Summary
Hypoxi är ett kännetecken för tumörmikromiljö och spelar en avgörande roll i cancerprogressionen. Denna artikel beskriver tillverkningsprocessen av en hypoxic cancer-på-ett-chip baserat på 3D cell-utskrift teknik att rekapitulera en hypoxi-relaterade patologi av cancer.
Abstract
Mikromiljön för cancer har en betydande inverkan på sjukdomsförloppet. I synnerhet är hypoxi den viktigaste drivkraften för canceröverlevnad, invasion och chemoresistance. Även om flera in vitro-modeller har utvecklats för att studera hypoxirelaterad cancerpatologi, har det komplexa samspelet mellan den cancermikromiljö som observerats in vivo ännu inte reproducerats på grund av bristen på exakt rumslig kontroll. I stället har 3D-biofabriceringsmetoder föreslagits för att skapa mikrofysiologiska system för bättre emulering av cancerekologi och noggrann utvärdering av cancerbehandling. Häri föreslår vi en 3D-cellutskriftsmetod för att tillverka en hypoxisk cancer-på-ett-chip. Hypoxiframkallande komponenter i chipet fastställdes baserat på en datorsimulering av syrefördelningen. Cancer-stroma koncentriska ringar trycktes med hjälp av bioinks som innehåller glioblastom celler och endotelceller att rekapitulera en typ av fast cancer. Det resulterande chipet realiserade centrala hypoxi och förvärrad malignitet i cancer med bildandet av representativa patofysiologiska markörer. Sammantaget förväntas det föreslagna tillvägagångssättet för att skapa ett system med fast cancer-mimetisk mikrofysiologisk strategi överbrygga klyftan mellan in vivo- och in vitro-modeller för cancerforskning.
Introduction
Cancermikromiljön är en kritisk faktor som driver cancerprogressionen. Flera komponenter, inklusive biokemiska, biofysiska och cellulära signaler, bestämmer de patologiska egenskaperna hos cancer. Bland dessa är hypoxi starkt förknippad med canceröverlevnad, spridning och invasion1. På grund av obegränsad tillväxt och uppdelning av cancerceller utarmas näringsämnen och syre kontinuerligt, och en hypoxisk gradient genereras. Under förhållanden med låg syrehalt aktiverar cellerna hypoxi-inducerbar transkriptionsfaktor (HIF)-associerad molekylär kaskad. Denna process inducerar en nekrotisk kärna, utlöser metaboliska förändringar och initierar blodkärlshyperplasi och metastasering2,3. Därefter orsakar hypoxi i cancerceller förstörelsen av närliggande normala vävnader. Hypoxi är dessutom starkt förknippat med terapeutisk resistens hos solida tumörer på multifaktoriellt sätt. Hypoxi kan allvarligt hämma strålbehandling, eftersom radiokänsligheten är begränsad på grund av reaktiva syrearter1,4. Dessutom minskar det pH-nivåerna av cancermikromiljö, vilket minskar läkemedelsackumuleringen1. Därför är reproducerning patologiska funktioner relaterade till hypoxi in vitro en lovande strategi för vetenskapliga och prekliniska resultat.
Modellering av en specifik mikromiljö av cancer är avgörande för att förstå cancerutveckling och utforska lämpliga behandlingar. Även om djurmodeller har använts i stor utsträckning på grund av deras starka fysiologiska relevans, finns det problem relaterade till artskillnader och etiska problem5. Även om konventionella 2D- och 3D-modeller möjliggör manipulering och realtidsavbildning av cancerceller för en djupgående analys, kan deras arkitektoniska och cellulära komplexitet inte helt rekapituleras. Till exempel har cancersfäroidmodeller använts i stor utsträckning, eftersom cancercellsaggregering i en sfäroid naturligt kan generera hypoxi i kärnan. Dessutom har ett stort antal cellulära sfäroider av enhetlig storlek producerats med hjälp av plast- eller silikonbaserade multibrunnssystem6,7. Den lägre flexibiliteten när det gäller att fånga den exakta heterogena strukturen hos cancervävnader med konventionella plattformar har dock krävt inrättandet av en avancerad biofabriceringsteknik för att bygga en mycket biomimetisk plattform för att förbättracancerforskningen 8.
3D-mikrofysiologiska system (MPS) är användbara verktyg för att rekapitulera den komplexa geometrin och patologiska progressionen av cancerceller9. Eftersom cancerceller känner av den biokemiska lutningen av tillväxtfaktorer och kemokiner och den mekaniska heterogenitet som reproduceras i systemet, kan viktiga egenskaper hos cancerutveckling undersökas in vitro. Till exempel har cancer livskraft, metastaserad malignitet och läkemedelsresistens beroende på de varierande syrekoncentrationerna studerats med hjälp av MPSs10,11. Trots de senaste framstegen, genererar hypoxiska förhållanden för in vitro-modeller förlitar sig på komplexa tillverkningsförfaranden, inklusive anslutning till fysiska gaspumpar. Därför behövs enkla och flexibla metoder för att bygga cancerspecifika mikromiljöer.
