우리는 FLIM-FRET 측정을 사용하여 살아있는 슈도모나스 aeruginosa에서 두 개의 고도로 다르게 표현된 단백질 사이 단백질 단백질 상호 작용을 특징짓는 프로토콜을 여기에서 기술합니다. 이 프로토콜에는 박테리아 변형 구조, 박테리아 고정, 이미징 및 이미징 후 데이터 분석 루틴이 포함됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 단백질 상호 작용 (PPI)은 세포에서 다양한 주요 과정을 제어합니다. Förster 공명 에너지 전송 (FRET)와 결합된 형광 평생 화상 진찰 현미경 검사법 (FLIM)은 살아있는 세포에 있는 PPI에 관하여 정확한 정보를 제공합니다. FLIM-FRET는 FLIM 이미지의 각 픽셀에서 FRET 기증자의 형광 수명 붕괴를 측정하여 PPI 및 공간 세포 조직에 대한 정량적이고 정확한 정보를 제공합니다. 우리는 PPI의 중요한 특징을 드러내는 기술의 질그리고 견고성을 보여주기 위하여 매우 다른 복사 숫자로 표현된 두 개의 상호 작용 단백질의 특정 경우에 살아있는 슈도모나스 aeruginosa에서 PPI를 감시하기 위하여 신청한 FLIM-FRET 측정을 위한 상세한 프로토콜을 여기에서 제안합니다. 이 프로토콜은 박테리아 돌연변이 구조에서 최종 분석까지 복잡한 FLIM-FRET 데이터의 간단한 해석을 위한 고급 시각화 가능성을 제공하는 PPI 특성화에 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.
서론
단백질 단백질 상호 작용(PPI)은 세포1에서다양한 주요 공정을 제어한다. PPI의 역할은 단백질 조성, 친화성 기능 및 세포2의위치에 따라 다릅니다. PPI는 다른 기술을 통해 조사 할 수 있습니다3. 예를 들어, 공동 면역 강수량은 PPI를 식별하거나 확인하기 위해 일반적으로 사용되는 비교적 간단하고 견고하며 저렴한 기술입니다. 그러나 상호 작용하는 단백질이 발현 수준이 낮거나 상호 작용이 특정 환경에서만 일시적이거나 관련이있을 때 PPI를 공부하는 것은 어려울 수 있습니다. P. aeruginosa에서 피버딘 통로의 상이한 효소 사이에서 발생하는 PPI를 연구하는 것은 일반 철 공동 요인 억압자의 억압이 세포4,5,6에서발현될 피버딘 통로의 모든 단백질의 발현을 허용하도록 안심할 것을 요구한다. 통로의 모든 단백질에 대한 이 일반적인 규정은 그들의 상호 작용을 승진시키기 위하여 예상되는 세포에 있는 적시 발현 결과. 크기, 자연, 발현 수준 및 이 대사 경로의 단백질 수의 기간에....
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프로토콜
1. 플라스미드 건설
- 2개의 PCR(PCR1 및 3)에 의해 증폭되는 DNA 서열(P. aeruginosa PAO1의 유전체 DNA 사용)은 P. aeruginosa 게놈에 있는 삽입 부위에 대응하는 영역의 상류 및 하류에 높은 충실도 DNA 폴리머를 가진 700개의 염기 쌍의 상류 및 하류에 있다. 파란색과 녹색의 프라이머에 제한 사이트를 추가하고 빨간색 프라이머에 mCherry와 겹치는 시퀀스를 추가(그림 2).
- eGFP로 C-terminus에 표시된 PvdA의 경우, 프라이머에 의해 정지 코돈에 비해 700bp 영역상류를 증폭하고, 녹색프라이머와 스톱 코돈이 들어있는 700bp 하류 영역을 증폭시한다.
- mCherry와 N-종착체에 표시된 PvdL의 경우, 시작 코동을 포함하여 PvdL 유전자에 상류700 bp 영역을 증폭하고, 프라이머에 의해 파란색으로, 녹색프라이머와 700 bp 다운스트림 영역을 증폭.
