Summary
En protokoll for å kultur mikrosporidiske parasitten Edhazardia aedis. Parasitten er passasjer fra en generasjon Aedes aegypti mygg til neste via horisontal overføring på larvalstadiet etterfulgt av vertikal overføring på voksenstadiet. Levende sporoplasmer overlever langsiktig i infiserte egg.
Abstract
Edhazardia aedis er en mikrosporidisk parasitt av Aedes aegypti mygg, en sykdomsvektor som overfører flere arbovirus som forårsaker millioner av sykdomstilfeller hvert år. E. aedis forårsaker dødelighet og redusert reproduktiv kondisjon i myggvektoren og har blitt utforsket for sitt potensial som biokontrollmiddel. Protokollen vi presenterer for å kultere E. aedis er basert på sin naturlige infeksjonssyklus, som innebærer både horisontal og vertikal overføring på forskjellige livsstadier av myggverten. Aegypti mygg er utsatt for sporer i larvalstadiet. Disse infiserte larver modnes deretter til voksne og overfører parasitten vertikalt til deres avkom. Infiserte avkom brukes deretter som en kilde til sporer for fremtidig horisontal overføring. Culturing E. aedis kan være utfordrende for de uinnvidde gitt kompleksiteten i parasittens livssyklus, og denne protokollen gir detaljert veiledning og visuelle hjelpemidler for avklaring.
Introduction
Aedes aegypti er myggvektoren til flere arbovirus (f.eks. dengue, Zika, gul feber) som til sammen anslås å utgjøre hundrevis av millioner sykdomstilfeller hvert år og mer enn 30.000 dødsfall1,2. Behandling for sykdommer forårsaket av disse patogenene er begrenset til støttende omsorg, og det er sannsynlig at ytterligere arbovirus vil dukke opp i fremtiden3. Kontroll av myggvektoren er derfor av primær betydning, da den effektivt forhindrer overføring av nåværende og fremvoksende patogener4. Tradisjonelt bruker vektorkontrollstrategier primært kjemiske insektmidler, men motstand mot mange vanlige insektmidler har drevet etterspørselen etter nye metoder for vektorkontroll. En potensiell agent som har blitt utforsket for sine biokontrollegenskaper mot Ae. aegypti er parasitten Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, først identifisert som Nosema aedis av Kudo i 1930, er en mikrosporidisk parasitt av Ae. aegypti mygg7. Utviklingen og reproduksjonen av E. aedis er relativt kompleks og livssyklusen kan fortsette på fleremåter 7,8,9. En vanlig utviklingssyklus er beskrevet i dybden i Becnel et al., 19897 og benyttes til laboratorieforplantning (figur 1)8. Kort sagt begynner syklusen når Ae. aegypti egg vertikalt infisert med E. aedis luke inn i infiserte larver som utvikler uninukleate sporer i fettkroppen, og dør vanligvis som larver eller pupper. Uninukleate sporer utgitt fra døde larver forurenser habitatet og innta av sunne Ae. aegypti larver. Disse sporene spirer hovedsakelig i fordøyelseskanalen, smitter fordøyelsesvev av de eksponerte larver, noe som resulterer i horisontal overføring. Horisontalt infiserte larver utvikler seg til voksne (foreldregenerering) hvor binucleate sporer dannes. I kvinnen invaderer disse binucleate sporer reproduktive kanalen og deres tilhørende sporoplasm infiserer utvikle eggceller. Disse eggene klekkes deretter inn i infiserte larver (filial generasjon), noe som resulterer i vertikal overføring av parasitten og videreføring av syklusen som beskrevet ovenfor.
