Behavior

De driekamerkeuzegedragstaak met Zebrafish als modelsysteem

Published: April 14, 2021 doi: 10.3791/61934

Cassie J. Rowe^1,2, Mikayla Crowley-Perry^1,3, Elizabeth McCarthy¹, Terry L. Davidson^2,4, Victoria P. Connaughton^1,2

¹Department of Biology, American University, ²Center for Behavioral Neuroscience, American University, ³Department of Chemistry, American University, ⁴Department of Neuroscience, American University

Summary

We presenteren een gedragskamer die is ontworpen om cognitieve prestaties te beoordelen. We verstrekken gegevens waaruit blijkt dat zebravissen, eenmaal verworven, de taak 8 weken later onthouden. We tonen ook aan dat hyperglycemische zebravissen de cognitieve prestaties hebben veranderd, wat aangeeft dat dit paradigma van toepassing is op studies die cognitie en geheugen beoordelen.

Abstract

Neurodegeneratieve ziekten zijn leeftijdsafhankelijk, slopend en ongeneeslijk. Recente rapporten hebben ook hyperglykemie gecorreleerd met veranderingen in geheugen en/ of cognitieve stoornissen. We hebben een cognitieve taak met drie kamers aangepast en ontwikkeld die vergelijkbaar is met die met knaagdieren voor gebruik met hyperglycemische zebravissen. De testkamer bestaat uit een centraal gelegen startkamer en twee keuzecompartimenten aan weerszijden, met een school van specifieke kenmerken als beloning. We verstrekken gegevens waaruit blijkt dat zebravissen, eenmaal verworven, de taak minstens 8 weken later onthouden. Onze gegevens geven aan dat zebravissen robuust reageren op deze beloning en we hebben cognitieve tekorten in hyperglycemische vissen geïdentificeerd na 4 weken behandeling. Deze gedragstest kan ook van toepassing zijn op andere studies met betrekking tot cognitie en geheugen.

Introduction

Neurodegeneratieve ziekten zijn leeftijdsafhankelijk, slopend en ongeneeslijk. Deze ziekten nemen toe in prevalentie, wat resulteert in een dringende noodzaak om nieuwe therapeutische strategieën te verbeteren en te ontwikkelen. Het begin en de presentatie van elke ziekte is uniek, omdat sommige taal-, motorische en autonome hersengebieden beïnvloeden, terwijl andere leerachterstanden en geheugenverlies veroorzaken¹. Met name cognitieve tekortkomingen en/of stoornissen zijn de meest voorkomende complicaties bij alle neurodegeneratieve ziekten². In de hoop licht te werpen op de onderliggende mechanismen die betrokken zijn bij deze neurodegeneratieve ziekten, is het gebruik van veel verschillende modelsystemen (waaronder eencellige organismen tot Drosophila tot gewervelde dieren van hogere orde zoals knaagdieren en mensen) gebruikt; de meeste neurodegeneratieve ziekten blijven echter ongeneeslijk.

Leren en geheugen zijn zeer geconserveerde processen onder organismen, omdat constante veranderingen in de omgeving aanpassing vereisen³. Stoornissen in zowel cognitie als synaptische plasticiteit zijn aangetoond in verschillende knaagdiermodellen. In het bijzonder gebruiken gevestigde gedragstesten associatief leren om cognitieve veranderingen te beoordelen na verschillende door stoornissen veroorzaakte ziekten en^{aandoeningen 4}. Bovendien beoordeelt contrastdiscriminatieomkering cognitieve tekorten omdat het gaat om leer- en geheugenfuncties van hogere orde, en omkering hangt af van remming van een eerder aangeleerde associatie. De veel gebruikte driekamerkeuzetaak verduidelijkt mogelijke tekorten in leer - en geheugenpaden van het centrale zenuwstelsel⁵^,⁶. Onlangs is dit veld uitgebreid met niet-zoogdiermodellen, zoals zebravissen(Danio rerio),omdat verschillende paradigma's zijn ontwikkeld voor een reeks leeftijden, van larven tot volwassenen⁷^,⁸.

Zebravissen bieden een balans van complexiteit en eenvoud die voordelig is voor de beoordeling van cognitieve stoornissen met gedragstechnieken. Ten eerste zijn zebravissen vatbaar voor gedragsscreening met hoge doorvoer, gezien hun kleine omvang en productieve reproductieve aard. Ten tweede bezitten zebravissen een structuur, het laterale pallium, dat analoog is aan de hippocampus van zoogdieren, omdat het vergelijkbare neuronale markers en celtypen⁷heeft. Zebravissen zijn ook in staat om ruimtelijke informatie te verkrijgen en te onthouden⁹ en zijn, net als mensen, dagelijk¹⁰. Daarom is het niet verwonderlijk dat zebravissen steeds vaker als model voor neurodegeneratieve ziekten worden gebruikt. Het ontbreken van geschikte gedragstesten heeft het echter moeilijk gemaakt om het zebravismodel toe te passen voor cognitieve beoordelingen. Gepubliceerd werk met zebravisspecifieke gedragstesten omvat associatieve leertaken¹¹, angstgedrag¹², geheugen¹³, objectherkenning¹⁴en geconditioneerde plaatsvoorkeur¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Hoewel er veel ontwikkelingen zijn geweest met betrekking tot gedragstests van zebravissen, moeten tegenhangers voor sommige tests van cognitieve functies bij knaagdieren nog worden ontwikkeld voor gebruik met zebravissen¹⁸.