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결과
상이한 세균균균에 대해 측정된 형광 수명의 경험적 누적 분포 기능(ecdf)은 도 8에도시된다. FRET가 발생하면 ecdfs는 수명이 짧을 수 있는 수명(그림8A,8B)으로이동합니다. 두 단백질의 상호 작용이 두 형광사이의 장거리 결과를 초래할 때 FRET가 발생하지않습니다(도 8C). 이러한 상황은 FLIM의 두 파트너 간의 상호 작용이 없는 것과 구별될 수 없습니다. 따라서 분자 모델이나 복잡한의 알려진 아키텍처에서 염료 간 거리를 예측할 수 없는 경우 상호 작용을 프로브할 기회를 최대화하기 위해 다양한 위치에 단백질을 표시하는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, PvdA(고음발성)와 비리보소말 펩타이드 인더니테타제 PvdL(세포당 몇 개 사본) 사이의 단백질 발현의 큰 차이로 인해 동일한 PvdA/PvdL 복합체는 유사한 F.......
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토론
FLIM-FRET는 강도 기반 FRET 이미징에 비해 몇 가지 주요 이점을 제공합니다. 형광 수명은 형광의 본질적인 매개 변수입니다. 결과적으로, 그것은 빛 여기의 강도에 어느 쪽도 형광의 로컬 농도에 의존 하지 않습니다. 형광 수명은 또한 사진 표백에 의해 또한 제대로 영향을 받지 않습니다. 국소 단백질 농도가 세포 극구 구획 또는 지구 전체에 걸쳐 매우 이질적일 수 있는 세포에서 PPI를 입증하는 것은 특히 흥미롭습니다. FLIM-FRET는 단백질 또는 단백질 중 하나의 발현 수준이 낮기 때문에 복합체의 농도가 낮은 모든 상황에서도 흥미롭습니다.
PPI의 맥락에서, 수명 단축에 대한 책임이 있는 FRET 메커니즘과 상호 작용의 본질에 대한 정보는 평균 수명만 고려하면 추론하기 어렵습니다. 실제로, 평균 수명의 단축은 적당한 FRET와 상호 작용하는 종의 높은 비율 때문일 수 있습니다, 또는 수용인과 짧은 거리에서 상호 작용하는 기증자의 낮은 비율에 반대에. 불균형한 스토이치오.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 FLIM 데이터 수집및 FLIM 설정의 기술 유지 보수 및 개발에 대한 그의 귀중한 지원에 대한 박사 루도빅 리커트를 인정합니다. 이 작품은 퐁도 라 레체르체 앙 치미 (https://icfrc.fr/)의 보조금에 의해 지원되었다. VN은 퐁디션 부어 라 레체르체 메디칼 (FRM-SPF201809006906)에 의해 투자된다. YM은 프랑스 인스티투트 대학(IUF)에 감사하며 연구에 전념할 추가 시간을 제공합니다. IJS와 JG는 스트라스부르의 약물 전달 연구소가 재정적 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 525/50 nm 대역 통과 필터 | F37-516, AHF, 독일 | ||
| 680 nm 단역 통과 필터 | F75-680, AHF, 독일 | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 황산 암모늄 (NH4) 2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA 중합 효소 5U/μ L | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (두께 번호 1.5, 20× 20mm | 니텔 유리 | MS0011 | |
| 고충실도 DNA 중합효소 Phusion 2U/μ L | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| 용해 물질 국물 (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| 마그네슘 황산염 헵타하이드레이트 (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| 현미경 슬라이드 (25× 75mm) | Knitel 유리 | MS0057 | |
| NucleoSpin 젤 및 PCR 클린 | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin 플라스미드 | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| 인산칼륨 이염기성(K2HPO4) | 시그마-알드리치 | RES20765 | |
| 인산칼륨 일염기성(KH2PO4) | 시그마-알드리치 | P5655 | |
| 나트륨 숙시네이트(디소듐) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCmage, SPCM 소프트웨어 | Becker & 히클 | ||
| 멸균 접종 루프 | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA 리가제 1U/μ L | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC 모듈 | SPC830, Becker & Hickl, 독일 | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
참고문헌
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of....
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재인쇄 및 허가
