Summary
このプロトコルは、液体クロマトグラフィー質量分析と高度な特徴抽出およびバイオインフォマティクス分析ソフトウェアを組み合わせたペプチドグリカン組成の詳細な分析をカバーしています。
Abstract
ペプチドグリカンは、細菌の細胞壁の重要な成分であり、抗菌剤の一般的な細胞標的です。ペプチドグリカン構造の側面はすべての細菌でかなり保存されていますが、グラム陽性/陰性の間および種間でもかなりのばらつきがあります。さらに、成長段階および/または環境刺激に応答して細菌種内で起こり得るペプチドグリカンに対する多数の既知のバリエーション、修飾、または適応がある。これらの変異は、成長/分裂、抗生物質耐性、宿主防御回避など、多くの細胞機能に関与することが知られている非常に動的な構造を生成します。ペプチドグリカン内の変動を理解するには、全体的な構造をその構成部分(ムロペプチドとして知られる)に分解し、全体的な細胞組成を評価する必要があります。ペプチドグリコミクスは、高度な質量分析と強力なバイオインフォマティクスデータ分析を組み合わせて、ペプチドグリカンの組成を詳細に調べます。以下のプロトコルでは、細菌培養物からのペプチドグリカンの精製、液体クロマトグラフ質量分析計によるムロペプチド強度データの取得、およびバイオインフォマティクスを使用したペプチドグリカン組成の鑑別分析について説明します。
Introduction
ペプチドグリカン(PG)は、タンパク質やその他の細胞成分の構造的サポートを提供しながら、細胞の形態を維持するのに役立つ細菌の決定的な特徴です1,2。PGの骨格は、β-1,4結合N-アセチルムラミン酸(MurNAc)とN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)が交互に結合しています1,2。各MurNAcは、隣接する二糖結合ペプチドに架橋することができるᴅ-ラクチル残基に結合した短いペプチドを持っています(図1A、B)。この架橋により、細胞全体を囲む網目状の構造が生成され、しばしば嚢と呼ばれます(図1C)。PG合成中、前駆体は細胞質内で生成され、フリッパーゼによって細胞質膜を横切って輸送される。前駆体は、続いてトランスグリコシラーゼおよびトランスペプチダーゼ酵素によって成熟PGに組み込まれ、それぞれグリコシド結合およびペプチド結合を生成する3。しかし、一旦組み立てられると、PGを修飾および/または分解して成長および分裂を含む多くの細胞プロセスを実行する細菌によって産生される多数の酵素が存在する。さらに、PGのさまざまな修飾は、細胞シグナル伝達、抗菌剤耐性、および宿主免疫回避に関与している株、増殖条件、および環境ストレスに特異的な適応を与えることが示されています4。例として、一般的な修飾は、PG 4,5,6を分解する宿主産生リゾチーム酵素へのグリカンβ-1,4結合へのアクセスを制限することによって耐性を付与するMurNAc上のC6アセチル基の付加である。腸球菌では、ペプチド側鎖の末端ᴅ-Alaをᴅ-Lacで置換すると、抗菌剤であるバンコマイシン7,8に対するより大きな耐性が付与されます。
PGの単離および精製の一般的な手順は、1960年代に記載されて以来、比較的変わっていません9。細菌膜は、SDSによる熱処理によって溶解され、続いて結合タンパク質、糖脂質、および残りのDNAを酵素的に除去します。精製された無傷の嚢は、続いてGlcNAcとMurNAcの間のβ-1,4結合の加水分解によって個々の成分に消化することができる。この消化により、構造修飾および/または架橋が損なわれていないGlcNAc-MurNAc二糖が生成され、ムロペプチドと呼ばれます(図1B)。
PGの組成分析は、最初に高圧液体クロマトグラフィー分離(HPLC)を介して行われ、各ムロペプチドを精製し、続いてムロペプチド10,11を手動で同定しました。それ以来、これは液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS)に取って代わられ、検出感度が向上し、個々のムロペプチドを精製する手動作業負荷が軽減されます。しかし、ムロペプチドの手作業による同定の時間と複雑さは依然として制限要因であり、実施される研究の数を減らしています。近年、「オミック」技術の出現により、自動LC-MS特徴抽出が強力なツールになり、非常に大規模なデータセットからの複雑なサンプル中の個々の化合物を迅速に検出および同定できるようになりました。特徴が特定されると、バイオインフォマティクスソフトウェアは、複雑なデータセット間のわずかな違いでも分離し、ユーザーにグラフィカルに表示する差分分析を使用して、サンプル間の変動を統計的に比較します。PG組成の分析のための特徴抽出ソフトウェアの応用は、探求され始めたばかりであり12,13,14、バイオインフォマティクス分析12に結合されています。ペプチド断片化を予測するタンパク質データベースが容易に入手でき、完全に自動化された同定を可能にするプロテオミクス解析とは異なり、ペプチドグリコミクス用の断片化ライブラリは現在存在しません。しかしながら、特徴抽出は、ムロペプチド同定を予測するために既知および予測された構造データベースと組み合わせることができる12。ここでは、PG組成の自動同定とバイオインフォマティクス鑑別分析のためのムロペプチドライブラリと組み合わせたLC-MSベースの特徴抽出を使用するための詳細なプロトコルを紹介します(図2)。
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Protocol
1.ペプチドグリカンサンプル調製
- 細菌培養物の増殖
注:細菌培養物の増殖は、細菌種および検査対象の増殖条件によって異なります。テストする実験パラメータは、成長条件を定義します。- 細菌株と実験計画に必要な増殖条件下で細菌培養物を増殖させる。細菌を三重培養物(生物学的複製)、すなわち株または増殖条件ごとに3つの別々のコロニーとして増殖させる。
注:成長条件および成長段階は、PG組成1、2、10に有意な影響を与えることが知られている。培養と反復の間の一貫性を維持するために細心の注意を払う必要があり、組成の変化は実験誤差ではなく実験パラメータによるものであることを確認する必要があります。 - 培養液を4°Cまで急冷し、遠心分離(11,000 x g、10分、4°C)により回収し、細胞ペレットを-20°Cで凍結した。 凍結前にセルペレットを予冷した4°C、pH 6.5の20mMリン酸ナトリウムで洗浄する。凍結細胞ペレットの製造は、収集プロセス中にPGを変更および/または分解する可能性のある酵素の活性を制限するために、サンプル間で可能な限り迅速かつ一貫して行う必要があります。サンプルは、凍結することなく抽出プロセス(セクション1.2)で直接処理できます。ただし、すべてのサンプルが同様の方法で処理されていることを確認してください。