3D-celltrycksteknik har fått stor uppmärksamhet på grund av dess exakta kontroll av biomaterialens rumsliga arrangemang för att rekapitulera inhemska biologiska arkitekturer12. I synnerhet övervinner denna teknik de befintliga begränsningarna hos 3D-hypoximodeller på grund av dess höga kontrollerbarhet och genomförbarhet för att bygga upp de rumsliga egenskaperna hos cancermikromiljön. 3D-utskrift underlättar också datorstödd tillverkning genom en lager-för-lager-process, vilket ger en snabb, exakt och reproducerbar konstruktion av komplexa geometrier för att efterlikna faktiska vävnadsarkitekturer. Förutom fördelarna med befintliga tillverkningsstrategier för 3D MPSs kan de patofysiologiska egenskaperna hos cancerprogression reproduceras genom att mönstra de biokemiska, cellulära och biofysiskakomponenterna 13,14.
Häri presenterar vi en 3D-celltrycksstrategi för en hypoxisk cancer-på-ett-chip för att rekapitituera heterogeniteten hos en fast cancer (Figur 1)15. Tillverkningsparametrarna fastställdes via en beräkningssimulering av centrala hypoxi bildas i systemet. Cancer-stroma koncentriska ringar trycktes med kollagen bioinks som innehåller glioblastoma celler och endotel celler att efterlikna patofysiologi av glioblastom, en typ av fast cancer. Bildandet av en radiell syregradient förvärrade cancer malignitet, vilket indikerar förstärkt aggressivitet. Vidare anger vi framtida perspektiv för chipens tillämpningar på patientspecifika prekliniska modeller. Det föreslagna tillvägagångssättet för att skapa ett system med fast cancer-mimetisk mikrofysiologiskt system förväntas överbrygga klyftan mellan in vivo- och in vitro-modeller av cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Datorsimulering av syregradientbildning
-
Generering av en 3D-geometrimodell för hypoxisk cancer-på-ett-chip-utskrift
- Kör en 3D CAD-programvara.
- Skissa geometrimodellen av hypoxisk cancer-på-ett-chip. Klicka på Skissa och välj önskat plan för att rita geometrin. Se ritningen (figur 2A) för detaljskalan för varje del.
- Ställ in geometrins tjocklek genom att klicka på Feature-Protrusion Boss/Base. Ange önskad tjocklek (se figur 2A)i den tomma rutan och välj den gröna kontrollikonen för att bilda 3D-geometrin.
OBS: Dimensionen av cancer-på-ett-chip definieras baserat på önskade volymer av media och hydrogel. I det aktuella experimentet var de önskade volymerna av media och hydrogel cirka 1 500 μL respektive 500 μL, baserat på tidigare praktiska erfarenheter för upplösning av extruderingsbaserad bioprinter. - Spara geometrifilen som ett 3D CAD-filformat (.prt eller .stl).
-
Bestämning av cellulär densitet för induktion av hypoxisk kärna
- Kör ett fysiskt diffusionsprogram.
- Klicka på LiveLink och välj cad-programmet som används. Klicka på Synkronisera för att importera geometrin för hypoxisk cancer-på-ett-chip på simuleringsprogrammet. Eftersom kammarens inre utrymme kommer att fyllas med ett odlingsmedium i en faktisk experimentell miljö, kommer syre att spridas över kammarens inre utrymme och cellkonstruktionen, som kommer att bestå av cellbelastad hydrogel.
OBS: Se föregående studie för mer information om de fysiska parametrarna15. - Definiera den importerade 3D-geometrin som en kontrollvolym av utrymmet där syret sprids och cellerna förbrukar syre (figur 2B).
- Kör en datoranalys för gasdiffusionsanalys enligt en användarhandbok och tidigare etablerade metoder16,17.
- Från datoranalysresultaten, exportera de uppskattade syrekoncentrationsdata över tvärsnitt A-A vid varje tidpunkt enligt användarhandboken. Den styrande ekvationen bygger på Ficks första lag, uttryckt i Eq. (1) (Figur 2C).
Där c är koncentrationen, D är syrediffusionskoefficienten, N-cellen är cellernas densitet,
är den maximala upptagningshastigheten för syre och Km är Michaelis-Menten-konstanten. Konstanterna tillämpades enligt beskrivningen i en tidigare publikation15.
OBS: Varje tidpunkt betyder en stegpunkt för att observera syrespridningsförändring över tid. - Utvärdera om den minimala syrenivån når en tröskel för hypoxi och upprepa datoranalysprocessen med en ökning eller decrement av cellulär densitet.
OBS: Definiera att hypoxigradient bildas i konstruktionen om syrenivån på 80% i hydrogelområdet är mindre än 0,02 mM efter 24 timmar. - Bekräfta antalet celler som krävs för att generera syregradienten som inducera hypoxi i den centrala regionen från Fick första lag i steg 1.2.5 och simuleringsresultaten från steg 1.2.6.
OBS: I det här protokollet var cellnumret 2 × 106 celler/varje konstruktion.
är den maximala upptagningshastigheten för syre och Km är Michaelis-Menten-konstanten. Konstanterna tillämpades enligt beskrivningen i en tidigare publikation15.2. Cellkultur av cancerceller och stromalceller
-
Förberedelse av cellkulturmedier för att undvika fysiologisk stress
- För U-87 MG-celler (odödlig mänsklig glioblastom cellinje), placera 12 ml högsocker Dulbeccos modifierade Eagle medium som innehåller 10% fetala nötkreatur serum, 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin i en T-75 cell odlingskolv i en 37 °C, 5% CO2 fuktad inkubator i 30 min för att minimera de termiska och alkaliska effekterna av mediet på cellerna.
