כי השהיה זרוע HR ו LR עם מחסום 15 ס"מ לא הושפע על ידי ממשל CORT, והיה דומה עבור שתי הקבוצות עם נשק LR ו-HR(איור 3). לכן, CORT כרוני ו SDS בחוזקה להעביר מאמץ להגיב במשימת מחסום Y-מבוך בעכברים זכרים.

חשוב לציין, אם CORT כרוני או SDS פוגע בלמידה של משימת מחסום Y-maze (איור 4), עכברים אלה עלולים להיכשל להגיע לקריטריון באימונים בחירה חופשית, להשפיע על הפרשנות הבאה של תוצאות המחסום. לכן, אנו מציגים תוצאות מייצגות שליליות פוטנציאליות המציגות הפרש זה, המוערכות באמצעות בדיקות t-בדיקות עצמאיותנפרדות (איור 4).

הליך CNSDS מייצר פנוטיפ לא מופרך חזק בעכברים רגישים C57BL/6J זכר ונקבה(איור 5A). משימת אינטראקציה חברתית משמשת כדי שכבות עכברים לתוך עמידות (38.3%) ורגיש (61.7%) אוכלוסיות (איור 5B), שיכולותלהיות מחולקות עוד יותר לפי מין (זכרים: 43.3% עמידות, 56.7% רגישות; נקבות: 36.7% עמידות, 63.3% רגישות), תוך שימוש ב-ANOVAs חד-כיוון בין בקרת CNSDS, CNSDS Experimental-Resilient ו-CNSDS Experimental-Susceptible קבוצות. בעוד פרדיגמה שונה זה מייצר אפקטים לא מדבקים דומים כמו SDSבהתנהגויות הימנעות 28, זה עדיין לא יושם בשילוב עם תגמול רלוונטי לתרגום- ובדיקות התנהגותיות הקשורות מוטיבציה כגון המשימה מחסום Y-מבוך. זה חיוני עבור מחקרים עתידיים כדי להעריך את ההשפעות של לחצים כגון CNSDS על התנהגויות רלוונטיות תרגום כגון המשימה מחסום Y-מבוך אצל זכרים ונקבות.

קורט כרוני קבוצה משקל גוף (g)   אוכל יומי נתון (ז)  
    מתכוון Sem מתכוון Sem
הרכב 26.3 0.75 2.8 0.086
קורט (CORT) 22.4 0.58 2.4 0.065
לחץ תבוסה חברתית
שליטה 27.5 0.67 2.9 0.088
SDS (SDS) 23.8 0.66 2.5 0.074

טבלה 1: משקל הגוף וכמות המזון המסופקים מדי יום. כלי רכב ועכברים המנוהלים על ידי CORT, כמו גם עכברי בקרה ו-SDS נשקלו מדי שבוע ונרשמה כמות המזון שניתן. משקל גוף ממוצע (g) על פני בדיקות Y-מבוך, ומזון יומי ממוצע (g) נתון מצוינים.