注:後のステップで十分な製品を確保するために、かなりのサイズの湿電池ペレットが使用されます。これにより、十分に大きな嚢ペレットが生成され、製品を大幅に失うことなく、繰り返しの洗浄ステップ(セクション1.2.5および1.2.14)中に簡単に視覚化および維持されます。細菌や生育条件によって、この収量は異なる可能性があります。グラム陰性菌 である緑膿菌の場合、PAO1、0.5 OD600 培養液の4 Lは3〜4 gの細胞ペレットを生成し、~10 mgの精製嚢を生産するのに十分でした(セクション1.2.17)12。これは、LC-MSに必要なサクリ(セクション2)よりも大幅に過剰です。ただし、測定精度(セクション1.2.17)と正規化(セクション1.3)に役立ちます。
- 細菌株と実験計画に必要な増殖条件下で細菌培養物を増殖させる。細菌を三重培養物(生物学的複製)、すなわち株または増殖条件ごとに3つの別々のコロニーとして増殖させる。
- ペプチドグリカン嚢の抽出
注:PGを抽出するためのプロトコルは、refから適応されています。9,11,15.このプロトコルは、他の細胞成分を含まない、嚢全体として個々の細菌細胞からPGを抽出します。このプロトコルは、グラム陰性菌またはグラム陽性菌のいずれかで使用できます。ただし、グラム陽性細胞の場合、より厚いPG構造を分離し、細胞壁関連ポリマーを除去するために調整が必要になる場合があります。例えば、テイコ酸。- 凍結細胞ペレットを、元の培養量20 mMリン酸ナトリウムpH 6.5の約1:10で再懸濁します。このステップを4°Cで実行します(バッファー11,12のmLあたり1〜8 mgの湿潤細胞ペレット重量にすることができます)。
注:PGのアセチル化状態を維持するには、6.5以下のpHが必要です15,16。 - 沸騰した8%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)20 mMリン酸ナトリウムpH 6.5に細胞懸濁液を滴下し、最終的な1:1容量(すなわち、最終濃度は4%SDS)にし、水冷コンデンサーを備えた丸底フラスコで穏やかに攪拌します。(図2、ステップ2)
- 完全に膜が解離するように、攪拌しながら30分から3時間穏やかな沸騰を維持します。得られた混合物が完全に透明で、細胞の塊や粘度が残っていないことを確認してください。完全な解離を保証するために、より長い沸騰が好ましい。
- 室温まで冷まします。サンプルは室温で一晩放置できます。
注意: SDSが存在する場合は、サンプルを室温に保ち、SDSを溶液に保持します。 - 70,000 x g で40分間(または嚢を完全に沈降させるのに必要な時間)の超遠心分離により、嚢をペレットとして回収します。
- 連続した超遠心分離(セクション1.2.5)と、洗浄バッファーがSDS濃度~0.001%になるまで、pH 6.5の室温20 mMリン酸ナトリウム~50 mLの懸濁液で嚢を繰り返し洗浄します。通常、5〜7回の洗浄で十分です。
注意: 洗浄バッファー内の残りのSDSの濃度をテストするには、比色染料Stains-all17を使用します。 - サクリを5〜10 mLの室温20 mMリン酸ナトリウムpH 6.5に再懸濁します。
- サンプルを室温で短時間(~40%、50W、20kHz、20秒)超音波処理して、塊を分散させます。
注:拡張超音波処理は、機械的にPG構造18のせん断を引き起こします。 - サンプルにアミラーゼ、DNase、RNase各50 μg/mL、10 mM硫酸マグネシウムを補給し、攪拌またはナットレーションを行いながら37°Cで1時間消化します。
注:アミラーゼ消化は、嚢内に閉じ込められた残りのグリコーゲンを除去します11。 - 100 μg/mLのプロナーゼを加え、攪拌またはナットレーションと~0.02%アジ化ナトリウムで37°Cで一晩消化します。
注:プロナーゼ消化は、追加された酵素(セクション1.2.9から)を除去し、PGに共有結合しているリポタンパク質を除去します。
注意: アジ化ナトリウムは非常に有毒であり、適切な使用/廃棄方法が必要です。 - 70,000 x g で25°Cで40分間(または嚢を完全に沈降させるのに必要な時間)超遠心して、アジ化ナトリウムを除去します。
- ペレットを25mLの2%SDS 20 mMリン酸ナトリウムpH 6.5に再懸濁します。
- 水冷コンデンサーを備えた蒸し器または丸底フラスコで1時間沸騰させます(セクション1.2.2)。
注意: 2番目のSDS沸騰ステップは、嚢から残りのすべてのタンパク質と汚染物質を除去します。 - SDS濃度が~0.001%になるまで、~50mLの室温二重蒸留水(ddH 2 O)でサクリ洗浄(セクション1.2.6)を繰り返します。
- 嚢を懸濁するのに十分な量のddH2Oにペレットを再懸濁し、容器を洗浄し(例えば、25mL)、-80°Cで一晩凍結する。 サンプルは次のステップで凍結乾燥されるため、容量は変化する可能性がありますが、容量が小さいほど凍結乾燥に必要な時間が短くなります。
- 翌日、懸濁液を凍結乾燥し、室温で保存する。
- 得られた凍結乾燥サクリの量を分析天びんで測定します。
- ddH2Oでサクリを10 mg / mLに希釈し、さらに分析する前に塊を破壊するために簡単に超音波処理します。
- 凍結細胞ペレットを、元の培養量20 mMリン酸ナトリウムpH 6.5の約1:10で再懸濁します。このステップを4°Cで実行します(バッファー11,12のmLあたり1〜8 mgの湿潤細胞ペレット重量にすることができます)。
- 精製ペプチドグリカンの定量
- セクション1.2.18から精製された嚢の量を定量して、差動分析中に質量分析データが均等化されるようにします(セクション3.2)。参考文献15で概説されている詳細な方法論に従ってください。
注:精製された嚢(セクション1.2.18)は、酸加水分解によって個々の糖成分とアミノ酸成分に分解されます。個々の成分は、パルスアンペロメトリック検出を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離および定量されます。PGの構造を考えると(図1)、個々のムロペプチドは単一のMurNAc残基と単一のGlcNAc残基で構成されています。したがって、いずれかの残基の濃度を定量することは、サンプル内のムロペプチドの量1:1を表す。MurNAcは、クロマトグラフィー16中の他のPG成分からのクリーンなピーク分離のために好ましい。
