방법 논문

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

DOI:

10.3791/61776

⸱

2022년 5월 6일

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1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서, 우리는 초파리 배아 단백질 및 RNA의 검출 및 국소화를 위한 프로토콜을 기술한다 수집에서 사전-포베딩 및 포매, 면역염색, 및 mRNA 를 계내 혼성화에 이르게 한다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

칼슘 유도 칼슘 방출 신호 (CICR)는 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을합니다. 세포 증식 및 아폽토시스, 발달 및 노화, 뉴런 시냅스 가소성 및 재생에 이르기까지 모든 세포 활성은 Ryanodine 수용체 (RyRs)와 관련이 있습니다. 칼슘 신호 전달의 중요성에도 불구하고, 초기 개발에서 그 기능의 정확한 메커니즘은 불분명하다. 임신 기간이 짧은 유기체로서, 초파리 멜라노가스터의 배아는 발달 중에 CICR 관련 단백질 및 그들의 조절자의 분포 및 국소화를 조사하기위한 주요 연구 대상입니다. 그러나 지질이 풍부한 배아와 키틴이 풍부한 쵸리온으로 인해 유리 표면에 배아를 장착하기가 어려워 유용성이 제한됩니다. 이 연구에서는 초파리 배아를 슬라이드에 부착하는 것을 크게 향상시키는 실용적인 프로토콜과 성공적인 조직 화학, 면역 조직 화학 및 현장 혼성화를위한 세부 방법을 소개합니다. 크롬 명반 젤라틴 슬라이드 코팅 방법 및 배아 사전 임베딩 방법은 초파리 배아 단백질 및 RNA 발현을 연구하는 데 수율을 극적으로 증가시킵니다. 이 접근법을 입증하기 위해, 우리는 초파리 멜라노가스터의 초기 배아 발달 동안 RyR의 잘 알려진 조절자 인 DmFKBP12 / Calstabin을 연구했습니다. 우리는 싱크로나이셜 배반배엽 단계에서 DmFKBP12를 확인하고 개발 중에 DmFKBP12의 동적 발현 패턴을 보고 하였다: 초기에는 세포융합 배반엽에서 고르게 분포된 단백질로서, 그 후 세포 배반배엽 동안 피질의 기저층으로 미리 국소화하고, 초기 위축에서 삼겜층 단계 동안 원시적 뉴런 및 소화 구조에 분배하기 전에. 이 분포는 RyR이 이러한 층에서 유래 한 중요한 장기 시스템에서 중요한 역할을 설명 할 수 있습니다 : 식도 하 및 식도 신경절, 복부 신경계 및 근골격계.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

칼슘 유도 칼슘 방출 신호전달(CICR)은 골격/평활근 및 심장 혈관 기능, 세포 증식 및 아폽토시스, 발달, 노화, 신경 시냅스 가소성 및 재생과 같은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다1,2,3,4,5,6 . 리아노딘 수용체 (RyRs) 및 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체 (IP3Rs)는 그들의 조절인자인 단백질 키나아제 A (PKA), Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II (CaMKII), FK506 결합 단백질 (FKBPs), 칼세퀘스트린 (CSQ), 트리아딘 및 junctin1,2,3,4,5,6에 의해 조절되는 칼슘 신호전달 경로의 주요 플레이어이다. . 이러한 단백질의 비정상적인 인간 발현 및 돌연변이는 부정맥7 및 종양원성 증식8,9과 같은 병리학적 생리학을 야기할 수 있다.

FKBPs는 RyRs에 의해 소포체(ER)로부터의 칼슘 방출을 조절한다. 이 과정은 수축 메커니즘에 필수적이며, 따라서 배아 RyRs1,2와 함께 칼슘 유도 칼슘 방출을 통해 미오신 액틴 수축에 의해 생성 된 모든 기계적 움직임을 담당합니다. 마우스 모델에서, RyR2 및 그 조절인자 FKBP12/Calstabin의 부족은 배아 발달 동안 또는 산후 초기 기간10,11,12에서 변함없이 치명적이다. FKBP12 / Calstabin 녹아웃 마우스는 배아 발달 중 불규칙한 여기 수축 결합 (EC) 및 뇌 부종으로 심각한 심장 결함을 나타냅니다. 이는 FKBP12/Calstabin이 심장 및 뇌 발달 모두에 중요한 RyR2 채널 발현을 조절하는 데 필수적인 역할을 한다는 것을 나타냅니다10.

