Summary
Vi beskriver ett protokoll för att omprogrammera mänskliga huden-härledda fibroblaster till inducerad neuronal stamceller (iNPC) och deras efterföljande differentiering till inducerad Astrocytes (IAs). Denna metod leder till snabb och reproducerbar generering av iNPC:er och iAs i stora mängder.
Abstract
Forskning om neurologiska sjukdomar fokuserar främst på neuroners inverkan på sjukdomsmekanismer. Begränsad tillgång till djurmodeller påverkar allvarligt studien av celltypsspecifika bidrag till sjukdom. Dessutom återspeglar djurmodeller vanligtvis inte variabilitet i mutationer och sjukdomskurser som ses hos mänskliga patienter. Omprogrammeringsmetoder för generering av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har revolutionerat patientspecifik forskning och skapat värdefulla verktyg för att studera sjukdomsmekanismer. IPSC-tekniken har dock nackdelar som tid, arbetsengagemang, klonurval selektivitet och förlust av epigenetiska markörer. De senaste ändringarna av dessa metoder möjliggör mer direkt generering av cellstammar eller specifika celltyper, kringgå klonurisolering eller ett pluripotent stamcellstillstånd. Vi har utvecklat en snabb direkt konverteringsmetod för att generera inducerade neuronala stamceller (iNPC) från hudfibroblaster som använder retrovirala vektorer i kombination med neuraliserande media. INPC:erna kan differentieras till nervceller (iNs) oligodendrocyter (iOs) och astrocyter (iAs). iAs produktion underlättar snabb testning av läkemedel och sjukdomsmekanismer eftersom differentiering från iNPC bara tar 5 dagar. Dessutom är iAs lätta att arbeta med och genereras i rena populationer i stort antal. Vi utvecklat en mycket reproducerbar co-culture analys med mus GFP + nervceller och patienten härledda iAs för att utvärdera potentiella terapeutiska strategier för många neurologiska och neurodegenerativa sjukdomar. Viktigt är att iA-analyserna är skalbara till 384-brunnsformat som underlättar utvärderingen av flera små molekyler i en platta. Detta tillvägagångssätt möjliggör samtidig terapeutisk utvärdering av flera patient cellinjer med olika genetisk bakgrund. Enkel produktion och lagring av iAs och kapacitet att screena flera föreningar i en analys gör denna metod anpassningsbar för personlig medicin.
Introduction
Att förstå underliggande sjukdomsmekanismer är avgörande för neurologiska sjukdomar eftersom det hjälper till att utveckla potentiella terapeutiska strategier. Medan djurmodeller historiskt har varit guldstandarden för att undersöka sjukdomar i nervsystemet, visar den direkta översättningen av potentiella terapier till en klinisk miljö ofta begränsad framgång1,2,3. Orsakerna till bristen på översättning är brist på variation av genetisk bakgrund och mutationer hos möss, ofullständig visning av sjukdom fenotyper och variation i läkemedelskänslighet eller dosering hos mänskliga patienter som inte avbildas väl i inavlade musstammar. Dessutom, för många sällsynta neurologiska störningar, finns inga eller få djurmodeller tillgängliga. Att studera sjukdomsmekanismer direkt i relevanta mänskliga celltyper kan underlätta forskning och förbättra översättningen till kliniken. För CNS-störningar är primära mänskliga celler svåra att hämta och representerar en mycket begränsad källa eftersom tarmbiopsier är invasiva eller endast kan hämtas efter döden i slutet av sjukdomen. Under de senaste 15 åren har utvecklingen av cellulär omprogrammeringsteknik snabbt utökat förmågan att modellera mänskliga neurologiska och neurodegenerativa sjukdomar in vitro.
