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Behavior

Avaliação Comportamental da Função Visual via Resposta Optomotor e Função Cognitiva via Y-Maze em Ratos Diabéticos

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61806
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 1, 1, 1,2, 1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Neuroscience, Emory University, 4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

A degeneração neural nos olhos e no cérebro como resultado do diabetes pode ser observada através de testes comportamentais realizados em roedores. O labirinto Y, uma medida de cognição espacial, e a resposta optomotor, uma medida da função visual, ambos fornecem insights sobre potenciais diagnósticos e tratamentos.

Abstract

A resposta optomotor e o labirinto Y são testes comportamentais úteis para avaliar a função visual e cognitiva, respectivamente. A resposta optomotor é uma ferramenta valiosa para rastrear mudanças nos limiares de frequência espacial (SF) e sensibilidade ao contraste (CS) ao longo do tempo em vários modelos de doenças da retina, incluindo retinopatia diabética. Da mesma forma, o labirinto Y pode ser usado para monitorar a cognição espacial (medida pela alternância espontânea) e o comportamento exploratório (medido por uma série de entradas) em uma série de modelos de doenças que afetam o sistema nervoso central. As vantagens da resposta optomotor e do labirinto Y incluem sensibilidade, velocidade de teste, uso de respostas inatas (treinamento não é necessário), e a capacidade de ser realizado em animais acordados (não anestesiados). Aqui, os protocolos são descritos tanto para a resposta optomotor quanto para o labirinto Y e exemplos de seu uso mostrados em modelos de diabetes tipo I e Tipo II. Os métodos incluem preparação de roedores e equipamentos, desempenho da resposta optomotor e o labirinto Y, e análise de dados pós-teste.

Introduction

Mais de 463 milhões de pessoas vivem com diabetes, tornando-se uma das maiores epidemias globais de doenças1. Uma das complicações graves decorrentes do diabetes é a retinopatia diabética (DR), uma das principais causas de cegueira para adultos americanos em idade de trabalho2. Nos próximos 30 anos, projeta-se que o percentual da população em risco de DR dobre, por isso é crucial encontrar novas formas de diagnosticar a DR em seus estágios iniciais para prevenir e mitigar o desenvolvimento da DR3. A DR tem sido convencionalmente considerada uma doença vascular4,5,6. No entanto, agora com evidência de disfunção neuronal e apoptose na retina que precede a patologia vascular, a DR é definida como ter componentes neuronais e vasculares4,5,6,7,8,9. Uma maneira de diagnosticar a DR seria examinar anormalidades neurais na retina, um tecido que pode ser mais vulnerável ao estresse oxidativo e à tensão metabólica do diabetes do que outros tecidos neurais10.

Declínios na função cognitiva e motora também ocorrem com diabetes e são frequentemente correlacionados com alterações na retina. Indivíduos mais velhos com diabetes tipo II retratam pior desempenho cognitivo básico e apresentam declínio cognitivo mais exacerbado do que os participantes de controle11. Além disso, a retina foi estabelecida como uma extensão do sistema nervoso central e patologias podem se manifestar na retina12. Clinicamente, a relação entre retina e cérebro tem sido estudada no contexto do Alzheimer e outras doenças, mas não é comumente explorada com diabetes12,13,14,15,16. Alterações no cérebro e na retina durante a progressão do diabetes podem ser exploradas usando modelos animais, incluindo o rato STZ (um modelo de diabetes tipo I no qual a toxina, estreptozotocina ou STZ, é usada para danificar células beta pancreáticas) e o rato Goto-Kakizaki (um modelo poligênico de diabetes tipo II no qual os animais desenvolvem hiperglicemia espontaneamente por volta das 3 semanas de idade). Neste protocolo, é fornecida uma descrição para o labirinto Y e a resposta optomotor para avaliar alterações cognitivas e visuais em roedores diabéticos, respectivamente. A resposta optomotor (OMR) avalia a frequência espacial (semelhante à acuidade visual) e a sensibilidade ao contraste, monitorando movimentos característicos de rastreamento reflexivo da cabeça para medir limiares visuais para cada olho17. A frequência espacial refere-se à espessura ou fineza das barras, e a sensibilidade ao contraste refere-se à quantidade de contraste entre as barras e o fundo (Figura 1E). Enquanto isso, o labirinto Y testa a memória espacial de curto prazo e a função exploratória, observada através de alternâncias espontâneas e entradas através dos braços do labirinto.

Ambos os testes podem ser realizados em animais acordados e não anestesiados e têm a vantagem de capitalizar as respostas inatas dos animais, o que significa que eles não necessitam de treinamento. Ambos são relativamente sensíveis, pois podem ser usados para detectar déficits no início da progressão do diabetes em roedores, e confiáveis, na forma de produzir resultados que se correlacionam com outros testes visuais, retinais ou comportamentais. Além disso, o uso do OMR e do labirinto Y em conjunto com testes como eletroretinograma e tomografia de coerência óptica pode fornecer informações sobre quando alterações retina, estrutural e cognitiva se desenvolvem em relação umas às outras em modelos de doenças. Essas investigações podem ser úteis na identificação de degenerações neurais que ocorrem devido ao diabetes. Em última análise, isso poderia levar a novos métodos de diagnóstico que efetivamente identificam a DR em estágios iniciais de progressão.