Voortbouwend op eerdere studies uit ons lab, hebben we een cognitieve taak gemodelleerd / ontwikkeld bij zebravissen op basis van de driekamerkeuzetaak die wordt gebruikt met knaagdieren die sociale interactie als beloning gebruiken. Daarnaast hebben we het associatieve leeraspect van de gedragstaak uitgebreid en contrastdiscriminatieomkering opgenomen in de hoop deze gedragstaak verder te ontwikkelen om cognitieve stoornissen te beoordelen. Dit stelde ons in staat om zowel de initiële verwerving van discriminatieonderwijs als de daaropvolgende remming van dat leren in de omkeringsfase te onderzoeken. In de huidige studie tonen we aan dat deze procedure een betrouwbare methode bood voor het beoordelen van cognitief functioneren bij zebravissen na glucose-onderdompeling gedurende 4 of 8 weken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de American University (protocol # 1606, 19-02).

1. Dieren

Opfok en onderhoud van dieren
1. Verkrijg volwassen wilde zebravissen (Danio rerio) van 4-11 maanden als embryo's en kweek ze in eigen huis.
2. Houd de vis in een aquatisch reksysteem bij 28-29 °C bij een donkere fotoperiode van 14 uur en 10 uur.
3. Voer de vis twee keer per dag met commerciële vlokken en vul aan met levende Artemia.
4. Kies willekeurig vis uit deze voorraadtanks voor gedragsexperimenten.
Na voltooiing van het experiment verdooft u de dieren door onderdompeling in 0,02% tricaine gedurende 2 minuten of totdat er een gebrek aan motorische coördinatie en verminderde ademhalingssnelheid is voor latere moleculaire en/of neurochemische analyses.

2. Driekamerkeuze testkamer

OPMERKING: Deze gedragstechniek is gewijzigd van Ruhl et al.²⁰.

Kamerbouw
1. Wijzig de gedragskamer²⁶— een aquarium van 40 L (50 x 30 x 30 cm³)— om een centrale of startkamer (10 x 30 x 30 cm³⁾te hebben, gescheiden van twee zijkeuzekamers (elk 20 x 30 x 30 cm³, figuur 1A).
2. Bouw de drie compartimenten met behulp van een aluminium "U-vormig" kanaal dat met aquariumkit op de glazen binnenwanden is aangebracht om de tank in drie kamers te scheiden.
3. Maak ondoorzichtige verdelers, 10 cm hoog, uit grijze PVC-plaat die aan weerszijden in de aluminium kanalen passen. Maak elke scheidingswand uit 2 stukken, elk even groot: een stilstaand onderstuk dat permanent in de tank is gemonteerd en een beweegbaar bovenstuk dat op en neer beweegt in de aluminium rupsbanden.
4. Lijm extra grote bindclips aan de bovenkant van de grijze PVC-platen om als handgrepen te fungeren.
5. Teken met behulp van een permanente markering kleine horizontale lijnen 10 cm boven de aanhechte grijze PVC-buis aan de buitenkant van de tank.
  OPMERKING: Dit merkteken is het punt waarop de bovenste grijze PVC-plaat wordt geopend om toegang tot beide zijden mogelijk te maken.
6. Voeg regelwater (systeem)water toe aan de tank tot een niveau van 25 cm van onder naar boven van de tank, of ~ 30 L. Plaats glazen aquariumverwarmers in elk deel van de kamer gedurende 24 uur voorafgaand aan de test om de temperatuur op 28,5 °C te brengen.
  OPMERKING: Verwijder de kachels aan het begin van de gedragssessie en voer na twee dagen gebruik een volledige wateruitwisseling uit.
Discriminatie-opzet
1. Plaats voor elke discriminatietaak individueel gekleurde viltstukken (beige, zwart of wit) op de buitenrug, zijkant en onderkant van de keuzekamers met behulp van klittenband (afbeelding 1B–D).
  OPMERKING: De centrale kamer mag geen achtergrondkleur hebben.
Als beloning, creëer een groep van conspecifics (shoal) door het plaatsen van 4 volwassen zebravissen, die anders niet zullen worden gebruikt in de studie, in een kleine, heldere tank in de verre achterhoek van elke keuze kamer (Figuur 1B–D).
OPMERKING: Kies elke dag willekeurig shoalvissen uit voorraadtanks, met ten minste één mannetje en één vrouwtje van dezelfde leeftijd en grootte als de experimentele vis in elke shoaltank.