Flere studier har undersøkt potensialet til E. aedis for biokontroll. Infeksjon med E. aedis har vist seg å resultere i redusert reproduksjonsevne for Ae. aegypti kvinner10. Videre, i et semi-felt eksperiment, uoverkommelig utgivelse av E. aedis resulterte i total utryddelse av en test Ae. aegypti befolkningen holdt innenfor en screenet kabinett6. Mens i stand til å gjennomgå noen stadier av utvikling i et variert sett av myggarter, overføres E. aedis bare vertikalt i Ae. aegypti, noe som indikerer en høy grad av vertsspesifisitet11,12. Likeledes, i en laboratorievurdering av den potensielle miljørisikoen forbundet med E. aedis,klarte mikrosporidisk parasitt ikke å infisere ikke-mål akvatisk fauna, inkludert rovdyr som innsteg Ae. aegypti larver smittet med E. aedis13. Disse resultatene fremhever potensialet for E. aedis som skal brukes i biologiske kontrollstrategier rettet mot naturlige Ae. aegypti populasjoner.
Til tross for at E. aedis viser løfte om bruk i vektorkontroll, er det utfordringer med å kultere og distribuere den i bred skala. E. aedissporer mister infeksiøsitet på mindre enn én dag ved kalde temperaturer (f.eks. 5 °C). Selv ved varmere temperaturer (det vil at 25 °C) mister sporer raskt infeksiøsitet i løpet av tre uker14. I tillegg må E. aedis dyrkes i levende Ae. aegypti mygg og kontrollert dosing av sunne larve mygg er nødvendig for å sikre ferdigstillelse av livssyklusen og for å forhindre sammenbrudd av befolkningen som brukes til kultur8. Kravet om in vivo-kultivering byr på en utfordring; Imidlertid kan nylige fremskritt innen myggmasseoppdragelse og robotikk (f.eks. Massaro et al.15) tillate storskala generasjon av E. aedis sporer. Vi forventer at visualisering av denne metodikken vil øke tilgjengeligheten til E. aedis rearing protokollen og tillate flere forskere å undersøke grunnleggende biologi og anvendt potensial i dette systemet. Vi forventer også at det vil legge til rette for økt samarbeid med ingeniører, robotister og den bredere teknologisektoren, noe som kan bidra til å forbedre masseoppdrettingen av E. aedis.
Figur 1: E. aedis forplantning i Ae. aegypti. Forplantning av E. aedis begynner med klekking E. aedis infiserte egg. Infiserte larver er oppdratt til 4th instar, E. aedis sporer er isolert fra disse larver, og sporer brukes til å oralt infisere sunne andre / 3rd instar larver oppdratt fra enuinfisertclutch av egg (horisontal overføring). Disse orally infiserte larver blir deretter oppdratt til voksen alder (foreldregenerering) og legger egg infisert med E. aedis (vertikal overføring). Infiserte egg (filial generasjon) klekkes deretter for å fortsette infeksjonssyklusen og parasittkulturen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
1. Dag 0
- Hatch Ae. aegypti egg infisert med E. aedis ved å plassere i larve bakskuff med 1 L deionisert (DI) vann. Tilsett 50 mg fiskemat.
MERK: På tidspunktet for publisering er en laboratoriestamme av E. aedis bare tilgjengelig fra laboratorier som aktivt forsker på parasitten, da E. aedis ikke er mottagelig for langsiktig lagring, og infiserte egg lagres for tiden ikke i repositorier. Forskere som er interessert i å jobbe med E. aedis, kan kontakte den tilsvarende forfatteren for å be om infiserte egg.
MERK: Klekking av et stort antall infiserte egg er vanligvis ikke nødvendig; ti E. aedis infiserte Ae. aegypti larver er tilstrekkelig til å ≥ 1000 friske larver.
MERK: For alle deler av denne protokollen, vi plassert mygg på følgende forhold: 14 h / 10 h lys / mørk syklus, 27 ° C temperatur og 80% relativ fuktighet.
2. Dag 1
- Etter klekking, reduser tettheten av larver til ~ 100 larver per brett, og gjør nye skuffer etter behov (også med 1 L DI vann).