RyR 실시 칼슘 스파크는 수정 된 메다카 난자의 접합체 형성 단계에서 처음 발견되었습니다13,14. 그러나 초기 배아 발달에서 칼슘 신호 전달의 기능에 대한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. 초파리 멜라노가스터에서, DmFKBP12 S107 돌연변이체로부터 얻은 결과는 유충 발달과 건강한 수명에 대한이 유전자의 중요성을 뒷받침하는 강력한 증거를 제공하며, 이는 산화 스트레스에 대한 기능에 기인합니다15,16. 최근에, 우리는 초기 초파리 멜라노가스터 개발 동안 FKBP12/Calstabin 단백질 및 메신저 RNA의 동적 국소화를 확인했다17. 이 방법론에 기술된 접근법을 사용하여, 우리는 세포융합 배반엽 (0-2 h), 세포 배반배엽 (2-3 h), 초기 gastrula (3-12 h), 및 후기 gastrula (12-24 h) 동안 D. melanogaster에서 FKBP12/Calstabin의 발현을 추적할 수 있었다. 이 논문에서, 우리는 고전적인 파라핀 절편을 위한 전-배아 임베딩, 배아 절편에 대한 예비코팅 슬라이드 처리, 조직-화학 염색 및 면역염색, 유전자 발현의 확인을 위한 mRNA 인-시츄 혼성화를 포함하는 이전 연구에서 모든 접근법의 상세한 프로토콜을 제시한다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 포도즙 한천 플레이트의 제조

  1. 한천 5g과 자당 5g을 증류수 150mL에 첨가한다. 한천과 자당이 완전히 용해 될 때까지 전자 레인지를 사용하여 삶으십시오. 100 % 포도 주스 50 mL와 용액을 함께 섞는다.
  2. 100% 프로피온산 1 mL를 첨가하여 최종 농도를 0.5% 프로피온산으로 만든다. 준비된 용액 25 mL를 각 플레이트에 붓는다. 한천이 응고된 후, 배지를 4°C에 보관한다.

2. 코팅 슬라이드

  1. 슬라이드를 세제로 전처리하십시오. 슬라이드를 수돗물로 3 번, 증류수로 한 번 씻으십시오. 이어서, 슬라이드를 45°C 오븐에서 2시간 동안 건조시켰다.
  2. 슬라이드를 약 450 mL의 이크로메이트 칼륨 황산 용액 (20 g의 디크로메이트 칼륨, 40 mL의 증류수 및 400 mL의 진한 황산)에 24 시간 동안 담그십시오. 슬라이드를 수돗물로 3 번, 증류수로 한 번 씻으십시오.
    1. 슬라이드를 45°C 오븐에서 두 시간 동안 건조시킨다. 95% 에탄올에 2시간 이상 담그십시오.
  3. 황산크롬칼륨 0.5g과 젤라틴 5g을 증류수 1L에 첨가한다. 사용 전에 60°C 수조에 녹인다. 크롬 명반 젤라틴은 장기간 동안 4°C에서 저장될 수 있다.
  4. 크롬 명반 젤라틴 10 μL를 슬라이드에 떨어뜨리고 용액으로 슬라이드의 전체 표면을 완전하고 고르게 덮는다. 젤라틴 측면이 있는 슬라이드를 42°C의 오븐에 48시간 동안 올려 놓는다. 제조된 슬라이드는 추후 사용을 위해 4°C에서 보관할 수 있다.
    참고: 이 단계는 매우 중요한 단계입니다. 완전한 코팅이 필요합니다. 초파리와 그 배아의 경우,이 슬라이드 코팅 접근법은 폴리 라이신 코팅보다 더 효율적으로 보입니다.