Figure 1
איור 1: SDS גורם לפנוטיפ דיכאוני המאופיין באינטראקציה חברתית פחות.
(א)סכמטי המתאר את ציר הזמן עבור פרוטוקולי מחסום CORT ו-Y-maze. (ב)נתונים מייצגים המציגים נפח נצרך (mL/g/day) בעכברים המנוהלים על-ידי CORT. (ג)סכמטי המתאר את ציר הזמן עבור פרוטוקולי מחסום SDS ו-Y-maze. (ד)במבחן אינטראקציה חברתית מייצג, עכברים רגישים SDS להציג זמן מופחת בילה אינטראקציה עם עכבר רומן בהשוואה לעכברים SDS עמיד או בקרה. פסים הם ממוצעים ± SEM. *p < 0.05. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: CORT ו- SDS מזיזים במאמץ בתגובה במשימת מחסום מבוך Y.
(A)ציר זמן של משימת מחסום Y-מבוך עבור CORT ו- SDS. (ב)CORT כרוני מפחית את בחירת זרוע HR בגבהים מחסום 15 ס"מ ו 20 ס"מ. נתון זה שונה מ- Dieterich et al. 202021. (ג)תוצאות מייצגות המוכיחות כי עכברים רגישים SDS להפחית את הבחירה של זרוע HR ב 15 ס"מ ו 20 ס"מ גבהים מחסום, בהשוואה לשליטה או עכברים SDS עמיד. פסים הם ממוצעים ± SEM. *p < 0.05. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ההמהיה של מבוך Y אינה מושפעת מ- CORT כרוני.
CORT כרוני אינו משפיע על ההשתיה כדי לבחור זרועות LR או משאבי אנוש במבוך Y. כמו כן, עכברי רכב ו- CORT בוחרים זרוע LR או HR עם השהיות דומות. נתון זה מודפס מחדש מ-Dieterich et al. 202021. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: CORT כרוני ו-SDS פוגע בבחירת זרוע משאבי אנוש בחירה חופשית.
תוצאות מייצגות מראות כי עכברים שנחשפו גם CORT כרוני או SDS להפחית את מספר בחירות זרוע תגמול גבוה בהשוואה עכברים שליטה באימון בחירה חופשית, לסבך פרשנות של תוצאות ו / או עיכוב או מניעת מעבר לבדיקות מחסום. פסים הם ממוצעים ± SEM. *p < 0.05. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ריבוד עכברים זכרים ונקבה החשופים ל-CNSDS לאוכלוסיות רגישות וגמישות.
(א) תרשים של פרדיגמת CNSDS ניסיונית ובקרה. נתון זה מודפס מחדש מיוהן ואח' 201928. (ב) CNSDS מייצרת ריבוד חזק של עכברים עמידים בפני CNSDS (RES) ו-CNSDS רגישים (SUS). נתון זה מודפס מחדש מיוהן ואח' 201928. פסים הם ממוצעים ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעוד פרדיגמת CORT כרונית מספקת מינון CORT קבוע מי השתייה, מניסיון יכול להיות כמה שונות בכמות הנצרכת על ידי עכברים. יתר על כן, ניתן להעריך את הצריכה רק עבור הכלוב הכולל, ומוצע נלקח בהתבסס על מספר העכברים בכלוב. בנוסף, דליפה יכולה להתרחש בעת שקילת הבקבוקים, העברת העכברים לבדיקות התנהגות, או בעת שינוי לכלוב טרי. עם זאת, מעקב אחר צריכת רכב ו-CORT הוא עדיין אפשרי ומדויק על פני שבועות של טיפול ובדיקות התנהגות. אנו ממליצים בחום לשקול ולהחליף בקבוקים המכילים רכב או CORT פעם אחת בשבוע, כמו גם שמירה על זמני קבע לשקול ולהחליף בקבוקים. לדוגמה, שינוי לבקבוקים טריים בעת שקילה ומילוי הבקבוקים יכול להיעשות בימי שני, ולאחר מכן לשקול ולמלא מחדש את כל הבקבוקים שנעשה שוב ביום חמישי או שישי. באופן דומה, עדיף לשקול את כל העכברים בו זמנית ביום המיועד בכל שבוע. לבסוף, חשוב לציין כי פרדיגמה CORT זה בוטה ייצור אנדוגני של קורטיקוסטרון על ידי ציר HPA. לכן, עכברים חייבים להישאר על CORT לאורך בדיקות התנהגותיות עד שהם הוקרבו. אם עכברים נלקחים מ-CORT, אז הם עלולים לסבול משבר אדיסוני של אי ספיקת יותרת הכליה חריפה. הליכים חלופיים השתמשו 2-3 שבועות חשיפה CORT, ואחריו גנחה מתקדמת את CORT ולאחר מכן חלון בדיקת התנהגות של כ 3-4 שבועות כמו רמות CORT אנדוגנילחזור נורמלי 17,19.

במשימת מחסום Y-maze, זה קריטי להתחיל מגורים מבוך ואימונים מיד לאחר פרוטוקול SDS (איור 2A). אזהרה אפשרית של ציר זמן ניסיוני זה היא כי עכברים מאומנים בעקבות מניפולציה ולא מראש, שם הם יכולים להיות מחולקים באופן שווה בהתבסס על ביצועי אימון. עם זאת, בניסיון שלנו הכשרה לפני לעומת לאחר ניהול CORT אינו משפיע באופן משמעותי על התנהגות אינסטרומנטלית16. כל העכברים מאומנים ביסודיות ומגיעים לקריטריון (>70% בחירת זרוע HR במפגשי בחירה חופשית) לפני ההתקדמות לבדיקות מחסום. עכברים צריכים קודם להיות מיושבים כראוי במבוך, כך שהוא הופך למאמן מוכר, כפי שמצאנו זה עוזר בשלב האימון הבא. בעת אימון כל עכבר, חשוב לשמור על זרועות הגמול הגבוהות והנמוך המעוצבות עבור כל עכבר בודד, כך שעכבר אינו חוצה זרוע המצפה ל-4 כדורים ומומצא 2, או להיפך. אנו ממליצים לשמור הן נייר והן עותקים דיגיטליים של קבצי נתונים גולמיים גדולים המציינים את זרועות התגמול הגבוהות והנמוך המנוכלות עבור כל עכברי הבקרה וה-SDS.