Traditionella metoder för cellomprogrammering innebär omprogrammering av fibroblaster eller andra celltyper till inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som kan differentieras till celltyper från alla trebakterieskikten 4. Takahashi och Yamanaka var de första som visade att återuttryck av fyra stamcellsutskriftsfaktorer är tillräckligt för att omdirigera somatiska celler för att bli iPSCs5. iPSCs kan sedan differentieras ytterligare till specifika celltyper. Nackdelen med denna process är dock att det är arbetsintensivt och tidskrävande att generera och isolera stabila stamcellskloner. Somatiska mutationer eller specifika avvikelser i modercellen upprätthålls också i stamcellsklonen och kan påverka resultaten av studien6. Dessutom tyder ökande bevis på att omprogrammeringsprocessen till stamceller raderar värdefulla epigenetiska förändringar som kan påverka cellulärasjukdomsmekanismer 4,7,8. Under de senaste åren fokuserade forskarna på modifierade omprogrammeringsmetoder som möjliggör en mer direkt generation av olika celltyper samtidigt som de kringgår det pluripotenta stamcellstillståndet9,10,11,12 (granskat i 13,14). De första genombrotten visade in vitro kombinatoriska omprogrammering av fibroblaster till kardiomyocyter15,nervceller16 och hepatocyter17 genom utomkvedshavandeskap av flera härstamning-specifika transkription faktorer eller microRNAs18. Detta följdes av studier som direkt omprogrammerar celler för att modelleraneurologiska störningar 19,20. Som nämnts ovan har sådana direkt omprogrammerings- eller konverteringsprotokoll potentiella fördelar jämfört med klassiska iPSC-protokoll, inklusive hastighet och ablation av klonisoleringssteget. Dessutom tyder bevis på att dessa protokoll gör det möjligt att upprätthålla en större mängd epigenetisk information relaterad till patientens ålder och sannolikt gäller samma sak för sjukdomsrelevantamarkörer 7,8.
Hittills har de flesta in vitro-forskning om neurologiska sjukdomar främst fokuserats på nervceller. Det är dock välkänt att andra celltyper som astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter spelar en avgörande roll i sjukdomspatologi och progression av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD), amyotrofisk lateral skleros (ALS), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD), multipel skleros (MS) och andra neurologiska patologier som Rett syndrom (RTT), sömnstörningar, missbruk, epilepsi, lysosomal lagringsstörningar, depression, migrän och patologisksmärta 21,22,23,24,25,26. Astrocyter är den vanligaste celltypen i centrala nervsystemet (CNS) och fram till nyligen har de i stort sett försummats ur patologisksynvinkel 7. De är nu kända för att ha en kritisk roll i att stödja nästan alla homeostatiska funktioner i friska CNS. Dessutom är det uppenbart att de har en viktig patologisk inverkan och är mycket värdefulla för att förstå sjukdomsmekanismen och utvärdera terapeutiska strategier19.
I den aktuella beskrivningen beskriver vi ett protokoll för direkt omvandling av mänskliga patienten fibroblaster till inducerad neuronal stamceller (iNPCs) med retrovirala vektorer som uttrycker Yamanaka omprogrammering faktorer (Klf4, Oct3/4, Sox2 och c-Myc) och efterföljande exponering för neuraliserande medier. Tidigare studier har använt olika kombinationer av transkriptionella faktorer för direkt omprogrammering till neurala celler (ses över 14), men de faktorer som används i det beskrivna protokollet är i stort sett tillgängliga antingen som plasmider för in husproduktion av virusvektorer, eller som kommersiellt tillgängliga redo att gå virala omprogrammeringssatser. De resulterande iNPC: erna kan differentieras ytterligare till inducerade nervceller (iNs)27, oligodendrocyter (iOs)24 och astrocyter (iAS)19 för att studera deras roll i neurologiska sjukdomar. Vårt protokoll innebär inte tidskrävande generering av iPSCs som de flesta tillgängliga protokoll använder för härledning av mänskliga astrocyter28. Cirka 98% till 100% av direkt omprogrammerade iNPC kan skilja sig åt i GFAP-positiva astrocyter29 jämfört med endast 2% med direkt konverteringsmetod från fibroblaster till astrocyter30. Nyligen har en jämförande transkriptomisk studie med vår beskrivna omprogrammeringsmetod visat att iNPC omprogrammerade från donatorfibroblaster kan behålla åldrande funktioner på transkriptionell och funktionell nivå som liknar ålder matchade postmortem astrocyter och primära astrocyter29. Således är detta omvandlingsprotokoll ett kraftfullt verktyg för att undersöka sjukdomsmekanismer och utvärdera nya terapeutiska metoder för åldersrelaterade neurodegenerativa och neurologiska störningar.