3. 초파리 배아 임베딩

  1. 초파리 배아 수집
    참고 : 우리는 초 파리 배아를 0-2 시간 (싱크 리얼 블라스토 배엽), 2-3 시간 (세포 배반엽), 3-12 시간 (초기 gastrula) 및 12-24 시간 (후기 gastrula)18의 4 기간에 수집했습니다. 각 기간에서 주요 배아 유형의 비율은 표 1에 나타내었다.
    1. 플라스틱 수집 병에 400-500 마리의 파리를 넣고 효모 추출물이 들어있는 포도 주스 한천 접시로 병을 덮으십시오. 초파리 배아는 실온에서 포도 주스 한천 위에 놓여진다.
    2. 4 기간의 배아를 수집하고, 각 플레이트에 PBS 2 mL (137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4)를 부드럽게 첨가하여 배아를 부유시켰다. 약 200개의 배아를 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 2분 동안 얼음 위에 두어 배아를 정착시킨다.
  2. 사전 임베딩
    1. 초파리 배아 200개를 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 2 분 동안 보관하여 배아를 정착시킨 다음 피펫으로 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 튜브에 50% 표백제 1mL를 넣고 2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.
      참고 : 표백제는 신선하게 준비해야하며 표백제의 양은 수집 된 배아의 양에 따라 달라질 수 있습니다.
    2. 여과지에 부어 배아를 부드럽게 모으고 매번 PBS 1 mL로 3 번 씻으십시오.
    3. 배아를 여과지로 약 5 mL의 n-헵탄으로 옮긴다.
    4. 혼합물을 신선한 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 메탄올 1 mL를 첨가하고 부드럽게 흔든다. 침강 후 배아를 수집하십시오.
    5. 상층액을 제거하고 배아를 PBS 1 mL로 3-5회 세척한다.
    6. 배아를 400μL의 Bouin 용액(71% 포화 피크르산, 24% 포르말린, 5% 아세트산)으로 30분 동안 고정시킵니다. 고정된 배아를 매번 5분 동안 PBS 1 mL에 3회 세척한다.
    7. 배아를 응집시키려면, 샘플을 고무 마개로 옮기고 PBS를 제거한다.
    8. 1.2% 아가로스-PBS 용액을 준비하고 용액을 60°C로 유지한다. 200 μL의 1.2% 아가로스-PBS 용액을 배아 상에 첨가하여 한천 블록에 고정시킨다.
    9. 스토퍼에서 블록을 꺼내 PBS에 저장하십시오.
      참고 : 사전 임베딩 접근법 중에 프로 워밍은 성공을 위해 중요합니다. 우리는이 단계에서 사용될 원심 분리 튜브 및 마이크로 피펫 팁이 작동하기 전에 완전히 미리 따뜻해야한다고 강력히 제안합니다.
  3. 파라핀 임베딩
    1. 미리 포매된 한천 블록을 각각 15분 동안 35% 에탄올, 50% 에탄올, 75% 에탄올 및 85% 에탄올에 담그십시오. 그런 다음 95 % 에탄올과 100 % 에탄올에 2 번 담그십시오.
      참고 : 블록의 배아 수에 따라 각 블록 부피의 약 5-10 배에 이어 15-30 분 동안 등급이 매겨진 고정제가 필요합니다.
    2. 배아 블록을 100% 에탄올 및 자일렌(1:1 비율) 용액에 15분 동안 담그십시오.
    3. 블록을 1분 동안 자일렌으로 옮겨 배아 조직을 투명하게 만든다.
    4. 블록을 자일렌과 파라핀 (1:1 비율)에 30분 동안 잠급니다.
    5. 블록을 파라핀 I, 파라핀 II 및 파라핀 III에 각각 2 h 동안 침지시킨다.
    6. 임베딩 박스를 미리 파라핀으로 채운 다음 블록을 부드럽게 수평으로 임베딩 박스 하단으로 옮깁니다. 파라핀이 자연적으로 응고된 후, 고형화된 파라핀 블록은 4°C에서 저장될 수 있다.
      참고: 사전 내장된 샘플은 다음 단계에 따라 냉동 절제에 사용할 수 있습니다. 배아가 전술한 바와 같이 아가로오스로 미리 포매된 후에, 샘플은 단순히 OCT 화합물에 포매된다. 그 후, 냉동 절제술은 일상적인 냉동 절제 프로토콜에 따라 수행 될 수 있습니다. 이어서, 규칙적인 염색 접근법이 절편에 사용될 수 있다.