Os sistemas OMR e Y-maze usados para desenvolver este protocolo estão descritos na Tabela de Materiais. Pesquisas anteriores sobre o OMR, por Prusky et al.18, e o labirinto Y, de Maurice et al.19, foram usados como ponto de partida para desenvolver este protocolo.

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Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais dos Veteranos de Atlanta e conformes com o guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório (NIH Publications, 8ª edição, atualizada em 2011).

1. A resposta optomotor (RM)

  1. Configurar o aparelho OMR (detalhes sobre aparelhos e software em Tabela de Materiais)
    1. Escolha a plataforma de tamanho apropriado para o roedor: mouse, rato ou rato grande/prejudicado (Figura 1A).
    2. Abra o software OMR, que deve abrir para uma janela com várias guias de opções e uma transmissão de vídeo ao vivo do interior do tambor OMR/virtual (Figura 1B). Aproxime-se ou desça com a câmera de vídeo conforme necessário para que a plataforma e seus arredores sejam visíveis.
    3. Observe os ícones ao longo do lado esquerdo da imagem ao vivo (Figura 1C). Clique no ícone de asterisco e no ícone de listras giratórias para que as listras verdes e as listras giratórias verdes desapareçam da alimentação ao vivo.
    4. Clique no ícone da bússola para que um círculo verde e duas linhas perpendiculares apareçam. Estique o círculo verde para que ele se alinhe perfeitamente com o círculo preto na plataforma, o que garantirá que o OMR esteja perfeitamente alinhado.
    5. Clique no ícone da bússola porque não é necessário ver o círculo durante o teste. Clique no ícone de asterisco verde e no ícone de listras giratórias verdes para fazê-los reaparecer. Note que as listras verdes giram na mesma direção que as listras do tambor, permitindo que o pesquisador conheça a direção das listras.
    6. Clique na guia Teste . Em Teste, clique na guia Psicofísica . Em Limiar, selecione Frequência para medir a frequência espacial.
      NOTA: O software OMR usa um paradigma de escada para calcular automaticamente a frequência espacial (SF). O contraste será mantido em 100%.
    7. Em Teste, clique na guia Predefinições . Selecione as configurações padrão para Mouse18 ou Rat20.
    8. Em Teste, clique na guia Em branco . Verifique a caixa Blank on Tracking , que pausará as listras/apagará as telas do computador no tambor sempre que o mouse estiver clicado com o botão direito do mouse.
    9. Clique na guia Resultados , que é onde os resultados do teste serão exibidos.
  2. Avaliar a frequência espacial
    1. Coloque o roedor na plataforma circular no centro da câmara de realidade virtual composta por quatro monitores de computador que mostram grades verticais de ondas seno circulando a câmara a uma velocidade de 12°/s (Figura 1D).
    2. Observe que a câmera de vídeo posicionada na parte superior da câmara está projetando o comportamento do roedor ao vivo no monitor do computador.
    3. Procure a presença ou ausência de ações reflexivas pela cabeça do roedor enquanto as grades se movem no sentido horário ou anti-horário. Certifique-se de que as barras ilustradas estão visíveis no programa — elas mostrarão a direção do movimento de grade.
      1. Cuidado com a cabeça do roedor para se mover na mesma direção que as grades. Espere até que haja uma perseguição suave, não explosões erráticas de movimento da cabeça, para contá-lo como rastreamento.
      2. Clique em Sim ou Não conforme apropriado. Observe que o SF começará com 0,042 cyc/deg e ajustará a cada sim e não para se tornar mais fácil ou mais difícil (Figura 1E). Clique em Redefinir se o teste precisa ser reiniciado devido a cliques acidentais ou incorretos de sim e não.
    4. À medida que o roedor é testado, certifique-se de manter o asterisco posicionado sobre a cabeça do roedor.
      NOTA: Este tem dois efeitos: 1) Mantém a frequência espacial correta. Se o asterisco estiver posicionado entre os ombros, por exemplo, a frequência espacial será mais baixa e as barras serão mais fáceis de ver, resultando em uma pontuação falsamente alta. 2) Para roedores com leves movimentos da cabeça, o asterisco torna mais fácil avaliar se a cabeça está realmente se movendo.
    5. Observe o sistema para dizer "Feito" quando a frequência espacial do roedor é atingida. Observe que os botões Sim e Não não serão mais clicáveis.
    6. Clique na guia Resultados , que exibirá a frequência espacial para o olho esquerdo, olho direito e olhos combinados.
      NOTA: Às vezes o software é definido de tal forma que os resultados são invertidos, ou seja, o olho direito é relatado como o olho esquerdo e o olho esquerdo é relatado como o olho direito. Isso foi descoberto ao avaliar roedores que tinham apenas um olho lesado em um modelo de glaucoma.
  3. Avalie a sensibilidade ao contraste
    NOTA: O teste de sensibilidade ao contraste pode ser realizado imediatamente após a etapa de medição da frequência espacial ou por conta própria no mesmo dia ou em um dia diferente se o roedor aparecer cansado após o teste de frequência espacial (siga os passos 1-2.2 se apenas testar a sensibilidade ao contraste).
    1. Clique na guia Teste e, em seguida, na guia Psicofísica . Em Limiar, selecione Contraste (único) para medir a sensibilidade ao contraste.
    2. Também usando um paradigma de escada, comece a ralar com a constante SF no pico da curva de Sensibilidade ao Contraste (CS). Para fazer isso, clique na guia Estímulo e , em seguida, na guia Grades . Na caixa de Frequência Espacial , tipo 0,064 para ratos e 0,103 para camundongos.
    3. Comece o contraste em 100% e procure os mesmos movimentos reflexivos da cabeça vistos durante os testes de frequência espacial. Observe que o contraste diminuirá à medida que o teste progride até que o roedor não tenha mais movimentos reflexivos da cabeça em resposta ao estímulo (Figura 1E).
    4. Observe que o sistema diga "Feito" e os botões Sim e Não não sejam mais clicáveis uma vez que o roedor não responda mais ao estímulo visual e o limiar de sensibilidade ao contraste tenha sido atingido. Clique na guia Resultados , onde a sensibilidade de contraste para o olho esquerdo, olho direito e olhos combinados será listada.
  4. Realizar análises pós-teste
    1. Para estudos de retinopatia diabética, onde se espera que ambos os olhos tenham déficits semelhantes, use o escore combinado (média dos olhos direito e esquerdo) para análise. Para modelos que causam danos diferenciais aos olhos (ou seja, lesão por explosão ou glaucoma), mantenha os dados do olho esquerdo e direito separados.
    2. Para Frequência Espacial, utilize escores brutos (os dados da guia Resultados ) para análise e média desses escores juntos por grupo (ou seja, diabético, controle, etc.).
    3. Para sensibilidade de contraste, use o valor bruto para calcular a sensibilidade de contraste relatada pelo contraste michelson de uma medição anterior da luminância da tela.