OBS: Glioblastoma valdes som en typ av fast cancer eftersom det har aggressiva egenskaper i en hypoxisk miljö. Andra olika typer av cancerformer kan tillämpas på denna modell. - För human navelsträngsenothelial celler (HUVECs), placera 12 ml endotel cell tillväxt medium i en T-75 cell kulturkolv i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 °C i 30 min.
HUVECs valdes eftersom det är en av de mest representativa endotelcellslinjerna. Olika typer av stromal celler kan också tillämpas på denna modell.
- För U-87 MG-celler (odödlig mänsklig glioblastom cellinje), placera 12 ml högsocker Dulbeccos modifierade Eagle medium som innehåller 10% fetala nötkreatur serum, 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin i en T-75 cell odlingskolv i en 37 °C, 5% CO2 fuktad inkubator i 30 min för att minimera de termiska och alkaliska effekterna av mediet på cellerna.
-
Snabb upptining av kryopreserverade cancerceller och stromalceller och deras underhåll
- Flytta kryovialer som innehåller 5 x 105 U-87 MG-celler och HUVECs från behållaren för flytande kväve till ett laminärt flödesskåp. Lossa omedelbart och sätt tillbaka locket för att frigöra det inre trycket.
- Placera försiktigt de kryopreserverade cellerna i ett vattenbad vid 37 °C i 2 minuter och håll locket borta från vattnet. Skölj injektionsflaskan med 70% etanol under laminärt flöde för att förhindra kontaminering.
- Överför de tinade cellerna till flaskorna som innehåller de beredda cellkulturmedierna som beskrivs i steg 2.1 och placera de cellinnehållande kolvarna i en fuktad inkubatorpå 5 % CO 2 vid 37 °C för cellåtervinning.
- Uppdatera cellkulturmedierna varannan dag och behåll celltillväxten.
- Efter 24 h upptining, byt ut cellkulturmediet för att undvika cytotoxicitet hos dimetylsulfoxid (DMSO), som användes för cellfrysning. Använd HUVECs, som har genomgått mindre än 6 passager.
3. Beredning av kollagen före gellösning
-
Löslighet av kollagensvamp med 0,1 N saltsyra (HCl)
- Förbered en lösning på 0,1 N HCl och filtrera den med ett 0,2 μm sprutfilter.
- För 3 ml av en 1% (w/v) neutraliserad kollagenförgellösning, förbered kollagensvampar som skärs i 5 x 5 mm2 bitar och väger 30 mg.
- Överför de skurna kollagenbitarna till en steril glasflaska på 10 ml.
OBS: Förbered 1,5 gånger volymen av den nödvändiga kollagenhydeln, med tanke på förlusten av hydrogelen på grund av kollagenlösningens klibbiga egenskaper. - Tillsätt 2,4 ml 0,1 N HCl i den kollagenhaltiga glasflaskan och inkubera den på vippen vid 15 varv/min och 4 °C i 3 dagar.
OBS: Volymen av 0,1 N HCl-lösningen var fyra femtedelar av den slutliga volymen av nödvändig kollagenhydrgel. I detta fall förbereddes 3 ml kollagen. - Efter matsmältningen, sikta de osmältade kollagenpartiklarna med en 40 μm cellsil. Förvara den sura kollagenlösningen vid 4 °C och använd den inom 7 dagar.
-
pH-justering för 1% neutraliserad kollagenlösning före gel
- Centrifugera den sura kollagenlösningen vid 1224 x g i 5 min vid 4 °C.
- Tillsätt 30 μL fenolröd lösning som pH-indikator till en slutlig koncentration på 1% (v/v) och 300 μL 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutlig koncentration på 10% (v/v) i kollagenlösningen före gel.
- Neutralisera pH till 7 med 1 N natriumhydroxid (NaOH) och kontrollera färgförändringen.
OBS: Baserat på formeln, mol H+ = molaritet H+ x volym H+ = mol OH-= molaritet OH- x volym OH-, lägg till 240 μL NaOH. - Tillsätt destillerat vatten för att erhålla en total volym på 3 ml.
- Efter pH-justering, förvara den neutraliserade kollagenlösningen på 1 % (w/v) vid 4 °C och använd den inom 3 dagar.
OBS: För att förkontrollera geleringen av den neutraliserade kollagenförgellösningen, gör 50 μL kollagendroppar på en liten maträtt med en positiv deplacementpipett och inkubera dem i en 37 °C inkubator i 1 timme. Se följande tre metoder för att verifiera korslänkning av kollagendroppar. - Kontrollera om färgen på kollagen har ändrats till ogenomskinligt vitt från genomskinlig färg.
- Luta behållaren och kontrollera om kollagenet är fäst vid behållarens botten.
- Häll 1x PBS på dropparna och kontrollera om kollagenkonstruktionen inte är trasig i lösningen.
