Summary
Hier beschrijven we het gebruik van spectrale optische coherentietomografie (SD-OCT) om retinale en oculaire structuren in vivo te visualiseren in modellen van retinale degeneratie, glaucoom, diabetische retinopathie en bijziendheid.
Abstract
Spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) is nuttig voor het visualiseren van retinale en oculaire structuren in vivo. In onderzoek is SD-OCT een waardevol hulpmiddel om veranderingen in een verscheidenheid aan retinale en oculaire ziekte- en letselmodellen te evalueren en te karakteriseren. In door licht geïnduceerde retinale degeneratiemodellen kan SD-OCT worden gebruikt om het dunner worden van de fotoreceptorlaag in de loop van de tijd te volgen. In glaucoommodellen kan SD-OCT worden gebruikt om de verminderde retinale zenuwvezellaag en de totale retinale dikte te controleren en om oogzenuw cupping te observeren na het induceren van oculaire hypertensie. Bij diabetische knaagdieren heeft SD-OCT onderzoekers geholpen bij het waarnemen van een verminderde totale retinale dikte en een verminderde dikte van specifieke retinale lagen, met name de retinale zenuwvezellaag met ziekteprogressie. In muismodellen van bijziendheid kan SD-OCT worden gebruikt om axiale parameters te evalueren, zoals axiale lengteveranderingen. Voordelen van SD-OCT zijn onder meer in vivo beeldvorming van oculaire structuren, de mogelijkheid om veranderingen in oculaire dimensies in de loop van de tijd kwantitatief te volgen en de snelle scansnelheid en hoge resolutie. Hier beschrijven we de methoden van SD-OCT en tonen we voorbeelden van het gebruik ervan in ons laboratorium in modellen van retinale degeneratie, glaucoom, diabetische retinopathie en bijziendheid. Methoden omvatten anesthesie, SD-OCT-beeldvorming en verwerking van de beelden voor diktemetingen.
Introduction
Spectral-domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) is een nauwkeurige beeldvormingsmodaliteit met hoge resolutie waarmee clinici en onderzoekers oculaire structuren niet-invasief kunnen onderzoeken. Deze beeldvormingstechniek is gebaseerd op interferometrie om driedimensionale retinale beelden in vivo vast te leggen op een micrometerschaal 1,2. Het is uitgegroeid tot een van de meest gebruikte beeldvormingsmodaliteiten in het visieonderzoek en in de kliniek vanwege de eenvoudige detectie en nauwkeurigheid van pathologische kenmerken zoals structurele defecten en / of verdunning van retinale lagen en subretinale vloeistof3. In onderzoek met diermodellen van zichtgerelateerde aandoeningen heeft SD-OCT essentiële niet-invasieve analyses gegeven van relaties tussen structuur en functie en hun histopathologische oorsprong4. Vanwege de resolutie (tot 2-3 micron, afhankelijk van de diepte in het oog5), heeft SD-OCT de mogelijkheid om zelfs kleine veranderingen in de dikte van de retinale laag te detecteren. Dit type analyse kan essentiële informatie verschaffen voor ziekteprogressie en de werkzaamheid van neuroprotectieve methoden en behandelingen voor visusgerelateerde aandoeningen beoordelen.
SD-OCT is een niet-invasief alternatief voor het histologisch onderzoeken van de structuur, en van de twee is aangetoond dat ze gecorreleerd zijn6. Hoewel SD-OCT geen cellulaire resolutie bereikt, maakt het wel longitudinale studies bij dieren mogelijk. Dit is voordelig omdat de progressie van de ziekte in individuele dieren in de loop van de tijd kan worden gevolgd in plaats van dieren op specifieke tijdstippen te moeten euthanaseren. Naarmate beeldvormingstechnieken blijven verbeteren, zal ook de SD-OCT-technologie vooruitgang boeken, waardoor de beeldkwaliteit wordt verbeterd en de mogelijkheid om biologische processen zoals de retinale bloedvatfunctie in detail te beoordelen. Zelfs sinds de komst in 1991 heeft sd-oct-technologie enorme vooruitgang geboekt in resolutie, snelheid en gevoeligheid7.
De huidige studie maakt gebruik van een SD-OCT-systeem om veranderingen in retinale lagen te kwantificeren in knaagdiermodellen van retinale degeneratie, glaucoom en diabetische retinopathie. Het SD-OCT-systeem dat hier wordt gebruikt, is een OCT-systeem met fourierdomein dat gebruik maakt van energiezuinig, nabij-infrarood licht om in realtime diepte-opgeloste beelden te verkrijgen, te verwerken en op te slaan. Het SD-OCT-systeem heeft uitgebreide dieptebeeldvormingsmogelijkheden in de golflengteband van 800 nm, met een diepte van 8 mm en een resolutie van 4 μm. In Fourier-domeindetectie is het interferentiesignaal tussen verstrooid licht van het weefsel en een referentiepad Fourier getransformeerd om axiale scans en / of axiale diepteprofielen van verstrooide intensiteit te construeren8. Voor de studies hier wordt de OCT-bundel gescand over de gewenste retinale structuur terwijl seriële axiale scans worden verkregen. Doorgaans verkrijgt een scanpatroon het tweedimensionale raster (B-scans) als een verzameling lineaire eendimensionale scanlijnen (A-scans), die overeenkomen met 2D-dwarsdoorsnedeafbeeldingen met behulp van een rasterscanpatroon. Voor studies gericht op bijziendheid bij muizen, wordt dit systeem ook gebruikt om afmetingen van oculaire structuren te meten (bijv. Hoornvliesdikte, lensdikte, glasvochtkamerdiepte en axiale lengte).
Het huidige systeem stelt gebruikers in staat om hun eigen protocollen te ontwerpen en scans te maken die kunnen worden aangepast en geselecteerd op basis van de oculaire structuren van belang. De belangrijkste scans in deze door de gebruiker gedefinieerde protocollen maken deze beeldvormingstechniek gebruiksvriendelijk. Voor beeldanalyses hebben we op maat gemaakte programmering ontwikkeld in een wiskundig modelleringsprogramma. SD-OCT is een krachtig hulpmiddel om pathomorfologische veranderingen in oculaire structuren niet-invasief te identificeren en te kwantificeren en de progressie van de ziekte te monitoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee en voldoen aan de National Institutes of Health-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (NIH Publications,8e editie, bijgewerkt in 2011).
OPMERKING: Het SD-OCT-systeem dat wordt gebruikt om het onderstaande protocol te ontwikkelen, wordt beschreven in de materiaaltabel. Hoewel sommige procedures specifiek zijn voor dit specifieke systeem, kan de algemene aanpak worden aangepast voor andere LGO-hulpmiddelen en diermodellen. Verder worden deze protocollen in ons laboratorium vaak gebruikt bij muizen en ratten; de algemene aanpak kan echter worden toegepast op verschillende diermodellen en SD-OCT-apparaten, op voorwaarde dat een persoon de juiste lens en mogelijkheden op zijn apparaat heeft.
1. De optische coherentietomografieapparatuur instellen
- Open de SD-OCT-software (Materiaaltabel).
- Definieer wie de OCT, het onderzoek en de behandelingsarm (indien relevant) gebruikt. Geef deze categorieën een naam op een manier die onderzoekers helpt om later tijdens de gegevensanalyse naar de gewenste scans te zoeken.
- Klik op het tabblad Patiënt/onderzoek op Test examinator. Selecteer de naam van de examinator. Gebruik de knop Examinatoren instellen en artsen om nieuwe examinatoren toe te voegen.
- Klik op Studienaam om het onderzoek te definiëren. Klik op het tabblad Studie om een nieuw onderzoek toe te voegen of behandelingen in een bestaand onderzoek aan te passen. Klik rechts van Select Treatment Arm om een behandelarm te selecteren.
- Klik op de knop Patiënt toevoegen , die wordt gebruikt om een nieuw tijdstip voor een hele groep toe te voegen. Wanneer het venster verschijnt, voert u ID-nummer, Voornaam en Achternaam in. Selecteer Man of Vrouw. Voer de geboortedatum in.
- Klik op de knop Examen toevoegen om de afzonderlijke ratten toe te voegen. Om de ratten te identificeren, klikt u op een examen. Klik op Examen bewerken. Voer het ID-nummer in het vak Notities invoeren in . Klik op de knop Wijzigingen opslaan .
- Bevestig de juiste lens op het apparaat (figuur 1B), selecteer de bijbehorende configuratie in de software en kies de bijbehorende referentiearmpositie.
OPMERKING: Het beschreven SD-OCT-systeem heeft aangepaste lenzen, vooraf ingestelde scanpatronen en referentiearminstellingen die specifiek zijn voor de diersoort en het gebied van het oog dat wordt afgebeeld (netvlies of hoornvlies, muis of rat). Sommige van deze details zijn specifiek voor het beschreven SD-OCT-systeem (zie materiaaltabel). Niet alle apparaten bieden bijvoorbeeld handmatige aanpassing van de padlengte van de referentiearm . - Dubbelklik op het tabblad Patiënt/onderzoek op het gemarkeerde onderzoek om door te gaan naar het tabblad Beeldvorming en begin met beeldvorming of klik gewoon op het tabblad Beeldvorming . Als er een standaardscan is, klikt u met de rechtermuisknop om deze te verwijderen.
- Laad een vooraf ingesteld scanprotocol door te klikken op de knop Selecteer een protocol in de lijst . U kunt ook afzonderlijke scans toevoegen.
- Kies voor rattenmodellen van glaucoom en diabetische retinopathie en muismodellen van retinale degeneratie een pre-set die bestaat uit vier afbeeldingen: 2 OD- en 2 OS-scans. Kies voor muizenbijziendheid een vooraf ingestelde set die bestaat uit 8 afbeeldingen: 4 OD- en 4 OS-scans.
OPMERKING: Vooraf ingestelde beeldvorming wordt in meer detail uitgelegd in sectie 3. Dit is iets dat elk laboratorium voor zichzelf of met de fabrikant maakt tijdens de installatie op locatie.
2. Verdoof het dier
- Dien verdoving toe.
- Verdoof ratten met ketamine (60 mg/kg) en xylazine (7,5 mg/kg) via intraperitoneale injectie.
- Verdoof muizen met ketamine (80 mg/kg) en xylazine (16 mg/kg) via intraperitoneale injectie.
- Wacht tot de dieren volledig verdoofd zijn en reageer niet op teenknijpen.
- Dien pupilverwijdingsdruppels toe (1% tropicamide). Wacht tot de pupillen verwijden voordat ze zich in beeld brengen.
OPMERKING: Verwijding van pupillen vergroot het gezichtsveld, maar is geen vereiste. Lokale (cornea) anesthetische druppels (0,5% tetracaïne) om het oog te verdoven, moeten ook worden gebruikt als iets het oog raakt (bijvoorbeeld bij het aanbrengen van contactlenzen of het gebruik van een gids). Een gids is een apparaat dat over de scankop wordt geplaatst en beginners helpt het oog en de scankop op een rij te zetten. - Na het verdoven van het knaagdier, plaatst u het knaagdier in een knaagdieruitlijningssysteem dat het dier in de 3-dimensionale ruimte kan roteren (figuur1 A, 1C, &1D). Zorg voor thermische ondersteuning.
OPMERKING: Momenteel gebruiken we knaagdieruitlijningssystemen voor muizen en ratten die zijn ontworpen en verkocht met het SD-OCT-apparaat. - Breng vloeistof aan (bijv. zoutoplossing of kunstmatige tranen) om de ogen gesmeerd te houden. Zorg ervoor dat het oog niet uitdroogt tijdens beeldvorming, zodat de optische eigenschappen van het oog tussen scans worden gehandhaafd (wanneer het hoornvlies nat is, is het netvlies duidelijk te zien).
- Zorg ervoor dat u vocht in het tegenovergestelde oog houdt bij het scannen van het eerste oog, zodat het niet uitdroogt.
- Gebruik een delicate taakveeg om overtollige zoutoplossing vlak voor de beeldvorming af te voeren, omdat te veel of te weinig glijmiddel op het oog de beeldkwaliteit zal beïnvloeden.
OPMERKING: Het gebruik van steriele smeermiddelgel wordt niet aanbevolen tijdens OCT, omdat dit de beeldvorming kan verstoren. Indien nodig kan steriele smeermiddelgel na de procedure worden gebruikt. Een contactlens kan ook worden aangebracht om te zorgen voor voldoende vocht op het oog tijdens de test. In onze ervaring zorgde een contactlens niet voor een duidelijke verbetering van de beeldkwaliteit, maar contactlenzen helpen wel het risico op uitdroging van het hoornvlies tijdens de beeldvormingssessie te verminderen.
3. Knaagdier OCT beeldvorming
- Begin met één oog (OS of OD) en beeld het contralaterale oog daarna af.
- Plaats het dier met behulp van de twee rotatiebewegingen van het knaagdieruitlijningssysteem, zodat de blik horizontaal is en langs de as van de OCT-lens kijkt (figuur 1D).
- Gebruik de OCT in de Free Run-modus om het netvlies te oriënteren voor gegevensverzameling. Gebruik de Aim-modus (door op de Aim-knop te klikken) in eerste instantie voor een continue weergave van zowel horizontale als verticale B-scans in realtime.
- Beweeg de scankop dichter bij het oog totdat het netvlies zichtbaar is (omdat retinalenzen van muizen en ratten een vaste focus hebben, waardoor de lens naar het oog gericht is, richt zich dieper in het netvlies). Gebruik vervolgens het uitlijningssysteem voor knaagdieren om de positie van het dier omhoog / omlaag aan te passen en te draaien / draaien om de oogzenuwkop in het midden te positioneren, de horizontale scan horizontaal en de verticale scan verticaal te maken (figuur 1A).
- Pas de werkafstand zo aan dat het retinale beeld vlak en niet gebogen is.
- Pas de positie van de referentiearm aan om de afbeelding boven aan het etalagevenster te houden. Pas op dat je niet te ver naar binnen duwt, anders zal het oogbeeld op zichzelf terugdraaien.
- Retinale beeldvorming
- Voor glaucoom, retinale degeneratie en diabetische retinopathiemodellen: definieer een volumescan die bestaat uit 1000 x 100 x 1 (A-scans x B-scans x herhaalde B-scans) voor gemiddelden. Maak bij ratten een volumescan van 3 x 3 mm. Voer bij muizen een volumescan van 1,5 x 1,5 mm uit.
- Centreer de oogzenuw in de horizontale en verticale toegang, zodat de volumescan zich in het midden bevindt. Neem de tijd om ervoor te zorgen dat de oogzenuwkop zich in het midden van de scan bevindt en recht langs de neus-temporale en superieur-inferieure assen (figuur 2). Scan en centreer opnieuw om er zeker van te zijn dat het precies in het midden is, indien nodig. Herhaal deze scan indien nodig totdat de oogzenuwkop gecentreerd en uitgelijnd is langs beide assen. Klik op de knop Momentopname om een foto te maken.
OPMERKING: Sommige SD-OCT-apparaten hebben de mogelijkheid om de kromming van het oog optisch te manipuleren (het beeld is bijvoorbeeld afgeplat) door de afstand van het oog tot de lichtbron met de referentiearm aan te passen. We raden aan om de beelden af te vlakken en te centreren bij het uitvoeren van directe diktemetingen door de retinale lagen om de nauwkeurigheid langs de voorste-achterste richting te verbeteren. - Klik op de knop Opslaan om de afbeelding op te slaan.
- Maak een radiale scan gecentreerd op de oogzenuwkop die 1000 x 4 x 20 is (A-scan x B-scan x herhaalde B-scans). Gebruik herhaalde B-scans om de helderheid van het oog of het netvlies te verbeteren, wat zal helpen bij het interpreteren van gebieden van het oog of lagen van het netvlies tijdens gegevensanalyse.
OPMERKING: Nogmaals, bij ratten is deze radiale scan 3 mm, terwijl bij muizen de radiale scan 1, 5 mm is. - Sla de afbeelding op.
- Herhaal stap 3.1 tot en met 3.2.5 in het contralaterale oog.
- Axiale lengtemetingen
- Voor projecten waarbij het hele oog in beeld wordt gebracht, zoals bijziendheid bij muizen, neemt u drie scans van het hele oog en één netvliesscan voor elk oog. Kies een vooraf ingestelde die bestaat uit een radiale scan van 500 x 20 x 1 en de volledige diameter van het oog omvat.
OPMERKING: Deze instelling geeft een afbeelding van de gehele lengte van het muizenoog van het hoornvlies tot het vaatvlies. - Centreer het midden van het oog en het netvlies in het gezichtsveld. Neem drie radiale scans (whole eye scans): een lineaire B scan van 1000 x 5 x 2 en twee extra lineaire B scans van 1000 x 5 x 2 op dezelfde locatie. Sla de afbeeldingen op.
- Zoom daarna, indien gewenst, in en maak een volume- of rechthoekige scan (retinascan) vergelijkbaar met de beschrijving in 3.2 die bestaat uit 1000 x 20 A-scans x B-scans. Sla de volumescan op.
- Herhaal stap 3.3 tot en met 3.3.3 in het contralaterale oog.
OPMERKING: Axiale lengtemetingen zijn alleen mogelijk op kleine ogen (muis of kleiner) omdat het beeldvenster van huidige systemen niet groot genoeg is om een groter oog vast te leggen.
- Voor projecten waarbij het hele oog in beeld wordt gebracht, zoals bijziendheid bij muizen, neemt u drie scans van het hele oog en één netvliesscan voor elk oog. Kies een vooraf ingestelde die bestaat uit een radiale scan van 500 x 20 x 1 en de volledige diameter van het oog omvat.
4. Stappen na de beeldvorming
- Sla opgeslagen gegevens op in een cloud, wat een goede praktijk is voor gegevensbeheer en gemakkelijke toegang biedt voor latere analyse. Voer gegevensanalyse uit met aangepaste software die is ontwikkeld in een wiskundig modelleringsprogramma (Materiaaltabel).
- Verwijder het knaagdier uit het uitlijnsysteem van knaagdieren en geef een intraperitoneale injectie van atipamezole (1 mg / kg voor ratten en muizen) om de effecten van het xylazine om te keren, zodat het knaagdier sneller wakker wordt.
- Laat knaagdieren herstellen op een verwarmingskussen op lage hitte. Geef indien nodig extra zoutoplossing druppels. Breng knaagdieren terug naar hun thuiskooi wanneer ze de volledige ambulatie hebben herwonnen.
- Sluit het programma en schakel de OCT uit.
5. Nabewerking van OCT-beelden
- Verwerk de afbeeldingen met behulp van aangepaste software die is ontwikkeld in een wiskundig modelleringsprogramma om aan specifieke OCT-behoeften te voldoen (meet bijvoorbeeld de dikte van interessegebieden door de afbeeldingen handmatig te markeren).
- Afhankelijk van het doel van het beeld (netvlies van de muis, netvlies van ratten of bijziendheid /axiale lengte), gebruikt u een van de drie verschillende programma's:
- Voor het verwerken van het netvlies selecteert u de OCT-scans die u wilt laden. Definieer eerst het midden van de oogzenuwkop met een eenvoudige klik.
- Kijk hoe het programma verticale lijnen genereert die afstanden aan weerszijden van de oogzenuwkop definiëren. Merk op dat in het netvlies van de rat deze lijnen zich op 0,5 mm en 1,2 mm afstand van het midden van de oogzenuwkop bevinden, voor een totaal van 4 verticale lijnen die de nasale-temporale en inferieure-superieure assen van het oog vertegenwoordigen, afhankelijk van de radiale B-scan die momenteel wordt geanalyseerd.
OPMERKING: In het netvlies van de muis bevinden deze verticale lijnen zich op 0,25 mm en 0,5 mm van het hoofdcentrum van de oogzenuw. - Baken de volgende lagen langs elke regel af:
De retinale zenuwvezellaag (RNFL), de binnenste plexiforme laag (IPL), de binnenste nucleaire laag (INL), de buitenste plexiforme laag (OPL), de buitenste nucleaire laag (ONL), het externe beperkende membraan (ELM), de binnenste segmenten / buitenste segmenten (IS / OS), retinaal pigmentepitheel (RPE) en de totale retinale dikte.
OPMERKING: De radiale scan heeft meestal geen nasale / temporale en superieure / inferieure labels wanneer deze wordt geopend. Scans kunnen zo worden gemaakt dat ze een n/t- en s/I-oriëntatie hebben, en met name die scans worden later geanalyseerd. - Nadat een afbeelding is afgebakend en het programma is gesloten, exporteert u deze metingen naar een spreadsheetsoftware voor gegevensanalyse.
- Gebruik deze lengte- en diktewaarden uit stap 5 om vergelijkingen tussen groepen te maken, bijvoorbeeld om te bepalen of er regionale verschillen (n/t/s/i) of longitudinale veranderingen zijn.
- Bepaal voor retinale metingen eerst of er verschillen zijn in de nasaal-temporale en inferieure-superieure as op de afstanden van 0,5 mm en 1,2 mm.
OPMERKING: Als er geen verschillen in kwadranten worden waargenomen, kunnen de metingen van 0,5 mm en 1,2 mm samen worden gemiddeld. Dit is een vergelijkbare aanpak voor de retinale scans van de muis alleen bij 0,25 mm en 0,5 mm. - Voor bijziendheidsstudies, gebruik dit programma om de oculaire parameters langs de optische as van het oog te beoordelen. Open het wiskundige modelleringsprogramma. Selecteer eerst een afbeelding die u wilt laden.
- Nadat u de afbeelding hebt geladen, markeert u handmatig elke scan (radiale en B-scans). Markeer de voorste en achterste randen van het hoornvlies, de lens, de glasvochtkamer en het netvlies, zodat het programma de dikte van het hoornvlies, de dikte van de lens, de diepte van de voorste en glasvochtkamer, de totale retinale dikte, de totale axiale lengte berekent.
- Sluit na het markeren het programma af dat een opslagmenu vraagt. Sla de afgebakende waarden op in een spreadsheetsoftware en gemiddelde van de drie afzonderlijke scans samen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SD-OCT wordt als succesvol beschouwd als beelden van hoge kwaliteit zodanig worden verkregen dat oculaire afmetingen betrouwbaar kunnen worden gemeten. Hier worden verschillende toepassingen van SD-OCT geïllustreerd met behulp van modellen van retinale degeneratie, glaucoom, diabetische retinopathie en bijziendheid.
In een lichtgeïnduceerd retinale degeneratie (LIRD) model induceert blootstelling aan fel licht (10.000 lux) degeneratie van fotoreceptorcellen in het netvlies9. Representatieve SD-OCT-beelden tonen een dunnere buitenste nucleaire laag, die de fotoreceptorcellichamen bevat, in netvliezen van LIRD BALB / c-muizen in vergelijking met onbeschadigde (controle) muizen (figuur 3A &3B). Na het kwantificeren van de dikte van de retinale laag, werd een significant verschil waargenomen tussen onbeschadigde en LIRD-muizen voor de totale retinale dikte (figuur 3C), de buitenste nucleaire laagdikte (figuur 3D) en de DIKTE VAN IS / OS (figuur 3E).
Om glaucomateuze schade experimenteel te modelleren, gebruikten we een model van oculaire hypertensie (OHT)10. Kortom, Bruine Noorse ratten (n=35) kregen een injectie van hypertone zoutoplossing in de limbusader van één oog, terwijl het contralaterale oog diende als interne controle11. Voor glaucoomstudies hebben we de dikte van de retinale zenuwvezellaag (RNFL) gekwantificeerd. Na 8 weken OHT zagen we duidelijke remodellering aan de oogzenuwkop, inclusief oogzenuw cupping (figuur 4A &B). Vervolgens kwantificeerden we de RNFL-dikte en vonden we RNFL-verdunning na 8 weken OHT in vergelijking met nulmetingen (figuur 4C).
Om diabetische retinopathie te modelleren, werden Goto-Kakizaki-ratten, een niet-obeen, polygeen model van diabetes dat hyperglycemie ontwikkelt vanaf de leeftijd van 2-3 weken, 12,13 gebruikt. Netvliezen van Goto-Kakizaki ratten en Wistar ratten (niet-diabetische controles) werden in beeld gebracht met SD-OCT (figuur 5A&5B). Op de leeftijd van 6 weken waren RNFL en de totale retinale dikte verminderd bij Goto-Kakizaki-ratten in vergelijking met Wistar-ratten in het centrale netvlies (gegevens niet getoond) en het perifere netvlies (figuur 5C&5D). De grootste verschillen werden waargenomen in de inferieure en temporale kwadranten van het netvlies (figuur 5C&5D).
Om muismodellen voor bijziendheid te evalueren, werd de axiale lengte gemeten bij Bmal1-/- muizen. Bmal1 is een klokgen van belang omdat circadiane ritmes een rol kunnen spelen bij de ontwikkeling van bijziendheid14,15. De axiale lengte van het Bmal1-/- muisoog (figuur 6B) is zichtbaar langer dan het wildtype oog (figuur 6A) in de OCT-beelden. Kwantificering van de axiale lengte bevestigt dat Bmal1-/- muizen significant langere axiale lengtes hebben op de leeftijd van 84 dagen (figuur 6C), waaruit blijkt dat het ontbreken van het klokgen bijdraagt aan de ontwikkeling van bijziendheid.
Dit protocol genereerde beelden van oculaire structuren in modellen van retinale degeneratie, glaucoom, diabetische retinopathie en bijziendheid. Beelden waren van voldoende kwaliteit zodat oculaire afmetingen, waaronder de buitenste nucleaire laag, de retinale zenuwvezellaag, de totale retinale dikte en de axiale lengte, konden worden gekwantificeerd. De resultaten toonden aan dat significante verschillen in de afmetingen van oculaire structuren in vivo konden worden waargenomen met behulp van SD-OCT.
Figuur 1: Opstelling van SD-OCT apparatuur.
(A) Foto van het uitlijningssysteem voor knaagdieren en de LGO-scankop. (B) Foto van oct-lenzen van ratten en muizen. (C) Afbeelding van het uitlijningssysteem van de muisknaagdier dat zijn vermogen om in de 3-dimensionale ruimte te bewegen illustreert. (D) Close-up van het knaagdieruitlijningssysteem, met name de knoppen die de beweging regelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: SD-OCT-voorbeeldscan.
Afbeelding van een live scan van het netvlies van de muis vlak voordat een volume- of radiale scan wordt uitgevoerd. (A) toont de nasaal-temporele uitlijning, terwijl (B) de superieur-inferieure uitlijning laat zien. Zodra de netvliezen in deze twee afbeeldingen recht zijn in hun respectievelijke verticale of horizontale vlakken en de oogzenuw in beide afbeeldingen is gecentreerd, gaan we verder met het verkrijgen van het SD-OCT-beeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: SD-OCT gebruiken om het dunner worden van de fotoreceptorlaag in de loop van de tijd te volgen in een muismodel van retinale degeneratie.
(A) Representatieve SD-OCT scan van een onbeschadigd (controle) netvlies van een BALB/c muis. (B) Representatieve SD-OCT-scan van een netvlies van een door licht geïnduceerde retinale degeneratie (LIRD) BALB/c muis. (C-E) Kwantificering van de totale retinale dikte (C), de dikte van de buitenste nucleaire laag (ONL) (D) en de dikte van het binnenste segment/buitenste segment (IS/OS) (E) bij onbeschadigde en LIRD Balb/c muizen. Gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Met behulp van SD-OCT maten we een afname van de laagdikte van de retinale zenuwvezel en observeerden we oogzenuw cupping na het induceren van oculaire hypertensie in een rattenmodel van glaucoom.
(A) Representatieve SD-OCT-scan van een netvlies- en oogzenuwkop van een rattenoog genomen voorafgaand aan het induceren van oculaire hypertensie (Baseline: OHT). (B) SD-OCT-scan van hetzelfde netvlies van dezelfde rat na 8 weken OHT (experimenteel model van glaucoom). (C) Kwantificering van de dikte van de retinale zenuwvezellaag (RNFL) bij baseline in vergelijking met OHT-ogen. Gemiddelde ± SEM. Deze gegevens zijn overgenomen uit Feola et al.11Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Sd-OCT gebruiken om een verminderde totale retinale dikte en verminderde dikte van specifieke retinale lagen waar te nemen in een rattenmodel van diabetes.
(A) Representatieve SD-OCT scan van een netvlies van een Wistar (Wild-type control) rat. (B) Representatieve SD-OCT-scan van een netvlies van een Goto-Kakizaki (diabetische) rat. Retinale lagen: retinale zenuwvezellaag (RNFL), binnenste plexiforme laag (IPL), binnenste nucleaire laag (INL), buitenste plexiforme laag (OPL), buitenste nucleaire laag (ONL), extern beperkend membraan (ELM), binnenste segmenten / buitenste segmenten (IS / OS), retinaal pigmentepitheel (RPE) en totale retinale dikte (TRT). (C-D) Kwantificering van RNFL (C) en totale retinale dikte (D) in Wistar- en Goto-Kakizaki-netvliezen waarbij de centrale lijn het gemiddelde is en het gearceerde gebied de SEM voor alle vier kwadranten (Sup, Superior; Temp, Temporeel; Inf, Inferieur; Nas, Nasaal) van het perifere netvlies (1,2 mm van de oogzenuwkop). ** p < 0,01, *** p < 0,001. Dit cijfer is aangepast van Allen et al.13Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: SD-OCT gebruiken om de axiale lengte te evalueren in een muismodel van bijziendheid.
Hele ogen SD-OCT beelden van wild-type (A) en Bmal1-/- (B) muizenogen op de leeftijd van 84 dagen. De ogen van Bmal1-/- muizen hebben een significant langere axiale lengte dan de wild-type ogen (C). AL: axiale lengte; RT: retinale dikte; VCD: glasvochtkamerdiepte; LT: lensdikte; ACD: diepte van de voorste kamer; CT: dikte van het hoornvlies. De lange verticale lijn geeft axiale lengtegrenzen aan (boven en onder aangegeven door horizontale lijn) voor het wild-type oog. Korte pijl geeft de achterste axiale lengtemarkering voor het Bmal1-/- oog aan. Gemiddelde ± SEM. De centrale lijn in het midden van elke afbeelding (A &B) is een verticaal verzadigingsartefact. Het wordt meestal gebruikt als een gids om het oog te centreren, maar als de scan goed is uitgelijnd, kan deze verdwijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoge resolutie beeldvorming van oculaire structuren in vivo maakt de beoordeling van retinale en oculaire veranderingen in de loop van de tijd mogelijk. In dit protocol werd aangetoond dat SD-OCT verschillen in oculaire structuren in vivo vastlegt in modellen van retinale degeneratie, glaucoom, diabetische retinopathie en bijziendheid.
Het meest kritieke aspect bij het uitvoeren van SD-OCT is het verkrijgen van een duidelijk beeld van het netvlies of een andere oculaire structuur van belang. Het is belangrijk om de tijd te nemen om ervoor te zorgen dat het netvlies perfect gecentreerd is en een uitstekende helderheid heeft. Zware ademhaling door het knaagdier kan resulteren in luidruchtige beelden (het netvlies is eigenlijk te zien om op het scherm te wiebelen). Dit gebeurt soms als een dier niet volledig bewusteloos is na narcose toediening. Om dit probleem te omzeilen, kunnen meerdere B-scans worden gemiddeld om te helpen visualiseren waar de grenzen van de retinale lagen liggen, en vervolgens kan de beste afzonderlijke B-scanafbeelding worden geanalyseerd.
Een andere veelgemaakte fout is dat het oog te droog of te nat is. Dit kan eenvoudig worden gecontroleerd door een extra druppel zoutoplossing aan te brengen, deze weg te voeren met een laboratoriumdoekje en te beoordelen of het beeld in helderheid is verbeterd. Een overweging om rekening mee te houden bij het markeren van retinale laagdiktes op SD-OCT-afbeeldingen is hoe de RNFL te markeren. Hoewel het mogelijk is om op sommige Knaagdier-LGO's onderscheid te maken tussen de RNFL en GCL, zijn deze twee lagen vaak niet van elkaar te onderscheiden. Voor consistentie markeren we de hele RNFL-regio (RNFL + GCL, indien zichtbaar) als de RNFL. Sommige studies melden de RNFL en GCL als afzonderlijke lagen of combineren de GCL en de binnenste plexiforme laag 16,17,18, hoewel dit onderzoek meestal werd uitgevoerd bij mensen, die veel grotere ogen hebben dan knaagdieren. Rapportage van RNFL-dikte is meer typisch in knaagdierstudies 11,13,19,20. Een ander belangrijk probleem is dat zeer kleine veranderingen in markering een zeer grote verandering kunnen veroorzaken, vooral bij bijziendheid vanwege de kleine omvang van de structuren die worden gemeten. Een verschil in meting van 6 μm is bijvoorbeeld gelijk aan een dioptrieverandering in brekingsfout21. Omdat kleine veranderingen zo'n groot verschil maken in metingen, is de helderheid van het beeld van cruciaal belang.
Een beperking van dit protocol, en van SD-OCT in het algemeen, is dat er heldere oculaire media nodig zijn voor een goed beeld. Hoornvlieslaesies, lensafwijkingen en staar kunnen bijvoorbeeld voorkomen dat gebruikers duidelijke beelden krijgen. Dit is een probleem bij diabetische retinopathie beeldvorming, in het bijzonder, omdat cataract zich vaak ontwikkelt bij diabetische knaagdieren22. Als het cataract- of andere oculaire probleem klein is, is het soms mogelijk om de scankop eromheen te manoeuvreren. Voor grotere oculaire mediaverstoringen zijn retinale OCT-beelden onmogelijk te verkrijgen. Deze netvliezen kunnen nog steeds worden onderzocht met behulp van histologie, omdat retinale histologie niet afhankelijk is van heldere oculaire media.
Een andere beperking is het feit dat hyperreflectieve laesies, zoals exsudaten en bloedingen, evenals grote retinale vaten, resulteren in schaduw van de onderliggende retinale structuren, en daardoor details van de onderliggende morfologie verloren gaan. In een geval met choroïdaal neovasculair membraan en diabetisch retinopathie/macula-oedeem waarbij de retinale dikte meer dan 400 μm bedroeg, was het moeilijk om de onderliggende pathologie en choroïde23 te onderscheiden. Bovendien kan SD-OCT alleen worden gebruikt om de dikte op specifieke locaties te beoordelen. SD-OCT heeft ook een beperkte penetratiediepte voor het in beeld brengen van het vaatvlies en voor beeldvorming van hele ogen (het hele oog kan worden afgebeeld in een muis, maar niet in grotere dieren). Een andere beperking is dat fluorescerende of andere markers niet kunnen worden gebruikt met SD-OCT zoals met scanning laser oftalmoscopie (SLO). Typische SLO-apparaten maken het echter niet mogelijk om retinale lagen in doorsnede te visualiseren met hetzelfde gemak dat wordt waargenomen met SD-OCT. Ten slotte is de resolutie met SD-OCT niet perfect. Het is echter veel verbeterd ten opzichte van de resolutie die beschikbaar was bij het begin van SD-OCT en blijft in de loop van de tijd verbeteren.
Concluderend zijn de voordelen en betekenis van de SD-OCT-techniek dat het in vivo beeldvorming van oculaire structuren en kwantitatieve tracking van veranderingen in oculaire dimensies in de loop van de tijd mogelijk maakt, en dat het deze beeldvorming met een snelle scansnelheid uitvoert. Vanwege de hoge resolutie van SD-OCT kan het worden gebruikt om subtiele verschillen te detecteren die niet met het blote oog waarneembaar zijn (figuur 4 & figuur 5). Verder is SD-OCT een nuttig hulpmiddel om meerdere parameters van het oog te meten in een aantal ziekte- en letselmodellen. Alleen al in dit protocol werd SD-OCT gebruikt om de retinale dikte te meten in modellen van retinale degeneratie en diabetische retinopathie, retinale dikte en cupping in een glaucoommodel en axiale lengte in een bijziendheidsmodel. SD-OCT kan ook worden gebruikt om corneakromming24 te meten, retinale veranderingen na ontploffing en traumatisch hersenletsel te beoordelen 19,25,26, pathologie te identificeren bij leeftijdsgebonden maculaire degeneratie27 en de retinale gezondheid te bewaken tijdens en na oculaire injecties28 en retinale plaatsing van prothetische apparaten zoals subretinale implantaten29. Het kan ook worden gebruikt in andere diermodellen zoals boomspitsmuizen30 en niet-menselijke primaten31. SD-OCT kan ook worden gebruikt om retinale pathologie te lokaliseren op basis van kwadrant (superieur, inferieur, nasaal, temporeel) en locatie (centraal versus perifeer). De toekomstige SD-OCT-apparaten zullen een nog grotere resolutie bereiken. Bovendien maakt OCT-angiografie beeldvorming van de retinale en choroïdale microvasculatuur mogelijk door gebruik te maken van de reflectie van laserlicht van het oppervlak van rode bloedcellen terwijl ze door de retinale vasculatuur bewegen32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Department of Veterans Affairs Rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) naar RSA, Merit Award (RX002615) en Research Career Scientist Award (RX003134) naar MTP, Career Development Award (CDA-2, RX002342) naar AJF, EY028859 naar MTP, NEI Core Grant P30EY006360, Research to Prevent Blindness en Foundation Fighting Blindness.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% tropicamide | Sandoz | Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59 | |
| 0.5% tetracaine | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| AIM-RAS G3 120 V | Leica Bioptigen | 90-AIMRAS-G3-120 | Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice |
| Celluvisc gel | REFRESH CELLUVISC | #4554; NDC-0023-4554-30 | |
| G3 18 mm Telecentric Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-18 | |
| G3 Mouse Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-M | |
| G3 Rat Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-R | |
| heating pad | Fabrication | 11-1130 | |
| InVivoVue software | Leica Bioptigen | Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system | |
| MATLAB | Mathworks | mathematical modeling program | |
| Mouse/Rat Kit | Leica Bioptigen | 90-KIT-M/R | Mouse/rat rodent alignment system |
| saline | ADDIPAK | 200-39 | |
| System Envisu R4300 VHR 120 V | Leica Bioptigen | 90-R4300-V1-120 | SD-OCT system |
References
- Wojtkowski, M., et al. Ultrahigh-resolution, high-speed, Fourier domain optical coherence tomography and methods for dispersion compensation. Optics Express. 12 (11), 2404-2422 (2004).
- Nassif, N., et al. In vivo high-resolution video-rate spectral-domain optical coherence tomography of the human retina and optic nerve. Optics Express. 12 (3), 367-376 (2004).
- Theelen, T., Teussink, M. M. Inspection of the Human Retina by Optical Coherence Tomography. Methods in Molecular Biology. 1715, 351-358 (2018).
- Nakazawa, M., Hara, A., Ishiguro, S. I. Optical Coherence Tomography of Animal Models of Retinitis Pigmentosa: From Animal Studies to Clinical Applications. Biomed Research International. 2019, 8276140 (2019).
- Drexler, W., et al. Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography. Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).
- VanLeeuwen, J. E., et al. Altered AMPA receptor expression with treadmill exercise in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned mouse model of basal ganglia injury. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 650-668 (2010).
- Tian, J., et al. Performance evaluation of automated segmentation software on optical coherence tomography volume data. Journal of Biophotonics. 9 (5), 478-489 (2016).
- Kraus, M. F., et al. Motion correction in optical coherence tomography volumes on a per A-scan basis using orthogonal scan patterns. Biomedical Optics Express. 3 (6), 1182-1199 (2012).
- Boatright, J. H., et al. Tool from ancient pharmacopoeia prevents vision loss. Molecular Vision. 12, 1706-1714 (2006).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
- Goto, Y., Kakizaki, M., Masaki, N. Production of spontaneous diabetic rats by repetition of selective breeding. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 119 (1), 85-90 (1976).
- Allen, R. S., et al. Retinal Deficits Precede Cognitive and Motor Deficits in a Rat Model of Type II Diabetes. Investigative Ophthalmolology & Visual Science. 60 (1), 123-133 (2019).
- Stone, R. A., et al. Altered ocular parameters from circadian clock gene disruptions. PLoS One. 14 (6), 0217111 (2019).
- Chakraborty, R., et al. Circadian rhythms, refractive development, and myopia. Ophthalmic & Physiological Optics. 38 (3), 217-245 (2018).
- Davies, E. C., et al. Retinal ganglion cell layer volumetric assessment by spectral-domain optical coherence tomography in multiple sclerosis: application of a high-precision manual estimation technique. Journal of Neuro-ophthalmology. 31 (3), 260-264 (2011).
- Carnevali, A., et al. Optical coherence tomography angiography analysis of retinal vascular plexuses and choriocapillaris in patients with type 1 diabetes without diabetic retinopathy. Acta Diabetologica. 54 (7), 695-702 (2017).
- Springelkamp, H., et al. Population-based evaluation of retinal nerve fiber layer, retinal ganglion cell layer, and inner plexiform layer as a diagnostic tool for glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 8428-8438 (2014).
- Allen, R. S., et al. Long-Term Functional and Structural Consequences of Primary Blast Overpressure to the Eye. Journal of Neurotrauma. 35 (17), 2104-2116 (2018).
- Zhao, D., et al. Age-related changes in the response of retinal structure, function and blood flow to pressure modification in rats. Scientific Reports. 8 (1), 2947 (2018).
- Schmucker, C., Schaeffel, F. A paraxial schematic eye model for the growing C57BL/6 mouse. Vision Research. 44 (16), 1857-1867 (2004).
- Aung, M. H., Kim, M. K., Olson, D. E., Thule, P. M., Pardue, M. T. Early visual deficits in streptozotocin-induced diabetic long evans rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (2), 1370-1377 (2013).
- Puzyeyeva, O., et al. High-Resolution Optical Coherence Tomography Retinal Imaging: A Case Series Illustrating Potential and Limitations. Journal of Ophthalmology. 2011, 764183 (2011).
- Liu, A. S., et al. Topography and pachymetry maps for mouse corneas using optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 190, 107868 (2020).
- Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino, E., Kardon, R. H., Harper, M. M. Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (5), 3440-3450 (2013).
- Harper, M. M., et al. Blast-Mediated Traumatic Brain Injury Exacerbates Retinal Damage and Amyloidosis in the APPswePSENd19e Mouse Model of Alzheimer's Disease. Investigative Ophthalmology Visual Science. 60 (7), 2716-2725 (2019).
- Zhang, M., et al. Advanced image processing for optical coherence tomographic angiography of macular diseases. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4661-4675 (2015).
- Muhlfriedel, R., et al. Optimized Subretinal Injection Technique for Gene Therapy Approaches. Methods in Molecular Biology. 1834, 405-412 (2019).
- Adekunle, A. N., et al. Integration of Perforated Subretinal Prostheses With Retinal Tissue. Translational Vision Science & Technology. 4 (4), 5 (2015).
- Sajdak, B. S., et al. Noninvasive imaging of the tree shrew eye: Wavefront analysis and retinal imaging with correlative histology. Experimental Eye Research. 185, 107683 (2019).
- Dominik Fischer, M., et al. Detailed functional and structural characterization of a macular lesion in a rhesus macaque. Documenta Ophthalmologica. 125 (3), 179-194 (2012).
- Hagag, A. M., Gao, S. S., Jia, Y., Huang, D. Optical coherence tomography angiography: Technical principles and clinical applications in ophthalmology. Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (3), 115-129 (2017).
- Treister, A. D., et al. Prevalence of Subclinical CNV and Choriocapillaris Nonperfusion in Fellow Eyes of Unilateral Exudative AMD on OCT Angiography. Translational Vision Science & Technology. 7 (5), 19 (2018).