- セクション1.2.18から精製された嚢の量を定量して、差動分析中に質量分析データが均等化されるようにします(セクション3.2)。参考文献15で概説されている詳細な方法論に従ってください。
2. 質量分析データ取得
- 質量分析用ムロペプチドの調製
- 精製サクリ800 μgに100 μg/mLのムタノリシン、100 mM酢酸アンモニウムpH 5.5、および50 mM塩化マグネシウムを100 μLの反応で補給します。
- 37°Cで一晩消化します。
- pH 9.0 に 1:1 容量 0.5 M ホウ酸塩バッファーを加え、~10 mg/mL 水素化ホウ素ナトリウム (NaBH4) を補給します。
注:α型とβ型アノマー型の間で環状糖を変異させると、ムロペプチドの液体クロマトグラフィー分離中に複数のピーク形成が発生します。NaBH4 による治療は、MurNAcをムラミトール11に還元することにより、2つの形態間の相互変換を排除します。この処理では、1,6-アンヒドロMurNAcまたは1,4結合糖残基は減少しません。
注意:NaBH4 の反応により、少量の水素ガスが生成されます。NaBH4 反応は気泡を生成し、ガスを逃がすためにマイクロフュージチューブを開いたままにしておく必要があります。 - サンプルを室温で~20〜30分間インキュベートします。
- 短時間遠心分離して、サンプルをマイクロフュージチューブに沈降させ、気泡を除去します。
- 1:5 リン酸を使用して pH を <4.0 に調整し、5 μL 刻みで加えます。リトマス試験紙を使用してpHをテストします。
- ~17,000 x g で1分間遠心分離し、残っている不溶性物質を沈降させます。
- 0.2 μmの微量遠心フィルターを使用してろ過します。
- サンプルは、LC-MSに注入する前に30,000 x g で10分間遠心分離され、微粒子がMSに注入されないようにします。
- LC-MS のセットアップ
- C18表面多孔性粒子カラム(100 mm x 2.1 mm、孔径<3 μm)を、最小小数点4桁 のm/z 検出精度を備えた四重極飛行時間(QTOF)質量分析計に取り付けます。
- ムロペプチドの液体クロマトグラフィー分離を行う
注:各生物学的トリプリケート(セクション1.1.1)は、LC-MS(セクション2.2.2から2.2.3)を3回(テクニカルトリプリケート)で実行する必要があります。したがって、テストされた各条件には、合計9つのLC-MSデータファイルが含まれます。データ取得は、市販のソフトウェアを使用して実行しました( 材料表を参照)。ただし、取得ソフトウェアはMS機器に基づいて選択する必要があります。以下は、このプロトコルを実行するためのパラメータを使用してMSを設定するためのガイドを表しています。詳細な説明については、製造元のマニュアルを参照してください。- クロマトグラフィー分離のために、0.1%ギ酸(A)および0.1%ギ酸(B)を含むアセトニトリルを以下の溶媒に調製する。
- 以下のパラメータを使用してクロマトグラフィー分離の方法を設定します。
- 流量を0.4mL/分に設定します。
- カラムを 2% B (~24 カラム容量) で 10 分間コンディショニングします。
- オートサンプラーを使用して、セクション2.1.9から10 μLのサンプルを注入します。
注:データ収集を開始する前に、LC-MSプロトコルを介して1つの初期サンプルを実行します。この実行はデータには使用されませんが、後続のすべての実行の保持時間の再現性を高めるために使用されます。保持時間の再現性は、質量電荷比(m / z )ピークの正確な識別とグループ化のために、スペクトル処理(セクション3.1)中に必要です。 - ムロペプチドを2%Bで5分間(~12カラム容量)分離し、13分かけて15%Bに増やし(~30カラム容量)、さらに10分かけて50%Bまで増やし(~24カラム容量)、最後に2分かけて98%Bまで増やします(~5カラム容量)。
注意: グラデーションの最初の2分と最後の5分を破棄(無駄に)します。 - 98% B のカラム洗浄で、6 分間 (~14 カラム容量) および 20 分 (~47 カラム容量) の再平衡化で終了します。
- ムロペプチドの質量分析検出を行う
- MSメーカーの指示に従って、LC-MS基準質量標準を含むアセトニトリルのチューニングミックスを使用して、ポジティブモードで質量軸を校正します。
注:MSは、クロマトグラフィーの実行を開始する前に調整されます(セクション2.2.2.1)。 - 以下のパラメータを使用してMSデータ取得の方法を設定します。
注:MSおよびMS/MSデータは、ムロペプチドのクロマトグラフィー分離(セクション2.2.2.4および2.2.2.5)と同時に収集されます(セクション2.2.3.2から2.2.3.6)。クロマトグラフィーパラメータとMSパラメータ(セクション2.2.2.2および2.2.3.2)はどちらも、複数のサンプルを順番に実行するためのワークリストのセットアップ中に追加される単一の方法です。 - エレクトロスプレーキャピラリー電圧を4.0kV、乾燥ガス温度を350°Cに設定し、流量を13L/minに設定します。
注意: 窒素(純度>99%)は、すべての質量分析データ収集中に噴霧、乾燥、および衝突ガスとして使用する必要があります。 - ネブライザーの圧力を40psiに設定し、フラグメンターを150Vに設定します。
- ノズル、スキマー、オクタポールのRF電圧をそれぞれ1000 V、65 V、750 Vに設定します。
- 300 GHz(拡張ダイナミックレンジ)正イオンモードでスキャン範囲を2,000〜4 m / z に設定します。
- MS および MS/MS スキャンレートが 1 スペクトル/秒のデータ依存 MS/MS 集録を使用してデータ収集を設定します。サイクルごとに5つの前駆体質量を、単独、二重、および三重に帯電した順に選択します。
- MS/MSフラグメンテーション衝突エネルギーを15、20、30eVに設定します。
- MSメーカーの指示に従って、LC-MS基準質量標準を含むアセトニトリルのチューニングミックスを使用して、ポジティブモードで質量軸を校正します。
3. ムロペプチド存在量の差異解析
- LC-MS クロマトグラムスペクトル処理
注:再帰的特徴抽出は、市販のソフトウェアを使用して実行されました( 材料表を参照)。他の特徴抽出ソフトウェアを使用することができる。ただし、他のソフトウェアでは、非常に堅牢な再帰的抽出を実現するために、追加の手動データ処理が必要になる場合があります。さまざまなソフトウェアが、用語機能、エンティティ、および複合をほぼ同じ意味で使用します。PG分析については、全て、個々のムロペプチドを代表するLC−MSイオンクロマトグラムの同定を指す(例えば、 図3)。スペクトル処理中(セクション3.1)、特徴は、単一の化合物標識の下にグループ化された単一のムロペプチドの複数の可能なイオン種を含む複数の m/z ピークを表します。- [ ファイル] で、新しいプロジェクトを開始します。
- LC-MS QTOFデータファイルを追加し、個々のデータファイルを実験条件/グループ(2つの異なる増殖条件など)に割り当てます。
- データ処理ウィザードのバッチ再帰的特徴抽出(低分子/ペプチド)を実行し、LC-MS条件および機器のパラメーターに一致するようにデータ処理フィルターを設定して、個々のムロペプチドを表す m/z ピークを正確に識別、グループ化、検証します。クロマトグラムから、保持時間のドリフトと既知の類似ピークの m/z の変動を調べて、初期フィルターパラメータを設定します。
注:再帰的特徴抽出では、最初の非標的分子特徴抽出アルゴリズムを使用して、すべてのデータファイルでクロマトグラム特徴(m / z ピーク)を識別して整列させます。作成されると、これらの特徴は、識別された特徴の信頼性と精度を向上させるために、ターゲット分子特徴抽出アルゴリズムを使用して元のデータファイル(再帰的)を再評価するために使用されます。最初の非ターゲット抽出を狭い検出ウィンドウで設定し、再帰的抽出に幅広い検出パラメーターを使用して、最初の抽出で欠落している可能性のあるすべてのデータファイルのピークを特定することをお勧めします。再帰的特徴抽出の実行は、サンプル数、データの複雑さ、および存在するコンピューターハードウェアによっては、完了するまでに数時間かかる場合があります。 - 特徴抽出結果を確認します。多数のフィーチャがグループ内で整列できなかった場合は、再帰フィルタリング パラメーターを調整して、必要に応じて検出ウィンドウを広げたり制限したりします。これを実現するには、抽出された各特徴量のクロマトグラムと同位体プロファイルを調べて、すべてのデータファイルで特徴検出が同様に行われたことを確認します。また、データ ファイル内で識別された各特徴について、スコア、警告、および特徴が選択したフィルター パラメーターに合格したかどうかを調べます。
注: 検出ウィンドウを狭くして、個別の機能が誤ってグループ化されないように注意する必要があります。これは、データファイル間の異種の同位体プロファイル、または有意なm / z / 保持時間の変動によってしばしば指摘されます。逆に、 m/z と保持時間が類似している機能が複数ある場合は、フィルタパラメータが厳しすぎて、1つのMSピークが2つの特徴に分割される可能性があります。したがって、保持期間フィルター パラメーターを調整して特徴抽出 (セクション 3.1.3) を再度実行し、これらの特徴をより適切にグループ化できるようにします。最も低い存在量のピークを視覚化すると、使用されたフィルター(セクション3.1.3)がバックグラウンドノイズより上のピークを正確に識別したかどうかが示されます。最も低い存在量のピークが背景に似ている場合は、新しいバックグラウンド フィルター パラメーターを使用してフィーチャ抽出を再実行します。 - データを複合交換ファイル(.cef)(統計ソフトウェアプログラムと互換性のある形式)、または各サンプルの各特徴量の質量、保持時間、および存在量を含む列区切りファイル(.csv)としてエクスポートします。
- スペクトル特徴の微分解析
注:差動分析は、市販のソフトウェアを使用して実行しました( 材料表を参照)。他のバイオインフォマティクスソフトウェアを使用することができる。- プログラムを開き、指示されたら新しいプロジェクトを開始します。
- データのインポートとデータ分析の手順に従います。データのインポート中に、フィーチャ抽出ファイルをアップロードします (セクション 3.1)。データ分析中に、差分分析の有意性と倍率の変化を選択し、すべてのデータファイルの強度の中央値に対するデータのベースラインを選択します。フィルターを再度適用すると、堅牢な再帰的特徴抽出が無効になるため、データフィルターを設定しないでください(これが前のスペクトル処理ステップ(セクション3.1)で行われた場合)。ただし、特徴抽出と同様に、LC-MSデータ収集のドリフトによる質量(m/z)と保持時間に基づいて差分分析を調整する必要があります。特徴抽出(セクション3.1)で決定されたパラメータを使用します。
注:ムロペプチド定量(セクション1.3)を使用してデータファイルを正規化し、変動が実験パラメータによるものであり、嚢精製の変動によるものではないことを確認します(セクション1.2)。外部スケーラーオプションを使用して、サンプルMurNAc濃度の違いについて各データファイルを調整します。 - 分析が完了したら、結果のグラフ分析と統計分析を調べて、テストされた実験条件間で有意な存在量の変化を示すムロペプチドを特定します。
- プロジェクト ナビゲータで、さまざまな解析を右クリックし、エクスポート オプションを選択して、フィーチャの詳細を、各フィーチャの m/z、保持時間、生および正規化強度値、 p 値、FDR、およびフォールドの変化を含む列区切り (.csv) データ ファイルとして保存します。すべての関連データを取得するには、複数の分析を保存する必要があります。
- p値<0.05およびフォールド変化>2を含む統計分析を上回ったムロペプチドのみを含む2番目の.csvファイルをエクスポートします。
- スペクトル特徴に対するムロペプチドの同一性のアノテーション
注:同定された各特徴には、 m / z に基づいて予測されたムロペプチド構造を割り当てる必要があり、このアノテーションはMS / MSフラグメンテーションを調べることによって確認されます。注釈を確認した後、差分分析を実行して改良する必要がある場合があります(セクション3.2)。- 微分解析ソフトウェア内の[結果の解釈]で、[IDブラウザ]を選択します。予想されるムロペプチド構造のライブラリを追加し、以前に使用したのと同様のパラメーターを選択します(セクション3.1.3)。これにより、識別された特徴ごとに予測されたムロペプチドアノテーションが生成されます。ムロペプチド構造のライブラリは、予測されたムロペプチド構造の m/z とMSデータベースソフトウェアを使用して作成できます( 材料表を参照)。ただし、>6,000の可能なムロペプチドの m / z のライブラリは、参考文献12にあります。
- 予測ムロペプチドのマッチングスコアおよび生物学的関連性に基づいて予測ムロペプチドアノテーションを選択する、すなわち、生物学的試料中に存在する可能性が最も高いムロペプチドを選択する。
- MS/MSクロマトグラムの m /zピークを、既知のムロペプチド構造の考えられるすべての断片化の予測 m/z と比較することにより、予測されたムロペプチドアノテーションを手動で確認します(例: 図4)。
- クロマトグラム表示プログラムを使用して、MSおよびMS/MSデータを表示します(図4の材料表を参照)。
- 分子エディター(化学構造描画プログラム)を使用して予測されたムロペプチド構造を描画します( 材料表、図4、灰色の挿入 図を参照)。マスフラグメンテーションツールを使用して、各結合が個別または組み合わせて切断された場合のMSフラグメントの m/z を表示します。
注:MS/MSに使用されるフラグメンテーションエネルギーに応じて、ムロペプチド構造の任意の結合でフラグメンテーションが発生する可能性があります。しかしながら、いくつかの結合は、より低いエネルギーレベルでより容易に/頻繁に断片化される。例えば、ペプチド側鎖の断片化は、アミノ酸間のアミド結合で最も頻繁に起こる。断片化を評価する際には、GlcNAc残基がムロペプチドから非常に容易に断片化されることに注意することが重要です。したがって、既知のムロペプチド構造の断片化は、GlcNAcの有無にかかわらず評価する必要があります。GlcNAcのソース内断片化により、スペクトル処理(セクション3.1)で抽出されたいくつかの特徴は、単一のムロペプチド構造を表す可能性があります。見つかった場合は、これらの特徴をマージし、差分分析を再評価する必要があります。 - 決定されたムロペプチド構造の考えられるすべての断片化(セクション3.3.3.2)をMS/MSクロマトグラム(セクション3.3.3.1)と比較します。ムロペプチドのアノテーションを確認するために、複数のフラグメントのm/zピークを、 m/z アライメントウィンドウが非常に少ないMS / MSクロマトグラムで見つける必要があります(図4)。
- MS/MSフラグメンテーションが曖昧な場合のムロペプチドの同一性を解明するために、セクション2.2.2から2.2.3をサンプル(セクション2.1.9)で繰り返し、m/zの優先プリカーサーリストと追加のMS/MSフラグメンテーション衝突エネルギーを伴う保持時間を組み込んだ追加のMS /MS データ取得を行います。
- 同じムロペプチドとしてアノテーションされた共溶出エンティティについては、差分分析(セクション3.2.2)を再度実行し、抽出された特徴をマージします。
- ムロペプチド修飾の全体的な変化の評価
- 統計的に有意な高倍率変化ムロペプチドの.csvファイル(セクション3.2.4)を編集して、各ムロペプチド修飾について単一のカラムを含めます。この列に、注釈(セクション3.3)された各ムロペプチドの指定を入力します(例:アセチル化対脱Nアセチル化GlcNAcまたはMurNAc)。
- 変更した.csvファイルをペルセウス22,23にアップロードします。正規化された強度値を[メインインポート]ボックスにインポートし、変更指定を[カテゴリ別インポート]ボックスにインポートします。
- 行に注釈を付けるで、行にカテゴリ別注釈を付け、各実験パラメータにデータファイルを追加します。
- テストで、2つのサンプルテストをクリックして、学生の t検定を実行します(p値<0.05、FDR<0.05、s0 = 1)。
- 1Dをクリックして、1D注釈22,23を実行します。0.05<1DアノテーションFDRは、試験された実験パラメータ間のムロペプチド修飾の有意な存在量変化を示す。閾値(s0)= 1を設定すると、すべてのムロペプチドの1DアノテーションFDRスコアが表示されます。
- グラフ作成ソフトウェア( 材料表を参照)内で、各ムロペプチド修飾の存在量の倍率変化のヒートマップを作成し、有意性を示すために1Dアノテーションスコアを表示します(図5B)。各ムロペプチド修飾のフォールド変化は、修飾を含むすべての個々のムロペプチドの生の強度を使用してMicrosoft Excelで生成できます。
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Representative Results
強力なピーク認識ソフトウェアと相まって、MS機械の検出感度の向上により、複雑なサンプルの物質組成を非常に詳細に分離、監視、分析する能力が向上しました。これらの技術的進歩を利用して、ペプチドグリカン組成に関する最近の研究では、古いHPLCベースの方法論11,25,26,27,28,29,30,31よりも自動LC-MS特徴抽出技術12,13,14,24が使用され始めています。.一般的な特徴抽出ソフトウェアパッケージは数多くありますが、再帰的特徴抽出を使用する市販のソフトウェアは、LC-MSデータセット内で見つかった各ムロペプチドのすべての電荷、同位体、付加体バージョンを自動的に識別して組み合わせることで、迅速かつ堅牢です(図3)。さらに、抽出された特徴の初期保持時間、m / z、および同位体パターンを使用してデータセットを再評価(再帰)し、すべてのデータファイル内の各特徴を正確に識別できるようにします。したがって、再帰アルゴリズムは、ピーク識別の検証と信頼性の向上に役立ちます。ほとんどの一般的な特徴抽出プログラムは、電荷/同位体などをグループ化しません。これは追加の手動ステップとして必要になります。さらに、汎用プログラムは、再帰アルゴリズムの一部であるデータセット全体としてではなく、各データファイル内で個別に抽出されるため、堅牢性が低下します。
ここで提示されたペプチドグリコミックプロトコルは、最近、2つの生理学的成長条件、すなわち自由遊泳性プランクトンおよび静止共同バイオフィルム間のPGの組成変化を調べるために使用された12。高感度QTOF MSと再帰的特徴抽出を組み合わせて使用し、160の異なるムロペプチドを認識および追跡しました。これは、この生物で同定されたムロペプチドの数の8倍に相当し、以前に29,32、他の生物で他の方法論を用いて同定されたムロペプチドの2倍以上であった10,14,24。
MSデータから抽出された各 m/z ピークを特定のムロペプチドに関連付けることは、既知および予測されたムロペプチド構造のデータベースとの相互参照によって容易になります。抽出された各特徴の断片化MS/MSクロマトグラム(図4)を、データベースを使用して提案されたムロペプチドの断片化プロファイル(図4、灰色の挿入図)と比較します。
ペプチドグリコミクスデータは、実験のセットアップと尋ねられる質問に応じて、さまざまな方法で表示できます。このようなグラフィカル分析には、主成分分析 (PCA)、散布図、火山プロット、ヒート マップ、および階層クラスタリング分析を含めることができます。たとえば、火山プロットは、テストされた条件間で統計的に有意な高い存在量変化を示すムロペプチドを強調しています(図5A)。試験条件間の有意な存在量変化を表すこれらの選択されたムロペプチドは、ムロペプチド修飾についてさらに調べることができる。これらの修飾は、アミノ酸置換の存在、アセチル化変化、またはアミダーゼ活性の存在を含み得る。一緒に調べると、同じ修飾を有する複数のムロペプチドを調べて、1つの実験条件(図5A—強調表示された点が緑色)になり、グループ全体が有意性について評価されます(図5B)。このようにしてムロペプチド修飾を追跡することは、実験パラメータによって影響を受ける特定の酵素活性を示すことができる。さらに、この傾向からの外れ値は、特定の特異性または生物学的機能を有する酵素活性を示している可能性がある(図5A—オレンジ色の強調表示された点)。
図1:典型的なグラム陰性ペプチドグリカン構造の例。 (A)グラム陰性菌では、ペプチドグリカンは内膜と外膜の間のペリプラズムに位置しています。(B)単一のムロペプチドは、β-1,4 結合N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)(青色)と N-アセチルムラミン酸(MurNAc)(紫色)と付加ペプチド側鎖(オレンジ色)からなる。ペプチド側鎖は、成熟網目様ペプチドドリカン(A)を生成する隣接するムロペプチドの側鎖に架橋することができる。精製には、ペプチドグリカンを細胞全体から分離し、他のすべての細胞物質を剥ぎ取った嚢として分離することが含まれます。(C)ペプチドグリカン嚢の透過型電子顕微鏡写真。比較すると、グラム陽性PGは、構造のより大きなバリエーションからなることができ、グラム陽性分類分類33の一部です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ペプチドグリコミクスワークフロー。 サンプル調製。ステップ1、細菌細胞を増殖させ、ペレット化する(セクション1.1)。ステップ2、ペプチドグリカン嚢を4%SDSボイルで精製します(セクション1.2)。データ収集。ステップ3は、ペプチドグリカン骨格の N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)と N-アセチルムラミン酸(MurNAc)との間のβ-1,4-結合の切断によってムロペプチドを生成する嚢の酵素消化(セクション2.1)。ステップ4、LC-MS / MSによるムロペプチド強度の分析(セクション2.2)。データ分析。ステップ5、再帰的特徴抽出は、単一のムロペプチドに関連する全ての電荷、付加物および同位体を同定および収集する(セクション3.1)。ステップ6、予測された断片化をMS/MSクロマトグラムと比較することによるムロペプチドの同定(セクション3.3)。ステップ7、異なる実験パラメータ間のペプチドグリカン組成変化を比較するバイオインフォマティクス差分分析(セクション3.2)。 ステップ8は、1Dアノテーションを用いて異なる実験パラメータ内のムロペプチド修飾の全体的な変化を調べる(セクション3.4)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:再帰的特徴抽出の例。 アラニン(A)、イソ-ᴅ-グルタミン酸(E)、メソ-ジアミノピメリン酸(m)、アラニン(A)のペプチド側鎖を表すムロペプチドの場合、隣接するムロペプチド側鎖(1864.8 m/z)のAE m Aに架橋する。1864.8 m/zの抽出された特徴には、電荷(+1、+2、および+3)、付加物(ナトリウムおよびカリウムなど)、GlcNAcの損失(1または2 GlcNAc)、および各バリエーションの複数の同位体ピーク(ズームインセットなど)が含まれます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ムロペプチドの断片化と同定。 注釈として、MSクロマトグラムから抽出された各 m/z ピーク(特徴)には、ムロペプチドライブラリとの類似性に基づいて提案されたムロペプチド構造が与えられます。この提案された構造を確認するために、化学描画プログラム(灰色の挿入図)を使用して予測されたMS/MSフラグメントが生成されます。この予測フラグメンテーションは、MS/MS クロマトグラムと比較されます。予測されたフラグメント(灰色の挿入図)がMS/MSクロマトグラムと一致すると、提案されたムロペプチド構造が確認されます。図は参考文献12から修正されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ペプチドグリカン組成の鑑別分析。 (A)遊泳性浮遊性浮遊性または静止バイオフィルム培養として増殖した緑膿菌から精製したペプチドグリカン間のムロペプチド強度の襞変化と統計的有意性の火山プロット。ペプチド側鎖内の典型的なアミノ酸配列の変化を表す修飾を有する全てのムロペプチドが強調される。バイオフィルム由来ペプチドグリカンの存在量が減少する傾向を示したアミノ酸置換ムロペプチドは緑色で強調表示されています。この傾向の外れ値であり、バイオフィルム由来のペプチドグリカンで存在量の増加を示したアミノ酸置換ムロペプチドはオレンジ色で強調表示されています。(B)バイオフィルム中の存在量の増加(オレンジ色)と存在量の減少(緑)を伴うすべてのアミノ酸置換ムロペプチドの存在量のグローバルフォールド変化のヒートマップ。これらのムロペプチドを再グループ化し、モノマー、架橋二量体でアミノ酸置換が発生したかどうか、または4番目(AE m +)、5番目(AEm A +)、または両方のアミノ酸(AEm ++)が置換されたかどうかを評価しました。ムロペプチドの各群の有意性を、有意性についてFDR<0.05の1Dアノテーションによって評価し、関連する1Dスコアを表示する。1Dアノテーションは、2つ以上のムロペプチドに対してのみ実行できます(たとえば、AEm++置換は2つのムロペプチドでのみ見つかりました)。したがって、この場合、有意性は、グループではなく個々のムロペプチドについて調べられなければならない。図は参考文献12から修正されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、細菌培養物からペプチドグリカンを精製する方法、LC-MS検出のプロセス、およびバイオインフォマティクス技術を使用した組成の分析について説明しています。ここではグラム陰性菌に着目し、グラム陽性菌の分析を可能にするには若干の修正が必要になります。
ムロペプチドの調製は、1960年代に最初に製造されて以来、実質的に同じままです9,11,15。精製されると、嚢(セクション1.2.18)は、ストレプトマイセス・グロビスポラス由来のムラミダーゼ酵素ムタノリシンを使用して個々のムロペプチドに消化されます。ムタノリシンは、β-1,4-グリコシド結合を切断することによってPG構造を消化し、ペプチド側鎖が付加されたGlcNAc-MurNAc二糖からなる個々のムロペプチドを放出し、修飾または架橋を含みます(図1)。
PG組成の研究に使用された以前の方法論の限界は、ムロペプチドの時間のかかる手動同定でした。複雑さと難しさのために、付加体、電荷、および/または同位体が分析に含まれている場合と含まれていない場合があります。さらに、ほとんどの研究では、分析を最も豊富で精製が最も簡単なムロペプチドに限定していました。したがって、方法論の複雑な性質のために、比較的少数の高レベルの詳細なPG組成分析が実施されています。「オミック」タイプの分析では、生物学的システムの高レベルの概要のために、比較的大規模で複雑なLC-MSデータセットの作成と統計分析に最近の技術的改善が使用されてきました。ペプチドグリコミクスの応用により、PG組成の非常に詳細な分析が可能になります。
ペプチドグリコミクス内では、再帰的特徴抽出により、すべてのデータファイルを一度に調べることで、手作業の作業負荷が軽減され、精度が向上します。再帰的特徴抽出アルゴリズムを使用して、複数のLC-MSクロマトグラフィーデータファイルにわたって固有のスペクトル特徴(m/zピーク)を識別、整列、およびグループ化し、ムロペプチドm/zピークの同定を自動化します。このアルゴリズムは、多数の潜在的な同位体、イオン付加体、および電荷状態を取り、複数のm/zピークをその代表的な単一の化合物(または特徴)に凝縮する同位体パターンマッチングを使用します(この場合は単一のムロペプチドを表します)(図3)。スペクトル特徴群の検証は、各クロマトグラフィーデータファイル内の保持時間、m/z、および同位体パターンマッチングを比較することによって達成され、データセット全体で特徴を確実に抽出します。一般的な特徴発見アルゴリズムには、同位体マッチングや、複数のサンプルにわたるm / zピークの整列、グループ化、または検証が含まれていない場合があり、この特徴抽出を実現するには追加の手動データ処理が必要になります。
特徴が特定されると、バイオインフォマティクス差分分析アルゴリズムは非常に大きなデータセット全体を処理するため、複雑なデータからの有用な比較と解釈が可能になります。これらのバイオインフォマティクスのグラフィカル分析を使用することは、大規模なデータセットを視覚化および解釈して、生物学的プロセスを示す可能性のある傾向を調べるための強力な方法です。これらの強力なグラフ分析を使用してペプチドグリカンを非常に詳細に調べたのはごく最近のことです12。鑑別分析(セクション3.2)は、異なる実験条件間の個々のムロペプチドの存在量の変化を評価します。しかしながら、細菌細胞全体の状況において、PG修飾酵素の活性は、触媒活性の特異性に応じて複数の異なるムロペプチド構造をもたらし得る(すなわち、二糖上のアセチル基の付加は、ペプチド側鎖の修飾の有無にかかわらずあり得る)。したがって、すべての個々の注釈付きムロペプチドにわたる特定の修飾の全体的な存在量変化を評価することは、PGに作用する酵素活性に関する洞察を与える(図5)したがって、個々のムロペプチドの存在量変化を調査するために鑑別分析が使用される。一方、1Dアノテーションは、特定のPG変更の存在量の変化を調べます。1Dアノテーションによる結合差分析により、PG組成を個々のムロペプチドレベルと全体的なPG酵素活性の指標の両方で評価することができます。
鑑別分析中、PGは少数の高存在量のムロペプチドと多数の低存在量のムロペプチド12から構成されていることに注意することが重要です。したがって、ベースラインは、分析の後のステップ中に高存在量のムロペプチドからバイアスを除去するために非常に重要です。また、複数のt検定が実行されるため、誤検知を減らすための統計的補正を適用する必要があります。デフォルトは、多くの場合、ベンジャミニ-ホッホベルク偽発見率 (FDR)19 です。より保守的なボンフェローニファミリーワイズエラー率(FWER)20,21などの他の修正が可能です。
バイオインフォマティクスソフトウェア内では、特徴抽出で特定された m/z ピークにも予測構造が割り当てられます。他の「オミック」タイプの分析(プロテオミクスなど)は、予測フラグメンテーションスペクトルマッチングによる化合物同定を可能にする大規模な化合物データベースの可用性の恩恵を受けます。現在、ムロペプチド予測断片化ライブラリーは存在せず、ムロペプチド同定の確認は手動ステップのままです。しかし、ペプチドグリコミックフラグメンテーションデータベースが開発され、一般に利用可能になるにつれて、この手動同定ステップは、セクション3.3.3および3.3.4を排除または大幅に削減することにより、より自動化され、アクセス可能になります。
大腸菌では、PGは細胞当たり~3.5 x10 6ムロペプチドからなる34。QTOF MSの検出限界内では、最も存在量の低いムロペプチドでさえ、細胞12内の単一のムロペプチドの数百コピーを表すことができる。したがって、最も存在量の低いムロペプチドに対する変化を理解することは、細胞内のPG標的酵素の生物学的活性に関する有用な洞察を提供する可能性があります。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、このプロトコルの改良に貢献したジェニファー・ゲデス・マカリスター博士とアンソニー・クラーク博士に感謝の意を表します。この作業は、C.M.K(PJT 156111)に授与されたCIHRからの運営助成金と、E.M.A.に授与されたNSERCアレクサンダーグラハムベルCGS Dによってサポートされました。 BioRender.com 日にフィギュアが作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) | Agilent | LC-MS data acquisition | |
| Heating mantle controller, Optichem | Fisher | 50-401-788 | for 4% SDS boil |
| Heating Mantle, 1000mL Hemispherical | Fisher | CG1000008 | for 4% SDS boil |
| Incubator, 37°C | for sacculi purification and MS sample prep | ||
| Leibig condenser, 300MM 24/40, | Fisher | CG121805 | for 4% SDS boil |
| Lyophilizer | Labconco | for lyophilization of sacculi | |
| Magentic stirrer | Fisher | 90-691-18 | for 4% SDS boil |
| mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 | Aglient | LC-MS data acquisition | |
| microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm | Fisher | 50-197-9573 | cleanup of sample before MS injection |
| Retort stand | Fisher | 12-000-102 | for 4% SDS boil |
| Retort clamp | Fisher | S02629 | for 4% SDS boil |
| round bottom flask - 1 liter pyrex | Fisher | 07-250-084 | for 4% SDS boil |
| Sonicator model 120 | Fisher | FB120 | for sacculi purification |
| Sonicator - micro tip | Fisher | FB4422 | for sacculi purification |
| Ultracentrifuge | Beckman | sacculi wash steps | |
| Ultracentrifuge bottles, Ti45 | Fisher | NC9691797 | sacculi wash steps |
| Water supply | City | for water cooled condenser | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgesoft | molecular editor for muropeptide fragmentation prediction | |
| Excel | Microsoft | viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc. | |
| MassHunter Acquisition | Aglient | running QTOF instrument | |
| MassHunter Mass Profiler Professional | Aglient | bioinformatic differential analysis | |
| MassHunter Personal Compound Database and Library Manager | Aglient | muropeptide m/z MS database | |
| MassHunter Profinder | Aglient | recursive feature extraction | |
| MassHunter Qualitative analysis | Aglient | viewing MS and MS/MS chromatograms | |
| Prism | Graphpad | Graphing software | |
| Perseus | Max Plank Institute of Biochemistry | 1D annotation | |
| Material | |||
| Acetonitrile | Fisher | A998-4 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637 | |
| Amylase | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Boric acid | Fisher | BP168-1 | |
| DNase | Fisher | EN0521 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| LC-MS tuning mix - HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Nitrogen gas (>99% purity) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Phosphoric acid | Fisher | A242 | |
| Pronase E from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNase | Fisher | EN0531 | |
| Sodium azide | Fisher | S0489 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318 | |
| Sodium Phosphate (dibasic) | Fisher | S373 | |
| Sodium Phosphate (monobasic) | Fisher | S369 | |
| Stains-all | Sigma-Aldrich | E9379 |
References
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