4. 헤마톡실린-에오신 염색

  1. 초파리 배아 섹션을 준비하십시오. 준비된 절편을 60°C의 오븐에 15분 동안 놓은 다음, 절편을 각각 10분 동안 2회 크실렌에 침수시킨다. 절편을 100% 에탄올과 자일렌(1:1 비율)에 1회 2분 동안 잠급니다.
  2. 절편을 100% 에탄올 I, 100% 에탄올 II, 95% 에탄올, 85% 에탄올, 75% 에탄올, 50% 에탄올 및 증류수에서 3분 동안 수화시킨다.
  3. 2 분 동안 헤마 톡실린 용액으로 절편을 얼룩지게하십시오. 슬라이드를 1% 산 알코올 용액(염산 1 mL, 70% 에탄올 100 mL)에 빠르게 담그고 슬라이드를 증류수로 세척한다.
  4. 슬라이드를 50% 에탄올, 75% 에탄올, 85% 에탄올 및 95% 에탄올에 순차적으로 담그십시오.
  5. 1 분 동안 에오신 용액으로 섹션을 얼룩지게하십시오.
  6. 슬라이드를 95% 에탄올 I, 95% 에탄올 II, 95% 에탄올 III, 100% 에탄올 I, 100% 에탄올 II 및 100% 에탄올 III에서 각각 1분 동안 탈수시킨다.
  7. 슬라이드를 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 매번 5분 동안 클리어합니다.
  8. 제조업체의 지침에 따라 중립 balsam으로 슬라이드를 장착하십시오.

5. 주기적인 산-은 메테나민 염색

  1. 초파리 배아의 파라핀 부분을 증류수로 탈파라핀화하고 수화시킨다.
  2. 절편을 실온에서 15분 동안 1% 주기적 산으로 산화시킨다.
  3. 슬라이드를 증류수에서 각각 1분 동안 3회 헹구십시오.
  4. 슬라이드를 약 40 mL의 갓 여과된 은 메테나민 작업 용액(3% 메테나민, 5% 질산은, 5% 붕산나트륨 용액)에 넣고 60°C에서 1시간 및 20분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 1 분 동안 헹구십시오.
  5. 슬라이드를 0.2% 염화금으로 2분 동안 톤한 다음, 슬라이드를 증류수에서 1분 동안 헹구었다.
  6. 슬라이드를 3분 동안 3% 티오황산나트륨에 넣은 다음, 슬라이드를 증류수에서 1분 동안 헹구었다.
  7. 슬라이드를 헤마톡실린에서 30초 동안 반염색합니다. 달리기 수돗물에 슬라이드를 3-5 분 동안 씻으십시오.
  8. 슬라이드를 각각 5분 동안 70% 에탄올, 80% 에탄올, 95% 에탄올 I, 95% 에탄올 II, 95% 에탄올 III, 100% 에탄올 I, 및 100% 에탄올 II에서 탈수시킨다.
  9. 슬라이드를 각각 5분 동안 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 클리어합니다.
  10. 제조업체의 지침에 따라 중립 balsam에 슬라이드를 장착하십시오.