3. Gedragstaken

Acclimatisering
OPMERKING: Acclimatisatie aan de gedragskamer bestaat uit drie dagen training; twee dagen groepsacclimatisatie gevolgd door één dag individuele training.
Groepsacclimatisatie
1. Bevestig de beige (neutrale) viltachtergrond aan de buitenkant van beide keuzecompartimenten en dompel een onder water staande shoaltank onder in elk van de keuzecompartimenten (figuur 1B).
2. Voeg vijf-zes zebravissen toe aan de middelste startkamer met beide schuifdeuren open en laat de vis 30 minuten vrij rondlopen.
  OPMERKING: De experimentele zebravis moet in staat zijn om als beloning met deze shoalvissen door de tank te communiceren en te socialiseren nadat ze tijdens de acclimatisatie in een van beide keuzecompartimenten zijn overgestoken. Een vis wordt geacht een van de zijkamers te zijn binnengegaan wanneer zijn hele lichaam de kamer binnenkomt.
3. Herhaal deze procedure met dezelfde experimentele vis gedurende een tweede dag (2 dagen groepsacclimatisatie).
  OPMERKING: Houd niet dezelfde groepen vis.
Individuele acclimatisatie
1. Kameropstelling: Bevestig de beige (neutrale) viltachtergrond aan de buitenkant van beide keuzecompartimenten en dompel een levende shoaltank onder in beide keuzecompartimenten, zoals bij groepsacclimatisatie (figuur 1B,E).
  1. Plaats een individuele zebravis gedurende 2 minuten in de centrale startkamer met de schuifdeuren gesloten en open na de periode van 2 minuten beide deuren tegelijkertijd.
  2. Zorg ervoor dat elke vis in totaal 10 keer vanuit de centrale kamer door een deur zwemt, ongeacht welke kant. Beloon de vis elke keer dat hij een van de zijkamers binnenkomt (1 dag individuele acclimatisatie).
    OPMERKING: Als een vis deze taak niet 10 keer binnen een periode van 30 minuten kan voltooien of helemaal niet de startkamer wil verlaten, sluit deze dan uit van het onderzoek.
2. Gegevensverzameling: registreer het aantal keren dat de vis naar beide kanten zwemt en de totale tijd die nodig is om de taak te voltooien.
Aanwinst
OPMERKING: Na acclimatisatie begon zebravis met een 3-daagse acquisitietaak.
1. Kameropstelling: Bevestig een wit viltstuk aan de buitenkant van het ene keuzevak en een zwart viltstuk aan de buitenkant van het andere keuzevak (afbeelding 1C,F).
  OPMERKING: Wissel de achtergrondkleur van elke zijde dagelijks af met behulp van een pseudorandomschema³⁷.
  1. Plaats voor de duur van deze fase van de training een shoal-beloning die alleen in een van de keuzecompartimenten is geplaatst; dit wordt de beloonde kant.
  2. Om met de verwerving te beginnen, plaatst u een enkele experimentele vis in de startkamer voor een periode van 2 minuten met de keuzecompartimenten afgesloten.
  3. Open na de acclimatisatie van 2 minuten tegelijkertijd beide deuren, waardoor u toegang krijgt tot beide keuzecompartimenten en start de stopwatch om de keuzelatentie te beoordelen.
  4. Met behulp van een bevooroordeeld ontwerp wijst u de vis willekeurig een zwarte of witte voorkeur toe (d.w.z. W +/ B- of B + / W-), wat betekent dat de shoal in het zwarte (B +) of witte (W +) keuzevak wordt geplaatst.
2. Het keuzeantwoord aanduiden
  1. Zodra de vis een keuze maakt door een van de zijcompartimenten in te gaan, stopt u de timer.
  2. Als de vis de voorkeurszijde correct kiest, sluit dan onmiddellijk de deur tussen de centrale kamer en die kant om de vis gedurende 1 minuut tot de voorkeurszijde te beperken en laat deze beloond worden door interactie met de shoaltank (figuur 1C,F). Scoor deze proef als "C" voor "Correct" (beloond).
  3. Als de vis door de verkeerde deur zwemt, breng hem dan terug naar de centrale kamer, sluit beide deuren en scoor de proef als "I" voor "onjuist" (niet-beloond).
  4. Als de vis niet binnen 2 minuten na het openen van de deuren een beslissing neemt, verplaats de vis dan gedurende 1 minuut naar de juiste kant en scoor de proef als "M" voor "gemarkeerd" (krachtbeloond).
  5. Wanneer u vissen terugbrengt/verplaatst naar de startkamer, leid de vis dan voorzichtig de centrale kamer in met behulp van een visnet als herdersgereedschap.
    OPMERKING: Schep de vis niet uit het water en vervang deze in de startkamer, omdat dit de gedragstest kan beïnvloeden.
  6. Zodra de vis terugkeert naar de centrale kamer, wacht u 1 minuut voordat u de taak opnieuw uitvoert. Zorg ervoor dat elke vis de taak 8 keer uitvoert.
3. Gegevensverwerving
  1. Noteer voor elke experimentele vis de tijd tot de eerste beslissing (of keuzelatentie) en de individuele scores (C, I of M) voor elk van de 8 verwervingsproeven (punt 3.4.2) in volgorde.
  2. Rapporteer de resultaten voor deze experimenten werden gerapporteerd als groepsgemiddelden voor elke studie op elke acquisitiedag.
  3. Zodra een vis een proef heeft voltooid, categoriseert u deze als een "goed presterende" vis of een "slecht presterende" vis.
    OPMERKING: Een vis werd als "goed presterend" beschouwd als hij met succes de juiste kant van de tank koos in ten minste 6 van de 8 totale proeven voor de dag. Elke vis die niet aan dit criterium voldoet, presteert "slecht".
  4. Eenmaal geïdentificeerd, huis goed presterende en slecht presterende vissen afzonderlijk.
  5. Categoriseer de vis als "hoge" of "lage" performers op elk van de drie dagen van verwerving, nadat een vis de proeven heeft voltooid.
    OPMERKING: Aan het einde van de derde dag van verwerving blijven vissen gedurende de duur van het onderzoek als "hoog" of "laag" performers.
    OPMERKING: Sommige vissen die aanvankelijk in de groep 'slecht presterend' zaten, leren de taak op overnamedag 2 of 3. Wanneer dit gebeurt, kan de eerste 'slecht presterende' vis worden verplaatst naar de 'high performing' groep. Verplaats de vis na dag 3 (het einde van de acquisitie) niet meer op deze manier tussen groepen.