2. O labirinto Y

  1. Prepare roedores para testes
    1. Adapte os roedores ao quarto por 30 minutos antes do teste.
      NOTA: O pesquisador pode permanecer na sala com as luzes acesas, mas deve permanecer em silêncio durante este tempo.
    2. Limpe o labirinto Y com solução de higienização segura para os animais e limpe toda a solução de higienização com toalhas de papel. Certifique-se de que o labirinto está seco.
  2. Conduza o labirinto Y
    1. Rotule o braço inicial do labirinto Y como B e os outros 2 braços como A e C (Figura 2A). Coloque um roedor no braço mais próximo do pesquisador (braço B) perto do centro do labirinto Y. Uma vez colocado o roedor, inicie o temporizador (detalhes sobre labirinto e temporizador em Tabela de Materiais).
      1. Permita que cada roedor explore o labirinto Y por 8 minutos. Faça gravações durante este tempo e observe quaisquer observações. Sente-se a vários metros do labirinto enquanto o mantém à vista e evite fazer qualquer barulho.
      2. Registo o local de partida como A, e cada vez que o roedor faz uma entrada em um novo braço, registe a nova localização do roedor (Figura 2B). Defina uma entrada como todos os quatro membros do roedor estar em um dos braços.
      3. Cuidado com os roedores para se esconderem e permanecerem parados em um braço do labirinto. Se o roedor permanecer no mesmo local por mais de 60 anos e não parecer mostrar comportamento exploratório, mova o roedor em direção ao centro do labirinto Y, e continue o julgamento.
    2. Após cada roedor, remova as fezes e limpe o labirinto com solução higienizadora.
      1. Certifique-se de que toda a solução de higienização seja limpa com toalhas de papel e o labirinto esteja completamente seco antes de colocar o próximo roedor no labirinto.
  3. Calcular a alternância espontânea e o comportamento exploratório
    1. Calcule o comportamento exploratório como o número total de entradas feitas durante 8 min.
    2. Calcular a cognição espacial medida pela alternância espontânea:
      o número de alternâncias bem sucedidas/(o número total de entradas - 2)
      1. Defina uma alternância bem sucedida à medida que o roedor se move para três locais diferentes sequencialmente (Exemplo: ABC, CAB, BCA, etc.). Observe cada alternância bem sucedida (Figura 2B).
      2. Se os movimentos foram registrados como ACABCABABCABC, desconsidere os dois locais iniciais no cálculo da alternância espontânea (de tal forma que haja 11 movimentos no denominador). Conte o número de movimentos precisos (movimentos precisos = 8). Calcule a precisão percentual como: 8/(13 - 2) = 72,7%.

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Representative Results

O OMR é considerado bem sucedido se limiares de frequência espacial e sensibilidade ao contraste podem ser obtidos a partir de um roedor. Aqui, o uso da RM Para avaliar a frequência espacial é ilustrado no controle ingênuo ratos Brown-Noruega e Long-Evans, ambos jovens (3-6 meses) e envelhecidos (9-12 meses). Ratos da Noruega Marrom normalmente mostram uma frequência espacial mais alta do que os ratos de Long-Evans. Além disso, observou-se um efeito de envelhecimento na frequência espacial nos ratos de Long-Evans (Figura 3A). Os dados foram analisados utilizando-se uma ANOVA unidirecional seguida por comparações pós-hoc de Holms-Sidak, pois os resultados jovens e idosos vieram de diferentes coortes.