4.3D utskrift av gaspermeabel barriär
-
3D-utskrift av en offerpoly (etylen-vinylacetat) (PEVA) mögel
- Generera 3D-geometrin för den offer PEVA-form som definieras i steg 1 med hjälp av en 3D CAD-programvara (Figur 3A).
OBS: 3D-geometrin och den detaljerade modellskalan, inklusive dimensions-, enheter- och linjetyper, visades i figur 2A. - Konvertera 3D CAD-filen till ett STL-filformat genom att klicka på | Filformat som STL. Klicka också på Alternativ | Utdataformulär som ASCII för G-kodgenerering.
- Klicka på | Öppna STL-filen och välj den sparade STL-filen för att importera den genererade STL-filen. Klicka på Segmentmodell av STL-CAD-växlare för att automatiskt generera G-koden för offer PEVA-formen (Figur 3B, C).
OBS: Utskriftsbanan genereras med anslutningen av korsande punkter mellan stl-filens grundläggande figur och skivplanet (dvs. lagret). I grund och botten är den grundläggande figuren för ett fragment i en STL-fil en triangel som innehåller 3D-koordinaterna. När de korsande punkterna mellan triangeln och lagret har erhållits genereras en G-kod för utskrift genom att ansluta varje punkt utan en överlappande bana på ettlager 18. Alla G-kodgenereringsalgoritmer ombord kan användas för att generera utskriftsvägar för chiptillverkningen. - Förbered en steril självhäftande och hydrofil histologirutschbana.
OBS: Det hydrofila glidglaset är avgörande för permanent bindning av polydimethylsiloxane (PDMS) på glaset och vidhäftningen av kollagenkonstruktionerna kapslar in cancerceller och stromal celler. - Skriv ut den offer peva mögel på bilden med ett 50 G precisionsmunstycke vid ett pneumatiskt tryck på 500 kPa vid 110 °C.
OBS: Linjebredden påverkas av materialets matningshastighet, munstyckesmätare och temperatur. Munstycket på 50 G användes och en matningshastighet på 400 tillämpades för att generera 500 μm linjebredd för offerväggen. Munstycksmätaren, det pneumatiska trycket och matningshastigheten definieras med praktiska resultat19. Offerväggen måste vara tillräckligt tjock för att hålla PDMS-lösningen, som är nästa tillverkningssteg.
- Generera 3D-geometrin för den offer PEVA-form som definieras i steg 1 med hjälp av en 3D CAD-programvara (Figur 3A).
-
Gjutning av polydimethylsiloxane (PDMS) barriär
- Blanda 6 ml PDMS bas elastomer och 0,6 ml härdningsmedel homogent över 5 min i en plastbehållare. Detta kan tillverka 6 hypoxic cancer-on-chips, med tanke på förlusten på grund av den klibbiga egenskapen hos PDMS.
- Ladda den blandade PDMS-lösningen i en engångsspruta på 10 ml och montera spruthuvudet med en 20 G plastsmalt dispensspets.
- Fyll den offer PEVA-formen med den blandade PDMS-lösningen i sprutan. Den blandade PDMS kommer att fylla offer PEVA mögel med en konvex yta. Höjden på PDMS-barriären kommer att vara högre än PEVA-formen.
- Härda PDMS-barriären i en ugn vid 40 °C i över 36 timmar för att undvika smältning av PEVA. Öka inte temperaturen till över 88 °C, vilket är peva:s smälttemperatur.
- Lossa offer PEVA-formen med ett par precisions pincett och sterilisera den gaspermeabla barriären vid 120 °C i en autoklav.
5. Beredning av cellinkapslade kollagenbiofärger
-
Avlossning av de beredda cancercellerna och stromalcellerna
Med tanke på cellens livskraft bör hela utskriftsprocessen slutföras så snart som möjligt efter det att cellerna har lossats.- Tvätta cancer och stromal celler med 10 ml 1x PBS med en serologisk pipett; behandla med 2 ml 0,25% trypsin-etylendiaminetetraacetsyra (EDTA) med en pipett och inkubera dem i 3 min vid 37 °C.
- Neutralisera de trypsiniserade cellerna med 3 ml cellkulturmedier; samla upp suspensionerna av celler i 15 ml koniska rör och centrifugera vid 516 x g i 5 minuter vid 20 °C.
- Aspirera supernaten långsamt; återanvänd cellpellets i 5 ml cellkulturmedel och räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer.
- Överför 5 x 106 celler av varje celltyp till nya 15 ml koniska rör och centrifugera dem vid 516 x g i 5 min vid 20 °C.
- Aspirera av supernaten och lägg den på våt is.
-
Blandning av varje celltyp med 1% neutraliserad kollagenlösning före gel
OBS: För att undvika termisk stelning av den 1% neutraliserade kollagenlösningen före gel bör denna process utföras på våt is.- Återanvänd varje typ av cellpellet som samlats in i steg 5.1.4 med 20 μL cellkulturmedier vardera.
- Tillsätt 1 ml av den 1% neutraliserade kollagenlösningen före gel i var och en av de återanvända cellupphängningen och blanda dem homogent med en positiv deplacementpipett. Den slutliga koncentrationen av varje celltyp kommer att vara 5 x 106 celler/ml.
- Överför de cellinksplade kollagenbiobläcken till 3 ml engångssprutor med en positiv engångspipett och förvara sprutorna vid 4 °C tills 3D-celltryck.
6.3D celltryck av cancer-stroma koncentriska ringar
-
3D-cellutskrift av kollagenbiobläck som kapslar in cancerceller och stromalceller
- Generera 3D-geometrin hos de cancer-stroma koncentriska ringarna definierade i steg 1.2 med hjälp av en 3D CAD-programvara.
OBS: Dimensionerna på cancer stroma koncentriska ringar definieras via simulerade parametrar. De slutliga dimensionsparameterdimensionerna visas i figur 3A. - Konvertera 3D CAD-filen till ett STL-filformat och generera en G-kod för de cancer-stroma koncentriska ringarna med hjälp av en STL-CAD-utbytare.
Obs: Se anteckningen i steg 4.1.2 för G-kodgenereringsalgoritmen. - Ladda de cellinkspläterade kollagenbiobläcken i 3 ml engångssprutor på 3D-skrivarens huvud och ställ in temperaturen på huvudet och plattan på 15 °C.
OBS: Om temperaturen på skrivarens huvud och platta når över 37 °C blir biobläcket korslänkad och skrivs inte längre ut. - Läs in den genererade utskriftssökvägen på 3D-skrivarens kontrollprogramvara.
- Genom att klicka på Start-knappen skriver du ut kollagenbiobläcken som kapslar in cancerceller och stromalceller på den gaspermeabla barriären efter den laddade G-koden med en 18 G plastnål vid pneumatiskt tryck på cirka 20 kPa vid 15 °C.
- Placera manuellt ett steriliserat glasskydd på 22 mm x 50 mm ovanpå den gaspermeabla barriären för att generera den hypoxiska lutningen.
OBS: Jämför två grupper beroende på förekomsten av glasskydd (GR+) och frånvaro (GR-) av det för att verifiera genereringen av hypoxic gradienten. - Efter att ha genererat tre hypoxiska cancer-på-chips, överför chipsen till en inkubator vid 37 °C i 1 h för att korslänka kollagenbiobläcken.
- Generera 3D-geometrin hos de cancer-stroma koncentriska ringarna definierade i steg 1.2 med hjälp av en 3D CAD-programvara.
-
Slutförande av tillverkningsprocessen och underhållet av hypoxisk cancer-på-ett-chip
- Efter avslutad 3D-cellutskrift av hypoxisk cancer-på-ett-chip, gnugga försiktigt täckglasen ovanpå de gaspermeabla barriärerna med cellskrapan för tät bindning (Figur 4A, B).
OBS: Täckglaset och den gaspermeabla barriären monteras via hydrofobisk bindning utan kemiska lim, helt enkelt skrapa den bundna delen mellan täckglaset och PDMS-barriären. - Introducera 1,5 ml endotelcellstillväxtmedium till varje chip. För att undvika avskildhet av cancerkonstruktionen, introducera cellkulturmedium från ena sidan av chipet. Luta chippet så att cellkulturmedierna kan flöda med en pipett.
- Uppdatera cellkulturmedierna varje dag i en vecka. Använd en pipett för att aspirera cellkulturmediet. Använd inte en tryckpump.
- Efter avslutad 3D-cellutskrift av hypoxisk cancer-på-ett-chip, gnugga försiktigt täckglasen ovanpå de gaspermeabla barriärerna med cellskrapan för tät bindning (Figur 4A, B).
7. Utvärdering av cellens livskraft efter utskrift
-
Beredning av prover och behandling med calcein AM- och EthD-1-lösning
- Värm 1x PBS i ett vattenbad vid 37 °C.
- Bered analyslösningen genom att tillsätta 0,75 μL kalceinacetoxymetyl (calcein AM) och 3 μL ethidium homodimer (EthD-1) till 1,5 ml förvärmd PBS.
- Aspirera försiktigt alla media från chipet med en pipett.
- Tvätta cancerkonstruktionen med förvärmd PBS. Fyll 1,5 ml PBS i chippet med en pipett och låt det stå i 10 minuter vid rumstemperatur. För att undvika deformation av cancerkonstruktionen, introducera 1x PBS från ena sidan av spånorna och luta spånorna så att 1x PBS kan flöda.
- Aspirera PBS från chipet; behandla 1,5 ml-analyslösningen och inkubera chipet vid 37 °C i 20 minuter med en folie för att skydda mot ljus. Använd en pipett för att aspirera 1x PBS; Använd inte en sugpump.
-
Avbildning av cellens livskraft med hjälp av ett fluorescensmikroskop
- Visa och fånga de märkta cellerna med hjälp av ett fluorescensmikroskop (Figur 4C).
OBS: Calcein AM markerar levande celler med grön fluorescens (våglängd ~488 nm). EthD-1 representerar signalen av döda celler med röd fluorescens (våglängd ~594 nm). - Räkna antalet levande och döda celler med hjälp av bildprogram, ett bildbehandlingsprogram med öppen källkod och beräkna livskraften med siffrorna .
- Visa och fånga de märkta cellerna med hjälp av ett fluorescensmikroskop (Figur 4C).
8. Immunofluorescens för att validera bildandet av central hypoxi och dess effekt på cancer malignitet
-
Fixering, permeabilisering och blockering av cancerkonstruktionen
- Förbered 1x PBS, 4% paraformaldehyd (PFA), 0,1% (v/v) Triton X-100 och 2% (w/v) bovin serumalbumin (BSA) vid rumstemperatur.
- Aspirera försiktigt alla media från chipet med en pipett och skölj chipet tre gånger med 1x PBS. För att undvika deformation av cancerkonstruktionen, introducera 1x PBS från ena sidan av spånorna och luta spånorna så att 1x PBS kan flöda. Mellan varje tvättsteg, låt chipet stå med 1x PBS i 5 minuter för att ta bort restlösningar.
OBS: 1x PBS aspirerades med en pipett, inte en tryckpump. - Tillsätt 500 μL 4% PFA till cancerkonstruktionen på chipet med en pipett; lämna den i 15 min och tvätta tre gånger med 1x PBS för att fixa cellerna i cancerkonstruktionen.
- Behandla cancerkonstruktion med 500 μL på 0,1% Triton X-100 med en pipett vid rumstemperatur i 5 min och tvätta tre gånger med 1x PBS för att lösliga och permeabilisera cellmembranet.
- Behandla cancerkonstruktion med 500 μL 2% BSA med en pipett vid rumstemperatur i 1 timme för att blockera reaktiva epitoper.
OBS: Täck chipet med paraffinfilm för att förhindra avdunstning. - Efter 1 h, tvätta chipet tre gånger med 1x PBS.
-
Behandling med primär antikropp, sekundär antikropp och DAPI och avbildning av strukturen med hjälp av ett konfokalt mikroskop.
- Förbered isotypkontrollantikroppar och cocktail av primära antikroppar genom att späda ut antikropparna i 1x PBS till varje önskad arbetskoncentration.
OBS: De specifika detaljerna för antikropparna anges i materialförteckningen. Samma arbetskoncentrationer av isotypkontrollantikroppar som de primära antikropparna bör användas. - Aspirera försiktigt alla 1x PBS från chipet med en pipett och behandla chipet med 200 μL primär antikroppslösning vid 4 °C över natten. Täck spånorna med paraffinfilm för att förhindra avdunstning.
- Aspirera den primära antikroppslösningen och tvätta chipet tre gånger med 1x PBS.
- Späd ut sekundära antikroppar och DAPI i 1x PBS till önskad arbetskoncentration.
OBS: En grön fluorescenskonjugerad sekundär antikropp används i detta fall vid ett förhållande av 1:200. DAPI användes vid ett förhållande av 1:1000. - Aspirera försiktigt alla 1x PBS från chipet med en pipett och behandla chipet med 200 μL sekundär antikropp-DAPI-lösning vid 4 °C i 3 timmar. Täck chipet med paraffinfilm för att förhindra avdunstning och linda det sedan med aluminiumfolie för att förhindra fotografering.
- Aspirera den sekundära antikropp-DAPI-lösningen och tvätta chipet tre gånger med 1x PBS.
- Efter avslutad färgning steg, överför cancer konstruktionen till en confocal maträtt genom att försiktigt greppa med tång.
- Visualisera och fånga de märkta cellerna med hjälp av ett konfokalt mikroskop (figur 5).
OBS: Våglängden för det konfokala mikroskopet justerades, beroende på typen av fluorescerande markörer. De specifika detaljerna för antikropparna anges i materialförteckningen. För att effektivt upptäcka cellpositionen skulle det vara bättre att först observera de DAPI-färgade kärnorna i konstruktionen. Detektion excitation/emission våglängder av fluorescerande signaler var 358/461 nm (DAPI, Blå), 494/517 nm (grön) och 590/617 nm (röd). Förstoringarna var 4x, 10x och 20x, justerade från den lägsta till den högsta.
- Förbered isotypkontrollantikroppar och cocktail av primära antikroppar genom att späda ut antikropparna i 1x PBS till varje önskad arbetskoncentration.
9. Statistisk analys
-
Cellräkning med bildbehandlingsprogram
- Kör ett bildbehandlingsprogram för att räkna antalet levande och döda celler.
- Öppna de fluorescerande bildfilerna. Klicka på | Öppna och importera TIFF-bilderna.
- Konvertera bilderna till 16-bitars gråskalebilder. Klicka på Bild | Skriv | 16-bitars gråskala.
- Justera tröskelvärdet genom att klicka på Bild | Justera | Tröskelvärde och välj sedan färgen på de celler som ska vara svarta.
- Klipp isär sammanfogade celler genom att klicka på Process | Binär | Vattendelare för exakt cellräkning.
- Räkna antalet celler genom att klicka på Analysera och sedan på Analysera partiklar tre gånger. beräkna medelvärdet och presentera data som medelvärdet ± standardfel.
OBS: Immunofluorescence markörer analyserades genom att jämföra fluorescens intensiteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hypoxisk cancer-på-ett-chip utvecklades med hjälp av datorstödd 3D-cellutskriftsteknik för att rekapitulera hypoxi och cancerrelaterad patologi (Figur 1). Syretransport och konsumtion simulerades med hjälp av 3D-geometrimodellen. Chippet designades i form av koncentriska ringar för att efterlikna den radiella syrediffusionen och utarmningen i cancervävnader (figur 2A). Efter att ha definierat kontrollvolymen i ett utrymme där syre diffuserades och konsumerades av celler, bestämdes en lämplig cellulär densitet för central hypoxigenerering genom beräkningsfinitelementanalys (Figur 2B, C).