- Tilsett et stykke tørr kattemat i hvert brett. Etterfyll mat når den er utarmet, men gir ikke et overskudd av mat. Ett stykke kattemat (~ 200 mg) hver tredje dag er tilstrekkelig.
MERK: Juster matmengden avhengig av de spesifikke opphøyelsesforholdene (det vil si reduser maten hvis vann blir uklart eller larver dør, øk maten hvis larver er sterkt forsinket i utviklingen). Andre fôringsregimer og/eller oppringingsforhold enn de som foreslås her, kan brukes, men justeringer av tidspunktet for denne standardprotokollen kan være nødvendig.
3. Dager 4\u20125
- Når infiserte larver er 3rd - 4th instars, luke sunn / uinfisert Ae. aegypti egg i et nytt brett.
- Bak på tettheter slik at sunn Ae. aegypti nåandre - 3rd instar i 48-72 h. I våre hender kan dette oppnås ved hjelp av tettheter på 200 \ u2012300 larver per 1 L vann med ad libitum tilgang til mat. Klekking av grupper av sunne egg over flere dager kan garantere at larver er på riktig stadium når det trengs.
4. Dager 7\u20128: Horisontal overføring
MERK: Dosing av friske larver med E. aedis kan ikke utføres før uninukleate sporer er på høye tall i infiserte larver (1 x 104 - 1 x 106 per larve). Dette skjer sent i 4th instar scenen (Figur 2).
- Høst og kvantifisere uninukleate sporer.
- Bruk en overføringpipette (man må kanskje kutte spissen til en bredere diameter) for å flytte 10 infiserte larver til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Fjern avlsvann med en overføringspipet og vask en gang ved å tilsette ~ 1 ml rent DI-vann. Fjern vaskevannet med en pipet, tilsett 500 μL rent DI-vann til de 10 larver, og homogeniser ved hjelp av en pestle og mekanisk homogenisator.
- Kvantifisere sporer ved hjelp av et hemocytometer ved 400x forstørrelse.
MERK: Uninukleate sporer kan identifiseres ved deres distinkte pyriformformform (det vil si pæreform; Figur 2A).
- Dose sunn Ae. aegypti larver med E. aedis.
- Lag fersk larvematslam ved å blande 1,2 g leverpulver, 0,8 g bryggergjær og 100 ml vann.
MERK: Maten trenger ikke å være frisk hvis den er autoklavet og oppbevares ved 4 °C til bruk. - Overfør 100andre - 3rd instar sunn Ae. aegypti larver i 150 ml beger eller prøvekopper.
- Doser hvert beger på 100 larver med 5 x 104 – 1 x 105 sporer.
- Tilsett 2 ml larvalmatslam og DI-vann til et endelig volum på 100 ml.
- Lag fersk larvematslam ved å blande 1,2 g leverpulver, 0,8 g bryggergjær og 100 ml vann.
- Etter 12–24 timer eksponering, overfør eksponerte larver til bakskuffer og bakover til voksen alder etter en standard oppholdelsesprotokoll16.
5. Overvåking og vertikal overføring
- Overvåk dosed larver for pupering og overfør pupper når de utvikler seg til en fremvekstskopp i et bur. Sukker feed voksne ad libitum (per16,17). Eclosing voksne vil bli smittet av E. aedis.
- Blod fôr voksne (per16,17) og samle egg. Vertikal overføring av E. aedis skjer på dette trinnet.
MERK: Hvis ytterligere blodmåltider gis så snart oviposisjonen er fullført, kan kvinner legge minst en ekstra clutch av egg før voksne lider (ofte plutselig) høye nivåer av dødelighet. - Bruk disse Ae. aegypti egg infisert med E. aedis å fortsette forplantning starter med trinn 1 av denne protokollen.
MERK: Egg kan oppbevares i 2 – 3 måneder under passende forhold16. - Rengjør alle materialer som kom i kontakt med E. aedis med 10% blekemiddel og autoklavering (om mulig) for å forhindre forurensning.