6. 면역조직화학

  1. 초파리 배아의 파라핀 절편을 표준 프로토콜19에 따라 PBS로 탈파라핀화하고 재수화시킨다.
  2. 실온에서 10 분 동안 메탄올 중 0.3 % H2O2로 슬라이드를 처리하고 빛을 피하십시오.
  3. 적절한 항원 검색 버퍼를 식물성 증기선에서 슬라이드가 있는 용기 내에서 대략 100°C로 예열한다. 컨테이너에는 뚜껑도 있어야합니다. 슬라이드를 컨테이너에 넣습니다. 증기선의 뚜껑을 닫습니다.
    1. 이 시점부터 20 분 동안 용기를 증기선에 보관하십시오. 슬라이드 용기의 뚜껑을 완전히 조여서 김이 나는 과정에서 수증기가 들어갈 수 있도록해서는 안됩니다.
  4. 슬라이드를 실온으로 복귀시킨 후 PBS-T(PBS with Tween-20, pH 7.2)로 3회 5분 동안 부드럽게 헹구고, 슬라이드를 PBS로 각각 1분 동안 3회 헹구었다.
  5. 슬라이드를 실온에서 60분 동안 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단한다.
  6. 슬라이드를 1차 항체(1:1000에서 항-FKBP12)로 4°C에서 밤새 또는 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
  7. 슬라이드를 PBS-T로 각각 5분 동안 4회 세척한다.
  8. 슬라이드를 이차 항체(항토끼, 1:5,000)와 접합된 HRP 표지된 중합체와 함께 실온에서 90분 동안 적용한다. 사진 표백을 피하기 위해 어둠 속에서이 작업을 수행하십시오.
  9. 슬라이드를 PBS-T로 각각 5분 동안 3회 세척한다.
  10. 슬라이드를 5% 3,3'-디아미노벤지딘-테트라하이드로클로라이드(DAB)로 2-10분 동안 현미경 하에서 반응 생성물의 색상이 적절해질 때까지 인큐베이션한다.
  11. 슬라이드를 헤마톡실린으로 30초 동안 반염색하고 슬라이드를 증류수로 각각 5분 동안 2회 세척한다.
  12. 슬라이드를 각각 1분 동안 50% 에탄올, 70% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올 및 100% 에탄올로 탈수시킨다.
  13. 슬라이드를 각각 5분 동안 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 클리어합니다.
  14. 제조업체의 지침에 따라 중립 balsam에 슬라이드를 장착하십시오.

7. 현장 혼성화

참고: 초파리 배아 절편은 0.01% 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리수로 제조하였다. 현장 혼성화에 사용되는 모든 액세서리 는 DEPC 하룻밤 처리를 미리 적용합니다.