אנחנו לא מאמינים שיש הבדל בביצועי המבוך בשל המפרטים המדויקים של צורת המבוך (Y-מבוך לעומת T-מבוך), ומאמינים כי חוקרים יכולים להשתמש או בניסויים התנהגותיים בחירה הקשורים למאמץ. כמו כן, דיווחנו בעבר על עלייה קלה בבחירת זרוע HR ב 15 ס"מ לעומת 10 ס"מ בעכברים המנוהלים על-ידירכב 21. עם זאת, החוקרים צריכים לצפות דומה או מופחתת בחירת זרוע HR כמו גובה המחסום עולה מעבר 15 ס"מ, כמו על ידי עכברי מחסום 20 ס"מ לעתים נדירות לבחור את זרוע HR21.

בנוסף, חשוב להשתמש בתרסיס אתנול 70% כדי לנקות את המבוך ולהסיר שאריות ריחות לאחר כל מפגש. אנו ממליצים גם להפעיל את העכברים באופן עקבי כך שיש מרווח זמן בין-ניסיון קבוע יחסית לכל העכברים. אנו מציעים רכיבה על אופניים כ 4-6 עכברים בכל פעם, אשר אמור לתת מרווח של כ 5 דקות. לבסוף, במפגש הבחירה החופשית האחרונה, ובכל מפגשי מבחן המחסום, חשוב להקליט השהיה כדי לבחור כל זרוע בכל הניסויים. כמו כן, עכברים מצליחים מדי פעם לקפוץ לראש קירות פרספקס, או בתדירות גבוהה יותר מראש המחסומים. אנו ממליצים על מתאם קיר פרספקס גבוה יותר לאורך צידי המבוך אם זה קורה. אלה יכולים להיות פשוט חתיכות מלבניות של פרספקס (רוחב של 20 ס"מ, אורך של 80 ס"מ). אנו מסמנים כל ניסוי שבו עכבר לא מצליח לבחור זרוע בתוך 60 שניות או בוחר זרוע אך אינו אוכל את כדורי המזון כמשפט מושמט. לבסוף, הן CORT כרוני ו SDS יכול להקטין את משקל הגוף אשר משפיע על כמות המזון הנצרך על פני שבועות שלבדיקה 21. החוקרים צריכים לשקול באופן קבוע עכברים ולהתאים את כמות המזון שניתן בכלוב הבית כדי לשמור על עכברים בכ 90% של משקל הגוף שלהם האכלה חופשית.

כאן אנו דנים גם בפרדיגמה שפותחה לאחרונה, מתח תבוסת חברתית כרונית שאינה מפלה (CNSDS) (איור 5A),לגורם לאוכלוסיות רגישות ועמידות בעכבריםזכר ונקבה (איור 5B). הפרדיגמה CNSDS יכול לשמש על ידי חוקרים פרה-קליפליים המעוניינים בהפרעות מתח או מצב רוח. בפרדיגמה של CNSDS חיוני שהנקבות הניסיוניות יותקפו לפחות פעם אחת בכל מפגש. כמעט בכל מפגשי התבוסה החברתית הזכרים הניסיוניים מותקפים מספר פעמים. כל תוקפן CD-1 חייב להיות מוקרן בקפדנות עם עכברי C57BL/6J זכר ונקבה לפני תחילת פרוטוקול CNSDS, כמו גם הקלטת כל ההתקפות בכל הפעלה. בעוד אנו מתארים מצב שליטה מינית כפולה ב מתודולוגיית CNSDS שבו זכר אחד ונקבה אחת אינטראקציה, זה עשוי להיות מתאים עבור כמה לכלול זכר נוסף עבור אינטראקציות שליטה אלה, ובכך לחקות את שני הזכרים ונקבה אחת בשימוש בהליך CNSDS. הליך בקרה חלופי זה אינו משפיע על אופן הפעולה של עכברים בהתנהגויותהימנעות 28. בנוסף, יש ליישם בדיקת אינטראקציה חברתית 24 שעות לאחר פרוטוקול התבוסה ל-10 ימים כדי להבטיח את יעילות השיטה ולשכב עכברים זכרים ונקבה כעמידים או רגישים ל- CNSDS24.