O uso da RM Para avaliar a sensibilidade ao contraste é ilustrado no modelo STZ de diabetes tipo I que recebeu tratamento de intervenção de exercício. Os ratos Long-Evans foram designados para um dos quatro grupos: controle, controle + ativo, diabético e diabético + ativo. Ratos diabéticos receberam injeções intravenosas da toxina STZ para danificar as células beta pancreáticas e induzir hiperglicemia. Ratos ativos receberam 30 minutos de exercício de esteira, 5 dias por semana. Ratos inativos tinham uma esteira trancada. Déficits significativos na sensibilidade de contraste (Figura 3B) foram observados em ratos diabéticos. O tratamento do exercício reduziu esses déficits (Figura 3B). Esses resultados demonstram que a RM É útil tanto para detectar e rastrear déficits de retina ao longo do tempo quanto para avaliar os efeitos dos tratamentos e intervenções na doença da retina22. Os dados foram analisados utilizando-se de medidas repetidas bidirecional ANOVA seguidas por comparações pós-hoc de Holms-Sidak. Observe que os resultados podem ser apresentados como dados normalizados para controle (Figura 3B) ou como valores brutos (Figura 3A; para frequência espacial: em ciclos/graus ou c/d; para sensibilidade ao contraste: unidades arbitrárias ou a.u.). Normalmente, 6-10 animais, dependendo da gravidade da lesão, são necessários para encontrar uma diferença significativa com a OMR.

O labirinto Y é considerado bem sucedido se o roedor entrar em pelo menos 5 braços do labirinto em 8 minutos. Aqui, a capacidade do labirinto Y de avaliar a função cognitiva e o comportamento exploratório é ilustrada no rato Goto-Kakizaki, um modelo poligênico e não obeso de diabetes tipo II que desenvolve hiperglicemia moderada a partir de 2-3 semanas de idade e não requer suplementação de insulina. Déficits significativos na cognição espacial, medidos pela alternância espontânea (Figura 4A) e comportamento exploratório, medido pelo número de entradas (Figura 4B), foram observados em ratos goto-kakizaki em comparação com os controles Wistar a partir das 7 semanas de idade. Os ratos de controle parecem mostrar uma diminuição no comportamento exploratório de 4 para 8 semanas. Essa tendência também é observada em estudos de longo prazo (mais de 8 meses de idade). A diminuição do movimento pode ser devido à falta de novidade com exposição repetida ao labirinto ou uma diminuição geral do movimento com a idade. Os ratos de controle parecem mostrar um aumento na cognição espacial de 4 para 8 semanas. Essa tendência não é observada em estudos de longo prazo em que os animais são executados mensalmente em vez de semanalmente (na verdade, um declínio com o envelhecimento é frequentemente observado), e, portanto, esse aumento na cognição espacial pode ser devido a um efeito de aprendizagem de correr o labirinto uma vez por semana. Os dados foram analisados utilizando-se de medidas repetidas bidirecional ANOVA seguidas por comparações pós-hoc de Holms-Sidak. Um mínimo de 10 animais, dependendo da gravidade da lesão, são tipicamente necessários para encontrar uma diferença significativa com o labirinto Y.

Este protocolo gerou dados de função visual e função cognitiva em modelos de diabetes tipo I e Tipo II. Os escores para animais individuais foram mediados em conjunto e utilizados para detectar diferenças significativas entre os grupos de tratamento no início da progressão do diabetes. A realização de avaliações retinárias e cognitivas ao longo do tempo em modelos de doenças sistêmicas como diabetes permite o monitoramento do aparecimento temporal de déficits ao longo do tempo. Por exemplo, no modelo Goto-Kakizaki, os déficits da função da retina foram mostrados para preceder déficits de comportamento cognitivo e exploratório23 (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Instalação do equipamento OMR. (A) Imagem de mouse, rato e plataformas de ratos grandes ou prejudicadas. (B) Imagem da tela do computador durante o teste. (C) Painel de botões durante o teste. (D) Esquema de rato na plataforma na câmara. (E) Exemplos de gradientes que mostram aumento da frequência espacial e sensibilidade ao contraste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Instalação do equipamento Y-maze. (A) Imagem do labirinto Y com braços rotulados. (B) Foto de um caderno de laboratório com o exemplo da gravação do labirinto Y. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Usando o OMR para rastrear a função visual. (A) Limiares de frequência espacial para ratos jovens (n = 11) e envelhecidos (n = 15) Brown-Norway (BN) e jovens (n = 20) e envelhecidos (n = 13) Long-Evans (LE). Este número apresenta dados brown-noruega de Feola et al., 201921. (B) Utilização do OMR para rastrear a redução da função da retina ao longo do tempo e os efeitos protetores do exercício em um modelo de rato STZ de diabetes tipo I. Limiares de sensibilidade ao contraste para ratos diabéticos inativos versus ratos diabéticos ativos e ratos de controle. Asteriscos cinza escuro representam diferenças entre ambos os grupos de controle e ambos os grupos diabéticos. Asteriscos laranja representam diferenças entre ratos diabéticos inativos e ratos diabéticos ativos. Este número apresenta dados de um subconjunto de ratos de Allen et al., 201822. Média ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Usando o labirinto Y para rastrear a função cognitiva e o comportamento exploratório ao longo do tempo no modelo Goto-Kakizaki de diabetes tipo II em comparação com os controles Wistar. (A) Função cognitiva (alternância espontânea) para ratos Goto-Kakizaki (diabético) e Wistar (controle) de 4 a 8 semanas de idade. (B) Comportamento exploratório (número de inscrições) de 4 a 8 semanas de idade. Média ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Asteriscos representam diferenças entre ratos Goto-Kakizaki e Wistar em cada ponto de tempo. Apenas uma coorte de ratos foi executada de 4 semanas a 8 semanas (GK: n = 7; Wistar: n = 10). Todas as outras coortes foram executadas de 5 semanas a 8 semanas (GK: n = 22; Wistar: n = 23) para um total n de 29 (GK) e 33 (Wistar) nas semanas 5 a 8. Este número foi modificado a partir de Allen et al., 201923. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Linha do tempo de mudanças funcionais no modelo Goto-Kakizaki do diabetes tipo II. Após o aparecimento da hiperglicemia, as primeiras alterações observadas no rato Goto-Kakizaki foram na função retina, medida por eletroretinograma (ERG), aparecendo com 4 semanas de idade. Mudanças de comportamento cognitivo e exploratório apareceram após 6 semanas de idade. Este número foi modificado a partir de Allen et al., 201923. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O OMR e o labirinto Y permitem a avaliação não invasiva da função visual e déficits de função cognitiva em roedores ao longo do tempo. Neste protocolo, o OMR e o Labirinto Y foram demonstrados para rastrear déficits visuais e cognitivos em modelos de roedores de diabetes.