  1. 리보프로브 준비
    1. 주형 DNA를 선형화하여 5' 오버행을 생성하는 제한 효소를 사용하여 클로닝된 삽입물로부터 하류의 제한 효소 부위에서 절단한다. 선형화 후, 페놀/클로로포름 추출 및 후속 에탄올 침전을 통해 주형 DNA를 정제한다. 표준 프로토콜을 사용합니다.
    2. 정제된 주형 DNA 1 μg을 RNase가 없는 원심분리 튜브에 첨가한다. 원심 분리기 튜브를 얼음 위에 놓습니다. DEPC 처리된 물을 총 부피 13 μL에 충분히 첨가한다.
      1. 그런 다음 다음 시약을 순서대로 첨가한다: 2 μL의 10x NTP 표지 혼합물, 2 μL의 10x 전사 완충액, 1 μL의 보호기 RNase 억제제, 2 μL의 RNA 폴리머라제 SP6 또는 RNA 폴리머라제 T7.
    3. 피펫팅과 원심분리기로 반응을 짧게 혼합한다. 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
      참고: 더 긴 인큐베이션은 표지된 RNA의 수율을 증가시키지 않는다. 반응 튜브에 적용된 짧은 스핀 (~ 800 rpm)은 다음 단계를 계속하기 전에 필요합니다. 이 스핀은 인큐베이션에서 생성 될 수있는 모든 내용물이 튜브의 바닥으로 올 수있게합니다.
    4. 2 μL의 RNase-free DNase I을 첨가하여 주형 DNA를 제거하고 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
    5. 2 μL의 200 mM EDTA (pH 8.0)를 첨가하여 반응을 정지시켰다.
      참고: DIG 표지된 RNA 프로브는 1년 동안 에탄올 중에서 -15 내지 -25°C에서 저장될 수 있다.
  2. 초파리 배아 섹션의 사전 혼성화
    1. 초파리 배아의 절편을 42°C 오븐에 48시간 동안 놓는다.
    2. 슬라이드를 100% 자일렌에서 10분 동안 두 번 분리하십시오.
    3. 슬라이드를 5분 동안 100% 에탄올, 95% 에탄올, 90% 에탄올, 70% 에탄올 및 50% 에탄올에 순차적으로 침수시켜 수화시킨다.
    4. 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 3회 인큐베이션하여 조직으로부터 고정 용액/Bouin의 용액을 제거하였다.
    5. 슬라이드를 100 mmol/L 글리신/PBS 용액으로 각각 5분 동안 2회 세척한다.
    6. 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 2회 세척한다.
    7. 슬라이드를 PBS 중의 0.3% 트리톤 X-100으로 15분 동안 인큐베이션하여 멤브레인을 투과시킨다.
    8. 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척한다.
    9. 슬라이드를 15 μg/mL RNase-free 프로테이나제 K에서 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
    10. 슬라이드를 PBS 중의 4% 파라포름알데히드로 3분 동안 인큐베이션하여 소화를 정지시킨다.
    11. 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 2회 세척한다.
    12. 슬라이드를 100 mM 트리에탄올아민 완충액 (pH 8.0)에서 0.25% (v/v) 아세트산 무수물과 함께 각각 5분 동안 2회 인큐베이션한다.
    13. DEPC 물을 슬라이드 수분 챔버에 넣으십시오. 슬라이드에 20μL의 사전 혼성화 용액(연어 정자 DNA 100μg/mL 포함)을 추가합니다. 슬라이드를 슬라이드 수분 챔버에 넣으십시오. 슬라이드를 42°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
      참고 : 젖은 상자의 뚜껑의 견고성을 보장하고 젖은 상자는 사전 혼성화 용액과 후속 하이브리드화 용액의 조직으로부터의 휘발 및 편차를 방지하기 위해 항상 수평으로 유지되어야합니다.
  3. 초파리 배아 섹션의 혼성화
    1. 예비 혼성화 용액을 제거하고 슬라이드를 각각 5분 동안 0.2x SSC(150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산나트륨, pH 7.0)로 3회 세척한다. 조직 샘플 주위의 0.2x 초과 SSC를 닦아냅니다.
    2. 30 μL의 프로브 혼성화 용액 (사전 혼성화 용액으로 희석하여 2-6 ng의 디곡신 표지 RNA 프로브 포함)을 피펫으로 적용하십시오. 슬라이드를 대략 20 h 동안 42°C에서 슬라이드 수분 챔버 내에서 인큐베이션한다.
      참고 : 마지막 메모의 제안으로 캡 견고성을 확인하십시오. 그렇지 않으면, 사전 혼성화 또는 사전 혼성화의 누출로 인한 드라이업은 슬라이드에서 의사 양성을 포함한 더러운 배경을 생성합니다.
  4. 교 잡
    1. 혼성화 용액을 제거하고 슬라이드를 4x SSC 용액으로 37°C에서 각각 15분 동안 4회 세척한다.
    2. 슬라이드를 2x SSC 용액에서 20 μg/mL의 RNase A로 37°C에서 30분 동안 세척한다.
    3. 슬라이드를 37°C에서 15분 동안 1x SSC 용액으로 세척한다.
    4. 슬라이드를 37°C에서 15분 동안 0.5x SSC 용액으로 세척한다.
    5. 슬라이드를 37°C에서 15분 동안 0.1x SSC 용액으로 세척한다.
    6. 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척한다.
    7. 슬라이드를 세척 완충액 (100 mM 말레산, 150 mM NaCl, 0.3% (v/v) 트윈 20, pH 7.5)에서 1분 동안 세척한다.
    8. 슬라이드를 갓 제조된 블로킹 용액 100 mL(트윈 20이 없는 말레산 완충액 중 2% 양 혈청)에 30분 동안 인큐베이션한다.
    9. 슬라이드를 20 mL의 항체 용액에서 45분 동안 인큐베이션한다.
      1. 항체를 각 사용 전에 원래의 바이알에서 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 필요한 양을 표면으로부터 조심스럽게 피펫팅한다. 항-디곡시게닌-AP 1:5000 (150 mU/mL)을 블로킹 용액에 희석하십시오.
    10. 슬라이드를 100 mL의 세척 완충액으로 각각 15분 동안 2회 세척하여 결합되지 않은 항체 접합체를 제거하였다.
    11. 슬라이드를 2-5분 동안 20 mL의 검출 완충액 (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5)에서 평형화시킨다.
    12. 슬라이드를 갓 준비된 컬러 기판 용액 10 mL와 함께 슬라이드 수분 챔버에서 인큐베이션한다. 반응은 몇 분 안에 시작되고 16 시간 후에 완료됩니다. 색상이 변하는 동안 흔들거나 섞지 마십시오.
    13. 슬라이드를 50 mL의 증류수로 5분 동안 세척하여 반응을 중지시킨다.
    14. 어둠 속에서 밤새 샘플을 말리십시오.
    15. 슬라이드를 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올 I 및 100% 에탄올 II에서 각각 3분 동안 탈수시킨다.
    16. 슬라이드를 각각 20분 동안 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 클리어합니다.
    17. 중립 발삼으로 슬라이드를 장착하십시오.
    18. 반전된 현미경 및 제조업체 소프트웨어로 이미지를 문서화하고 분석합니다. ImageJ를 사용하여 세로 축을 따라 또는 배아의 차동 영역 내에서 양성 신호의 밀도에 따라 분포 분석을 수행합니다.
      참고: 단계 7.4.12에서 갓 준비된 컬러 기판 용액과 함께 인큐베이션하는 동안, 반응 색상은 맨눈으로 볼 수 있다. 색상 발달이 어떻게 스테레오 스코프로 검사 될 수 있는지에 대한이 관찰. 일단 반응 색상이 합리적이면 단계 7.4.13을 수행하여 반응을 중지시킬 수 있다.