4. Experimentele behandeling

Na de verwervingsperiode, wanneer de vis het vermogen aantoont om een eenvoudige discriminatietaak tussen de zwart-witte achtergrond op te lossen, begint het behandelingsregime voor de experimentele zebravis.
OPMERKING: Om de toepasbaarheid van deze methode aan te tonen, toont deze studie twee experimentele ontwerpen:
1. Longitudinaal onderzoek
  1. Breng de experimentele vis gedurende 8 weken terug in hun bewaartanks. Houd de vis in standaardtanks met dagelijkse waterverwisselingen en voer ze twee keer per dag.
    OPMERKING: Voer gedurende deze 8 weken geen gedragstraining uit in de bedrijfstanks.
  2. Voer na deze periode een omkeringsbeoordeling uit om te beoordelen of de zebravis de omkeringstaak na 8 weken zonder training kan oplossen.
2. Hyperglykemie: Stel de experimentele groepen bloot aan water (omgaan met stressbeheersing), mannitol (1%–3%, osmotische controle) of glucose (1%–3%) gedurende 4 of 8 weken²²^,²³.
  OPMERKING: Voer gedurende deze 4 of 8 weken geen gedragstraining uit.

5. Omkering

OPMERKING: Na experimentele manipulatie (zoals in rubriek 4.2) worden de vissen getest in het laatste deel van het 3-kamer keuzeparadigma — omkering. Om dit te doen, wordt de beloonde kant omgekeerd (in vergelijking met acquisitie) zodat vissen die eerder werden beloond met een shoal aan de witte kant nu worden beloond met een shoal aan de zwarte kant en vice versa. Op deze manier beoordeelt omkering of de vissen hebben geleerd waar de beloning (shoal) zich bevindt, ongeacht de kleur van de achtergrond.

Kameropstelling
1. Bevestig zwart vilt aan de buitenkant van een van de keuzekamers en wit vilt aan de buitenkant van de andere, zorg ervoor dat de zwart-witte zijden dezelfde zijden hebben als bij de acquisitieproeven (punt 3.4).
2. Dompel de shoaltank onder in de uiterste achterhoek van de zijde die het tegenovergestelde is van de eerder beloonde keuzekamer(figuur 1D,G).
  OPMERKING: Met andere woorden, vissen die eerder aan de witte kant werden beloond, worden nu aan de zwarte kant beloond en vice versa.
3. Test de vis afzonderlijk zoals in punt 3.5. Begin met het plaatsen van een enkele experimentele vis in de startkamer voor een periode van 2 minuten en sluit de toegang tot de keuzecompartimenten af.
4. Open tegelijkertijd beide zijden van de kamer.
  OPMERKING: Voltooi in totaal 8 onderzoeken per dag gedurende drie opeenvolgende behandelingsdagen.
Het keuzeantwoord aanduiden
1. Als de vis de gewenste kleur correct kiest, sluit u onmiddellijk de deur naar de centrale kamer gedurende 1 minuut, zodat de vis kan communiceren met de shoal-beloning. Scoor deze proef als "C" voor "Correct" (beloond).
2. Als de vis door de verkeerde deur zwemt, breng hem dan terug naar de centrale kamer, sluit beide deuren en scoor deze proef als "ik" voor "onjuist" (niet-beloond).
3. Als de vis niet binnen 2 minuten na het openen van de deuren een beslissing neemt, verplaatst u de vis naar de juiste kant en scoort u de proef als "M" voor "gemarkeerd" (met kracht beloond).
Gegevensverwerving
1. Noteer voor elke experimentele zebravis de keuzelatentie en de individuele scores (C, I, M), in volgorde, voor elke proef.
2. Rapporteer de resultaten voor deze experimenten als groepsgemiddelden voor elk blok van twee experimenten op elk van de 3 omkeringsdagen.
3. Houd de gegevens voor goed en laag presterende vissen gescheiden om te bepalen of ze tijdens de omkering hetzelfde prestatieniveau vertonen als tijdens de acquisitie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Acclimatisatie aan de gedragskamer omvat drie dagen training: 2 dagen groepsacclimatisatie gevolgd door 1 dag individuele acclimatisatie. Omdat we echter geen onderscheid konden maken tussen individuele zebravissen, konden we alleen gegevens verzamelen tijdens individuele acclimatisatie. Op dit moment namen proefdieren (n = 30), geconditioneerd met behulp van een shoal-gebaseerde beloning, gemiddeld 125,11 s om hun eerste beslissing te nemen (figuur 2A) en een gemiddelde van 725,34 s (12 min) om de volledige individuele acclimatisatietaak te voltooien (figuur 2B). Er was geen significante zijvoorkeur tijdens de acclimatisatie (figuur 2C). Het aantal uitgesloten vissen was minimaal in vergelijking met andere beloningstypen (voedsel) die we eerder in ons laboratorium hadden beoordeeld (figuur 2C).

