살아있는 박테리아에서 단백질 단백질 상호 작용의 FLIM-FRET 측정.

단백질 단백질 상호 작용(PPI)은 세포^1에서다양한 주요 공정을 제어한다. PPI의 역할은 단백질 조성, 친화성 기능 및 세포^2의위치에 따라 다릅니다. PPI는 다른 기술을 통해 조사 할 수 있습니다³. 예를 들어, 공동 면역 강수량은 PPI를 식별하거나 확인하기 위해 일반적으로 사용되는 비교적 간단하고 견고하며 저렴한 기술입니다. 그러나 상호 작용하는 단백질이 발현 수준이 낮거나 상호 작용이 특정 환경에서만 일시적이거나 관련이있을 때 PPI를 공부하는 것은 어려울 수 있습니다. P. aeruginosa에서 피버딘 통로의 상이한 효소 사이에서 발생하는 PPI를 연구하는 것은 일반 철 공동 요인 억압자의 억압이 세포^4,5,6에서발현될 피버딘 통로의 모든 단백질의 발현을 허용하도록 안심할 것을 요구한다. 통로의 모든 단백질에 대한 이 일반적인 규정은 그들의 상호 작용을 승진시키기 위하여 예상되는 세포에 있는 적시 발현 결과. 크기, 자연, 발현 수준 및 이 대사 경로의 단백질 수의 기간에 있는 다양성은 재구성된 시스템에 있는 연구를 위해 어렵게 만듭니다^6. 따라서 그들의 세포 환경에서 PPI를 탐구하는 것은 그들의 네이티브 맥락에서 단백질의 생물학 기능을 더 이해하기 위하여 중요합니다.

형광을 포함하는 몇몇 방법만 살아있는 세포^7에서PPI를 탐구하는 것을 허용합니다. 측정할 수 있는 상이한 형광 파라미터 들 사이에서, 형광 수명(즉, 광자를 방출하기 전에 형광이 흥분한 상태로 남아 있는 평균 시간)은 살아있는 세포에서 탐구하는 가장 흥미로운 매개 변수 중 하나일 가능성이 높습니다. 형광의 형광 수명은 환경에 매우 민감하며 FLIM은 따라서 형광주변 주변의 화학적 또는 물리적 정보를 제공할 수^{있다 8.} 여기에는 형광 "기증자"의 짧은 거리에 위치한 형광의 "수용자"가 있는 상황에서 발생할 수 있는 Förster 공명 에너지 전송(FRET)의 존재가 포함됩니다. 에너지 전달은 기증자 형광 수명(그림1A)의현저한 단축을 초래하며, 형광 평생 이미징 현미경 검사법(FLIM)을 살아있는 세포에서 직접 단백질 단백질 상호 작용을 탐구하는 강력한 접근법으로 만듭니다. FLIM은 또한 세포^7,8에서상호 작용이 일어나는 위치에 대한 공간 정보를 제공할 수 있다. 이 방법은 상호 작용하는 두 파트너의 형광과 라벨링이 가능한 상황에서 PPI를 조사하는 데 매우 강력합니다.

FRET가 발생하기 위해서는 - 두 형광사이의 거리에 중요한 조건이^8,9가필요합니다. 두 형광은 10 nm 이상서로 멀리해서는 안됩니다. 따라서 FLIM-FRET 실험을 설계할 때 주의를 기울여야 하며, 이는 응모의 기증자와 용인이 상호 작용하는 복합체에서 서로 가까이 위치할 수 있는 기회를 갖도록 해야 합니다. 이것은 제약으로 보일 수 있지만, FRET의 거리 의존성은 FRET를 겪고있는 두 개의 라벨 단백질이 물리적으로 상호 작용해야한다는 것을 보장하기 때문에 실제로 진정한 이점입니다(그림 1A). 공동 지역화 실험에서 PPI에 대한 명확한 답변을 얻는 데 어려움 (두 개의 공동 지역화 된 단백질이 반드시 상호 작용하지 않을 수 있음) 따라서 FLIM-FRET를 사용하는 문제가 되지 않습니다.

그림 1: FLIM-FRET 분석 원리. FLIM-FRET 다차원 이미지의 각 픽셀에는 이 특정 위치에 기록된 형광 붕괴에 대한 정보가 포함되어 있습니다(#counts 채널 t에서 감지된 광자 수). (A)FLIM 이미지의 고전적인 표현은 일반적으로 2D 이미지(왼쪽)를 인코딩한 거짓 색상 수명입니다. 기증자의 평균 형광 수명 감소 - 색상 배율의 변화에 의해 볼 수 있듯이 - FRET의 존재에서 관찰 될 수 있으며이 공간 영역에서 PPI의 존재에 대해 유익하다. (B)FRET가 발생하기 위해서는 기증자 배출 스펙트럼과 수용자 흡수 스펙트럼 사이의 중첩이 필요하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

FRET에 대한 두 번째 요구 사항은 기증자의 방출 스펙트럼과 수용자의 흡수 스펙트럼이⁸ (도 1B)과겹쳐야한다는 것입니다. 기증자의 형광 여기는 수락자의 직접적인 형광 여기에 거의 기여하는 파장에 있어야합니다. 형광의 모든 조합이 가능하지 않으며 우리는 또한 FLIM-FRET 해석을 용이하게하기 위해 단일 exponential 형광 부패와 기증자를 우선적으로 사용하는 것이 좋습니다^10. 형광 단백질의 몇몇 부부는 대중적인 eGFP-mCherry 부부 를 포함하여 이 요구 사항을 충족합니다^(사용 가능한 형광 단백질 FRET 쌍의 팔레트에 대한 검토를 위해^{12,13참조).}

FLIM-FRET는 FLIM 이미지의 모든 픽셀에서 FRET 기증자의 형광 수명 붕괴를 측정할 수있습니다(도 1A). 획득 및 분석에서 서로 다른 형광 수명을 결정하는 두 가지 주요 기술이 있습니다: 주파수 도메인(FD)¹⁴ 및 시간 도메인(TD). TD FLIM은 보다 광범위하며 게이팅^방법(15),줄무늬^{카메라(16)} 또는 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC) 기술^8을포함한 다양한 검출 구성과 결합된 펄스 조명을 사용하여 수행됩니다. FD 및 TD 기술 모두 형광 수명은 직접 측정되지 않지만 측정된 데이터를 분석하여 수명 또는 상호 작용의 존재를 추정해야 합니다. TCSPC 기술의 경우 가장 널리 사용되는 분석은 잔류물의 가중 합계를 최소화하는 최소 정사각형 반복 재응경을 사용하여 단일 또는 다중 지수 함수로 붕괴를 피팅하는 데 의존합니다.

마지막으로, FLIM-FRET는 단일 광자 또는 다광자 여기를 사용하여 모두 수행 할 수 있습니다. 최신 초점 평면에서 자동 형광 및 광 피해를 감소 와 같은 몇 가지 장점이 있습니다. 다광원 여기는 또한 두꺼운 3D 샘플^8에서작동하는 경우 더 긴 여기 깊이를 허용한다. 반대로, 단일 광자 여기는 형광 단백질의 2광자 흡수 단면이 제한되기 때문에 일반적으로 더 효율적입니다^17.

여기서, 우리는 PPI의 중요한 특징을 드러내는 기술의 질과 견고성을 보여주기 위하여 사본의 높게 다른 수로 표현된 2개의 상호 작용 단백질 (PvdA 및 PvdL)의 특정 경우에 살아있는 P. aeruginosa에 있는 PpI의 FLIM-FRET 측정을 위한 프로토콜을 제안합니다. PvdA 및 PvdL 단백질은 피오버딘 생합성에 관여합니다. PvdA는 L-ornithine N5-oxygenase이며 L-N5-formyl-N5-하이드록소니틴을 L-ornithine에서 합성하여 하이드록실화(PvdA) 및 포름(PvdF)^18을합성한다. PvdL은 4개의 모듈로 구성된 비리보소말 펩티드 합성(NRPS) 효소이다. 첫 번째 모듈은 미리스틱 산의 아킬레이션을 촉매합니다. 두 번째 모듈은 L-Glu의 활성화와 그 응축을 myristic-coA로 촉매합니다. 그런 다음, 세 번째 모듈은 D-Tyr에서 isomerizedL-Tyr 아미노산을 응축시합니다. 마지막으로, 네 번째 모듈은 L-Dab(Diaminobutyric acid) 아미노산을 결합하여 액면트리페티드 L-Glu/D-Tyr/L-Dab^6을형성한다. 따라서 PvdL은 피버딘 전구체의 3가지 제1 아미노산의 합성을 담당한다. PvdL과 PvdA 단백질의 상호 작용은 PvdI 및 PvdJ와 반대로, L-N5-포르몰닐-N5-하이드록소니틴에 특화된 모듈을 운반하지 않는 PvdL로서 놀랍습니다. 이러한 상호작용은 피버딘 전구체 생합성을 담당하는 모든 효소가 큰 과도 및 동적 다중 효소^{복합체(19,20)로}배열된다는 것을 시사한다.

이 보고서에서 우리는 기본적으로 두 상호 작용 eGFP와 mCherry 라벨 단백질을 표현하는 세균균을 구성하는 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 또한 효율적인 FLIM-FRET 세포 화상 진찰을 위한 견본 준비 그리고 조건을 기술합니다. 마지막으로, 최근 개발된 도구를 포함하여 이미지 분석을 위한 단계별 자습서를 제안하여 복잡한 FLIM-FRET 데이터를 간단하게 해석할 수 있는 고급 시각화 가능성을 제공합니다. 이 보고서를 통해, 우리는 모험뿐만 아니라 대부분의 생물학자들에게 FRET-FLIM이 네이티브 셀룰러 환경에서 PPI에 대한 질문을 직접 해결할 수있는 접근 가능하고 강력한 기술이라고 확신하고 싶습니다.

1. 플라스미드 건설

1. 2개의 PCR(PCR1 및 3)에 의해 증폭되는 DNA 서열(P. aeruginosa PAO1의 유전체 DNA 사용)은 P. aeruginosa 게놈에 있는 삽입 부위에 대응하는 영역의 상류 및 하류에 높은 충실도 DNA 폴리머를 가진 700개의 염기 쌍의 상류 및 하류에 있다. 파란색과 녹색의 프라이머에 제한 사이트를 추가하고 빨간색 프라이머에 mCherry와 겹치는 시퀀스를 추가(그림 2).
   1. eGFP로 C-terminus에 표시된 PvdA의 경우, 프라이머에 의해 정지 코돈에 비해 700bp 영역상류를 증폭하고, 녹색프라이머와 스톱 코돈이 들어있는 700bp 하류 영역을 증폭시한다.
   2. mCherry와 N-종착체에 표시된 PvdL의 경우, 시작 코동을 포함하여 PvdL 유전자에 상류700 bp 영역을 증폭하고, 프라이머에 의해 파란색으로, 녹색프라이머와 700 bp 다운스트림 영역을 증폭.

그림 2: PvdA-mCherry 건설에 사용되는 PCR 전략 및 플라스미드 건설개요. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오 - pvdA는 철 취득에 관여하는 이차 대사 산물인 사이드로포어 피버딘의 생합성에 관여하는 효소를 인코딩합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. eGFP 인코딩 DNA(시작 및 정지 코돈 제외)를 고충실도 DNA 폴리머라제로 빨간색으로 프라이머로 증폭시다.
3. PCR 정리열(재료 표)에서PCR 제품을 정화합니다.
4. 겹치는 PCR 제품을 equimolar 비율로 혼합하고 PCR 1 및 3(그림 2의녹색 및 파란색)에 사용되는 제한 부위가 있는 프라이머를 사용하여 두 번째 PCR을 수행합니다.
5. PCR 제품을 아가로즈-1x TAE(Tris-Base Acetate EDTA pH 8.0) 젤로 마이그레이션하고, 해당 밴드를 잘라 PCR 정리키트(재료표)로앰플리톤을 추출한다.
   참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
6. 해당 제한^{효소(21)를}이용한 PCR 앰플리턴 및 pEXG2 플라스미드다이제스트.
7. 리게이트 플라스미드와 T4 DNA 리개아제90 ng의 플라스미드 및 분자 비 1:1 (플라스미드:삽입)를 사용하여 삽입합니다.
8. 리칭 생성물 및 TOP10의 100 μL을 혼합하여 화학적으로 유능한 세포 E. 대장균 TOP10 세포에서 플라스미드 시공을 변환합니다. 60s에 대한 42 °C 열 충격을 진행하기 전에 30 분 동안 얼음에 유능한 박테리아 / 플라스미드 혼합물을 배양하십시오. 그런 다음 튜브를 얼음위에 10분 동안 넣습니다.
9. 세균에 리소제니 국물(LB)1mL을 넣고 37°C에서 1h로 배양한다.
10. 15 μg/mL 젠타미신을 함유한 LB 한천에 100 μL 박테리아를 플레이트.
11. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
12. 콜로니 PCR에 의한 인서트의 존재를 스크린: 하나의 분리된 변압제 식민지로부터, 플라스미드에 혼성화프라이머를 함유하는 PCR 믹스에 첨가되는 세균의 분량을 집어들며, 암플리콘의 존재는 아가로즈 젤(DNA 폴리머라제)에서 제품을 실행하여 검출될 수 있다. PCR에 사용되는 동일한 식민지에서, 15 μg/mL 젠타미신을 포함하는 신선한 접시에 소량의 박테리아를 이송하여 플라스미드 추출에 사용한다. 마지막으로 플라스미드(재료표)를 분리하고정화하고 시퀀싱하여 삽입을 확인합니다.
13. -80°C에서 1.5mL 마이크로튜브에 20% 글리세롤을 함유한 LB내 플라스미드를 함유한 TOP10 박테리아를 저장하고 1.5mL 튜브에서 -20°C에서 정제된 플라스미드를 저장한다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

2. 플루오레센트 태그 삽입을 P. 아루기노사의 염색체 게놈에 삽입(도 3)

1. P. aeruginosa,TOP10 및 대장균 도우미 박테리아를 성장, 하룻밤 궤도 흔들림 에서 30 °C에서 항생제없이 LB의 5 mL에서 각각^{하나 22.} 대장균 TOP10에서 패스미드를 PAO1 균주로 옮기고 플라스미드를 균등재조합에 의해 게놈으로 통합하여 P. aeruginosa의 게놈에 형광 태그 삽입을 생성한다. 벡터를 절제하는 두 번째 교차 오버 이벤트는 해당 돌연변이를 생성합니다.
2. 세균 배양의 600nm(OD_{600 nm)에서}광학 밀도를 측정하고 동일한 양의 P를 혼합한다. aeruginosa (500 μL, OD_{600 nm} = 1.0) 대장균 TOP10 pEXG2 (500 μL, OD_{600 nm} = 1.0) 및 E. coli HB101 pRK600 도우미 (500 μL, OD_{600 nm} = 1.0) 마이크로 튜브 마이크로 5.m. 마이크로 튜브에서 마이크로 튜브 1.0.
3. 원심 분리기 는 박테리아를 펠릿 9,300 x g에서 5 분.
   참고: 온라인 도구를 사용하여 원심 g-force를 분당 회전(rpm)으로 변환하여 원심분리기 속도를 조정할 수 있습니다.
4. 세균성 펠릿을 보관하고 상체를 폐기하십시오.
5. LB의 50 μL에서 박테리아를 포함하는 펠릿을 다시 중단합니다.
6. LB 한천(37°C에서 예열)의 중간에 혼합물의 현물(~50 μL)을 플레이트하고 37°C에서 5h를 배양한다.
7. 멸균 접종 루프로 그 자리를 긁어 내고 LB의 1mL에서 다시 중단하십시오.
8. 이 세균현탁100μL은 대장균(대장균 TOP10 pEXG2 및대장균 HB101 pRK600 도우미는 클로람페니콜에 민감하지만 P. aeruginosa는 자연적으로 내성이 있음) 및 30 μg mcubaia/Cl에서 30 μg/mL 클로람페니콜을 함유하고 있습니다.
9. 1mL LB에서 한 식민지를 재중단하고 궤도 흔들림 4h에서 37 °C에서 배양하십시오.
10. 원심분리기는 9,300 x g에서 3분, 950 μL의 상피를 폐기하십시오. LB의 50 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 자당을 함유하고 NaCl없이 LB 천에 혼합물을 분리합니다.
11. 30 °C에서 하룻밤 을 배양하십시오.
12. LB 한천과 LB 천에 분리된 식민지를 발견하여 겐타미신 민감도를 확인하기 위해 15 mg/mL 젠타미신을 함유합니다.
13. PCR 콜로니(DNA 폴리머라제)에 의한 eGFP 또는 mCherry 삽입및 특정 프라이머를 사용하여 시퀀싱을 검증한다.

그림 3: 형광 태그 삽입에 의한 P. 아루기노사 균주의 시공 의정서. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 피버딘 측정

1. 하룻밤 궤도 흔들림에서 30 °C에서 LB의 5 mL에서 박테리아를 성장.
2. 원심분리에 의한 펠릿 박테리아, 세척 및 SM5mL에서 자라며(수치네이트 미디엄, 구성: 6 g∙L^-1 K₂HPO_4,3g∙L^-1 KH₂PO_4,1 g+L^-1 (NH₄₎₂ SO_4,0.2 g+L^-1 MgSO_4,7 H₂O 및 4 g(@L-1 나트륨 은 NaOH를 추가하여 7.0°C로 조정)에서 30°C로 조정하였다. SM은 철분 박탈 배지입니다 - 철의 부재는 철의 존재에서 일반적으로 억압 된 피버딘 경로의 단백질의 발현을 활성화합니다.
3. OD_{600 nm을} 측정하고 OD_{600 nm} = 0.1에서 신선한 SM 배지에서 박테리아를 다시 희석시키고 하룻밤 동안 궤도 흔들림하에서 30 °C에서 성장합니다.
4. 각 샘플에서 박테리아의 양을 결정하기 위해 OD_{600 nm을} 측정합니다.
5. P. 아루기노사 배양 100 μL을 포함하는 석영 큐벳을 준비하고 SM(900 μL)의 1mL로 완료합니다. SM 배지(공백)의 1mL를 포함하는 석영 큐벳을 준비한다.
6. UV 가시 분광광계를 사용하여 흡수 피크의 최대에서 흡광도를 측정합니다. pH 7.0에서 피버딘의 최대 흡수는 ~400 nm에서 발생합니다. e=19 000M -1∙cm-1에서 400nm에서 어금니 멸종 계수를 이용하여 맥주-램버트법칙을 이용하여 샘플에서 피오버딘(apo form) 농도를 결정한다.
   참고: 피오버딘은 흡수율이 농도에 따라 선형적으로 증가하는 ~0.1 ~1(UV 가시 분광계에 따라 다름)에서 흡수력 범위에서 정량화될 수 있다.

4. 박테리아 배양 및 세포가 PvdA, PvdL 및 PvdJ를 표현하는 조건

1. 1일째에는 적절한 글리세롤 스톡에서 LB 5mL로 튜브를 접종하고 궤도 셰이커 인큐베이터에서 200rpm에서 밤에 30°C에서 박테리아를 성장시다.
2. 2일째에, 펠릿 세포는 3분 동안 3,000 x g에서 원심분리에 의한 체질 세포를 폐기하고 상체를 폐기합니다.
3. SM의 10mL에서 세포를 다시 중단합니다.
4. 단계 4.2-4.3 한 번 반복하고 30 °C 200 rpm에서 하룻밤 사이에 SM에서 박테리아를 성장시다.
5. 3일째에는 신선한 SM에서 박테리아 배양을 1/10희석한다.
6. 같은 조건에서 하룻밤 다시 희석 된 박테리아를 성장.
   참고: 피버딘의 존재는 성장하는 매체의 노란색 녹색으로 색상이 될 때 시각적으로 감지할 수 있습니다. 피버딘 통로의 단백질의 발현이 활성화되었고 관심있는 효소가 세포에서 발현되고 있음을 보여줍니다.

5. 아가로즈 패드 준비(그림 4)

1. 평평한 수평 표면에 현미경 유리 슬라이드를 놓습니다. 초기 슬라이드의 양쪽에 접착제 테이프 두 층으로 얹은 두 개의 유리 슬라이드를 정렬합니다.
   참고: 3개의 정렬된 슬라이드 사이에 1-2mm 의 공간을 유지하여 밈처리된 아가로즈가 결국 접착제 테이프로 슬라이드에 퍼지는 것을 방지합니다.
2. 파이펫과 유리 슬라이드에 녹은 아가로즈 1 %의 70 μL의 물방울을 붓습니다. 상단에 네 번째 슬라이드를 추가하여 아가로즈 방울을 평평하게 하고 부드럽게 누릅니다. 잠깐 만요.
3. 상부 슬라이드를 벗고 아가로즈 패드의 다른 위치에서 3~4개의 반점으로 약 3μL의 박테리아파이펫으로 떨어뜨립니다.
4. 현미경 유리 커버 슬립 (예 : 22x22 mm #1.5 두께)로 덮습니다.
   참고: 커버의 평탄도와 두께는 2광자 여기로 작업하는 데 중요합니다. 정밀 커버립은 균일한 평탄도와 낮은 자동 형광을 가진 입술은 일반적으로 좋은 선택입니다.
5. 커버슬립을 녹인 파라핀으로 고정하여 커버슬립을 유리 슬라이드에 밀봉합니다. 먼저 커버슬립의 네 모서리를 고정합니다.

그림 4: 아가로즈 패드 준비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 2광자 현미경 으로 이미징

참고: 당사는 스캔 해제 형광 수집 모드에서 작동하는 60x 1.2NA 수분 침지 목표와 함께 수제 2광자 자궁 스캔 반전 현미경을 사용하고 있습니다. 2광자 내분 파장이 930nm로 설정됩니다. 10~20mW에서 작동하는 Ti:Sapphire 레이저(80MHz 반복속도, 70fs 펄스 폭 ≈)에 의해 제공됩니다. 형광광자는 680nm 쇼트 패스 필터와 525/50 nm 대역 패스 필터를 통해 수집한 후 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC) 모듈에 연결된 섬유 결합 눈사태 사진 다이오드로 이동하였다. 현미경은 또한 전송 형광 램프가 장착되어 있습니다. 여러 FLIM-FRET 현미경은 현재 상용화되었으며 많은 이미징 시설에 FLIM-FRET 측정을 수행할 수 있는 설치 장치가 장착되어 있습니다.

1. 형광 램프를 사용하여 샘플에서 박테리아의 단층에 초점을 맞추고 관심 영역을 선택합니다.
2. 여기 레이저 셔터가 닫혀 있고 레이저에서 나오는 적외선이 막혀 현미경에 들어가지 않는지 확인하십시오.
   주의: 레이저 광은 눈으로 볼 수 없지만 일시적인 직접 박람회 또는 레이저 반사가 매우 해롭고 돌이킬 수없는 눈 손상을 일으킬 수 있기 때문에 IR 펄스 레이저로 작업하는 주의와 지속적인 경계가 주어져야합니다. 현미경 설정을 사용하기 전에 현지 레이저 안전 절차 및 훈련을 참조하십시오.
3. 목표에 직면 커버립과 함께 무대에 현미경 슬라이드를 배치합니다.
4. 형광 램프가 켜져 있는지 확인합니다.
5. 필터 큐브 포탑을 돌려 eGFP 큐브를 선택하고 형광 램프 셔터를 엽니다.
6. 현미경의 안면쪽으로 형광 광을 보냅니다.
   주의: 적절한 필터를 빛의 경로에 배치하여 눈을 손상시킬 수 있는 형광 램프에서 나오는 직접 흥분 광을 버리십시오.
7. 현미경 손잡이를 사용하여 박테리아에 목표를 집중하십시오.
8. 전동 스테이지를 제어하는 조이스틱을 사용하여 샘플에 관심 있는 영역을 선택합니다.
   참고: 형광이 높은 시료로 집중하기가 더 쉬워져 서형광을 눈으로 직접 볼 수 있습니다.
9. FLIM-FRET 측정을 위해 2PE 레이저에 대한 여기를 전환합니다.
10. 형광 방출 경로를 검출기로 다시 보냅니다.
11. 필터 큐브 포탑을 돌려 930 nm 레이저에 대한 디크로이크 큐브를 선택합니다.
12. 레이저 전원을 20mW로 설정합니다.
13. 관심 영역의 크기를 30 μm로 설정합니다. 이 동작은 갈보 미러를 작동하는 전압을 조정하고 움직임의 범위를 정의합니다(그림5).
14. 검출기를 켜고 시료 스캔을 시작합니다 - 스캐닝을 제어하는 시작 및 정지 버튼은 또한 안전상의 이유로 레이저 셔터의 개폐를 제어하고 샘플의 광표백을 제한합니다(그림5).

그림 5: 현미경 제어 소프트웨어의 인터페이스의 회로도 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

15. 필요한 경우 현미경 미세 초점 노브를 약간 이동하여 초점을 조정합니다.
16. 컴퓨터 인터페이스에서 스테이지를 미세하게 이동하여 이미징을 위한 시야를 선택합니다. 이는 이미지의 새로운 중심을 정의하고 이동 스테이지를누르는 현미경 제어 소프트웨어(도5)에서이미지상에 십자가를 이동하여 설정에서 수행할 수 있다. 획득을 위한 좋은 시야는 10-30개의 움직이지 않는 박테리아가 있는 이미지에 해당하며, 모든 것이 올바르게 집중됩니다(모든 박테리아는 동일한 평면에 있음). 단일 셀 FLIM-FRET 데이터를 추출하는 데 관심이 있다면 박테리아가 잘 개별화되었는지 확인하십시오 (이미지 세분화가 훨씬 쉬워집니다).
17. SPCM 소프트웨어(데이터 수집을 위한 상용 소프트웨어)를 열고 광자 수량이 너무 높지 않은지 확인하여 평생 측정에 영향을 줄 수 있는 더미 효과를 방지합니다. 필요한 경우 레이저 강도를 낮추어 광자 수 속도를 낮춥니다(레이저 반복 속도의 약 1%).
    참고: 더미 업 효과는 시간 상관 단일 광자 계산(TCSPC) 장치의 데드 타임으로 인해 높은 광자 수 비율로 손실된 광자의 효과를 설명합니다. Pile-Up이 발생하면 빠르게 방출되는 광자를 오버샘플링하여 감쇠에 나타날 수 있는 추가 짧은 구성 요소로 측정된 평균 수명이 인위적으로 짧아집니다.
18. 수집 시간을 포함하여 획득 매개 변수를 조정합니다(일반적으로 충분한 광자를 수집하려면 60s에서 180s까지).
19. 시작 버튼을 누르고 수집이 완료될 때까지 기다립니다.
20. 데이터를 저장합니다.
21. 샘플 스캔을 중지하고 검출기를 끕니다.
22. 샘플에서 다른 시야필드를 선택하고 6.14-6.22 단계를 반복하거나 6.1-6.22단계를 반복하여 새로운 현미경 슬라이드를 이미지합니다.
    참고: P. aeruginosa살및 아가로즈 패드의 실온에서 최대 6-8시간 동안 살 수 있습니다(20°C에서 마지막 ~4회 두 배로). 이상적으로, 완전히 박테리아로 덮여 패드를 관찰하지 않도록 FLIM-FRET 측정을 수행하기 위해 너무 오래 기다리지 마십시오.

7. 데이터 분석

그림 6: SPCImage 소프트웨어의 데이터 분석 창의 메인 패널. 강도 이미지(블루박스), 평생 이미지(보라색 상자), 평생 히스토그램(오른쪽 위), 선택한 위치(그린 박스)의 부패 곡선, 대표 PvdA-eGFP 부패의 선택된 위치(시안 상자)에서 의 부패 파라미터가 집에서 만든 2개의 포토폰 내시경 에 bh SPC830 획득 카드를 사용하여 라이브 P. aeruginosa에 기록되어 있습니다. 상기 이미지를 가리켰던 픽셀의 실험붕괴 곡선은 계산된 기악 반응 기능(녹색 곡선)으로부터 부패를 감소시키는 모노 지수 핏(적색 곡선)을 그린 패널에서 볼 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 기본 분석
   1. SPCImage 소프트웨어를 실행합니다.
   2. 저장된 SPCM 파일을 가져옵니다. 강도 이미지는 소프트웨어의 왼쪽 상단 패널에 표시됩니다(그림 6 파란색 상자).
   3. 강도 이미지(그림6 블루 박스)에서 선택한 픽셀에 해당하는 감쇠 데이터를 표시하는 감쇠 곡선창(그림 6 녹색 상자)을 검사합니다. 각 시간 채널의 광자 숫자는 파란색 점으로 표시되고 부패의 적합성은 빨간색 선으로 그려집니다. 데이터를 로드한 후 소프트웨어에 이미지의 가장 밝은 픽셀이 표시됩니다. 이미지를 가로질러 파란색 십자가를 이동하여 강도가 낮은 픽셀을 검사합니다. 각 새 픽셀 위치에서 감쇠 창이 자동으로 새로 고칩니다.
      참고: 레이저 스캐닝 시스템의 기악 반응 기능(IRF)을 측정하는 것은 매우 어렵습니다. FLIM 데이터에서 형광 붕괴 곡선의 상승 가장자리에서 계산된 IRF는 감쇠 감소 에 사용할 수 있습니다. 이것은 SPCimage(그림 6 녹색 곡선)에서 기본적으로 수행 되는 옵션입니다.
   4. 피팅 박스의 시작 및 끝 채널을 이동하여 피팅 범위를 조정합니다(녹색 상자의 T1 및 T2). T1은 상승 부패의 처음 몇 채널에서 시작해야하고 T2는 부패의 끝에 마지막 채널을 정의하고 광자 카운트 오프셋 위의 광자의 숫자와 부패의 마지막 채널 중 하나로 선택할 수 있습니다 (즉, 부패가 상승하기 전에 계산 된 광자의 수준).
   5. 빈 값을 변경하여 비닝을 선택합니다. 곡선 붕괴는 선택한 픽셀의 광자 카운팅을 빈 매개변수에 의해 정의된 커서 위치 주위의 i 픽셀 영역과 통합합니다(비닝을 늘리면 감쇠에서 광자 수가 증가하고 다지수수 모델에 필요한 광자 수에 도달하는 데 도움이 될 수 있음).
   6. 임계값값을 조정합니다. 임계값보다 많은 광자가 있는 하나 이상의 채널이 없는 픽셀은 피팅 절차에 포함되지 않습니다. 물론 픽셀 수가 높을수록 분석이 길어집니다.
      참고: FLIM 데이터에는 엄청난 수의 픽셀 및 시간 채널이 포함될 수 있습니다. 소프트웨어의 마지막 버전은 GPU(그래픽 프로세서 유닛)를 사용하여 많은 수의 픽셀을 병렬로 처리할 수 있도록 허용하므로 처리 시간이 크게 줄어듭니다. 가장 낮은 형광 강도를 나타내는 박테리아 구조에 대응하는 이미지를 사용하여 비닝 및 임계값 파라미터를 조정하는 것은 흥미로할 수 있습니다(예: 가장 낮은 발현 수준을 가진 세균균균). 이렇게 하면 이러한 샘플에서 관찰된 관련 부패가 필터링 기준을 충족하고 분석에 포함됩니다. 그런 다음 이러한 매개 변수를 모든 이미지에 사용할 수 있습니다.
   7. 필요한 경우 감쇠 매개변수(시안 상자)를 조정합니다. 전환이 달라지자, 부패 함수를 보면 대부분의 시간이 분산되고 오프셋을 0으로 고정할 수 있습니다. 오프셋은 붕괴의 첫 번째 채널을 보고 추정 될 수있다 - 샘플의 낮은 형광으로 인해 오랜 시간 동안 이미징이 일반적으로 제로 오프셋이 되지 않습니다. 산란은 두꺼운 샘플에서 주로 발생하며 그렇지 않으면 무시할 수 있다고 간주 할 수 있습니다.
   8. 적합을 실행하기 전에 피팅 알고리즘을 선택합니다. 모델 옵션 표시/숨기기에서알고리즘 설정 창을 엽니다. 최대 가능성 추정(MLE)알고리즘(그림 7A)을선택합니다.
   9. 계산 | 감소 행렬을 클릭하여 이미지의 피팅을 실행합니다. 완료되면 수명 인코딩된 FLIM 이미지가 수명 이미지패널(그림 6 퍼플 박스)에 나타납니다.
      참고: 부패 곡선창(그림 6 녹색 상자)에서는 파란색 십자가를 이동하여 이미지의 각 픽셀에 해당하는 수명 값을 볼 수 있습니다.
      참고: 많은 수의 유사한 FLIM 데이터 파일을 자동으로 처리하려면 배치 처리 모드를 사용할 수 있습니다.
   10. 잔류(이상적으로 0 주위로 무작위로 분포) 및 1에 가까운 치 사각형 값을 보고 적합의 품질을 확인합니다.
   11. 장착된 데이터는 다양한 형식으로 내보낼 수 있습니다. txt 파일로 파일을 내보내려면 파일 | 내보내기. 내보내기 옵션창(그림 7B)에서 모든 선택 선택을 선택한 다음 내보내기를 클릭합니다.
   12. 마지막으로 분석 파일을 저장합니다. 분석 파일은 *.img 파일로 저장되며 SPCImage에서 직접 다시 열 수 있습니다.
       참고: 특히 불균형 한 기증자/수용자 수량의 경우, FLIM-FRET는 상호 작용하는 단백질 복합체의 혼합물에서 하위 인구를 드러낼 수 있습니다 - 특히 두 파트너의 농도가 매우 다른 경우 복잡하고 자유로운 종의 혼합물이 발생합니다. 비상호작용종(기증자만 부패와 매우 유사한 부패를 특징으로 함)은 데이터 집합 전반에 걸쳐 기증자 평생 구성 요소의 공간적 변종을 가정하는 상호 작용으로부터 차별받을 수 있다. 유사하게, 비-stoichiometric 상호 작용 복합체는 더 많은 기증자 또는 형광의 더 많은 수용인과 형성될 수 있습니다. 이러한 복합체의 형광 부패는 일반적으로 해석하기 어렵다. FLIM 다이어그램 플롯은 PPI^20,23의stoichiometry 및 바인딩 모드에 대한 중요한 정보를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. FLIM 다이어그램 플롯은 진폭의 함수로서 가장 짧은 수명 구성 요소의 그래픽 표현입니다. 유사한 감소 서명이 있는 픽셀을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 표현을 그리려면 실험형 형광 부패에 두 개의 기하급수적인 모델을 장착해야 합니다. 다음 단계는 이 프로세스를 안내할 수 있습니다.
   13. 먼저 공자 만 시공의 데이터를 분석합니다. 그것은 기증자의 평생 가치를 결정할 수 있습니다. 이상적으로, 기증자/수락자 구조와 동일한 조건에서 기록된 여러 이미지에 대해 이 값을 측정하여 기증자에 대한 강력한 평생 값을 검색합니다.
   14. 일단 결정되면, 2기하급수체 모형으로 기증자/수용자 구조물의 형광 부패를 맞춥니다. 시안 붕괴 매개변수상자(도 6)에서구성요소 수를 2로 설정한다. t2(ps) 매개 변수를 1단계에서 결정된 기증자의 강력한 수명 값으로 수정하고 이 매개 변수를 수정하려면 상자를 선택합니다.
       참고: 오버 피팅을 제한하고, 피팅 수렴을 개선하고, 보다 신뢰할 수 있는 2지수 적합성 파라미터^24,25,26을얻기 위해서는 수명이 오래 지속되는 평생 θ2를 수정하는 것이 중요합니다.
   15. *img 파일을 저장하고 7.1.11 단계에서와 같이 *.asc 파일로 데이터를 내보냅니다.

그림 7: (A) 지수 모델과 부패를 피팅하기 위한 알고리즘 설정입니다. MLE(최대 가능성 알고리즘 또는 최대 가능성 추정, MLE)을 적합 모델로 선택하고 (B) 내보내기 옵션 창을 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. R에서 FLIM 이미지의 고급 분석
   1. 필요한 경우 R(https://cran.r-project.org)과 RStudio(https://rstudio.com)를 설치합니다.
   2. RStudio를 열고 새 프로젝트를 만듭니다.
   3. 프로젝트 메인 폴더의 "데이터"라는 폴더에서 모든 해석 *.asc 파일을 이동합니다.
   4. 새 스크립트 파일을 열거나 추가 스크립트 FLIM_analysis 엽니다. R).
   5. 어설픈 데이터 분석을 위한 전용 어림디아그램 패키지를 설치하여 https://github.com/jgodet/flimDiagRam. 작업 영역에서 패키지를 호출합니다. (공지 HowTo_FlimDiagRam 참조)
      참고: 패키지 설치는 한 번만 수행해야 합니다. 설치되면 새 R 세션에서 패키지를 호출할 수 있습니다. github에서 R 패키지를 다운로드하려면 'devtools' 패키지를 설치해야 합니다. 'devtools'의 설치에는 몇 분이 걸릴 수 있습니다. flimDiagRam 패키지는 FLIM 데이터의 매개 변수 및 분포를 나타내고, 단일 개별화된 셀 수준에서 FLIM 데이터를 추출하고, 조건 또는 균주에서 FLIM 결과를 비교하고, FLIM 다이어그램 플롯과 같은 고급 시각화 도구를 사용하여 FLIM 데이터를 탐색하는 데 사용할 수 있습니다.
   6. 단계별 주석 코드를 사용하고 데이터는 아래의 대표 결과 섹션에 제시된 모든 하위 수치를 독립적으로 재현할 수 있습니다. 이 자습서는 https://github.com/jgodet/flimDiagRam/blob/master/HowTo.pdf HowTo_FlimDiagRam 공지에서 찾을 수 있습니다. 코드를 쉽게 변환하여 데이터를 분석할 수 있습니다.

상이한 세균균균에 대해 측정된 형광 수명의 경험적 누적 분포 기능(ecdf)은 도 8에도시된다. FRET가 발생하면 ecdfs는 수명이 짧을 수 있는 수명(그림8A,8B)으로이동합니다. 두 단백질의 상호 작용이 두 형광사이의 장거리 결과를 초래할 때 FRET가 발생하지않습니다(도 8C). 이러한 상황은 FLIM의 두 파트너 간의 상호 작용이 없는 것과 구별될 수 없습니다. 따라서 분자 모델이나 복잡한의 알려진 아키텍처에서 염료 간 거리를 예측할 수 없는 경우 상호 작용을 프로브할 기회를 최대화하기 위해 다양한 위치에 단백질을 표시하는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, PvdA(고음발성)와 비리보소말 펩타이드 인더니테타제 PvdL(세포당 몇 개 사본) 사이의 단백질 발현의 큰 차이로 인해 동일한 PvdA/PvdL 복합체는 유사한 FLIM-FRET 데이터를 초래하지 않는다. 사실, 불균형 한 스토이치오메트리FLIM-FRET 데이터의 해석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 기증자와 라벨이 부착된 단백질에 따라, 불균형한 스토이치오메트리는 기록된 형광 수명 분포에서 결합된 기증자 라벨 단백질에 비해 자유의 기여도의 차이로 이어집니다(그림8A,8B).

그림 8: FRET(단일 지수 모델)에 대한 응답으로 기증자에서 발생하는 변경 의 그림은 형광 수명 분포를 의미합니다. PvdA(블루 폼)또는PvdJ(노란색 형태)(C)단백질을 eGFP(녹색) 또는 mCherry(빨간색) 형광 단백질로 표기한 PvdL(회색 형태)의 상호작용을 표현한다. 경험적 누적 분포 함수(낮은 그래프)는 형광 수명 분포 간의 차이를 명확하게 강조할 수 있습니다. (A)형광의 기증자로 표시된 PvdA의 과잉의 존재에서, eGFP 기증자의 평균 평생 분포는 FRET를 겪지 않는 기증자에 의해 지배되고 또한 mCherry-PvdL와 FRET를 겪고 있는 몇몇 기증자의 수명을 통합합니다. 이러한 상황에서, 혼합물(녹색-주황색 곡선)의 수명 분포는 라벨이 없는 PvdL만으로 형성된 동일한 혼합물의 수명 분포에 가깝습니다(녹색 곡선). (B)라벨링 순서가 변경되고 수락기로 표시된 PvdA의 과잉이 존재하는 경우, 평균 수명 분포는 여러 수용인(주황색 곡선)으로 FRET를 받는 기증자를 포함하여 이송 종에 의해 지배된다. 따라서 이 분포는 레이블이 지정되지 않은 PvdA(녹색 곡선)로 형성된 동일한 복합체와 매우 다릅니다. (C)단백질이 상호작용하지 않거나 복합체에서 염료 거리가 너무 크기 때문에 FRET가 발생하지 않거나, 수명 분포의 변화는 기증자의 연동 수명 분포에 대응하는 광녹색 곡선을 PvdJ-eGFP-eGG에 대응하는 녹색 곡선과 비교한다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

다이어그램 플롯은 그림 9에서볼 수 있듯이 stoichiometry에 대한 중요한 정보를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. PvdA-eGFP/mCherry PvdL 돌연변이체에서, 기증자 라벨PvdA의 양은 mCherry PvdL의 양보다 훨씬 높습니다. 샘플에 존재하는 모든 기증자 들 사이에서, 그들 중 몇 명만이 PvdL과 상호 작용하고 있습니다. 도 9A에서,~2.3ns를 중심으로 한 단일 tau1 값을 관찰할 수 있으며, 혼합물내 종의 약 30-40%를 나타낸다. 단일 tau1 값은 각 PvdA-eGFP 기증자가 하나의 mCherry PvdL 수락자로만 전송할 수 있음을 시사합니다.

역라벨링(PvdA-mCherry/eGFP PvdL)에서 대부분의 eGFP PvdL 단백질은 PvdA에 비해 PvdL의 수가 적기 때문에 PvdA-mCherry와 상호 작용할 것으로 예상됩니다. 이는 더 높은 값으로 이동되는 alpha1 값에 의해 확인됩니다. 더욱이, tau1 값은 수명이 ~1.5ns로 낮은 단명종의 유령과 함께 훨씬 더 분산되었다(도 9B). 이는 도 9A의 상황과 비교하여 추가 전달이 발생하므로 다중 PvdA 단백질이 단일 PvdL 단백질에 결합될 수 있음을 시사합니다. 그 결과, 각 복합체에 대해 eGFP 수명은 eGFP가 에너지를 전달하는 mCherry 단백질의 수와 분포에 따라 달라집니다. 종합하면, 데이터는 각 PvdL 단백질이 다중 PvdA 단백질과 상호 작용할 수 있다는 것을 건의합니다

그림 9: FLIM 다이어그램 플롯은 기부자(A) 또는 수락자(B) 및 여러 바인딩 사이트를 초과하는 경우 플롯합니다. FLIM 다이어그램 플롯은 두 지수 적합을 사용하여 검색된 FRET를 받는 기증자의 부패 구성 요소에 포함된 특정 정보를 제공합니다. PvdA-eGFP/mCherry-PvdL돌연변이(A)에서,수평 축상에 있는 데이터 포인트의 분산된 위치에 의해 주어진 단일 tau1 값이 관찰되고 그 진폭은 FRET에 종사하는 기증자의 인구에 대해 유익하다. PvdA-mCherry/eGFP-PvdL시스템(B)에서tau1 값은 훨씬 더 분포되어 있으며, 이는 하나의 PvdL(grey form) 단백질이 다중 PvdA(blue form) 단백질과 상호작용할 수 있음을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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