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결과

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도면은 시험 및 실험을 위해 높은 지질 및 키틴 함유 초파리 배아 (표 1)를 유리 슬라이드 표면에 부착시키는 문제를 극복하기 위해 사용되는 프로토콜을 설명합니다. 그림 1에 표시된 크롬 명반 젤라틴 슬라이드 코팅 방법을 활용하여 슬라이드 표면에 초파리 배아의 부착을 강화했으며, 그림 2에 표시된 배아 사전 임베딩 방법을 사용하면 네 가지 초기 개발 단계 (즉, 세포 배반배엽, 세포 배반엽, 초파리 배아의 초기 및 후기 gastrula). 도 3은 세포융합 및 세포성 배반배엽 단계에서 검출된 FKBP12/Calstabin 항체의 단백질 분포를 보여준다. 이러한 조직화학적 결과로부터, FKBP12 발현은 동시성 배반배엽(패널 A 내지 H)에서 덜 편광되고, 이어서 트로피토배엽 ...

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토론

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RyRs 및 IP3Rs 매개 칼슘 신호 전달은 척추 동물 및 무척추 동물 모두의 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정에서 근본적인 경로입니다1,2,3,4. 인간에서, RyR2 유전자에서 CPVT 관련 R4496C 돌연변이와 같은 점 돌연변이는 심근세포의 사르코플라스마 망상으로부터 칼슘 누출을 유발하여, 심장 기능 장애를 초래한다. 이러한 돌연변이는 신체 활동 중 갑작스런 심장 사망의 위험이 높은 부정맥으로 존재하며,이 돌연변이를 운반하도록 설계된 마우스 모델에서 재현 가능합니다. 운동 조건 하에서,이 칼슘 누출 돌연변이를 가진 마우스는 야생형 카운터 파트에 의해 입증되지 않은 심장 갑작스런 사망을 경험했습니다.18,20,21,22.

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (#31771377 / 31571273 / 31371256), 국립 교육부 (#MS2014SXSF038)의 외국 저명한 과학자 프로그램 (National Department of Education Central Universities Research Fund) (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45)의 지원을 받았으며 XZ는 우수 박사 학위 논문 기금 (#2019TS082 / 2019TS079), 산시 성 교육부의 핵심 프로그램 (#20JS138), 산시 성 과학 기술부의 자연 과학 기초 연구 프로그램 청소년 프로젝트 (#2020JQ-885).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
-20° C 냉장고Meiling 생물학 & 의료용DW-YL270리젠트 보관에 사용
-80° C 초저온 냉장고ThermoForma 90 시리즈리젠트 저장에 사용
한천: Sigma-AldrichWXBB6360V포도 주스 한천 플레이트
준비 Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsRoche11093274910digoxigenin 표지 화합물
검출 : 생화학 인큐베이터Shanghai Bluepard InstrumentsLRH-250현장 Hybridization
Bouin의 솔루션Sinopharm 화학 시약 베이징69945460Drosophila Embryo Embedding
CentrifugeEppendorf540BH07808In-situ Hybridization
Centrifuge tubeDenvilleC-2170Drosophila Embryo Collection
Chrome AlumSinopharm 화학 시약 베이징10001018코팅 슬라이드
항온 수조Jintan Henfeng InstrumentsKW-1000DCHematoxylin-Eosin 염색, 면역 조직 화학, 현장 혼성화 및주기적 산 -은 메테 나민 염색
Dako REAL EnVision 감지 시스템DakoK5007면역조직화학반응 또는 제자리 혼성화 반응에서 1차 항원 항체에 결합하고 표적은 염색으로 표지됩니다.
DEPCSigma-AldrichD5758현장 교잡
DIG RNA 라벨링 키트Roche11093274910SP6 및 T7 RNA 중합효소를 사용한 체외 전사를 통한 diagoxigenin-UTP로 RNA 라벨링
Drosophila melanogasterBloomington Stock CenterBDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 <em>Drosophila melanogaster mutant
의 재고전기 돌풍 건조 오븐Tianjin Taiste Instruments101-0AB코팅 슬라이드 및 파라핀 임베딩용
EosinSigma-Aldrich230251Hematoxylin-Eosin 염색
에탄올Sinopharm 베이징에서 화학 시약100092680파라핀 임베딩, Hematoxylin-Eosin 염색, 면역조직화학, 현장 혼성화 및 주기적인 산-은 Methenamine 염색
베이징의 젤라틴시노팜 화학 시약10010328코팅 슬라이드
금 염화물시그마 - 알드리치379948주기적 산 -은 메테 나민 염색
헤마 톡실린시그마 - 알드리치H3136헤마 톡실린 -에오신 염색
고순도 PCR 제품 정제 키트Roche11732668001PCR 제품
정제 용지능형 항온 및 습도 상자Ningbo Jiangnan InstrumentsHWS플라이 유지 보수
LE AgaroseHyAgarose14190108029
10014108초파리 배아 수집
Hematoxylin-Eosin 염색, 면역조직화학, 현장 혼성화 및 주기적 산-은 메테나민 염색
현미경 슬라이드MeVid Labware 제조P105-2001코팅 슬라이드
베이징의 중성 검Sinopharm 화학 시약10004160Hematoxylin-Eosin 염색
N-헵탄Sinopharm 베이징의 화학 시약40026768Drosophila Embryo 수집
파라핀 저미는기계 Huahai 과학 기구HH-2508III 현장 교잡
파라핀Sinopharm 베이징에 화학 시약69019461파라핀 끼워넣
pH/mV 미터SartoriusPB-10해결책의 PH 값 결정을 위해
질산은Sinopharm 베이징 10018461에서 화학 시약주기적인 산-은 메테나민 염색
초순수 미터ThermoAFXI-0501-P현장 하이브리드화
XyleneSinopharm 화학 시약 베이징10023418파라핀 임베딩
베이징 현미경 ZEISS Observer.A1에 메탄올 Sinopharm 화학 시약 사전 내장 는

참고문헌

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