En 3D-utskriftsvägskod för hypoxisk cancer-på-ett-chip genererades baserat på tidigare resultat (figur 3). CAD-filerna i offer PEVA mögel och cancer konstruktioner omvandlades till STL filformat (Figur 3A, B). Utskriftssökvägen kodades och överfördes till multiutskriftssystemet med hjälp av ett internt program (figur 3C).
En hypoxic cancer-på-ett-chip tillverkades med hjälp av 3D cell-utskrift teknik. För att rekapitulera den fasta cancerens strukturella, biokemiska och biofysiska heterogenitet fastställdes en stegvis tillverkningsprocess för cancerkonstruktionen och den gaspermeabla barriären, vilket är det enda sättet på vilket syre kan tränga in i systemet (figur 4A). En fackindelad cancer-stroma koncentrisk-ring struktur skapades för att reproducera de anatomiska funktionerna i den fasta cancern (Figur 4B). Cancervävnadens heterogena geometri realiserades in vitro med hjälp av 3D-celltryckstekniken. Cellens livskraft utvärderades efter utskrift för att bekräfta den kemiska och mekaniska belastningen under tillverkningsprocessen. Förhållandet mellan de grönfärgade levande cellerna var betydligt högre än för de rödfärgade döda cellerna. Kvantitativt var cellens livskraft efter utskrift mer än 96,92 % ± 2,46 % (figur 4C). Detta resultat bekräftar att tillverkningsförhållandena var lämpliga för cancerceller och stromal celler.
Två grupper jämfördes beroende på förekomsten (GR + )ochfrånvaron (GR-) av syregradienten för att kontrollera effekterna av den hypoxiska lutningen på cancerprogression (figur 5A). Under båda villkoren fanns mogna CD31+ endotelceller i de perifera regionerna, som anges att rumsligt mönstrade levande konstruktion producerades med hjälp av 3D bioprinting teknik. Jämfört med GR- villkoret visade GR+ villkoret en hypoxic gradient, som anger det gradvisa uttrycket av HIF1α (Figur 5B), där SHMT2+ pseudopalisading celler och SOX2+ pluripotenta celler observerades, som representerade den aggressiva patofysiologiska funktionen hos fast cancer (Figur 5C). De patologiska funktionerna i glioblastom rekapitulerades under det konstruerade hypoxiska tillståndet15.
Figur 1: Ett schema över utvecklingen av hypoxisk cancer-på-ett-chip. Denna siffra har ändrats från Nature biomedicinsk teknik15 (Copyright, 2019). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Beräkningssimulering av bildandet av syregradient på hypoxisk cancerpå ett chip. B)Ett schema som anger regionen för syrefördelningsanalys. Denna siffra har ändrats från Nature biomedicinsk teknik15 (Copyright, 2019). (C) En jetfärgkartabild av syrefördelningsprofilen. Denna siffra har ändrats från Nature biomedicinsk teknik15 (Copyright, 2019). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Generering av 3D-utskriftsvägskod för hyxisk cancer på ett chip. (B) En bild av offer PEVA mögel i STL filformat. C)En G-kod för offer PEVA mögel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:3D-cellutskrift av hypoxisk cancer-på-ett-chip. (A) Ett schema över tillverkningsprocessen för hypoxisk cancer-på-ett-chip. B)En tryckt hypoxisk cancer-på-ett-chip och fackindela struktur av cancer-stroma koncentriska ringar. skalstänger representerar 200 μm. (C) En fluorescensbild av den 3D-cellstryckta cancerkonstruktionen för utvärdering av livskraft. skalstänger representerar 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Generering av hypoxisk gradient och utvärdering avpatologiska egenskaper hos konstruerad fast cancer. B)Representativa immunostainingbilder av generering av syregradient med HIF1α. skalstänger representerar 200 μm. (C) Representativa immunostainingbilder av patologiska egenskaper hos hypoxisk cancer med SHMT2, SOX2 och CD31; skalstänger representerar 200 μm. Denna siffra har ändrats från Nature biomedicinsk teknik15 (Copyright, 2019). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskriver vi tillverkningsprocessen för en hypoxisk cancer-på-ett-chip baserad på 3D-celltrycksteknik. Bildandet av hypoxic gradienten i det utformade chipet förutspåddes genom datorsimuleringar. Miljön som kan inducera en heterogen hypoxic gradient reproducerades via en enkel strategi som kombinerar den 3D-printade gas-permeable barriären och glas locket. Hypoxi-relaterade patologiska funktioner i glioblastom, inklusive pseudopalisade och en liten population av cancer stamceller, recapitulated under hypoxic gradient villkor för chipet.
För att förbättra produktiviteten och repeterbarheten ändrades två viktiga tillverkningssteg sekventiellt jämfört med den tidigare publicerade modellen15. För det första producerades en PDMS-barriär indirekt för att övervinna den dåliga utskrivbarheten hos PDMS som innehåller ett härdningsmedel, som botas i realtid snarare än genom en direkt utskriftsmetod i ett steg. Därför anpassades biokompatiberbar PEVA med högre utskrivbarhet för att tillverka offerformen och PDMS tillsattes för att skapa den gaspermeabla barriären. För det andra ändrades typen av glidglas till ett hydrofilt belagd glidglas, vilket är gynnsamt för att stödja bioinkdeposition och formåtergivning. Slutligen möjliggjordes byggandet av de medelstora reservoarerna i båda ändarna av det spåneffektiva mediumutbytet.
Kritiska faktorer i varje tillverkningssteg av hypoxisk cancer-på-ett-chip via 3D bioprinting bör kontrolleras försiktigt. Under gjutning bör höjden på PDMS vara större än offer PEVA-formen, annars blir chipet åtdragen med täckglaset löst, vilket har en negativ effekt på hypoxisk kärngenerering. Vid utskrift av kollagen, en termiskt känslig hydrogel, bör tryckhuvudets temperatur bibehållas vid 15 °C för att förhindra att munstycket täpps till på grund av ett övergångsfenomen med solgel. Om hydrogelen blir temporalt korslänkad kan det blockerade munstycket enkelt rengöras med ett högt pneumatiskt tryck och en skarp nål. Men om blockeringen är allvarlig bör hydrogelen förberedas igen. Dessutom bör cellutskriftsprocessen slutföras inom 1 timme, med tanke på cellens livskraft.
3D-bioprinting-tekniken underlättar konstruktionen av en hypoxisk cancer-på-ett-chip som kan användas för att studera den underliggande mekanismen för cancer och för att förutsäga den terapeutiska resistensen hos olika solida tumörer15. Särskilt användningen av extruderingsbaserad 3D-bioprintingteknik möjliggjorde snabb och repetitiv produktion med hög frihet. Dessutom gör reproducerbarheten och den snabba tidsramen för cancermodellering det möjligt för läkemedelsområdet att bygga upp en datauppsättning av läkemedelskombinationskandidater för cancerbehandling. Men på grund av teknikens begränsade upplösning produceras den tryckta hypoxic-cancer-on-a-chip i intervallet flera hundra mikrometer, vilket kräver stor mängd material. Dessutom är det svårt att utveckla hög genomströmningsplattform för läkemedelsscreening under utrymmesbegränsningarna20. Därför bör tekniken förbättras för att utveckla modeller som kan stödja flerparameterstudier med begränsade resurser och rumslig omfattning.
Den utvecklade hypoxic-cancer-on-a-chip kan tillämpas på vävnadsspecifik cancermodellering genom att använda vävnadsspecifika material, såsom en hydrogel som härrör från en decellulär extracellulär matris (ECM). Eftersom ecm:s biokemiska och fysiologiska variationer påverkar cellulära funktioner kan överlägsen emulering av många cancertyper med organspecifik cancermikromiljö realiseras21. Dessutom, genom att kombinera med andra konstruerade vävnadskonstruktioner, inklusive konstruerade blodkärl, som har kritiska effekter på cancerutveckling, kan dynamiska patofysiologiska förändringar i angiogena, immunogena och metastaserande egenskaper studeras. Dessutom kan personlig cancerbehandling uppnås med det utvecklade chipet genom att använda patientbaserade celler15. Att testa läkemedelskänsligheten före klinisk behandling skulle vara ett viktigt steg för att förbättra behandlingens effekt under processen att hitta en lämplig terapeutisk behandlingsregim för en enskild patient i tid. En patientspecifik cancermodell med patientledd källa förväntas förbättra patientprofilering för att förutsäga skillnader i patofysiologi och chemosensitivity hos varje patient. I den tidigare studien förutspåddes patientspecifika terapeutiska effekter mot olika läkemedelskombinationer inom en rimlig tidsram (1- 2 veckor) med hjälp av den 3D-printade hypoxiska cancer-på-ett-chip, vilket resulterar i relativt snabba slutsatser jämfört med andra metoder, vilket tyder på potentialen för den patientspecifika prekliniska modellen15.
Sammanfattningsvis är 3D-celltryck av cancer-på-ett-chip gynnsamt för att rekapitla en heterogen cancermikromiljö. Den påminda mikromiljön driver den patologiska progressionen av cancer, inklusive bildandet av en nekrotisk kärna som härrör från hypoxi. Detta protokoll kan tillämpas på testning av cancerläkemedel och patientspecifika cancermodeller. I detta avseende förväntar vi oss att detta mycket kontrollerbara tillvägagångssätt kan vara fördelaktigt för att bygga olika cancermodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Koreas nationella forskningsstiftelse (NRF) som finansierades av utbildningsministeriet (nr 2020R1A6A1A03047902 och NRF-2018H1A2A1062091) och Koreas regering (MSIT) (nr. NRF-2019R1C1C1009606 och NRF-2019R1A3A3005437).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22x50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation |
References
- Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).
- Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R.
- Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I.
- Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
- Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).
- Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
- Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
- Yi, H. -G., Lee, H., Cho, D. -W.
- Yi, H. -G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
- Kang, T. -Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
- Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
- Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
- Shim, J. -H., Lee, J. -S., Kim, J. Y., Cho, D. -W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).
- Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).
- Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).