Representative Results
E. aedis infisert Ae. aegypti Liverpool (LVP1b12) egg ble klekket ut som beskrevet i protokollen ovenfor. I 4th instar-fasen kan visuelle tegn på infeksjon observeres, inkludert hvite sporecyster gjennom fettlegemene til infiserte larver (et eksempel på denne fenotypen er vist i figur 2B). Uninukleate sporer ble høstet fra 4th instar larver ved å homogenisere 10 larver i 500 μL DI vann. Disse sporene var pyriform (pæreformet) og lett synlig ved 400x (figur 2A). Ved hjelp av et hemocytometer ble det beregnet et sportall på 4,05 x10 3 sporer/μL. Ett hundre friske Aegypti larver ble deretter horisontalt smittet med ~ 50.000 sporer i 100 ml vann for en endelig dose på ~ 500 sporer / larve. Larver ble oppdratt til voksen alder (foreldregenerasjon) og blod matet ved hjelp av defibrinated kaninblod pluss 1% (v / v) 100 mM adenosin trifosfat. Vertikalt infiserte egg ble samlet inn (filial generasjon) og klekket for å fortsette E. aedis forplantning og for å kvantifisere infeksjon suksess.
På syv dager etter klekking ble 25 filialgenerasjonlarver overført til individuelle 1,5 ml mikrocentrifugerør og vasket en gang med DI-vann. Individuelle larver ble homogenisert i 250 μL di vann- og infeksjonsstatus og E. aedisbelastninger ble vurdert ved hjelp av et hemocytometer. Vertikal infeksjonsrate på E. aedis i filialgenerasjonen ble funnet å være 96% og gjennomsnittlig spore belastning av smittede individer på syv dager etter klekking var 3,31 x 105 (Område: 3,25 x 104 - 1,47 x 106; Figur 3).
Figur 2: Visualisering av E. aedis infeksjon i Ae. aegypti mygg. (A) E. aedis uninukleate pyriform sporer. Ti E. aedis infisert 4th instar larver ble homogenisert i 500 μL di vann ca syv dager etter klekking. 10 μL av homogenatet ble lastet på et hemocytometer og sett på 400X. Røde piler indikerer representative uninukleate E. aedis sporer. (B) E. aedis infisert 4th instar larver utvikle karakteristiske hvite spore cyster i hele fettkroppen18. De har også ofte misformet og distended abdominal segmenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kulturprotokoll fører til effektiv E. aedis infeksjon i filial generasjon. Ae. aegypti larver (n = 25) fra filialgenerasjonen ble homogenisert individuelt i 250 μL DI vann og 10 μL av homogenatet ble lastet på et hemocytometer. Tilstedeværelse av ennukleære sporer indikerte en positiv infeksjon og sporer ble kvantifisert for alle positive prøver. (A)Prevalens av infeksjon blant filial larver. Grå tilsvarer uinfiserte larver, og svart til infisert. Tall som vises på hvert segment gir absolutt antall personer i hver gruppe. (B) Spore belastning for hver infiserte person. Svarte prikker representerer loggen10 forvandlet uninukleate spor teller for hver larve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Vi presenterer her metoden opprinnelig beskrevet i Hembree og Ryan, 19828 for oppdrett av E. aedis microsporidia i Ae. aegypti mygg. Stammen av E. aedis brukes i denne studien ble avledet fra den opprinnelige feltsamlingen av Stephen Hembree i Thailand i 197919. Metoden kapitaliserer på horisontal overføring, som naturlig forekommer i overføringssyklusen til E. aedis7, for å forplante parasitten på en kontrollert måte. Denne metoden kan være utfordrende for nykommere som ikke er kjent med spore utseende, symptomer på infeksjon i larver, eller koordinering som kreves for å fullføre multi-stage rearing / dosing protokollen. Vårt håp er at de visuelle hjelpemidler som følger med denne protokollen vil redusere barrierer for oppføring for forskere som ønsker å kultur E. aedis.
Vi forplantet E. aedis i Ae. aegypti som beskrevet ovenfor og kvantifiserte suksessen til parasitisme i filialgenerasjonen. Kort, vi klekket E. aedis infisert Ae. aegypti egg, oppdratt dem til 4th instar, og samlet uninucleate E. aedis sporer fra de infiserte larver. Vi smittet deretter horisontalt friske larver med disse sporene via oral inntak, og oppdro de horisontalt infiserte larver til voksen alder. Vi blod matet de smittede voksne (foreldregenerasjon) og samlet egg (filial generasjon), som vi hypotetisk ville være vertikalt smittet med E. aedis parasitten. Vi klekket egg fra filialgenerasjonen og samlet og homogeniserte en undergruppe av larver da de var4 th instars. Vi kvantifiserte prosentandelen av larver som var smittet med E. aedis og den totale sporetellingen hos alle infiserte individer. Vi fant at de aller fleste (96%) av individer ble smittet og gjennomsnittlig sporelast av infiserte larver var ~ 105. Vi konkluderer med at vår oppdrettsprotokoll resulterte i svært vellykket forplantning av E. aedis i Ae. aegypti mygg.
Det er flere aspekter ved denne protokollen som kan være spesielt utfordrende for den uinnvidde brukeren. Vi tilbyr under noen tilleggsinformasjon som kan være til hjelp. For spørsmål om generell myggoppdragelse er en komplett guide til Ae. aegypti kolonivedlikehold utenfor omfanget av denne protokollen. Imidlertid kan mange vanlige spørsmål løses av ressurser fra Biodefense og Emerging Infections Research Resources Repository16,17 inkludertegg klekking, generelle diettbehov, bolig og miljøforhold, og blodfôring. Når det gjelder infeksjonens tidslinje, viser larver klekket fra infiserte egg ikke tegn på infeksjon før sent i 4th instar-scenen. Uninukleate sporer vises raskt, i løpet av 1-2 dager. Larver kan virke nesten uinfiserte ved 6 dager etter klekking, men sterkt infisert av dag 7 eller 8 etter klekking. I tillegg kan det være utfordrende å visualisere sporer i homogeniserte prøver fordi det er mange andre mikrober tilstede i hele mygghomogenater, inkludert andre eukaryotiske encellede organismer (f.eks. gjær) av samme størrelse som E. aedis uninukleate sporer. Den karakteristiske formen på E. aedis sporer (Figur 2A) er en svært pålitelig metode for identifisering og vil bidra til å skille E. aedis fra andre mikrober i homogenatet. Selv om det ikke er nødvendig for identifisering eller kvantifisering, hvis spore rensing er ønsket, det kan oppnås via kolloidal silika tetthet gradient sentrifugasjon som vil tillate separasjon av E. aedis sporer fra andre forurensende elementer i homogenatet. Denne prosessen er beskrevet i detalj i Solter et al.20.
Temperatur og kosthold som brukes i oppdrettspraksis varierer vanligvis mellom laboratorier, men variasjoner vil sannsynligvis fortsatt gi vellykket parasittforplantning. Mindre forskjeller i larvalmattype forstyrrer ikke vellykket infeksjon, selv om vi ikke eksplisitt testet forskjellige mattyper i denne protokollen. Effekten av temperaturen på infeksjon er testet og E. aedis infeksjon ble funnet å være robust ved et bredt spekter av temperaturer21. Maksimal sporproduksjon forekom ved 30,8 °C, men var fortsatt robust ved oppringingstemperaturer så lavt som 20 °C. Antall sporer ble redusert dramatisk ved høyere oppvinningstemperaturer (36 °C), derfor bør disse temperaturene unngås for denne protokollen.
Forurensning er alltid en bekymring når du arbeider med parasitter. E. aedis er en vellykket parasitt av Ae. aegypti og må derfor holdes atskilt fra uinfiserte laboratoriekolonier for å forhindre forurensning. Vi anbefaler lagring av infiserte mygg i en egen inkubator hvis mulig. Vi anbefaler også at materialer som brukes til mikrosporidia arbeid (f.eks larve skuffer, overføring pipetter, bur, egg samling kopper) er utpekt for mikrosporidia arbeid og ikke brukes bredere i hele insektet. Alle oppdrettsmaterialer skal steriliseres med 10% blekemiddel etter bruk og autoklavering kan brukes til å supplere blekemiddelsterilisering.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Spencer Blankenship for hjelp med myggoppdragelse. Vi takker også James N. Radl og M. Dominique Magistrado for nyttig tilbakemelding på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
| 150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
| 2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
| 3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
| Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
| Autoclave | For sterilization | ||
| Bleach | For sterilization | ||
| Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
| Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
| Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
| Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
| Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
| Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
| Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
| Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
| Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
| Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
| Pipette 1 - 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
| Pipette 100 - 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
| Pipette tips 1 - 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
| Pipette tips 100 - 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
| Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
| Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
| Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |
References
- WHO. Yellow fever. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever (2019).
- WHO. Dengue and severe dengue. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
- Weaver, S. C. Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community. Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).
- Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. K., Park, Y. H. Prevention and Control Strategies to Counter Dengue Virus Infection. Frontiers In Cellular and Infection Microbiology. 7, 336 (2017).
- Becnel, J. J. Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblysporidae) as a biocontrol agent of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. , Adelaide, Australia. 20-24 (1990).
- Becnel, J. J., Johnson, M. A. Impact of Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae) on a seminatural population of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Biological Control. 18 (1), 39-48 (2000).
- Becnel, J. J., Sprague, V., Fukuda, T., Hazard, E. I. Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N. G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Journal of Protozoology. 36, 119-130 (1989).
- Hembree, S. C., Ryan, J. R. Observations on the vertical transmission of a new microsporidian pathogen of Aedes aegypti from Thailand. Mosquito News. 42, 49-54 (1982).
- Johnson, M. A., Becnel, J. J., Undeen, A. H. A new sporulation sequence in Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae), a parasite of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 70 (1), 69-75 (1997).
- Becnel, J. J., Garcia, J. J., Johnson, M. A. Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae) effects on the reproductive capacity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 32 (4), 549-553 (1995).
- Becnel, J. J., Johnson, M. A. Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 9 (3), 269-274 (1993).
- Andreadis, T. G. Host range tests with Edhazardia aedis (Microsporida: Culicosporidae) against northern Nearctic mosquitoes. Journal of Invertebrate Pathology. 64 (1), 46-51 (1994).
- Becnel, J. J. Safety of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) for nontarget aquatic organisms. Journal of the American Mosquito Control Association. 8 (3), 256-260 (1992).
- Undeen, A. H., Becnel, J. J. Longevity and germination of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) spores. Biocontrol Science and Technology. 2, 247-256 (1992).
- Massaro, P., Sobecki, R., Behling, C., Criswell, V., Zha, T., Devenzengo, R. T. Automated mass rearing system for insect larvae. , Pub. No. US 2018/0092339 A1. USA (2018).
- Methods in Aedes Research. BEI Resources. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf (2016).
- Methods in Anopheles Research. BEI Resources. , Available from: https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf (2014).
- Desjardins, C. A., et al. Contrasting host-pathogen interactions and genome evolution in two generalist and specialist microsporidian pathogens of mosquitoes. Nature Communications. 6 (1), 1-12 (2015).
- Hembree, S. C. Preliminary Report of some mosquito pathogens from Thailand. Mosquito News. 39 (3), 575-582 (1979).
- Solter, L. F., Becnel, J. J., Vávra, J. Research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Elsevier Ltd. 329-371 (2012).
- Becnel, J. J., Undeen, A. H. Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).