אחת הסוגיות בשימוש בגישה ההיסטורית של החלפת עכברים לאוכלוסיות עמידות ורגישות המבוססות על מבחן האינטראקציה החברתית היא שלא ניתן למדוד במדויק את כל התנהגויות הסלידה באמצעות תוכנת מעקב וידאו. עכברים "גמישים" עם ציון אינטראקציה >1 עשוי להיות מפגין התנהגות כנועה סביב המכל דיור CD1 העכבר31. חשוב שהתחום יפתח תוכנה שעוקבת טוב יותר אחר התנהגות מיקרו-התנהגותית כזו. כלים כגון ניתוח התנהגותי פשוט (SimBA32),שפותח על ידי מעבדת הזהב כדי לאפשר מסווגים התנהגותיים להתנהגויות חברתיות מורכבות מכרסמים, עשויים להיות שימושיים בהקשר זה.

הרכבה מסוימת עלולה להתרחש במהלך פרוטוקול CNSDS. למרות שלא ראינו הריונות בפרדיגמה זו, החוקרים צריכים להיות מודעים לאפשרות זו.

מגבלה נוספת של פרוטוקולי תבוסה חברתית, כולל CNSDS, היא חלון הזמן המוגבל על פי הדיווחים כדי לחקור את השפעות הלחץ על התנהגות לאחר השלמת מפגשי תבוסה חברתית. לכן, התאמנו את פרוטוקולי מחסום המבוך הקיימים כך שיתאימו לכל האימונים, האימונים והבדיקות למסגרת זמן של 30 יום. עם זאת, זה עשוי לזרז את ההכשרה הכוללת עבור עכברים מסוימים, אשר עשויים להיאבק כדי להגיע 70% קריטריון עבור בחירת זרוע תגמול גבוה הדרוש כדי להשלים מפגשי בחירה חופשית(איור 4). בנוסף, ישנם ימים מוגבלים זמינים להשלמת כל בדיקות התנהגות אחרות ללא תכנון מתאים. עם זאת, מחקרים אחרונים מצביעים על כך שלחץ תבוסה חברתית יכול לייצר השפעות מתמשכות יותר על המוח וההתנהגות. מחקרים ממעבדת Miczek מראים כי 10 ימים של לחץ תבוסה חברתית יכול להגביר את צריכת אלכוהול מרצון בעכברים משך לפחות 4שבועות 31,33. פרוטוקולי תבוסה חברתית משתמשים במפגשי תבוסה להימשך בין 5 ל-10 דקות. אנו משתמשים 5 דקות חשיפות עבור CNSDS כדי להקטין את הסבירות לפציעות בעכברים C57BL/6Jניסיוניים 28. פרוטוקול CNSDS מייצר תוצאות דומות בנקבות לפרוטוקול התבוסה החברתית שפותחה על ידי ניומן ועמיתיו, שבו עכברים נקבה C57BL/6J נחשפים לעכברים ווברשוויצריים תושבים 28. בדומה ל-CNSDS, וריאציה זו של פרוטוקול התבוסה החברתית משתמשת ב-10 ימים של 5 דקות אינטראקציות כדי לגרום לפנוטיפ מתח כרוני.

שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לבחון כיצד מתח כרוני משפיע על עיבוד גמול ומוטיבציה בעכברים. הן עיבוד גמול, והן נושאים נשיים, הם מבחינה היסטורית לא נערך בתחום הפרעת מצב רוח פרה-לקלינלית. מחקרים עתידיים צריכים לקבוע את ההשפעה של מתח כרוני על מוטיבציה תגמול זכר ונקבה ולשכב עמיד לעומת עכברים רגישים(איור 5B). זה יהיה יקר לדעת אם ריבוד זה מייצר השפעות שונות על ביצועי מחסום Y-maze כפי שניתן לראות בהתנהגויות הימנעות, כגון שדה פתוח, מבוך מוגבה פלוס, והאכלה מודחקת חידושים. מחקרים עתידיים יכולים לשלב מתודולוגיות אלה עם טכניקות אחרות, כגון אופטוגנטיקה או טכנולוגיית DREADDS, כדי לבחון את המעגלים העצביים בתיווך תגובת הלחץ או לתגמל מוטיבציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לתומאס גרייס על בניית מבוכים Y, מחסומים, וכלובי תבוסה חברתית. המחברים רוצים להודות לג'יי לי, קארינה סטק ופראצ'י Srivastava על סיוע באיסוף נתונים. עבודה זו מומנה על ידי NIMH גרנט R01 MH112861 (BAS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic Sheet McMaster Carr 8560K215 Clear, 3/16" thick, 24" X 36"
Beta-cyclodextrin Sigma-Aldrich C4767 500 mg
C57BL/6J Mice Jackson Labs 000664 Adults age 7-8 weeks
Corticosterone Sigma-Aldrich C2505 or C27840 100 or 500 mg
Male CD-1 Mice Charles River 022 "Retired Breeders"
PVC Acrylic Sheet McMaster Carr 8560K215 White, 3/16" thick, 48" X 48"
Solidstate Ultrasonic Cleaner Fisher Scientific FS-28 Must reach 40 kHz
Steel Wire Cloth McMaster Carr 9219T143 1 ft X 2 ft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kessler, R. C., et al. Lifetime and 12-month prevalence of DSM-III-R psychiatric disorders in the United States. Results from the National Comorbidity Survey. Arch Gen Psychiatry. 51 (1), 8-19 (1994).
  2. Breslau, N., Davis, G. C. Chronic stress and major depression. Archives of General Psychiatry. 43 (4), 309-314 (1986).
  3. Willner, P. Chronic mild stress (CMS) revisited: consistency and behavioural-neurobiological concordance in the effects of CMS. Neuropsychobiology. 52 (2), 90-110 (2005).
  4. Monleon, S., et al. Attenuation of sucrose consumption in mice by chronic mild stress and its restoration by imipramine. Psychopharmacology (Berl). 117 (4), 453-457 (1995).
  5. Willner, P., Towell, A., Sampson, D., Sophokleous, S., Muscat, R. Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress, and its restoration by a tricyclic antidepressant. Psychopharmacology (Berl). 93 (3), 358-364 (1987).
  6. Berlin, I., Givry-Steiner, L., Lecrubier, Y., Puech, A. Measures of anhedonia and hedonic responses to sucrose in depressive and schizophrenic patients in comparison with healthy subjects. European psychiatry: the journal of the Association of European Psychiatrists. 13 (6), 303-309 (1998).
  7. Fawcett, J., Clark, D. C., Scheftner, W. A., Gibbons, R. D. Assessing Anhedonia in Psychiatric Patients: The Pleasure Scale. Archives of General Psychiatry. 40 (1), 79-84 (1983).
  8. Pardo, M., et al. Adenosine A2A receptor antagonism and genetic deletion attenuate the effects of dopamine D2 antagonism on effort-based decision making in mice. Neuropharmacology. 62 (5-6), 2068-2077 (2012).
  9. Salamone, J. D., Cousins, M. S., Bucher, S. Anhedonia or anergia? Effects of haloperidol and nucleus accumbens dopamine depletion on instrumental response selection in a T-maze cost/benefit procedure. Behav Brain Res. 65 (2), 221-229 (1994).
  10. Dienes, K. A., Hazel, N. A., Hammen, C. L. Cortisol secretion in depressed, and at-risk adults. Psychoneuroendocrinology. 38 (6), 927-940 (2013).
  11. Gotlib, I. H., Joormann, J., Minor, K. L., Hallmayer, J. HPA axis reactivity: a mechanism underlying the associations among 5-HTTLPR, stress, and depression. Biol Psychiatry. 63 (9), 847-851 (2008).
  12. Knorr, U., Vinberg, M., Kessing, L. V., Wetterslev, J. Salivary cortisol in depressed patients versus control persons: a systematic review and meta-analysis. Psychoneuroendocrinology. 35 (9), 1275-1286 (2010).
  13. Joels, M., Karst, H., Sarabdjitsingh, R. A. The stressed brain of humans and rodents. Acta Physiol (Oxf). 223 (2), 13066 (2018).
