Summary
نقدم هنا طريقة تجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات بكفاءة ، دون الحاجة إلى نقل الجينات أو ناقلات الفيروسات القهقرية. وبالتالي ، فإن هذه الاستراتيجية واعدة للطب الانتقالي وتمثل تقدما ملحوظا في تكنولوجيا الخلايا العضوية الجذعية.
Abstract
يمكن عكس النمط الظاهري للخلية أو تعديله بطرق مختلفة ، مع مزايا وقيود خاصة بكل تقنية. هنا نصف استراتيجية جديدة تجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات. هناك خطوتان رئيسيتان مطلوبتان. في الخطوة الأولى ، تتعرض الخلايا البالغة الناضجة (المتمايزة نهائيا) للممحاة اللاجينية 5-aza-cytidine لدفعها إلى حالة متعددة القدرات. تم تطوير هذا الجزء من البروتوكول ، استنادا إلى الفهم المتزايد للآليات اللاجينية التي تتحكم في مصير الخلية والتمايز ، ويتضمن استخدام المعدل اللاجيني لمحو الحالة المتمايزة للخلية ثم القيادة إلى نافذة عابرة عالية اللدونة.
في الخطوة الثانية ، يتم تغليف الخلايا المحذوفة في مفاعلات حيوية دقيقة متعددة التترافلورو إيثيلين (PTFE) ، والمعروفة أيضا باسم الرخام السائل ، لتعزيز إعادة ترتيب الخلايا 3D لتوسيع والحفاظ على اللدونة العالية المكتسبة والحفاظ عليها بشكل ثابت. PTFE هو مركب اصطناعي غير تفاعلي مسعور ويسمح استخدامه بإنشاء بيئة دقيقة خلوية ، والتي لا يمكن تحقيقها في أنظمة الثقافة التقليدية 2D. يشجع هذا النظام ويعزز الحفاظ على تعدد القدرات من خلال الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي الحيوي.
الإجراءات التقنية الموضحة هنا هي استراتيجيات بسيطة للسماح بتحريض وصيانة حالة عالية اللدونة في الخلايا الجسدية البالغة. سمح البروتوكول باشتقاق خلايا عالية اللدونة في جميع أنواع الثدييات التي تم اختبارها. وبما أنه لا ينطوي على استخدام نقل الجينات وخال من النواقل الفيروسية، فقد يمثل تقدما تكنولوجيا ملحوظا لتطبيقات الطب الانتقالي. علاوة على ذلك ، يوفر نظام المفاعل الحيوي الدقيق تقدما ملحوظا في تكنولوجيا الخلايا العضوية للخلايا الجذعية من خلال إعادة إنشاء بيئة دقيقة محددة في المختبر تسمح بزراعة طويلة الأجل للخلايا عالية اللدونة ، أي مثل ESCs و iPSCs والخلايا التي تم محوها فوق جيني و MSCs.
Introduction
خلال العقود الماضية ، تم تنقيح المفهوم المقبول على نطاق واسع للتقدم أحادي الاتجاه نحو التزام الخلايا والتمايز بالكامل. وقد ثبت أنه يمكن عكس مواصفات الخلية ، ويمكن دفع خلية متمايزة نهائيا نحو حالة أقل التزاما وأعلى تساهلا ، باستخدام طرق مختلفة.
من بين الطرق العديدة المقترحة ، تتضمن إحدى الطرق الواعدة استخدام المركبات الكيميائية لحث الخلايا على ما يسمى بتعدد القدرات المستحث كيميائيا. الجزيئات الصغيرة المستخدمة في هذا النهج قادرة على التفاعل وتعديل التوقيع اللاجيني لخلية ناضجة بالغة ، وتجنب الحاجة إلى أي ناقل معدل وراثيا و / أو فيروسي1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . أظهرت العديد من الدراسات مؤخرا أنه من الممكن تحويل الخلايا من نمط ظاهري إلى آخر من خلال توفير محفزات كيميائية حيوية وبيولوجية محددة تحفز على إعادة تنشيط الجينات مفرطة الميثيل 11،12،13،14،15. تسمح أحداث إزالة الميثيل هذه بتحويل الخلايا المتمايزة نهائيا إلى سلف بدائي أو خلية متعددة القدرات أو عالية اللدونة / متعددة القدرات 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
في موازاة ذلك ، ركزت العديد من الدراسات مؤخرا على فهم الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، وبشكل أكثر تحديدا ، على إمكانية استخدام القوى الميكانيكية للتأثير بشكل مباشر على مرونة الخلايا و / أو التمايز16،17،18،19. في الواقع ، لقد ثبت بوضوح أن المصفوفة خارج الخلية (ECM) تلعب دورا رئيسيا في التحكم في مصير الخلية. على وجه الخصوص ، فإن الإشارات الميكانيكية الحيوية والفيزيائية الحيوية التي تنتجها ECM تنظم مباشرة الآليات الجزيئية ومسارات الإشارات ، مما يؤثر على سلوك الخلية ووظائفها20,21. وقد مهدت هذه البيانات الحديثة الطريق لتطوير أنظمة جديدة للثقافة ثلاثية الأبعاد تحاكي بشكل أوثق البيئة الدقيقة للخلايا في الجسم الحي ، وتكرر المحفزات الميكانيكية والفيزيائية التي تقود سلوك الخلية.
نحن هنا نصف بروتوكولا من خطوتين يجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات. في الخطوة الأولى ، يتم احتضان الخلايا بجزيء إزالة الميثيل 5-aza-cytidine (5-aza-CR). هذا العامل قادر على الحث على إزالة ميثيل الحمض النووي العالمية الهامة من خلال التأثير المشترك للنقل المباشر من عشرة إلى أحد عشر (TET2) بوساطةالإجراء 8,10 والتثبيط غير المباشر لميثيل ترانسفيراز الحمض النووي (DNMT)22,23. تحفز هذه الخطوة على إزالة الكتل اللاجينية مع إعادة تنشيط لاحقة للتعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات ، وبالتالي توليد خلايا عالية اللدونة1،2،3،8،10 ، يشار إليها فيما يلي باسم "الخلايا التي تم محوها فوق وراثيا". في الخطوة الثانية ، يتم تغليف الخلايا في نظام ثقافة 3D. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم استخدام المركب الاصطناعي غير التفاعلي الكارهة للماء polytetrafluoroethylene (PTFE ؛ مع حجم الجسيمات 1 ميكرومتر) كمفاعل حيوي دقيق ، والذي يسمح بإنشاء بيئة دقيقة خلوية لا يمكن تحقيقها من خلال استخدام أنظمة الاستزراع ثنائية الأبعاد التقليدية10. تلتصق جزيئات مسحوق PTFE بسطح قطرة السائل التي يتم فيها إعادة تعليق الخلايا وتعزل قلب السائل عن السطح الداعم ، مع السماح بتبادل الغاز بين السائل الداخلي والبيئة المحيطة24. يشجع "المفاعل الحيوي الدقيق PTFE" الذي تم الحصول عليه ، والمعروف أيضا باسم "الرخام السائل" ، الخلايا على التفاعل بحرية مع بعضها البعض ، مما يعزز إعادة ترتيب الخلايا ثلاثية الأبعاد25،26،27 ، ويمتد ويحافظ بثبات على حالة اللدونة العالية المكتسبة من خلال الإشارات المتعلقة بالميكانيكا الحيوية10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت مراجعة جميع الدراسات والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة ميلانو. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر ، الذي نشرته المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH). تمت الموافقة على عزل الخلايا البشرية عن الأفراد البالغين الأصحاء من قبل اللجنة الأخلاقية في Ospedale Maggiore Policlinico ، ميلانو. تم تنفيذ جميع الطرق في دراستنا وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.
1. عزل الخلايا الليفية الجلدية
ملاحظة: يمكن تطبيق جميع الإجراءات الموضحة أدناه على الخلايا الليفية المعزولة من أنواع الثدييات المختلفة ، بما في ذلك الفأر والخنزير والإنسان. تم عزل خلايا المورين من الفئران الذكور البالغة من العمر 7 أسابيع وتم جمع أنسجة جلد الخنزير في المسلخ المحلي. تم عزل الخلايا البشرية عن المرضى البالغين ، بعد موافقة خطية مستنيرة.
- تحضير 0.1 ٪ محلول الجيلاتين الخنزير.
- يزن 0.1 غرام من الجيلاتين الخنزير ويذوبه في 100 مل من الماء. تعقيم محلول الجيلاتين عن طريق التعقيم قبل الاستخدام.
- غطي طبق بتري 35 مم بجيلاتين بورسين بنسبة 0.1٪ بإضافة 1.5 مل من المحلول المحضر. حضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- قطع خزعات جلد الثدييات (الفأر والخنزير والإنسان) التي يبلغ طولها حوالي 2-5 سم وضعها في محلول دولبيكو الملحي المخزن مؤقتا بالفوسفات (PBS) الذي يحتوي على محلول مضاد للفطريات مضاد للمضادات الحيوية بنسبة 2٪. يحفظ في + 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: يجب إجراء عمليات جمع الخزعات بالاتفاق وبعد موافقة اللجنة الأخلاقية، وفقا للمبادئ التوجيهية المعمول بها. - اغسل الخزعات التي تم جمعها على نطاق واسع ثلاث مرات في PBS معقمة طازجة تحتوي على محلول مضاد للفطريات مضاد حيوي بنسبة 2٪.
- جمع الخزعات من الغسيل الأخير ووضعها في طبق بتري معقم 100 ملم. استخدم مشرطا معقما لتقطيعها إلى قطع بحجم 2 مم3 تقريبا.
- في نهاية الحضانة لمدة 2 ساعة ، قم بإزالة الفائض من محلول الجيلاتين من طبق بتري 35 مم (الموصوف في الخطوة 1.1.2) ، وباستخدام ملقط جراحي معقم ، ضع على الفور 5-6 شظايا جلدية في كل طبق ثقافة مغلف مسبقا.
- بلل الشظايا بإضافة قطرات 100 ميكرولتر من وسط عزل الخلايا الليفية (الجدول 1) فوق كل منها. الثقافة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
ملاحظة: لمنع الوسط من التبخر، ضع طبق بتري 35 مم داخل طبق بتري 100 مم أو أكبر يحتوي على ماء معقم. تأكد من تغطية كل من أطباق بتري. - بعد 24 ساعة من الثقافة، تحقق من كمية الوسط في طبق بتري المستنبت 35 ملم. إذا لزم الأمر ، أضف 500 ميكرولتر من وسط عزل الخلايا الليفية للحفاظ على الشظايا رطبة.
- قم بإزالة الوسط بعناية وتحديثه على الأقل كل 2 أيام من الثقافة باستخدام ماصة.
- عندما تبدأ الخلايا الليفية في النمو من شظايا الجلد الموضوعة في طبق بتري 35 مم (الموصوف في الخطوة 1.5) وتبدأ في تكوين طبقة أحادية الخلية (عادة 6 أيام). قم بإزالة قطع الجلد باستخدام ملاقط جراحية معقمة وزرع في 2 مل من وسط عزل الخلايا الليفية.
- استمر في زراعة الطبقة الأحادية الخلية عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ حتى التقاء 80٪ وتحديث الوسط كل يومين.
2. زراعة خط الخلايا الأولية الليفية
- عندما تصل الخلايا الليفية إلى التقاء بنسبة 80٪ ، قم بإزالة وسط عزل الخلايا الليفية بعناية وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 3 مل من PBS يحتوي على محلول مضاد للفطريات مضاد حيوي بنسبة 1٪.
- لفصل الخلايا ، أضف 600 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ في طبق الاستزراع واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
- أضف 5.4 مل من وسط زراعة الخلايا الليفية لتحييد التربسين عندما تبدأ الخلايا في الانفصال عن طبق الاستزراع (الجدول 1).
- إزاحة الخلايا عن طريق السحب المتكرر واللطيف. خلايا الطبق في أطباق الثقافة الجديدة (بدون الجيلاتين) ، مع الحفاظ على نسبة المرور بين 1: 2 و 1: 4 (اعتمادا على معدل النمو).
ملاحظة: الطرد المركزي ليس ضروريا. - الحفاظ على الخلايا في الثقافة وتغيير الوسط كل 2 أيام ، حتى تصل إلى 80 ٪ من الالتقاء ومرورها.
ملاحظة: نشر الخلايا الليفية مرتين في الأسبوع للحفاظ على نمو قوي.
3. التعرض للخلايا الليفية ل 5-aza-CR
- تحضير محلول مخزون 1 mM 5-aza-CR الطازج.
- يزن 2.44 ملغ من 5-aza-CR ويذوب في 10 مل من الجلوكوز العالي DMEM. أعد تعليق المسحوق عن طريق الدوامة. تعقيم الحل مع مرشح 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: يجب تحضير محلول مخزون 5-aza-CR مباشرة قبل الاستخدام. - قم بإعداد حل عمل 5-aza-CR عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من محلول مخزون 5-aza-CR (3.1.1) في 1 مل من وسط زراعة الخلايا الليفية.
ملاحظة: تركيز حل العمل 5-aza-CR هو 1 ميكرومتر 1,2,3,8,9.
- يزن 2.44 ملغ من 5-aza-CR ويذوب في 10 مل من الجلوكوز العالي DMEM. أعد تعليق المسحوق عن طريق الدوامة. تعقيم الحل مع مرشح 0.22 ميكرومتر.
- التريبسين الخلايا كما هو موضح سابقا (2.1.-2.3) وإزاحة الخلايا عن طريق السحب المتكرر وبلطف.
- جمع تعليق الخلية ونقله إلى أنبوب مخروطي.
- عد الخلايا باستخدام غرفة عد تحت المجهر الضوئي في درجة حرارة الغرفة. احسب حجم الوسط اللازم لإعادة تعليق الخلايا للحصول على 4 × 104 خلايا في 30 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الليفية المكمل ب 1 ميكرومتر 5-aza-CR (انظر الخطوة 3.1.2).
ملاحظة: تعتمد الصيغة المراد استخدامها على نوع الغرفة المحدد.
- جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 150 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الحبيبة الفائقة وأعد تعليق الكريات باستخدام وسط زراعة الخلايا الليفية المكمل ب 1 ميكرومتر 5-aza-CR (انظر الخطوة 3.1.2). للحصول على حجم وسط زراعة الخلايا الليفية الذي سيتم استخدامه ، انظر الخطوة 3.4.
ملاحظة: كعنصر تحكم سلبي ، أعد تعليق الخلايا بنفس التركيز في وسط زراعة الخلايا الليفية بدون 5-aza-CR واستمر في تغليف الخلايا في مسحوق PTFE (الخطوة 4.1.-4.13).
4. تغليف الخلايا الليفية في المفاعلات الحيوية الدقيقة PTFE
- املأ طبق بتري 35 مم بمسحوق البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) لإنتاج سرير (الشكل 1A).
ملاحظة: استخدم أطباق بتري البكتريولوجيا مقاس 35 مم لتجنب التصاق الرخام السائل. من أجل الحصول على قشرة رقيقة مسعورة ومسامية ، استخدم مسحوق PTFE بمتوسط حجم جسيم يبلغ 1 ميكرومتر ويتم إنتاجه بحد أقصى طحن يبلغ 2.0 NPIRI. هذا يسمح بإنشاء رخام سائل قابل للنفاذ للغاز. علاوة على ذلك ، يسهل الطلاء الشفاف مراقبة عمليات تجميع الخلايا في الوقت الفعلي يؤدي حجم الجسيمات الأكبر إلى تعدد التشتت العالي الذي يمكن أن يسبب التبخر المرتفع والتشوه وفقدان الشكل الكروي ، والذوبان المبكر للمفاعلات الحيوية الدقيقة. - قم بتوزيع 30 ميكرولتر قطرة واحدة تحتوي على 4 × 10 4 خلايا (انظر الخطوات3.4 .- 3.5.) على سرير المسحوق (الشكل 1B).
- قم بتدوير طبق بتري 35 مم برفق في حركة دائرية للتأكد من أن مسحوق PFTE يغطي بالكامل سطح قطرة السائل لتشكيل مفاعل حيوي دقيق رخامي سائل (الشكل 1C).
- التقط المفاعل الحيوي الدقيق الرخامي السائل باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر ، مقطوع عند الحافة ، لاستيعاب قطر الرخام (الشكل 1D ، E). قم بصب المفاعل الحيوي الدقيق الرخامي السائل على طبق بتري نظيف من البكتريولوجيا لتحقيق الاستقرار فيه (الشكل 1F).
ملاحظة: لإنشاء احتكاك للإمساك بالرخام داخل الطرف ، قم بقطع أطراف الماصة بقطر أقل قليلا تقريبا من قطر الرخام السائل. - انقل المفاعل الحيوي الدقيق الرخامي السائل من طبق بتري إلى طبق بئر 96 (رخام / بئر واحد) (الشكل 1G).
- أضف ببطء 100 ميكرولتر من الوسائط من هامش البئر. يبدأ المفاعل الحيوي الدقيق في الطفو فوق الوسائط (الشكل 1H).
ملاحظة: ينكسر المفاعل الحيوي الدقيق في اتصال سائل مباشر ، بسبب اضطراب كره الماء PTFE. وكنهج بديل، يمكن وضع المفاعلات الحيوية الدقيقة الرخامية السائلة بشكل فردي في طبق استزراع البكتريولوجيا عيار 35 ملم. في هذه الحالة ، من أجل منع تبخر الرخام السائل ، يجب إدخال طبق بتري 35 مم الذي يحتوي على المفاعل الحيوي الدقيق في طبق بتري 100 مم ، تم اقتباسه سابقا بالماء المعقم. - احتضان المفاعل الحيوي الدقيق الرخامي السائل لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO 21،2،3،8،9.
ملاحظة: يمكن أن يضمن حجم جسيمات PTFE البالغ 1 ميكرومتر تبادلا مثاليا للغازات بين السائل الداخلي والبيئة المحيطة. - بعد حضانة 5-aza-CR لمدة 18 ساعة ، اجمع المفاعل الحيوي الدقيق الرخامي السائل باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر مقطوع عند الحافة (انظر الخطوة 4.5).
- ضع المفاعل الحيوي الدقيق في طبق بتري جديد من البكتريولوجيا مقاس 35 مم (الشكل 1D-F).
- استخدم إبرة لثقب الرخام السائل وكسره.
- استعادة الكرويات المشكلة مع طرف ماصة 200 ميكرولتر ، مقطوعة عند الحافة ، تحت مجهر مجسم (الشكل 1I ، J).
ملاحظة: تشكل الخلايا التي تم محوها فوق وراثيا والمغلفة في PTFE بنية كروية 3D (مجموع واحد في كل رخام سائل). - لتقييم اكتساب حالة متعددة القدرات استجابة ل 5-aza-CR ، تحقق من بداية التعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات ، OCT4 ، NANOG ، REX1 ، و SOX2 ، بواسطة PCR النوعي (الجدول 2).
- تابع الخطوة الثانية من البروتوكول كما هو موضح أدناه.
5. الثقافة في المفاعلات الحيوية الدقيقة PTFE للخلايا التي تم محوها وراثيا
- إعداد وسط ثقافة ESC طازج (الجدول 1).
- انقل المواد العضوية في طبق بتري يحتوي على وسيط ESC لغسل بقايا 5-aza-CR (انظر الخطوات 5.1.-5.2).
- قم بإعداد طبق بتري جديد 35 مم يحتوي على سرير مسحوق PTFE (انظر أيضا الخطوة 4.1).
- قم بتوزيع عضوي واحد في قطرة من 30 ميكرولتر من وسط ثقافة ESC على سرير المسحوق باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر ، مقطوع عند الحافة (انظر الخطوات 4.9.; 5.3.).
- قم بتدوير طبق بتري 35 مم برفق في حركة دائرية لتشكيل مفاعل حيوي دقيق رخامي سائل جديد ، والتقطه باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر ، وقطع عند الحافة ، ووضع المفاعل الحيوي الدقيق المشكل حديثا في بئر من 96 بئرا (رخام / بئر واحد) (انظر الخطوات 4.3.-4.6).
- ولتعويم المفاعلات الحيوية الدقيقة، يضاف 100 ميكرولتر من الوسائط من حافة البئر ليستحم الرخام ببطء (انظر الحاشية 4-7).
- استزراع المفاعلات الحيوية الدقيقة الرخامية السائلة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ طالما كان ذلك مطلوبا. تغيير الوسط كل يومين، باتباع الإجراء الموضح في 5.3.-5.7.
ملاحظة: في هذه المخطوطة ، يتم توفير النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام ثقافة المواد العضوية لمدة 28 يوما. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء فترة ثقافة أطول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول جميع الخطوات التي يتعين القيام بها لتوليد خلايا الثدييات متعددة القدرات والحفاظ عليها بشكل مستقر من الخلايا الجسدية البالغة. وقد نجحت هذه الطريقة مع الخلايا الليفية المعزولة من أنواع الثدييات المختلفة ، وهي الفأر والخنزير والإنسان. يتم الحصول على النتائج التمثيلية المبلغ عنها هنا من جميع خطوط الخلايا ، على التوالي من الأنواع الأصلية.
تظهر التحليلات المورفولوجية أنه بعد حضانة 18 ساعة باستخدام عامل إزالة الميثيل 5-aza-CR ، يتم تغليف الخلايا الليفية في مفاعلات PTFE الحيوية الدقيقة (3D Post 5-aza-CR) وتشكل هياكل كروية ثلاثية الأبعاد تعرض هندسة موحدة الحجم ، في جميع الأنواع الثلاثة التي تم النظر فيها. (الشكل 2A-C، 3D Post 5-aza-CR). 86.31 ± 4.13٪ من الخلايا المغلفة عدلت نمطها الظاهري بشكل ملحوظ ، مما يدل على ميزات مرتبطة عادة بالنمط الظاهري8 عالي اللدونة. وعلى النقيض من ذلك، فإن الخلايا ما بعد 5-aza-CR المستزرعة في ظروف قياسية ثنائية الأبعاد، على الرغم من استبدال الشكل الممدود للخلايا الليفية النموذجية بأخرى مستديرة أو بيضاوية، كانت أصغر حجما بكثير مع نوى أكبر وحبيبية، وتحتفظ بتوزيع أحادي الطبقة (الشكل 2). كانت التغيرات المورفولوجية مصحوبة ببداية التعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات في كل من خلايا 3D و 2D Post 5-aza-CR. كما لوحظ نسخ ل POU class 5 homeobox 1 (OCT4) ، و Nanog homeobox (NANOG) ، و ZFP42 بروتين إصبع الزنك (REX1) ، ومنطقة تحديد الجنس Y-box 2 (SOX2) ، والتي هي غائبة في الخلايا الليفية غير المعالجة (T0) ، تم اكتشافها (الشكل 3 ، الشكل 4 ، الشكل 5). علاوة على ذلك ، أظهر التحليل الكمي ل PCR تنظيما كبيرا للجينات المذكورة أعلاه ، وكذلك للجينات العشرة إلى أحد عشر عملية نقل -2 (TET2) ، وجزيء التصاق الخلايا الظهارية (EPCAM) ، وجينات cadherin 1 (CDH1) في خلايا 3D Post 5-aza-CR (الشكل 3 ، الشكل 4 ، الشكل 5 ، الأشرطة الزرقاء) مقارنة بالخلايا المستزرعة في أطباق بلاستيكية قياسية ثنائية الأبعاد (2D Post 5-aza-CR) (الشكل 3 ، الشكل 4 ، الشكل 5 ، قضبان برتقالية). وبالتوازي مع ذلك، كان من الممكن بوضوح اكتشاف انخفاض كبير في مستوى مستضد سطح الخلية Thy-1 المحدد للخلايا الليفية Thy-1 (THY1) في خلايا 3D و 2D Post 5-aza-CR (الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5).
كما تم تأكيد تحقيق حالة عالية من اللدونة من خلال تحليل ELISA للمثيلة العالمية للحمض النووي ، والذي يوضح انخفاضا كبيرا في مستويات المثيلة في كل من خلايا 3D و 2D Post 5-aza-CR (الشكل 6A-C). علاوة على ذلك ، بالاتفاق مع نتائج التعبير الجيني ، كانت مستويات مثيلة الحمض النووي أقل بكثير في خلايا 3D Post 5-aza-CR (الشكل 6 A-C ، الأشرطة الزرقاء) ، مقارنة بالخلايا 2D Post 5-aza-CR (الشكل 6A-C ، القضبان البرتقالية).
والأكثر إثارة للاهتمام ، أن خلايا 3D Post 5-aza-CR تحتفظ بالبنية الكروية ثلاثية الأبعاد المكتسبة (الشكل 2A ، 3D 28d) وتحافظ على مستويات تعبير عالية من الجينات المرتبطة بتعدد القدرات (الشكل 3 ، الشكل 4 ، والشكل 5 الأشرطة الزرقاء) وكذلك مستويات مثيلة الحمض النووي المنخفضة (الشكل 6A-C ، الأشرطة الزرقاء) ، خلال جميع فترة الثقافة اللاحقة ، وعلى وجه التحديد ، حتى يوم 28 ، عندما تم القبض على الثقافة. في المقابل ، على الرغم من أن خلايا 2D Post 5-aza-CR تنسخ لنفس جينات تعدد القدرات بعد العلاج بعامل إزالة الميثيل ، إلا أنها رفضت هذا التعبير بحلول اليوم 7 (الشكل 3 ، الشكل 4 ، الشكل 5 ، nd). وبالمثل، استمر الانخفاض في مستويات المثيلة خلال ال 72 ساعة الأولى؛ ثم زادت المثيلة ببطء ، وعادت مماثلة للخلايا الليفية غير المعالجة (الشكل 6 A-C ، T0 ، القضبان البيضاء) بحلول اليوم 7 من الثقافة (الشكل 6A-C ، قضبان البرتقال).
الشكل 1: تغليف الخلايا في المفاعل الحيوي الدقيق PTFE واستعادة المواد العضوية. (أ) تم ملء طبق بتري البكتريولوجيا ب PTFE لإعداد سرير مسحوق. (ب) تم توزيع قطرة واحدة من الخلايا المتوسطة المحتوية على طبقة PTFE فوق سرير PTFE. (ج) تم تدوير طبق بتري بلطف بحركات دائرية لتغطية القطيرة وإنتاج المفاعل الحيوي الدقيق. (د) تم قطع طرف ماصة 1000 ميكرولتر في النهاية (سهم أحمر) و (هاء) يستخدم لجمع المفاعل الحيوي الدقيق. (و) تم نقل الرخام السائل إلى طبق بتري نظيف لتثبيته ، (G) وضعت في طبق بئر 96 (رخام / بئر واحد) و (H) طفت على الوسائط. (I) لجمع المواد العضوية المشكلة حديثا ، تم ثقب المفاعل الحيوي الدقيق بإبرة و (J) تم استرداد مجاميع الخلايا التي تم الحصول عليها تحت المجهر المجسم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تشكل الخلايا التي تم محوها وراثيا من الثدييات المغلفة في المفاعلات الحيوية الدقيقة PTFE هياكل كروية ثلاثية الأبعاد. خلايا مورين (A) وخلايا الخنزير (B) وخلايا بشرية (C) مغلفة في PTFE ومعالجتها بهياكل كروية ثلاثية الأبعاد 5-aza-CR (3D Post 5-aza-CR) ، والتي تم الحفاظ عليها بثبات خلال جميع فترة الثقافة اللاحقة (3D 28d; شريط مقياس ، 100 ميكرومتر). وعلى النقيض من ذلك، حلت خلايا الفئران (A) والخنزير (B) والخلايا البشرية (C) المطلية على أطباق بلاستيكية والمعالجة ب 5-aza-CR محل الشكل الممدود للخلايا الليفية النموذجية (T0) في نمط ظاهري ظهاري مستدير واحتفظت بتوزيع أحادي الطبقة (2D Post 5-aza-CR). بحلول اليوم 7 من الثقافة، عادت الخلايا ثنائية الأبعاد إلى شكلها الأصلي الممدود الذي تم الحفاظ عليه بثبات لفترة الثقافة اللاحقة (2D 28 d; شريط مقياس ، 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تظهر الخلايا التي تم محوها فوق جيني من الفئران المغلفة في المفاعلات الحيوية الدقيقة PTFE مستوى عاليا وصيانة طويلة الأجل للتعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات. مستويات النسخ لجينات Oct4 و Nanog و Rex1 و Sox2 و Tet2 و Epcam و Cdh1 و Thy1 في الخلايا الليفية غير المعالجة (T0 ، القضبان البيضاء) ، والخلايا الليفية المعرضة ل 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) ، وفي نقاط زمنية مختلفة من الثقافة للخلايا المستزرعة PTFE المغلفة (القضبان الزرقاء) والطبق البلاستيكي القياسي (قضبان البرتقال). يتم الإبلاغ عن قيم التعبير الجيني مع تعيين أعلى تعبير إلى 1 وجميع التعبيرات الأخرى المتعلقة بذلك. تشير الحروف المرتفعة المختلفة إلى اختلافات كبيرة (P < 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تظهر الخلايا التي تم محوها فوق جيني من لحم الخنزير المغلفة في المفاعلات الحيوية الدقيقة PTFE مستوى عاليا وصيانة طويلة الأجل للتعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات. مستويات النسخ لجينات OCT4 و NANOG و REX1 و SOX2 و TET2 و EPCAM و CDH1 و THY1 في الخلايا الليفية الخنازير غير المعالجة (T0 ، القضبان البيضاء) ، والخلايا الليفية المعرضة ل 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) ، وفي نقاط زمنية مختلفة من الثقافة للخلايا المستزرعة PTFE المغلفة (القضبان الزرقاء) والطبق البلاستيكي القياسي (قضبان البرتقال). يتم الإبلاغ عن قيم التعبير الجيني مع تعيين أعلى تعبير إلى 1 وجميع التعبيرات الأخرى المتعلقة بذلك. تشير الحروف المرتفعة المختلفة إلى اختلافات كبيرة (P < 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تظهر الخلايا البشرية التي تم محوها وراثيا والمغلفة في المفاعلات الحيوية الدقيقة PTFE مستوى عاليا وصيانة طويلة الأجل للتعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات. مستويات النسخ لجينات OCT4 و NANOG و REX1 و SOX2 و TET2 و EPCAM و CDH1 و THY1 في الخلايا الليفية البشرية غير المعالجة (T0 ، القضبان البيضاء) ، والخلايا الليفية المعرضة ل 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) ، وفي نقاط زمنية مختلفة من الثقافة للخلايا المستزرعة PTFE المغلفة (القضبان الزرقاء) والطبق البلاستيكي القياسي (قضبان البرتقال). يتم الإبلاغ عن قيم التعبير الجيني مع تعيين أعلى تعبير إلى 1 وجميع التعبيرات الأخرى المتعلقة بذلك. تشير الحروف المرتفعة المختلفة إلى اختلافات كبيرة (P < 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: يعزز المفاعل الحيوي الدقيق PTFE تأثير إزالة الميثيل 5-aza-CR ويحافظ على نقص ميثيل الحمض النووي على المدى الطويل في الخلايا الليفية اللاجينية للثدييات التي تم محوها وراثيا. مستويات مثيلة الحمض النووي العالمية للخلايا الفئرانية (A) والخنازير (B) والبشرية (C) المغلفة في المفاعلات الحيوية الدقيقة PTFE (القضبان الزرقاء) أو المطلية على البلاستيك القياسي (القضبان البرتقالية) المعرضة ل 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) والمستزرعة في وسط ESC لمدة 28 يوما. الخلايا الليفية غير المعالجة (T0؛ القضبان البيضاء). تمثل النتائج متوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة مع خمس نسخ بيولوجية مستقلة. تشير الحروف المرتفعة المختلفة إلى اختلافات كبيرة (P < 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عزل الخلايا الليفية المتوسطة (100 مل) | |
| DMEM ، الجلوكوز العالي ، البيروفات | 77 مل |
| مصل البقر الجنيني ، مؤهل ، معطل بالحرارة | 20 مل |
| L-محلول الجلوتامين | 1 مل |
| محلول مضاد للفطريات مضاد حيوي (100×) | 2 مل |
| وسط ثقافة الخلايا الليفية (100 مل) | |
| DMEM ، الجلوكوز العالي ، البيروفات | 88 مل |
| مصل البقر الجنيني ، مؤهل ، معطل بالحرارة | 10 مل |
| L-محلول الجلوتامين | 1 مل |
| محلول مضاد للفطريات مضاد حيوي (100×) | 1 مل |
| وسط استزراع ESC (10 مل) | |
| هام F-10 مزيج المغذيات | 3,99 مل |
| DMEM ، انخفاض نسبة الجلوكوز ، البيروفات | 3,99 مل |
| استبدال مصل خروج المغلوب | 1 مل |
| مصل البقر الجنيني ، مؤهل ، معطل بالحرارة | 500 ميكرولتر |
| محلول مضاد للفطريات مضاد حيوي (100×) | 100 ميكرولتر |
| L-محلول الجلوتامين | 100 ميكرولتر |
| محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100X) | 100 ميكرولتر |
| 2-ميركابتوإيثانول (10 ملليمتر) | 100 ميكرولتر (0.1 ملليمتر) |
| مزيج النيوكليوسيد (0.3 م جوانوسين، 0.3 م أدينوزين، 0.3 م سيتيدين، 0.3 م يوريدين و 0.1 م تيميدين) | 100 ميكرولتر (3 ملم غوانوزين، 3 ملليمتر أدينوزين، 3 ملليمتر سيتيدين، 3 ملليمتر يوريدين و 1 ملليمتر تيمين) |
| ESGRO ماوس مؤتلف LIF بروتين (1000 وحدة / مل) | 10 ميكرولتر (1 وحدة/مل) |
| FGF البشري المؤتلف الأساسي (bFGF) (5 ميكروغرام / مل) | 10 ميكرولتر (5 نانوغرام/مل) |
الجدول 1: تكوين وسط عزل الخلايا الليفية ووسط زراعة الخلايا الليفية ووسط زراعة ESC.
| هدف | مجموعات PCR التمهيدي | جنس | |
| Cdh1 | خط الهجوم: غاغاكاكاغكتشاتا | فأر | |
| العكس: GTTGACCGTCCCTCCACAGT | فأر | ||
| إبكام | خط الهجوم: TGGCAACAAGTTGCTCTG | فأر | |
| العكس: CTTGTCGGTTCTTCGGACTC | فأر | ||
| نانوغ | إلى الأمام: AGGCTGATTTGGTTGGTGTC | فأر | |
| العكس: CCAGGAACCCACACTCAT | فأر | ||
| أكتوبر4 | إلى الأمام: ACACCTGGCTTCAGACTTCG | فأر | |
| العكس: AGTTGCTTTCCACTCGTGCT | فأر | ||
| ريكس1 | خط الهجوم: CAGGTTCTGGAAGCGAGTTC | فأر | |
| العكس: GACAAGCATGTGCTTCCTCA | فأر | ||
| سوكس2 | خط الهجوم: أغاكاغاتجاكاكاك | فأر | |
| العكس: CTCCGGGAAGCGTACTTA | فأر | ||
| Tet2 | خط الهجوم: GCACAGGGAGCAAGAGATTC | فأر | |
| العكس: ATGTTGACATTGCCAGTGGA | فأر | ||
| Thy1 | خط الهجوم: أاكتكتوغكاتشاتاك | فأر | |
| العكس: GCACGTGCTTCCTCTTCTCT | فأر | ||
| CDH1 | خط الهجوم: GAATGACAATGGCCCCATAC | لحم الخنزير | |
| العكس: AGGTGGTCACCTGGTCTTTG | لحم الخنزير | ||
| إبكام | إلى الأمام: GCTTGGTCAGTGCCAGTA | لحم الخنزير | |
| العكس: CTTCTGACCCCAGCAGTGTT | لحم الخنزير | ||
| نانوغ | خط الهجوم: ATCCAGCTTGTCCCCAAAG | لحم الخنزير | |
| العكس: ATTTCATTCGCTGGTTCTGG | لحم الخنزير | ||
| أكتوبر4 | خط الهجوم: GTTCAGCCAAACGACCATCT | لحم الخنزير | |
| العكس: CTCCAGGTTGCCTCTCACTC | لحم الخنزير | ||
| REX1 | خط الهجوم: CTTCAAGGAGAGCGCAAAAC | لحم الخنزير | |
| العكس: TGTCCCCAATCAAAAATGCT | لحم الخنزير | ||
| SOX2 | خط الهجوم: GCCCTGCAGTACAACTCCAT | لحم الخنزير | |
| العكس: GCTGATCATGTCCCGTAGGT | لحم الخنزير | ||
| TET2 | خط الهجوم: CAGAAAACAATGCAGCCAGA | لحم الخنزير | |
| العكس: GAATGGCTCGGTCTGAAG | لحم الخنزير | ||
| THY1 | خط الهجوم: GGCATCGCTCTCTTGCTAAC | لحم الخنزير | |
| العكس: GCTGGAGAAGTTGGTTCGAG | لحم الخنزير | ||
| CDH1 | خط الهجوم: TGCCCAGAAAATGAAAAAGG | بشري | |
| العكس: GTGTATGTGGCAATGCGTTC | بشري | ||
| إبكام | إلى الأمام: GCTGGTGTGTGAACACTGCT | بشري | |
| العكس: ACGCGTTGTGATCTCCTTCTCTCT | بشري | ||
| نانوغ | خط الهجوم: AGAAAAACAACTGGCCGAAG | بشري | |
| العكس: TGCTCCAGGACTGGATGTTC | بشري | ||
| أكتوبر4 | خط الهجوم: AATTTGCCAAGCTCCTGAAG | بشري | |
| العكس: GTTGCCTCTCACTCGGTTCT | بشري | ||
| REX1 | إلى الأمام: ACGTTTCGTGTGTCCCTTTC | بشري | |
| العكس: TATAACCGCTTTTGGGGGGTTG | بشري | ||
| SOX2 | خط الهجوم: أكاكاتكاتكاكاكت | بشري | |
| العكس: GCAAACTTCCTGCAAAGCTC | بشري | ||
| TET2 | خط الهجوم: CCCACTTACCTGCGTTTCAT | بشري | |
| العكس: ACTGTGACCTTTCCCCACTG | بشري | ||
| THY1 | خط الهجوم: AGATCCCAGAACCATGAACC | بشري | |
| العكس: GCACGTGCTTCTTTGTCTCA | بشري | ||
| هدف | رقم كتالوج فحوصات تقطمان | جنس | |
| أكتب | Mm02619580_g1 | فأر | |
| Cdh1 | Mm01247357_m1 | فأر | |
| إبكام | Mm00493214_m1 | فأر | |
| غابده | Mm99999915_g1 | فأر | |
| نانوغ | Mm02019550_s1 | فأر | |
| أكتوبر4 | Mm03053917_g1 | فأر | |
| ريكس1 | Mm03053975_g1 | فأر | |
| سوكس2 | Mm03053810_s1 | فأر | |
| Tet2 | Mm00524395_m1 | فأر | |
| Thy1 | Mm00493681_m1 | فأر | |
| بنك أبوظبي التجاري | Ss03376563_uH | لحم الخنزير | |
| CDH1 | Ss06942341_m1 | لحم الخنزير | |
| إبكام | Ss03384752_u1 | لحم الخنزير | |
| GAPDH | Ss03375629_u1 | لحم الخنزير | |
| نانوغ | Ss04245375_s1 | لحم الخنزير | |
| أكتوبر4 | Ss03389800_m1 | لحم الخنزير | |
| REX1 | Ss03373622_g1 | لحم الخنزير | |
| SOX2 | Ss03388002_u1 | لحم الخنزير | |
| TET2 | Ss06880359_m1 | لحم الخنزير | |
| THY1 | Ss03376963_u1 | لحم الخنزير | |
| بنك أبوظبي التجاري | Hs01060665_g1 | بشري | |
| CDH1 | Hs01023895_m1 | بشري | |
| إبكام | Hs00901885_m1 | بشري | |
| GAPDH | Hs02786624_g1 | بشري | |
| نانوغ | Hs02387400_g1 | بشري | |
| أكتوبر4 | Hs00999632_g1 | بشري | |
| REX1 | Hs00399279_m1 | بشري | |
| SOX2 | Hs01053049_s1 | بشري | |
| TET2 | Hs00325999_m1 | بشري | |
| THY1 | Hs00174816_m1 | بشري | |
الجدول 2: معلومات تمهيدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خلال العقود الماضية ، ركزت العديد من الدراسات على تطوير استراتيجيات لإعادة خلية متمايزة بشكل نهائي نحو حالة أقل التزاما وأعلى تساهلا. يسمح البروتوكول الموصوف هنا بتوليد الخلايا متعددة القدرات وصيانتها على المدى الطويل بدءا من الخلايا البالغة الناضجة المتمايزة نهائيا. تجمع هذه الطريقة بين خطوتين مستقلتين تتضمنان تحريض حالة عالية التساهل يتم تحقيقها من خلال المحو الكيميائي اللاجيني وصيانتها اللاحقة التي يتم ضمانها باستخدام نظام ثقافة 3D.
يتوافق تكوين الهياكل الكروية ثلاثية الأبعاد التي لوحظت في الخلايا المغلفة PTFE (الشكل 2) مع الدراسات الأخرى التي تظهر قدرة PTFE على تشجيع تجميع الخلايا بكفاءة ، مما يسهل إنشاء هياكل كروية للخلايا الشمية (OEC)25 أو تكوين مجاميع حلقية ثلاثية الأبعاد26. وتتوازى هذه التغيرات المورفولوجية مع بداية التعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات (الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5) الذي يظهر مستويات أعلى بكثير في خلايا 3D Post 5-aza-CR، عند مقارنتها بخلايا 2D Post 5-aza-CR (الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5). باستمرار ، تعرض خلايا 3D Post 5-aza-CR نقص ميثيل الحمض النووي أعلى من خلايا 2D Post 5-aza-CR (الشكل 6). بشكل عام ، تشير هذه النتائج إلى قدرة 5-aza-CR على إحداث حالة عالية من اللدونة ، بغض النظر عن نظام زراعة الخلايا المستخدم. ومع ذلك ، فإن حالة تعدد القدرات المستحثة كيميائيا التي تحققها الخلايا ، يتم تعزيزها بشكل كبير باستخدام مفاعل حيوي دقيق PTFE يعزز نسخ الجينات متعددة القدرات ويزيد من تأثيرات إزالة الميثيل 5-aza-CR. والأكثر إثارة للاهتمام هو أن خلايا 3D Post 5-aza-CR فقط تحتفظ بثبات بالبنية الكروية ثلاثية الأبعاد المكتسبة (الشكل 2) وتحافظ على مستويات تعبير عالية من الجينات المرتبطة بتعدد القدرات (الشكل 3 ، الشكل 4 ، الشكل 5) بالإضافة إلى انخفاض مستويات مثيلة الحمض النووي (الشكل 6) ، خلال جميع الفترة اللاحقة من الثقافة. وإجمالا، تظهر النتائج التمثيلية الواردة هنا أن هذه الاستراتيجية المكونة من خطوتين تتسم بكفاءة عالية وقوة، وأن استخدام مفاعل حيوي دقيق PTFE لا يعزز اللدونة العالية فحسب، بل يسمح أيضا بصيانته المستقرة والطويلة الأجل في أنواع الثدييات التي تم النظر فيها. لقد أثبتنا مؤخرا أن هذه الآثار المفيدة ترتبط بتنشيط مسار إشارات فرس النهر والإشارات المرتبطة بالميكانوبوسكوشن10 ، والتي ثبت سابقا أن لها دورا رئيسيا في التنظيم النشط لتعدد قدرات الخلايا28،29،30.
الخطوتان الأكثر أهمية لإجراء ناجح هما الصيانة الصارمة للخلايا عند 37 درجة مئوية ، في جميع الأوقات ، بما في ذلك التعامل معها تحت التدفق الرقائقي المعقم والمجهر واستخدام رقم الخلية الصحيح / معدل حجم السائل أثناء إنتاج المفاعل الحيوي الدقيق ، والذي قد يختلف وفقا لنوع الخلية المحدد المستخدم. في تجربتنا ، يوصى بشدة أيضا بإعداد الكواشف حديثا ، قبل استخدامها في الثقافة (وهذا أمر بالغ الأهمية لحل مخزون 5-aza-CR). علاوة على ذلك ، يجب أن يتم الانتعاش المتوسط تحت المجهر المجسم لأن المواد العضوية الكروية 3D قد تضيع أثناء التغييرات المتوسطة.
نقاط القوة الرئيسية لهذه الطريقة ليست متطلبات ناقلات معدلة وراثيا و / أو فيروسية. المتانة والتكاثر في أنواع الثدييات المختلفة ؛ تكاليف منخفضة ومرونة عالية لأنواع الخلايا المختلفة. ومن ناحية أخرى، يمكن أن يتمثل أحد القيود المحتملة في العدد المحدود من البيانات التي يتم الحصول عليها، بسبب صغر حجم المفاعلات الأحيائية الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي استخدام كثافة الخلايا العالية إلى انخفاض معدلات نقل الأكسجين والنمو المحدود في التعليق. وللتغلب على هذه المشاكل، لا يزال من الضروري القيام بمزيد من العمل بشأن استراتيجيات التوسع و/أو التخفيض.
من المهم تسليط الضوء على أن الجوانب الرئيسية المشتركة بين جميع التطبيقات القائمة على كروية 3D هي التكاثر ، وكفاءة الإنتاج ، وتوحيد حجم العضوية والتأثير على علم وظائف الأعضاء الخلوية. ترتبط هذه الميزات ارتباطا وثيقا بالقوى الميكانيكية المتولدة داخل نظام الثقافة وتختلف وفقا للطرق المختلفة المستخدمة. على سبيل المثال ، يمكن استزراع المواد العضوية متعددة الخلايا باستخدام أطباق غير ملتصقة في الأنظمة الثابتة. ويستند هذا النهج في المقام الأول إلى ظروف محدودة الانتشار، وعادة ما يؤدي إلى تشكيل مجموعات فضفاضة المجمعة. تظهر تقنية الإسقاط المعلق نفس القيد. في الواقع ، يؤدي ترسب تعليق الخلايا على الجانب السفلي من غطاء طبق زراعة الأنسجة إلى خلق بيئة جاذبية صغرى تركز الخلايا في واجهة الهواء السائل الحر ، مما يؤدي إلى توليد كرات متعددة الخلايا منخفضة التجميعها . يتم تمثيل بديل محتمل من خلال تقنية قارورة الدوار. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة مكلفة للغاية لأنها تتطلب كميات مرتفعة من وسط الثقافة. علاوة على ذلك ، يجب نقل المواد العضوية المشكلة إلى نظام زراعة ثابت عند استخدامها للتوصيف أو لمزيد من الاختبارات في المختبر. يمكن التغلب على كل هذه المشكلات باستخدام المفاعلات الحيوية الدقيقة الرخامية السائلة. في الواقع ، فإنها توفر سطحا سائلا غير ملتصق يجمع بين مزايا كل من الطرق الثابتة والغزل ، مما يؤدي إلى تجميع سريع للخلايا وتوليد كرويات مدمجة. في موازاة ذلك ، يسمح القاع المقعر والشكل الكروي والتدفق السائل الداخلي لكل رخام للخلايا بالاستقرار في قاع المفاعل الحيوي الدقيق ، مما يؤدي إلى تكوين عضويات موحدة في الحجم والشكل. ميزة أخرى مهمة في استخدام الرخام السائل تتمثل في تبادل الغاز الأمثل الذي ، بفضل شكله الكروي ، يمكن أن يحدث من خلال السطح بأكمله.
في الختام ، يسمح البروتوكول الموصوف هنا بتوليد فعال وبسيط من خلايا الثدييات متعددة القدرات. وبما أن هذه الاستراتيجية خالية من النواقل الفيروسية ولا تنطوي على استخدام أي نقل جيني، فهي واعدة للغاية لتطبيقات الطب الانتقالي ويمكن اعتبارها خطوة إلى الأمام في العلاج الخلوي الخاص بالمريض. علاوة على ذلك ، قد يمثل استخدام أنظمة زراعة المفاعلات الحيوية الدقيقة 3D طفرة ملحوظة في تكنولوجيا الخلايا العضوية للخلايا الجذعية وقد يشكل بيئة دقيقة مفيدة للزراعة طويلة الأجل لأنواع الخلايا المختلفة ، مثل ESCs و iPSCs و MSCs. وتتمثل ميزة إضافية في صغر الحجم الذي يسمح بدراسة تأثير إشارات الباراكرين / الأوتوكرين للبيئة الغنية التي أنشئت داخل المفاعل الحيوي الدقيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة كاراريسي و MiND FoodS Hub ID: 1176436. جميع المؤلفين هم أعضاء في COST Action CA16119 في المختبر 3-D إجمالي توجيه الخلايا واللياقة البدنية (CellFit).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
References
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