Na acclimatisatie begon zebravis met de acquisitiefase. Omdat vissen individueel werden getest, verzamelden we gegevens van elke vis op elk van de drie acquisitiedagen. De vissen werden geclassificeerd als 'high or low performers', waarbij 'high performers' sneller en nauwkeuriger reageerden, ondanks dat alle vissen dezelfde eerdere blootstelling aan de testkamer hadden. Alleen vissen die in ten minste 6 van de 8 proeven het beloonde keuzecompartiment selecteerden, werden geclassificeerd als 'high performers'. Vissen die niet aan dit criterium voldeden, waren 'low performers'. Hoog- en laag presterende vissen werden afzonderlijk gehuisvest om hun prestaties in alle daaropvolgende proeven te onderscheiden. Interessant is dat we merkten dat sommige vissen in de loop van de acquisitie van categorie veranderden (d.w.z. aanvankelijk 'low performers', maar 'high performers' werden). In feite nam het aantal goed presterende dieren elke dag toe, met beter presterende vissen op overnamedag 3 in vergelijking met dag 1 (figuur 3A). Op dag 3 was >50% van de vis 'high performers' geworden. Verder daalde de initiële keuzelatentie voor alle vissen gedurende de drie acquisitiedagen (A1-A3), wat wijst op een verbeterde prestatie met elke dag van verwerving (figuur 3B). Dezelfde trend werd ook waargenomen toen alleen de goed presterende visgroep werd overwogen: op dag 3 verbeterde de tijd tot eerste beslissing (werd sneller) (figuur 3C).

Voor elk verwervingsproefblok (gemiddelde van twee proeven/vissen) werd een discriminatieratio (beloont proeven/(beloning + niet-teruggeveerde proeven) berekend over de drie verwervingsdagen (A1-A3) voor alle proefdieren (n = 30) om te bepalen hoe nauwkeurig de vissen de discriminatietaak oplosten (verwerven) (d.w.z. naar de beloonde kant van de tank gaan). Deze verhouding toonde aan dat het percentage vissen dat zich tijdens elke proef naar de beloonde kant verplaatste, dagelijks steeg (d.w.z. over proefblokken op elke individuele dag) en over het algemeen (d.w.z. over de drie verwervingsdagen), wat resulteerde in alle vissen die boven het toeval presteerden aan het einde van de verwerving (stippellijn weergegeven in de grafiek; (Figuur 4A) en geeft aan dat de vis de discriminatietaak had geleerd.

Na het verwerven van discriminatie leren, hebben we getest hoe lang zebravissen zich de taak zouden herinneren. Om dat te doen, bleven geteste zebravissen 8 weken in houdtanks. Na deze tijd werden vissen getest op een omkeringstaak die 3 dagen duurde (R1-R3). We ontdekten dat de vissen sterk omkeringsgedrag en verhoogde discriminatie vertoonden gedurende de drie dagen van omkering(figuur 4B),wat aangeeft dat ze in staat waren om (1) de relatie tussen de kleur van de tank en de beloning te onthouden en (2) te remmen wat ze eerder hadden geleerd tijdens de verwerving en het omkerings-/tegenovergestelde paradigma te leren. Zoals blijkt uit figuur 4B,gingen zebravissen aanvankelijk naar de niet-beloonde kant van de tank, zoals blijkt uit de discriminatieratio die onder de kans ligt tijdens de eerste trails op omkeringsdag 1. Tegen het einde van R1 stegen de prestaties echter tot groter dan het toeval, een resultaat dat werd gehandhaafd op R2 en R3, met de hoogste discriminatieratioscores waargenomen op R3. Samen tonen deze gegevens aan dat naïeve proefdieren in staat zijn om de discriminatietaak op te lossen, hoewel het aanvankelijke gedrag 8 weken eerder werd verworven, zonder extra training tussen gedragssessies.

Het 3-kamer keuzeparadigma kan ook worden toegepast op onderzoek van ziektecomplicaties. In onze studie met hyperglycemische zebravissen werden acclimatisatie en acquisitie beschreven en werd omkering getest na 4 of 8 weken hyperglykemie. Hyperglykemie werd geïnduceerd met een alternatief onderdompelingsprotocol (McCarthy et al., 2020 - dit probleem), zodat de training om de andere dag plaatsvond, op dagen nadat zebravissen 24 uur in testoplossingen waren geweest. Tijdens de acquisitie was er een belangrijk effect van de trainingsdag op de discriminatieratio (F (2, 239) = 4.457, p = 0,012; Figuur 5A), waarbij de verhouding op A1 aanzienlijk lager is dan op A3 (p = 0,010), wat aangeeft dat de vis zijn keuzenauwkeurigheid in de loop van de tijd heeft verbeterd. Tijdens de omkering was er een significant hoofdeffect van de behandeling (F (2, 326) = 3.057, p = 0,048), maar geen andere significante hoofdeffecten of interacties (trainingsdag: (F (2, 326) = 1,602, p = 0,203); trainingsdag x behandeling: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,661, p = 0,203); trainingsdag x behandeling: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,661, p = 0,203); trainingsdag x behandeling: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,661, p = 0,203); trainingsdag x behandeling: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,203); trainingsdag x behandeling: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,203); trainingsdag x behandeling: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,203); trainingsdag x behandeling: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,66 Figuur 5A). De respons van met glucose behandelde dieren was significant verminderd in vergelijking met de met water behandelde dieren (p = 0,037), maar er waren geen andere significante verschillen (controle v. mannitol: p = 0,387; mannitol v. glucose: p = 0,524), wat wijst op een glucosespecifiek effect. Na 8 weken hyperglykemie werden geen statistische verschillen waargenomen in discriminatieratio's tussen acquisitietrainingen (F (2.263) = 2.909, p = 0,056; Figuur 5B). Er waren echter significante belangrijkste effecten van zowel de trainingsdag (F (2, 189) = 4.721, p = 0,010) als de behandeling (F (2, 189) = 7.940, p = 0,000) bij omkering, maar geen significante interactie (trainingsdag * behandeling = F (4, 189) = 0,869, p = 0,000). Latere paarsgewijze vergelijkingen van het minst significante verschil (LSD) identificeerden significante verschillen tussen R1 en R3 (p = 0,022) en tussen R2 en R3 (p = 0,003). LSD-paarsgewijze vergelijkingen brachten ook significante verschillen aan het licht tussen de waterzuiveringsgroep en zowel glucose- als mannitolbehandelingsgroepen (water v. mannitol: p = 0,008; water v. glucose: 0,000); de glucose- en mannitolgroepen verschilden echter niet significant van elkaar (p = 0,265), wat erop wijst dat deze verschillen in discriminatieratio te wijten kunnen zijn aan osmotische effecten.

Figuur 1: Testkamer met driekamerkeuze en gedragsopstelling. (A) 3-kamer schematisch. Proefdieren werden gedurende 2 minuten beperkt tot de centrale startkamer en kregen vervolgens toegang tot beide zijden van de tank aan het begin van een proef. Om dit te doen, werd de bovenste helft van elk van de twee scheidingswanden verhoogd om een ruimte van 10 cm te creëren voor vissen om in beide keuzecompartimenten over te steken. (B,E) Acclimatisatie werd uitgevoerd met behulp van een beige achtergrond en shoal van specifieke kenmerken als beloning. (C,F) Acquisitie werd uitgevoerd met behulp van zwart-witte achtergronden op de keuzekamers; beloning bevond zich slechts aan één kant van de kamer. (G) Omkering werd uitgevoerd met behulp van zwart-witte achtergronden op de keuzecompartimenten; beloning was alleen beschikbaar aan de andere kant van de kamer (vs. acquisitie). (H) Close-up afbeelding van shoal tank ondergedompeld in een van de keuzecompartimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Latentie en aantal gemarkeerde proeven tijdens individuele acclimatisatie. (A) Keuzelatentie van eerste beslissing. B) De totale tijdsduur om de individuele acclimatisatie te voltooien. (C) Het aantal vermeldingen aan de linker- en rechterkant verschilt niet, wat wijst op geen inherente zijvoorkeur vóór het begin van de verwerving. We rapporteren ook het totale aantal markeringsproeven tijdens individuele acclimatisatie. Waarden worden gerapporteerd als Gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Het percentage goed presterende vissen en de initiële keuzelatentie van alle vissen en goed presterende vissen over de drie acquisitiedagen. (A) Goed presterende vissen verplaatsten zich van de centrale kamer naar de beloonde kant van de kamer in ten minste 6 van de 8 proeven per aanwinstdag (A1-A3). (B) Gedurende drie dagen acquisitietraining (A1-A3) nam de totale latentie van de initiële keuze af; een trend die ook zichtbaar is bij goed presterende vissen (C). Waarden worden gerapporteerd als Gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Discriminatieprestaties tijdens acquisitie- en omkeringsproeven. (A) Discriminatieratio (beloont proeven/(beloning + niet-teruggeplaatste proeven) van vissen gedurende acquisitiedagen (A1–A3) en (B) tijdens omkeringsonderwijs 8 weken later. Omkering werd ook beoordeeld gedurende 3 dagen (R1-R3). Voor beide taken moest elke vis 8 proeven voltooien en de resultaten worden gepresenteerd in blokken van twee proeven (2, 4, 6, 8). De juiste reacties tijdens zowel acquisitie als omkering namen met de tijd toe, met een snellere respons waargenomen tijdens omkering, wat aangeeft dat de vis de taak heeft geleerd en onthouden. Waarden worden gerapporteerd als Gemiddelde ± SEM. De stippellijn vertegenwoordigt toeval. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5: Verwerving en omkering van hyperglycemische zebravissen met behulp van de 3-kamer keuze gedragstaak. (A) Voorafgaand aan de behandeling verwierf naïeve zebravissen de 3-kamerkeuze gedragstaak gedurende drie dagen gedragstraining (acquisitie, A1-A3). Er was een significant verschil tussen discriminatieratio's op A1 en A3, wat aangeeft dat er geleerd is (p = 0,012). Na 4 weken behandeling (gekleurde symbolen) was er een significant effect van de behandeling (p = 0,048), waarbij met glucose behandelde dieren significant lagere discriminatieratio's vertoonden in vergelijking met met water behandelde dieren (p = 0,037). (B) In een afzonderlijk experiment werd gedrag voor en na 8 weken hyperglykemie beoordeeld. Ondanks de gestage toename van de prestaties op elke overnamedag, waren er geen significante verschillen in discriminatieverhouding tussen A1 en A3. Na 8 weken behandeling (gekleurde symbolen) was er echter een hoofdeffect van de behandeling (p < 0,001) en een individueel hoofdeffect van de trainingsdag (p = 0,010). Post-hocanalyses toonden een significant verschil aan tussen de met water behandelde groep en zowel mannitol- als glucosebehandelde groepen, wat wijst op een osmotisch effect (water v. mannitol: p = 0,008; water v. glucose: p < 0,001). * duidt op een significant hoofdeffect. Gegevenspunten vertegenwoordigen groeps gemiddelde ± SEM, en gegevenspunten met verschillende letters verschillen aanzienlijk van elkaar. De stippellijn vertegenwoordigt toeval. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel er in de afgelopen 15 jaar²⁴een enorme groei is geweest in de hoeveelheid en verscheidenheid aan neurowetenschappelijk onderzoek dat is uitgevoerd met zebravissen , ontbreken gedragstesten bij deze soort in vergelijking met zoogdiermodelsystemen¹¹^,²⁵^,²⁶. Hier laten we zien dat een driekamerkeuzetaak die is ontwikkeld voor gebruik met knaagdieren kan worden aangepast om de verwerving en omkering van een visuele discriminatie bij zebravissen te beoordelen. Met behulp van een levende shoal als beloning, bood deze taak een robuuste test die kan worden toegepast op een verscheidenheid aan studies die gedragsgerelateerde ziekten onderzoeken, zoals hyperglycemische complicaties van diabetes, Alzheimer en dementie.

Eerder is vastgesteld dat zebravissen in staat zijn informatie te leren en op te slaan, aangezien zij ecologisch relevante beslissingen moeten nemen en noodzakelijk zijn om in het wild te overleven³. Onze acquisitie- en omkeringsgegevens in een longitudinaal onderzoek van 8 weken ondersteunen eerder bewijs dat zebravissen, hoewel klein, in staat zijn om een eenvoudige discriminatietaak te leren en te onthouden, en dat zebravissen ook eerder verworven reacties kunnen remmen. In de longitudinale studie van 8 weken nam het aantal gedwongen beloningen af en nam de discriminatieratio toe, wat aangeeft dat de vissen beter worden in het kiezen van de juiste, beloonde kant en de taak hebben geleerd. Hoewel deze veranderingen niet significant waren, zagen we wel een algemene neerwaartse trend in het aantal met geweld beloonde processen tijdens acquisitie en een toename van de discriminatieratio. Verder onthulden de resultaten van de driekamerkeuzegedragstaak met hyperglycemische vissen de toepasbaarheid van de test op studies die hyperglycemische aandoeningen onderzochten en geeft aan dat dit paradigma kan worden gebruikt in combinatie met andere experimentele manipulaties, zoals blootstelling aan geneesmiddelen of mutante lijnen, om potentiële effecten op cognitie te beoordelen.

Een belangrijke beperking van deze studie is dat we individuele vissen niet in de loop van de tijd kunnen identificeren en daarom moeten vertrouwen op groepsgemiddelden om de gegevens te beoordelen. Het ontwikkelen van een manier om vissen individueel te volgen in de verschillende behandelingsgroepen, zoals bij knaagdieren, zou deze problemen kunnen aanpakken. In een poging om deze verschillen op te lossen, sorteerden we de vis tijdens de acquisitiefase op basis van hun prestaties, wat een onverwacht voordeel van onze methodologie bleek te zijn. 'Goed presterende vissen' scoorden ≥ 6/8 op elke trainingsdag, terwijl vissen met lagere scores 'slecht presterende vissen' waren. Wanneer elke dag geteld, nam het aantal 'high performers' toe in de shoal beloonde groep, zodat er op dag 3 aanzienlijk meer vissen in deze categorie waren in vergelijking met de vis-beloonde behandeling. De keuzelatentietrends die bij alle vissen ('high + low performers') worden waargenomen, zijn vergelijkbaar met die welke alleen in de groep met 'hoog presterende' vissen worden waargenomen, wat suggereert dat de sterke reacties van deze groep de algemene reacties aansturen.

Samengevat geven deze bevindingen aan dat op scholen gebaseerd discriminatieonderwijs bij zebravissen een haalbaar kosteneffectief model biedt voor de studie van normaal en verminderd cognitief functioneren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

We danken Sabrina Jones voor haar hulp bij het aanpassen van een knaagdier driekamerkeuzeparadigma aan het zebravismodel en Jeremy Popowitz en Allison Murk voor hun hulp bij gedragsinzamelingsdagen, hulp bij het uitvoeren van proeven, dierenverzorging en tankopstelling. Speciale dank ook aan James M. Forbes (Mechanical Engineer) voor zijn hulp bij het ontwerp en de constructie van de 3-kamer keuzetank.

Financiering: VPC en TLD ontvingen een gezamenlijke Faculty Research Support grant (FRSG) van American University College of Arts and Sciences. CJR kreeg ondersteuning van American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Champion Sports Stopwatch Timer Set: Waterproof, Handheld Digital Clock Sport Stopwatches with Large Display for Kids or Coach - Bright Colored 6 Pack	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17 Recommend two of different colors; one for choice latency and one for time to completion
Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU=
Marineland® Silicone Aquarium Sealant	Petsmart	Item #2431002
PVC (Polyvinyl Chloride) Sheet, Opaque Gray, Standard Tolerance, UL 94/ASTM D1784, 0.125" Thickness, 12" Width, 24" Length	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2
Steelworks 1/4-in W x 8-ft L Mill Finished Aluminum Weldable Trim U-shaped Channel	Lowes	Item #55979Model #11377	https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181
Tetra 10 Gallon Fish tank	Petsmart	Item #5271256
Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in)	Petsmart	Item #5175115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Gitler, A. D., Dhillon, P., Shorter, J. Neurodegenerative disease: models, mechanisms, and a new hope. Disease Models & Mechanisms. 10, 499-502 (2017).
Perry, R. J., Watson, P., Hodges, J. R. The nature and staging of attention dysfunction in early (minimal and mild) Alzheimer's disease: relationship to episodic and semantic memory impairment. Neuropsychologia. 38, 252-271 (2000).
Gerlai, R. Learning and memory in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 134, Elsevier Ltd. (2016).
Davidson, T. L., et al. The effects of a high-energy diet on hippocampal-dependent discrimination performance and blood-brain barrier integrity differ for diet-induced obese and diet-resistant rats. Physiology and Behavior. 107, 26-33 (2012).
Yang, M., Silverman, J. L., Crawley, J. N. Automated three-chambered social approach task for mice. Current Protocols in Neuroscience. 56 (1), (2011).
Remmelink, E., Smit, A. B., Verhage, M., Loos, M. Measuring discrimination- and reversal learning in mouse models within 4 days and without prior food deprivation. Learning and Memory. 23, 660-667 (2016).
Salas, C., et al. Neuropsychology of learning and memory in teleost fish. Zebrafish. 3, 157-171 (2006).
Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
Luchiaria, A. C., Salajanb, D. C., Gerlai, R. Acute and chronic alcohol administration: Effects on performance of zebrafish in a latent learning task. Behavior Brain Research. 282, 76-83 (2015).
Fadool, J., Dowling, J. Zebrafish: A model system for the study of eye genetics. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 89-110 (2008).
Fernandes, Y. M., Rampersad, M., Luchiari, A. C., Gerlai, R. Associative learning in the multichamber tank: A new learning paradigm for zebrafish. Behavioural Brain Research. 312, 279-284 (2016).
Reider, M., Connaughton, V. P. Developmental exposure to methimazole increases anxiety behavior in zebrafish. Behavioral Neuroscience. , (2015).
Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
May, Z., et al. Object recognition memory in zebrafish. Behavioural Brain Research. 296, 199-210 (2016).
Mathur, P., Lau, B., Guo, S. Conditioned place preference behavior in zebrafish. Nature Protocols. 6, 338-345 (2011).
Guo, S. Linking genes to brain, behavior and neurological diseases: What can we learn from zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 3, 63-74 (2004).
Kily, L. J. M., et al. Gene expression changes in a zebrafish model of drug dependency suggest conservation of neuro-adaptation pathways. Journal of Experimental Biology. 211, 1623-1634 (2008).
Webb, K. J., et al. Zebrafish reward mutants reveal novel transcripts mediating the behavioral effects of amphetamine. Genome Biology. 10, (2009).
Clayman, C. L., Malloy, E. J., Kearns, D. N., Connaughton, V. P. Differential behavioral effects of ethanol pre-exposure in male and female zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 335, 174-184 (2017).
Ruhl, T., et al. Acute administration of THC impairs spatial but not associative memory function in zebrafish. Psychopharmacology. 231, 3829-3842 (2014).
Gellermann, L. W. Chance orders of alternating stimuli in visual discrimination experiments. The Pedagogical Seminary and Journal of Genetic Psychology. 42, 206-208 (1933).
Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44, 157-163 (2007).
Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13, 87-94 (2016).
Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: Zebrafish as a model system of human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 817341 (2012).
Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R., Court, P. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35, 63-75 (2014).
Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in cell biology. 101, 249-270 (2011).

Behavior

De driekamerkeuzegedragstaak met Zebrafish als modelsysteem

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.