  14. Samuels, B. A., et al. Modeling treatment-resistant depression. Neuropharmacology. 61 (3), 408-413 (2011).
  15. David, D. J., et al. Neurogenesis-dependent and-independent effects of fluoxetine in an animal model of anxiety/depression. Neuron. 62 (4), 479-493 (2009).
  16. Dieterich, A., et al. Chronic corticosterone administration induces negative valence and impairs positive valence behaviors in mice. Translational psychiatry. 9 (1), 1-13 (2019).
  17. Gourley, S. L., Taylor, J. R. Recapitulation and reversal of a persistent depression-like syndrome in rodents. Current Protocols in Neuroscience. 49 (1), 31-39 (2009).
  18. Gourley, S. L., et al. Regionally specific regulation of ERK MAP kinase in a model of antidepressant-sensitive chronic depression. Biol Psychiatry. 63 (4), 353-359 (2008).
  19. Gourley, S. L., Wu, F. J., Taylor, J. R. Corticosterone regulates pERK1/2 map kinase in a chronic depression model. Annals of the New York Academy of Sciences. 1148 (1), 509-514 (2008).
  20. Mekiri, M., Gardier, A. M., David, D. J., Guilloux, J. P. Chronic corticosterone administration effects on behavioral emotionality in female c57bl6 mice. Experimental and clinical psychopharmacology. 25 (2), 94 (2017).
  21. Dieterich, A., et al. Chronic corticosterone shifts effort-related choice behavior in male mice. Psychopharmacology (Berl). , (2020).
  22. Shafiei, N., Gray, M., Viau, V., Floresco, S. B. Acute Stress Induces Selective Alterations in Cost/Benefit Decision-Making. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2194-2209 (2012).
  23. Treadway, M. T., Buckholtz, J. W., Schwartzman, A. N., Lambert, W. E., Zald, D. H. Worth the 'EEfRT'? The effort expenditure for rewards task as an objective measure of motivation and anhedonia. PLoS One. 4 (8), (2009).
  24. Golden, S. A., Covington, H. E., Berton, O., Russo, S. J. p. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nature protocols. 6 (8), 1183 (2011).
  25. Yohn, S. E., et al. The VMAT-2 inhibitor tetrabenazine alters effort-related decision making as measured by the T-maze barrier choice task: reversal with the adenosine A2A antagonist MSX-3 and the catecholamine uptake blocker bupropion. Psychopharmacology (Berl). 232 (7), 1313-1323 (2015).
  26. Harris, A. Z., et al. A novel method for chronic social defeat stress in female mice. Neuropsychopharmacology. 43 (6), 1276 (2018).
  27. Takahashi, A., et al. Establishment of a repeated social defeat stress model in female mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
  28. Yohn, C. N., et al. Chronic non-discriminatory social defeat is an effective chronic stress paradigm for both male and female mice. Neuropsychopharmacology. 44 (13), 2220-2229 (2019).
  29. Krishnan, V., et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell. 131 (2), 391-404 (2007).
  30. Iñiguez, S. D., et al. Vicarious Social Defeat Stress Induces Depression-Related Outcomes in Female Mice. Biol Psychiatry. 83 (1), 9-17 (2018).
  31. Newman, E. L., Leonard, M. Z., Arena, D. T., de Almeida, R. M., Miczek, K. A. Social defeat stress and escalation of cocaine and alcohol consumption: Focus on CRF. Neurobiology of Stress. 9, 151-165 (2018).
  32. Nilsson, S. R., et al. Simple Behavioral Analysis (SimBA) - an open source toolkit for computer classification of complex social behaviors in experimental animals. bioRxiv. , (2020).
  33. Newman, E. L., Leonard, M. Z., Arena, D. T., de Almeida, R. M. M., Miczek, K. A. Social defeat stress and escalation of cocaine and alcohol consumption: Focus on CRF. Neurobiology of Stress. 9, 151-165 (2018).

Tags

התנהגות גיליון 162 דיכאון מתח כרוני בחירה הקשורה למאמץ מתח תבוסה חברתית קורטיקוסטרון הפרעות במצב הרוח גמול הבדלי מין
מתח כרוני משנה התנהגות בחירה הקשורה למאמץ במשימת מחסום Y-מבוך בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dieterich, A., Yohn, C. N., Samuels, … More

Dieterich, A., Yohn, C. N., Samuels, B. A. Chronic Stress Shifts Effort-Related Choice Behavior in a Y-Maze Barrier Task in Mice. J. Vis. Exp. (162), e61548, doi:10.3791/61548 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter