Summary
在这里，我们描述了一种简单、廉价和快速的清除方法，通过荧光成像，使用标记的组合来可视化血管、核、免疫细胞、神经元和脂滴涂层蛋白，从而解析小鼠和人类白色脂肪组织的 3D 结构。
Abstract
肥胖是一个主要的全球公共卫生问题，增加了患心血管疾病、2型糖尿病和肝病的风险。肥胖症的特点是脂肪组织 （AT） 质量增加，由于脂肪细胞增生和/或肥大，导致其三维结构的深刻重塑。事实上，在肥胖期间，AT的最大扩张能力对于肥胖相关病理学的发展至关重要。这种 AT 膨胀是一种重要的恒向机制，能够适应过多的能量摄入，并避免有害脂质溢出到其他代谢器官，如肌肉和肝脏。因此，了解导致 AT 扩展失败的结构重塑是临床适用性高的根本问题。在这篇文章中，我们描述了一种简单而快速的清除方法，在我们的实验室中经常使用这种方法，通过荧光成像来探索小鼠和人类白色脂肪组织的形态。这种优化的AT清除方法在任何配备化学罩、温度控制轨道摇床和荧光显微镜的标准实验室中都很容易实现。此外，使用的化合物是现成的。重要的是，此方法允许人们通过染色各种标记来专门可视化腺细胞、神经元和血管网络以及先天和自适应免疫细胞分布来解析 3D AT 结构。
Introduction
肥胖症的特点是脂肪组织质量增加，并已成为一个重大的全球公共卫生问题，因为肥胖者患心血管疾病、2型糖尿病、肝病和一些癌症的风险增加。
脂肪组织的基本生理功能是调节全身葡萄糖和脂质平衡1，2。1,在喂养期间，脂肪细胞（即脂肪组织的主要细胞）将膳食提供的葡萄糖和脂质的过量储存到甘油三酯中。在禁食过程中，脂肪细胞将甘油三酯分解成非酯化脂肪酸和甘油，以维持身体的能量需求。在肥胖症的发育过程中，脂肪组织通过增加脂肪细胞的大小（肥大）和/或（增生）数量来扩大脂肪细胞1，以增加其储存能力。当脂肪组织的膨胀达到其极限时，患者中一个恒定的极易变量，剩余的脂质会积聚到其他代谢器官，包括肌肉和肝脏3、4，4导致其功能衰竭，并引发肥胖相关的心代谢并发症1,1，5。因此，确定控制脂肪组织扩张的机制是临床的关键挑战。
肥胖期间在脂肪组织内记录的形态修饰与其病理功能障碍有关。一些染色程序已经被用来描述脂肪组织的组织，包括行为素6，血管标记7，脂滴标记8，和特定的免疫细胞标记9,9，10。然而，由于脂肪细胞（50至200μm）的巨大直径11，因此必须从三维分析整个组织的很大一部分，以便准确分析肥胖期间观察到的戏剧性的结构 AT 变化。然而，由于光线不穿透不透明组织，因此不可能使用荧光显微镜在大型组织样本中进行3D成像。组织清除方法，使其透明已经报告在文献（审查，见12），允许一个人清除组织，并执行深入，整个组织荧光显微镜。这些方法为评估健康和患病组织中的 3D 细胞组织提供了前所未有的机会。每种描述的方法都有优点和缺点，因此需要根据所研究的组织仔细选择（如要回顾，见13）。事实上，有些方法需要长时间的潜伏期和/或使用昂贵,、有毒或难以获得的材料或化合物，例如14、15、16、17、18、19。,1516,17,18,19利用一个世纪前沃纳·斯帕尔特霍尔茨（Werner Spalteholz）用于清除组织20的第一批化合物之一，我们建立了一个用户友好且价格低廉的协议，非常适用于清除任何实验室中所有小鼠和人类脂肪组织库，这些实验室具有典型的设备，包括化学罩、温度控制轨道摇床和共生显微镜。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该协议已经过测试，并验证了所有小鼠和人类白色脂肪组织库。人类和小鼠脂肪组织是根据欧洲法律收集的，并经法国和瑞典伦理委员会批准。
1. 小鼠和人类白色脂肪组织的固定
- 将收获的小鼠或人类白色脂肪组织浸入至少 10 mL 的 PBS 中，其中含有 4% 的甲醛 （PFA） 在 15 mL 塑料管中。
- 在室温下在滚动板上摇动塑料管 1 小时。
- 将塑料管在 4°C 下放在滚动板上过夜，以完成固定。
注：此协议适用于大型脂肪组织样本，如从喂养正常饮食的小鼠获得的整个表皮脂肪垫（≈250毫克-≈0.6厘米3）。对于较大的样本，如从喂养高脂肪饮食的小鼠（≈1.5 g - ≈4 厘米3）或人类脂肪组织样本中获得的表皮脂肪垫， 虽然清除协议应该完全适用于整个样品（通过扩大PFA和抗体混合物），一般来说，我们切割组织件约1克（≈2.5厘米3），以保留剩余的样品，无论是额外的染色或应用。对于 PFA（步骤 1.1.），我们建议使用大约 10 倍于组织体积。对于抗体混合物（步骤3.1.和3.4.），增加体积以完全浸入组织，并使用15 mL塑料管（见 材料表），如果组织太大，1.5 mL塑料微管（见 材料表）。
2. 小鼠和人类白色脂肪组织的渗透和饱和度
- 在室温下在 10 mL 中冲洗固定的白色脂肪组织 5 分钟，以去除所有 PFA 的痕迹。
- 将组织浸入含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料管中，并辅以 0.3% 甘氨酸（ 参见材料表），并在轨道摇床中室温下以每分钟 100 转 （rpm） 的速度摇动管 1 小时，以淬火剩余的自由醛组。
- 将组织浸入含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料管中，辅以 0.2% Triton X-100（参见材料 表），在温度控制的轨道摇床中以 37°C 摇动管，在 100 rpm 下摇 2 小时。
- 将组织浸入含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料管中，辅以 0.2% Triton X-100 和 20% DMSO（参见 材料表），并在温度控制的轨道摇床中以 100 rpm 的温度下摇动管。
- 将组织浸入含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料管中，辅以 0.1% Tween-20（ 参见材料表），0.1% Triton X-100， 0.1% 脱氧二边（参见 材料表）和 20% DMSO，在温度控制的轨道摇床中以 37°C 摇动管，转速为 100 rpm，至少 24 小时。
- 在含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料管中冲洗组织，并辅以 0.2% Triton X-100，并在 100 rpm 的轨道摇床中以室温摇动管，持续 1 小时。
- 将组织浸入含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料管中，辅以 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA（参见材料 表），并在37 °C 时在温度控制的轨道摇床中摇动管，温度控制在 100 rpm 12 小时，使任何可能非特异性结合抗体的位点饱和。
注：在步骤2.7中，BSA可被所用二级抗体的血清替代。
3. 小鼠和人类白色脂肪组织的染色程序
- 在含有 300 μL PBS 的 1.5 mL 塑料微管中转移组织，并辅以 0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA 和初级抗体（比冷冻染色多 10 倍浓度，但应评估每种抗体的最佳抗体浓度）。用铝箔覆盖管，在温度控制的轨道摇床中以 37°C 摇动管，在 100 rpm 下至少两天（参见步骤 1.1 和步骤 3.7.1 中的注释）。
- 在含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料管中冲洗组织，并辅以 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，并在温度控制的轨道摇床中摇动 37 °C 时受光线保护的管，在 100 rpm 下，在 100 rpm 下持续 5 小时。执行此步骤两次。
- 在含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料管中冲洗组织，辅以 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，并在 37 °C 下在 37 °C 下在温度控制的轨道摇床中摇动管，在 100 rpm 的温度控制轨道摇床中，持续一晚至两天。
- 将组织转移到含有 300 μL PBS 的 1.5 mL 塑料微管中，并辅以 0.2% Triton X-100、10% DMSO、3% BSA 和二次抗体（比冷冻染色浓缩多 10 倍）。用铝箔覆盖管，在温度控制的轨道摇床中以 37°C 摇动管，在 100 rpm 下至少两天（参见步骤 1.1 和步骤 3.7.1 中的注释）。
- 在含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料管中冲洗组织，并辅以 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，并在 37 °C 下在 37 °C 下在温度控制的轨道摇床中摇动管，在 100 rpm 的温度控制轨道摇床中运行 5 小时。执行此步骤两次。
- 在含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料管中冲洗组织，并辅以 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 3% BSA，并在 37 °C 下在 37 °C 下在 100 rpm 的温度控制轨道摇床中摇动管，持续一晚至两天。
- 在含有 10 mL PBS 的 15 mL 塑料管中冲洗组织，并在温度控制的轨道摇床中以 37°C 的速度在温度控制的轨道摇床中摇动管，防止光线，转速为 100 rpm，持续 2 小时。
注：对于特定结构（如核或苯丙烯）的标签，必须添加4+，6-二丁二苯酚（DAPI或等值）和/或荧光标记的法罗酮。当只使用荧光标记的原抗体时，或在步骤3.4。当使用二级抗体时。
注：对于染色过程，可以使用已经与氟化物结合的原抗体（如用于流式细胞测定的抗体），我们建议它获得时间和特异性。事实上，即使小鼠原抗体可以随后使用二次抗小鼠抗体，正如我们在这里证明的，我们经常观察到由于循环免疫球蛋白导致的血管非特异性染色。因此，为了避免这个问题，强烈建议使用已经标记的原抗体，在这里我们提供证据，证明流式细胞学中使用的抗体与我们的程序兼容。然而，在低水平表达的抗原的特定情况下，通过二级抗体进行信号扩增步骤是强制性的;当唯一可用的原抗体是在小鼠中，心脏灌注与PBS至少5分钟的牺牲可以去除很大一部分循环免疫球蛋白，从而非特异性染色。
4. 小鼠和人类白脂肪组织的清除程序
- 将组织浸入含有 10 mL 50% 乙醇的 15 mL 塑料管中，在 100 rpm 的轨道摇床室温下摇动管，防止光线，持续 2 小时。
- 将组织浸入含有 10 mL 70% 乙醇的 15 mL 塑料管中，在 100 rpm 的轨道摇床室温下摇动管，防止光线，持续 2 小时。
- 将组织浸入含有 10 mL 95% 乙醇的 15 mL 塑料管中，在 100 rpm 的轨道摇床中，在 100 rpm 的轨道摇床中摇动管，防止光线升高 2 小时。
- 将组织浸入含有 10 mL 100% 乙醇的 15 mL 塑料管中，在 100 rpm 的轨道摇床室温下摇动管，防止光线，持续 2 小时。
- 将组织浸入含有 10 mL 100% 乙醇的 15 mL 塑料管中，并在 100 rpm 的轨道摇床室温下摇动管，防止光线。
- 将组织浸入含有5 mL甲基水杨酸盐的塑料瓶中，在化学罩下摇动玻璃容器，防止光线，在100转/分Table of Materials的轨道摇床中，在100转/分的轨道摇床中，在室温下至少2小时。
注：通过避免步骤 4.3，可以显著加快清除过程（如有必要）。和4.5.，虽然最终结算质量将略有下降。
5.3D白脂肪组织的超全共生成像
- 将组织转移到装有玻璃底部的金属成像室 （参见材料表），并在化学罩下填充新鲜的甲基水杨酸盐。
注：为了将组织固定到位，从而防止组织在室内侧身漂浮或移动，在将组织安装到组织顶部时，在组织顶部涂抹多个 18 mm 圆形玻璃盖玻 片（参见材料表）。 - 将成像室放在倒置的共体显微镜上。
- 使用低放大镜（例如，4倍目标）对组织进行成像，以生成整个脂肪组织或人体组织样本的厘米3 3D图。
- 选择几个区域进行组织采样，放大率较高。通常，使用 20 倍长距离空气目标，在分辨率和深度之间提供良好的比率。我们获取深度在 600 到 2000 μm 之间的 z 堆栈的大型马赛克图像。
注：使用远距离目标在组织中更深入地成像。
6. 从3D脂肪组织图像中提取定量结果
注：可以使用许多现有的图像分析软件选项（无论是商业软件还是免费软件）执行不同结构的分割以及随后从点 5 生成的 3D 图像堆栈中提取定量信息。在以下几点中，我们描述了一种在我们的实验室中经常使用的策略，使用商业软件从 3D 脂肪组织图像中提取定量信息（ 参见材料表）。
- 将 3D 堆栈转换为软件格式以释放内存空间。
- 分割单元格。
- 打开 软件 的单元格模块。
- 将细胞 检测设置 更改为等离子膜染色。
- 选择用于描绘细胞外围的标记的荧光通道（标记皮质作用素或血浆膜标记的 phaloidin，如巨噬细胞的 F4/80、T细胞的 TCR-β 或免疫细胞亚型特有的分化 CD 蛋白集群）。
- 设置阈值并提供预期单元格大小范围（即用于细胞检测的 1 到 200 μm）。
- 运行分段。与 z 堆栈对应的卷将生成与分段单元格的颜色编码，每个相邻单元格的颜色不同。
- 在统计选项卡中应用统计过滤器（大小、圆度、圆度等）以排除分割伪物和/或根据其大小将分段细胞细化到感兴趣的细胞（即，20-200 μm 用于腺细胞;5-25 μm 用于巨噬细胞;1-3 μm 用于淋巴细胞）。
- 从统计选项卡中提取测量值和定量数据（体积、数量、大小、直径等）。
- 将细胞组分（核、囊泡等）或血管分割为结构。
注：虽然灯丝分割对研究容器的连通性非常有用，但我们使用表面模块分割来提取有关容器大小、体积和直径的数据。事实上，使用灯丝模块时，容器尺寸的量化丢失。- 打开 软件 的表面模块。
- 选择用于专门标记亚细胞组件的标记的荧光通道，以 3D 方式重建该分量。
- 设置阈值并提供结构的预期直径大小范围（即 0.5-5 μm 用于核;0-100 μm 用于容器;等）。
- 运行分段。将生成具有分段蜂窝结构的卷。测量和定量数据（体积、数量、大小、直径等）可以从统计选项卡中提取。
- 将容器分割为管状连续体。
注：虽然灯丝分割对研究容器的连通性非常有用，但我们使用表面模块分割来提取有关容器大小、体积和直径的数据。事实上，使用灯丝模块时，容器尺寸的量化丢失。- 打开 软件的纤维 模块。
- 选择与容器染色对应的荧光通道。
- 设置荧光强度的阈值，并选择适当数量的预计连接节点。
- 运行分段。代表船舶网络的丝丝将生成 3D。可从统计选项卡中提取测量值，从而获得定量数据，包括船舶长度、船舶分支数量等。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用此处描述和图1 中总结的程序，我们能够分别对图2A 和图 2B中所示的人类和小鼠白色脂肪组织进行污渍和光学清除。清除的组织被转移到金属成像室进行共体成像（图3A）。清除极大地改善了我们能够获取的组织图像的深度（图3B和图3C）。使用 4 倍目标（参见辅助影片1）以 3D 方式采集整个脂肪组织，以生成 3D 地图，从而能够选择使用 20 倍目标以高放大倍率获取的不同区域（图 3D）。高放大倍率图像是在深度为2毫米的3D中采集的（图3E）。
此过程允许使用 DAPI 标记标记许多一般细胞标记，包括核，使用荧光标记的法罗丁进行行为素。脂质液滴和脂肪细胞的具体染色可以通过使用百里平抗体实现（见材料表;图4A）和抗胶质4抗体（见材料表;图 4B）分别。通过使用 CD31 抗体可以检测血管（参见材料表;图4C）或在小鼠牺牲前不久静脉注射Lectin-DyLight649（见材料表;图 4D）。使用抗CD301-PhycoErythrin抗体可以可视化巨噬细胞和T细胞（见材料表;图 4D）和抗TCR-β-太平洋Bleu抗体（见材料表;图4E）。使用抗酪氨酸羟基酶（TH）抗体可以检测外周神经网络（见材料表;图4F-G.此外，该协议允许清除小鼠表皮脂肪组织（图4A-B，E），小鼠皮下脂肪组织（图4D，G），小鼠棕色脂肪组织（图4F）和人类脂肪组织（图4C）。Figure 4使用这些标签和商业软件（见材料表）的组合来分割这些标记，我们可以确定脂肪组织内 i） 脂肪细胞平均大小和大小分布（图5A-B）和 ii） 血管网络密度（图5C）。
图1：白脂肪组织清除程序摘要。小鼠或人类白色脂肪组织是固定的、渗透的、饱和的、染色的和清除的。然后以 3D 技术获取图像，并使用商业软件进行分析。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：白色脂肪组织的照片。（A） 清除程序之前和之后，人类白白白脂肪细胞组织的照片。（B） 清除程序前和之后小鼠表皮白脂肪组织的照片。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：通过脂肪组织清除改善成像深度。（A） 安装装有玻璃底的金属成像室。（B） Z系列小鼠表皮白脂肪组织图像，在清除之前和之后沾有 phaloidin-Alexa488（绿色） 的染色。（C） XZ 投影对应于面板 B z 堆栈上的白色虚线。（D） Z 投影 0.4 厘米 z 堆栈的小鼠皮下白色脂肪组织染色为行动素使用 Phalloidin-Alexa488 和获得在低放大倍率与 4 倍目标.右侧的小图像是在选定的组织位置使用 20 倍目标获得的。（E） 图像 z 堆栈的 3D 体积渲染的侧视图，从清除的小鼠白色脂肪组织染色的 Phalloidin-Alexa488 获得类似于从 （ D ） 获得的 20 倍图像。此处演示了高放大率过程实现的 3D 成像深度，并配以 z 深度颜色编码（深蓝色表示 z=0 mm，深红色表示 z=2 mm）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：小鼠和人类白色脂肪组织染色的几个标记。（A） 使用抗皮平1抗体和抗小鼠-alexa647-结合抗体染色的小鼠表皮白脂肪组织的单平面图像。（B） 马赛克单平面图像的小鼠表皮白脂肪组织染色核和脂肪细胞使用DAPI，抗胶质4抗体和抗小鼠-alexa647-结合抗体。（C） Z投影 600 μm z-堆栈的人类白色白脂肪基组织染色的容器使用CD31-alexa647-结合抗体。（D） Z投影600μm z-堆栈的小鼠皮下白色脂肪组织染色的血管和巨噬细胞使用letin-DyLight649静脉注射和抗CD301-alexa555抗体。右下部插图是白色虚线框的缩放图像。（E） 使用 phhalloidin-Alexa488 和抗 TCR®-太平洋蓝结合的小鼠表皮白脂肪组织染色为行为素和 T 细胞的单平面图像。右下部插图是白色虚线框的缩放图像。（F） Z投影50μm z-堆栈小鼠棕色脂肪组织染色的核和神经元网络使用DAPI，抗TH抗体和抗兔-alexa647-结合抗体。（G） Z 投影 600 μm z-stack 小鼠皮下白脂肪组织染色核和神经元网络使用 DAPI，抗 TH 抗体和抗兔-alexa647 结合抗体。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：使用市售软件分析3D图像（ 见材料表）。（A） 人类脂肪细胞的3D体积渲染，由市售软件在3D中分割。每个脂肪细胞与接触相邻的脂肪细胞的颜色不同。容器以红色表示。（B） 从面板 A 的 3D 体积渲染中对脂肪细胞进行大小定量和分布，该面板包含大约 20，000 个脂肪细胞。（C） 使用市售软件分段的3D血管的3D体积渲染，分别用红色或黄色表示大血管和小血管。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充电影1：图3D所示整个皮下白色脂肪组织的3D 体积渲染。白色框表示 2 厘米3 立方体 。 请点击这里下载此视频。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
脂肪组织内在病理进展过程中发生的改变，如肥胖，对于理解病理背后的机制至关重要。揭示脂肪组织中这种机制的开创性研究基于全球方法，如全脂肪组织蛋白质组学21、流细胞学,22、23和转录组学24、25。,2522此外，还利用组织,学分析26、27、28、29，,努力,探索脂肪组织的结构变化。然而，分析5-10μm脂肪组织部分，由于部分尺寸有限，限制了欣赏重要结构特征的能力。首先，只有几个脂肪细胞核每个部分都可检测到，因为每个部分只代表一小部分的脂肪细胞（1/10th）。其次，从脂肪组织部分估计的脂肪细胞的大小是不准确的，因为大多数脂肪细胞被切到赤道以下或后面，导致对它们平均大小的偏颇（低于）测量。第三，血管和神经纤维连续体在物理剖切过程中丢失。第四，由于三维坐标丢失，组织内免疫细胞的每个亚型的分布都难以确定。在这方面，我们在此建议的方法允许任何标准实验室以简单和廉价的方式以三维图像人类和小鼠白色脂肪组织。
此方法确实有一些限制。首先，准备组织（固定、渗透、染色、清除）所需时间很长（超过一周）。这将很难减少，因为大多数时间是需要染色组织。抗体在如此大型的组织样本中的渗透需要很长的潜伏时间。减少孵育时间会增加非同质抗体渗透的风险，从而导致染色伪影。因此，获得时间和缩短程序的唯一可能窗口是专用于清除组织的时间，这需要大约一天，当需要最佳结果，但可以减少到半天，没有质量急剧下降。第二个限制是组织可能的收缩。事实上，在任何使用溶剂使组织脱水的协议中，组织很可能因去除水而收缩。估计这种收缩总是具有挑战性的，这是几乎不可能在这里，因为组织的边缘变得透明时，脂质开始提取在脱水过程中。因此，需要谨慎解释清除组织的大小估计。然而，比较从具有不同基因型的小鼠和/或提交给不同环境条件的小鼠组织之间脂肪细胞大小或血管长度的变化仍然具有信息性11。最后一个限制与整个小鼠脂肪组织的大体积或大型人类脂肪组织手术样本有关。事实上，虽然该协议是完全适应清除这些大样本，成像整个器官是具有挑战性的与共体显微镜。克服这一问题并充分利用整个器官清除程序的潜力的策略是使用4倍目标获得整个器官的3D低放大倍率图，并选择随机分散在组织内的特定区域，其中使用20倍远距离目标可以获取更高的放大率3D图像。"高放大倍率"设置允许成像约 45 mm3 （4.7 x 4.7 x 2 mm） 的组织体积。虽然这个体积是有限的相比，整个器官的体积（0.5至超过4厘米3），重复在组织内的几个位置的采集使我们能够获得良好的样本，在细胞的亚细胞分辨率组织。请注意，成像大型组织将产生大量需要存储的成像数据。
与先前描述的清除脂肪组织14，30的方法相比，该程序有显著差异。首先，与使用甲醇、二氯甲烷和二苯甲酸酯14的AdipoClear不同，这里介绍的方法使用乙醇进行脱水，使用甲基水杨酸盐进行清除。因此，与二氯甲烷、甲醇和二苯乙基的高毒性相比，该程序更安全，因为它利用了食品/饮料加工业（乙醇和甲基盐酸盐）经常使用的毒性较低的清除溶剂。此外，根据协议组织的准备比阿迪波清除协议14快两天。最近，李和同事提出了另一种方法，通过将脂肪组织浸入甘油30中来清除脂肪组织片段。与此过程相比，此协议也非常简单，即使在高放大倍率下，图像的质量也很好。然而，此清除协议仅在使用 2 mm3 脂肪组织件时有效工作。在清除程序之前将组织切成这些微小的样品，即使在低放大率下，也可防止组织体积大于 2 mm3。此处介绍的程序允许在低放大率下以 3D 方式映射整个组织，并在高放大率下在全清除脂肪组织中多个已知位置获取 45 mm 3 左右的3D图像堆栈。
此过程可能有几个将来的应用程序。与任何方法一样，此处描述的过程可以简化和/或进一步优化。我们描述说，该过程的一个有趣的进展可能来自清算过程与其他成像方法的结合。例如，特定的成像设置，如光学投影断层扫描 （OPT）、总内部反射荧光显微镜 （TIRF）、选择性平面照明显微镜 （SPIM） 或刺激发射消耗显微镜 （STED） 原则上与程序兼容，尽管这将限制其适用于配备这些系统的实验室。或者，使用具有高数值光圈指数的目标和能够获取数百张图像的采集系统（在许多实验室中发现），人们可以通过使用超分辨率径向波动（SRRF）后处理图像分析免费软件31进行超分辨率分析。有趣的是，经典氟化物适用于SRRF分析，这将使整个人类和小鼠白色脂肪组织的3D超分辨率分析。
协议中的许多关键步骤都与清除本身之前的组织处理有关。首先，对于古典组织学分析来说，固定步骤是根本的。在固定性弱的情况下，结构特征不保留，而扩展固定会导致特定抗原位点的交联和阻塞，并随后进行非均匀免疫染色。另一个敏感的步骤是组织的染色，这提供了几个关键点，我们将在下面描述。首先，需要通过在低温分段测试来验证抗体，以确认它们的功能并确定其最佳浓度。用于清除程序的最终浓度是低温分段最佳浓度的十倍。其次，由于组织的大小，孵育时间也至关重要。孵育时间过短会产生弱或不均匀的免疫染色（例如，在组织外围正确染色，但没有内部染色）。同样，洗涤步骤过短将防止非特异性抗体从组织中去除，导致非特异性染色。据我们所知，用抗体延长组织孵育不会损害染色。因此，我们强烈建议延长孵育和洗涤期。第三，氟铬的选择必须适应感兴趣的信号。在一般组织样本中，特别是白色脂肪组织中，在 488 nm 和 555 nm 时可检测到不可忽略的自动荧光。对于高表达的蛋白质，这不是一个问题，染色将很好地在这些渠道工作。然而，对于低表达的蛋白质，我们强烈建议使用远红色的氟化物。对于结算，没有关键步骤，因为方法非常简单。请记住，甲基水杨酸盐与塑料材料不兼容，因此我们建议玻璃瓶用于清除步骤，并配备玻璃底的金属室进行成像。此安装程序的替代方案使用 i） 普通玻璃滑梯、牙科树脂和玻璃盖玻片（生成小玻璃室）或 ii）玻璃培养皿（用于直立显微镜设置）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有冲突要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了 INSERM 的支持， 蔚蓝海岸大学，以及法国国家研究机构（ANR）通过未来实验室信号投资（ANR-11-LABX-0028-01）的资助，通过第2学院"Systémes复合体"和学院4"复杂与多样性"项目UCA JEDI（ANR-15-IDEX-01） Médical基金会（+quipe FRM DEQ20180839587）和J.G.青年调查员计划（ANR18-CE14-0035-01-GILLERON）。我们还感谢由阿尔卑斯海洋局和Région PACA委员会资助的C3M成像核心设施，该设施也得到IBISA显微镜和成像平台Céte d'Azur（MICA）的支持。我们感谢马里恩·杜索在组织准备方面提供的技术帮助。我们感谢艾比·卡特里斯，UCA国际科学能见度，为手稿的校对阅读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C.
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W.
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