Passos críticos no protocolo

A OMR

Alguns pontos importantes a serem considerados ao realizar a OMR para avaliar a função visual são os parâmetros de teste utilizados, o design experimental e o tempo de teste e a experiência do pesquisador que realiza as medições. Uma das etapas mais críticas do protocolo é garantir que os parâmetros estejam corretamente definidos. Além disso, como parte da configuração, a câmara OMR deve ser limpa com solução de higienização ou outro desinfetante aprovado antes e depois de cada roedor. Também é importante que o pesquisador que realiza as medidas tenha sido treinado e tenha experiência na execução das medidas. Os melhores resultados são vistos quando os roedores estão calmos e aclimatados à sala, deixando-os em suas gaiolas por 30 minutos antes de iniciar o experimento. Também é importante determinar a frequência espacial de base e a sensibilidade ao contraste sempre que começar a trabalhar com uma nova cepa e notar que nem todas as cepas exibirão os mesmos níveis de linha de base. Ratos marrons-noruegueses têm maior frequência espacial do que ratos Long-Evans. Enquanto isso, algumas cepas de ratos albinos parecem ter comprometido a frequência espacial24, enquanto outras cepas de ratos albinos não apresentam comportamento de rastreamento. Muitos fatores podem contribuir para a resposta limitada dos animais albinos na RM: binocularidade perturbada devido à descussão diferencial das fibras do nervo óptico, falta de melanina na parte de trás do olho e grande proporção de cones de dupla opsina. Independentemente disso, os ratos albinos podem não ser sujeitos apropriados para os testes de RMM, uma vez que seu desempenho pode estar muito próximo do limite de detecção.

O labirinto Y

Um componente crítico da realização do labirinto Y envolve minimizar distúrbios durante o período de gravação. A colocação inicial do roedor no labirinto só deve ser feita depois de permitir que o roedor se aclimate até a sala por 30 minutos. Isso permite que o roedor se ajuste ao novo ambiente e evita que quaisquer fatores de confusão impactem o comportamento normal do roedor. Minimizar distúrbios durante cada ensaio é muito importante. Isso inclui evitar ruídos altos e garantir que o pesquisador esteja fora de vista do roedor. Essas distrações podem causar estresse ao roedor. Também é importante notar que as paredes da sala devem permanecer o mais nuas possível com uma cor neutra. Qualquer cor brilhante nas paredes ou cartazes pode distrair o roedor e pode afetar seu padrão de comportamento exploratório.

Limitações do método e modificações e solução de problemas do método

A OMR

Uma limitação potencial da OMR é que ela pode ser afetada pelo viés do experimentador, e diferentes experimentadores podem ter resultados ligeiramente diferentes, uma vez que a pontuação da OMR é subjetiva. Pode ser fácil perder um movimento de cabeça que é muito sutil ou classificar o comportamento exploratório como um movimento da cabeça. Como o viés pode afetar os resultados da RM, é melhor se o experimentador estiver mascarado para o grupo de tratamento e estudar o projeto quando possível. O desenvolvimento de uma OMR automática ou a comparação dos resultados de dois testadores também poderia ajudar a diminuir o viés do experimentador.

Um problema comum que pode ocorrer durante o teste de OMR é quando o roedor pula repetidamente da plataforma, dificultando a obtenção de um limiar visual. Se isso acontecer, tome nota dele e coloque suavemente o rato de volta na plataforma; também pode ser necessário medir o rato novamente no dia seguinte. Além disso, ratos que nunca foram medidos antes podem se envolver em comportamentos exploratórios quando colocados na OMR. Se isso for um problema, ter uma medida de linha de base adicional uma semana ou mais após a primeira medição pode ajudar a melhorar a precisão. Testes com quantidades excessivas desses comportamentos devem ser descartados.

Outros fatores, como idade ou pistas olfativas, também podem contribuir para a atividade indesejada. Por isso, é importante projetar experimentos de acordo com a linha do tempo do desenvolvimento do sistema visual em ratos e limpar completamente a plataforma e a câmara antes e depois de testar cada roedor. A hora do dia em que as medições de RM também devem ser consideradas, pois estudos anteriores mostraram que existem ritmos circadianos na frequência espacial25. Executar os ratos antes do meio-dia parece ser melhor para seu foco (laboratório de Rachael Allen — observações pessoais). Se os ratos ficarem muito distraídos, pode ajudar a tocar suavemente na parte externa da OMR.

A velocidade com que os testes são realizados também pode afetar os resultados. As medidas podem tornar-se menos precisas após 30 minutos ou mais se os roedores perderem o interesse no estímulo. Portanto, resultados mais precisos podem ser obtidos quando as medições são tomadas em aproximadamente ≤20 min. A duração de um único ensaio (para SF ou CS) é de 5 a 10 minutos para um especialista e 30 min para um iniciante. Se um roedor está mostrando pouco movimento, passando a maior parte do tempo arrumando, ou de outra forma não olhando na direção das barras, ele pode estar cansado. O roedor pode ser executado novamente em um dia diferente. Além disso, os testes de SF e CS podem ser realizados em dias diferentes, particularmente para testadores mais novos que podem ser mais lentos. A frequência com que o teste é realizado também pode afetar os resultados — realizá-lo semanalmente ou a cada duas semanas ajuda os animais a se manterem aclimatados ao teste, mas realizá-lo todos os dias ou a cada dois dias pode causar hiperacuidade26. Não executamos mais de um teste por dia, embora muitas vezes executamos tanto SF quanto CS no mesmo dia ou mesmo na mesma sessão. O tempo diário acumulado para executar uma coorte de ratos (n = 10) é de 2 h para um especialista.

O OMR mede cada olho de forma independente, resultando em escores visuais separados para cada olho. Nos modelos Morrison e microesferas de glaucoma e em um modelo de esmagamento de nervo óptico, nosso laboratório não observou nenhum impacto do olho danificado no olho não danificado27. Em um modelo de explosão, com a explosão direcionada a um olho, o olho contralateral mostrou danos, mas isso também pode ser devido a um efeito de explosão parcial28. Nos ratos de controle, não deve haver diferença nos resultados entre as direções no sentido horário ou anti-horário, mas alguns roedores podem ter um viés; assim, seria melhor alternar as direções29, se o sistema OMR não alternar automaticamente.

Dependendo do modelo da doença, as diferenças de grupo de tratamento na função visual podem variar de acordo com os parâmetros utilizados. Por exemplo, ao testar a sensibilidade ao contraste, se a frequência espacial for definida para um nível acima do limiar normal de frequência espacial e difícil de resolver, as diferenças na sensibilidade de contraste entre os grupos serão pequenas. No entanto, se a frequência espacial for definida para um nível que normalmente é fácil para os ratos verem, as diferenças de sensibilidade de contraste entre os grupos serão maiores30. Por isso, é importante considerar o desenho do estudo e os limiares normais de frequência espacial dos roedores ao definir parâmetros para a realização da RM.

O labirinto Y

Se um animal está assustado, pode congelar em um canto do labirinto. Além disso, se um barulho alto acontece fora da sala, um animal pode ficar assustado e não se mover no labirinto. Para explicar essas questões, os pesquisadores podem aclimatar ratos para a sala primeiro, mover um animal congelado para um ponto de escolha, executar um animal novamente em um dia diferente, ou executar os animais em luz vermelha, o que é pensado para torná-los menos nervosos, pois eles são normalmente ativos na escuridão (Rachael Allen's Lab — comunicação pessoal). Também é recomendado executar o labirinto Y ao mesmo tempo todos os dias para explicar as mudanças nos níveis de atividade ao longo do dia devido aos ritmos circadianos. Normalmente executamos os ratos antes do meio-dia (Laboratório de Rachael Allen — observações pessoais). A duração de um único ensaio é de 8 min (10 min, com limpeza). Nunca fazemos mais de um teste por dia. Se for necessário um julgamento adicional, o julgamento é realizado em outro dia. O tempo diário acumulado para executar uma coorte de ratos (n = 10) é de 2-3 h. As reduções relacionadas à idade na alternância espacial foram observadas em ratos aos 9-12 meses de idade e no comportamento exploratório aos 12 meses de idade28.

Embora tanto o comportamento exploratório quanto a cognição espacial diminuam em roedores diabéticos, os dois não parecem estar fortemente correlacionados e, portanto, não avaliamos independentemente a atividade locomotor antes dos testes do labirinto Y.

A significância do método em relação aos métodos existentes/alternativos

A OMR

Outros métodos de teste de função visual, como o rastreamento optokinetic, dependem da fixação da cabeça do animal no lugar e do rastreamento dos movimentos dos olhos. O teste de resposta optomotor (OMR) não contido permite uma medição longitudinal, não invasiva e confiável da função visual em roedores. Neste protocolo, foi descrito como o OMR pode ser usado para quantificar tanto a frequência espacial quanto os limiares de sensibilidade ao contraste para cada olho. Este método pode ser muito útil para detectar disfunção neuronal em estágio inicial em doenças como diabetes. Outros testes como a tarefa visual da água também podem ser usados para medir a frequência espacial31, mas como isso envolve treinar roedores para nadar em direção a um gradiente em um labirinto Y modificado, a tarefa é demorada e envolve muito treinamento. Além disso, a OMR mede valores para cada olho de forma independente, o que é útil em modelos onde a lesão é direcionada a um olho e o outro ocular serve como um controle contralateral (por exemplo, muitos modelos de glaucoma). Além disso, a OMR é uma avaliação sensível, capaz de detectar alterações já em 3 a 4 semanas após o diabetes, o que é mais cedo do que outras avaliações visuais. Ensaios eletrofisiológicos são uma alternativa aos testes visuais comportamentais. A eletroretinaografia (ERG) está mais disponível do que a OMR e pode determinar déficits em tipos de células precisas usando diferentes componentes da onda ERG32 (a- ondas representam função celular fotorreceptora, ondas b representam função celular bipolar). Enquanto isso, o OMR pode ser usado para determinar um déficit na função visual, sem revelar o ponto preciso de quebra ao longo da via. No entanto, a OMR é uma medida mais sensível de DR do que o ERG, com os déficits de RM tipicamente observados entre 2-4 semanas pós-hiperglicemia e déficits de ERG tipicamente observados de 4 a 8 semanas pós-hiperglicemia em roedores. Cataratas diabéticas graves podem afetar a OMR. No entanto, as cataratas diabéticas em roedores aparecem e/ou pioram sob anestesia, e assim, testes como ERG e tomografia de coerência óptica que requerem anestesia são afetados com muito mais frequência que a OMR, que é realizada em animais acordados.

O labirinto Y

O labirinto Y depende da cognição espacial como o labirinto de água morris, mas não usa um forte estímulo negativo (ou seja, água) para motivar o animal a realizar a tarefa. Assim, o labirinto Y é menos estressante para os animais e também é mais fácil de realizar. No entanto, é possível que o labirinto Y não seja tão sensível quanto o labirinto de água morris ou o labirinto barnes. Ao contrário do labirinto de água morris, o labirinto Y é um comportamento automático e não requer treinamento. Assim, o tempo envolvido na realização do labirinto Y é muito menor.

Conclusões e futuras aplicações ou direções do método

A OMR

O OMR é útil para medir a função visual em roedores rastreando movimentos da cabeça. É um método eficaz, mas existem atualizações e adições que são feitas continuamente para melhorar o protocolo. Alguns novos métodos utilizam o roedor parando a cabeça como um indicador OMR negativo combinado com o rastreamento da cabeça como um indicador positivo33. Isso permite medidas mais rápidas e precisas da função visual34. Outra forma de este processo ter sido modificado é desenvolver um sistema que rastreará automaticamente a cabeça sem marcadores artificiais para reduzir inconsistências que poderiam resultar de testadores humanos35. A partir de 2016, um sistema automatizado ou quantitativo de OMR chamado qOMR foi bem desenvolvido e está comercialmente disponível. No protocolo acima, a RM foi capaz de detectar déficits na frequência espacial e sensibilidade ao contraste em ratos diabéticos, bem como proteção contra déficits com tratamento (exercício).

O labirinto Y

O labirinto Y revela informações sobre comportamento exploratório e cognição espacial e foi usado aqui para detectar déficits comportamentais em roedores diabéticos às 7 semanas. Existem outros testes para observar a função cognitiva (ou seja, labirinto de água de Morris, labirinto de Barnes, novo reconhecimento de objetos), e é possível que esses testes possam ser capazes de revelar o declínio cognitivo anteriormente ou fornecer informações sobre diferentes aspectos da cognição. As direções futuras para o labirinto Y incluem colocar um novo objeto ou estímulo alimentar em um dos braços e observar o padrão exploratório do roedor36. Uma variação disso envolve bloquear um dos braços do labirinto Y, permitindo que o roedor explore os dois braços restantes, e depois reabrir o acesso ao terceiro braço e avaliar quanto tempo o roedor passa no terceiro braço novo. Outra melhoria valiosa que poderia ser feita em relação ao labirinto Y é o desenvolvimento de rastreamento automático dos roedores a fim de registrar seus movimentos. Isso eliminaria a necessidade de gravação manual dos movimentos dos roedores e tornaria os cálculos das alternâncias espontâneas mais precisos e eficientes.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Department of Veterans Affairs Rehab P&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) para RSA e (CDA-2, RX002342) para a AJF e os Institutos Nacionais de Saúde (NIH-NICHD F31 HD097918 para DACT e NIH-NIEHS T32 ES012870 para DACT) e NEI Core Grant P30EY006360.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OptoMotry HD CerebralMechanics Inc. OMR apparatus & software
Timer Thomas Scientific 810029AR
Y-Maze apparatus San Diego Instruments 7001-043 Available specifically for rats

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References

  1. IDF. International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edn. , Available from: https://diabetesatlas.org/upload/resources/material/20200302_133351_IDFATLAfinal-web.pdf (2019).
  2. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2018).
  3. Akpek, E. K., Smith, R. A. Overview of age-related ocular conditions. The American Journal of Managed Care. 19 (5), Suppl 67-75 (2013).
  4. Urano, F. Wolfram syndrome: diagnosis, management, and treatment. Current Diabetes Reports. 16 (1), 6 (2016).
  5. Adeva-Andany, M. M., Funcasta-Calderón, R., Fernández-Fernández, C., Ameneiros-Rodríguez, E., Domínguez-Montero, A. Subclinical vascular disease in patients with diabetes is associated with insulin resistance. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Reviews. 13 (3), 2198-2206 (2019).
  6. Chin, J. A., Sumpio, B. E. Diabetes mellitus and peripheral vascular disease: diagnosis and management. Clinics in Podiatric Medicine and Surgery. 31 (1), 11-26 (2014).
  7. Barber, A. J., Gardner, T. W., Abcouwer, S. F. The significance of vascular and neural apoptosis to the pathology of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 1156-1163 (2011).
  8. Pardue, M. T., Allen, R. S. Neuroprotective strategies for retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 65, 50-76 (2018).
  9. Aung, M. H., Kim, M. K., Olson, D. E., Thule, P. M., Pardue, M. T. Early visual deficits in streptozotocin-induced diabetic long evans rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (2), 1370-1377 (2013).
  10. Antonetti, D. A., et al. Diabetic retinopathy: seeing beyond glucose-induced microvascular disease. Diabetes. 55 (9), 2401-2411 (2006).
  11. Logroscino, G., Kang, J. H., Grodstein, F. Prospective study of type 2 diabetes and cognitive decline in women aged 70-81 years. BMJ. 328 (7439), 548 (2004).
  12. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
  13. Archibald, N. K., Clarke, M. P., Mosimann, U. P., Burn, D. J. The retina in Parkinson's disease. Brain. 132 (5), 1128-1145 (2009).
  14. Sakai, R. E., Feller, D. J., Galetta, K. M., Galetta, S. L., Balcer, L. J. Vision in multiple sclerosis: the story, structure-function correlations, and models for neuroprotection. Journal of Neuroophthalmology. 31 (4), 362-373 (2011).
  15. Wong, T. Y., et al. Retinal microvascular abnormalities and incident stroke: the Atherosclerosis Risk in Communities Study. The Lancet. 358 (9288), 1134-1140 (2001).
  16. Marquié, M., et al. Association between retinal thickness and β-amyloid brain accumulation in individuals with subjective cognitive decline: Fundació ACE Healthy Brain Initiative. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 37 (2020).
  17. Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
  18. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Vision Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  19. Maurice, T., et al. Behavioral evidence for a modulating role of σ ligands in memory processes. I. Attenuation of dizocilpine (MK-801)-induced amnesia. Brain Research. 647 (1), 44-56 (1994).
  20. Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22 (5), 677-684 (2005).
  21. Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
  22. Allen, R. S., et al. TrkB signalling pathway mediates the protective effects of exercise in the diabetic rat retina. European Journal of Neuroscience. 47 (10), 1254-1265 (2018).
  23. Allen, R. S., et al. Retinal deficits precede cognitive and motor deficits in a rat model of type II diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 123-133 (2019).
  24. Prusky, G. T., Harker, K. T., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behavioural Brain Research. 136 (2), 339-348 (2002).
  25. Hwang, C. K., et al. Circadian rhythm of contrast sensitivity is regulated by a dopamine-neuronal PAS-domain protein 2-adenylyl cyclase 1 signaling pathway in retinal ganglion cells. Journal of Neuroscience. 33 (38), 14989-14997 (2013).
  26. Mui, A. M., et al. Daily visual stimulation in the critical period enhances multiple aspects of vision through BDNF-mediated pathways in the mouse retina. PLoS One. 13 (2), 0192435 (2018).
  27. Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
  28. Allen, R. S., et al. Long-term functional and structural consequences of primary blast overpressure to the eye. Journal of Neurotrauma. 35 (17), 2104-2116 (2018).
  29. Maaswinkel, H., Li, L. Spatio-temporal frequency characteristics of the optomotor response in zebrafish. Vision Research. 43 (1), 21-30 (2003).
  30. Benkner, B., Mutter, M., Ecke, G., Münch, T. A. Characterizing visual performance in mice: an objective and automated system based on the optokinetic reflex. Behavioral Neuroscience. 127 (5), 788-796 (2013).
  31. Lehmann, K., Schmidt, K. F., Löwel, S. Vision and visual plasticity in ageing mice. Restorative Neurology and Neuroscience. 30, 161-178 (2012).
  32. Leinonen, H., Tanila, H. Vision in laboratory rodents-tools to measure it and implications for behavioral research. Behavioral Brain Research. 352, 172-182 (2018).
  33. Spielmann, M., Schröger, E., Kotz, S. A., Pechmann, T., Bendixen, A. Using a staircase procedure for the objective measurement of auditory stream integration and segregation thresholds. Frontiers in Psychology. 4, 534 (2013).
  34. Shi, C., et al. Optimization of optomotor response-based visual function assessment in mice. Scientific Reports. 8 (1), 9708 (2018).
  35. You, M., Yamane, T., Tomita, H., Sugano, E., Akashi, T. A novel rat head gaze determination system based on optomotor responses. PLoS One. 12 (4), 0176633 (2017).
  36. Whyte, A. J., et al. Reward-related expectations trigger dendritic spine plasticity in the mouse ventrolateral orbitofrontal cortex. The Journal of Neuroscience. 39 (23), 4595-4605 (2019).

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Comportamento Questão 164 retinopatia diabética retina labirinto Y resposta optomotor comportamento exploratório frequência espacial sensibilidade ao contraste memória espacial alternância espontânea

Erratum

Formal Correction: Erratum: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats
Posted by JoVE Editors on 01/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. The author list was updated.

The author list was updated from:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

to:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Stephen Q. Phillips1, Amber Douglass1, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

Avaliação Comportamental da Função Visual via Resposta Optomotor e Função Cognitiva via Y-Maze em Ratos Diabéticos
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Gudapati, K., Singh, A., Clarkson-Townsend, D., Phillips, S. Q., Douglass, A., Feola, A. J., Allen, R. S. Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. J. Vis. Exp. (164), e61806, doi:10.3791/61806 (2020).

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