Här beskriver vi protokollet som används för att generera iNPC: er och ytterligare differentiering i iAs, som är de mest lämpade för småskaliga små molekylära screening analyser. Sjukdomsmekanismer och drogtester med iAs kan göras med olika metoder såsom samkulturer med nervceller eller metabolisk och biokemisk analys. Fördelen med detta system är hastigheten och enkel underhåll av dessa cellinjer jämfört med iPSCs. Dessutom kan iNPC:er frysas i små portioner för differentiering av iAs, vilket underlättar läkemedelstester under konstanta förhållanden under längre tidsperioder. Sammantaget blir jämförelse av större provnummer möjlig på detta sätt vilket öppnar dörren för att utvärdera terapeutisk potential hos föreningar i en större och mer representativ patientpopulation.
Protocol
| media | reagens | Belopp att blanda | Slutlig koncentration (%) |
| Fibroblast media | DMEM, hög glukos, GlutaMAX | 500 ml | 89 |
| Fetala nötkreatur serum | 50 ml | 10 | |
| Antibiotiska-antimykotiska | 5 ml | 1 | |
| Basmedier | DMEM/F12 + Glutamax | 500 ml | 97 |
| N-2 (på 2) | 5 ml | 1 | |
| B-27 (på 1997) | 5 ml | 1 | |
| Antibiotiska-antimykotiska | 5 ml | 1 | |
| Konverteringsmedier | Basmedier | 50 ml | 99.9 |
| FGF (FGF) | 1 μL | 0,02 (20 ng/ml) | |
| Fonden för globaliseringsfonden | 1 μL | 0,02 (20 ng/ml) | |
| heparin | 50 μL | 0,1 (5 μg/ml) | |
| NPC-media (Neural Progenitor Cell) | DMEM/F12 + Glutamax | 500 ml | 96.9 |
| N-2 (på 2) | 5 ml | 1 | |
| B-27 (på 1997) | 5 ml | 1 | |
| Antibiotiska-antimykotiska | 5 ml | 1 | |
| FGF (FGF) | 10 uL | 0.002 | |
| Astrocyt Media | DMEM, hög glukos, GlutaMAX | 500 ml | 89 |
| Fetala nötkreatur serum | 50 ml | 10 | |
| Antibiotiska-antimykotiska | 5 ml | 1 | |
| N-2 (på 2) | 1 ml | 0.2 | |
| Media måste filtreras efter blandning av alla komponenter. Konverteringsmedia (med faktorer) måste förberedas fräscht varje vecka. | |||
Tabell 1. Medierecept för alla celltyper som ingår i protokollet. Media bör filtreras efter att alla komponenter har blandats med antingen ett sterilt vakuumfiltreringssystem för stora volymer eller spruta och 0,2 um sprutfilter. Konverteringsmedia (med faktorer) måste förberedas fräscht varje vecka.
1. Direkt omvandling av vuxna mänskliga fibroblaster till neuronala stamceller
OBS: En schematisk tidslinje för detta protokoll kan ses över i Meyer (2014)19.
- Använd primära fibroblaster för mänsklig hud som kan erhållas från cellbanker eller hudbiopsier31. Odlingsceller vid 37 °C i en 5% CO 2 vävnadskulturinkubator. Passageceller för minst 1-2 passager efter upptining före användning i experimentet. När cellerna är klara, täck en brunn av en 6-brunnsplatta med mänsklig fibronektin (1:200 utspädd i PBS) vid rumstemperatur i 15-20 min.
- När cellerna är redo att pläteras, ta bort fibronectin från skålen och tillsätt omedelbart celllösning eller 2 ml fibroblastmedel (tabell 1) - låt inte skålen torka ut innan du lägger till media. Beroende på hur snabbt cellerna växer, plätera 150.000 (fasta växande) - 200.000 (långsamt växande) fibroblaster i två brunnar av en människa fibronectin belagt 6-brunn pläterar varje.
OBS: Cellerna ska vara cirka 70% konfluenta för virustransduktion för att kunna hålla dem i samma platta i flera dagar efter transduktion. Det kan vara fördelaktigt att så vid två olika densiteter för att ha ett val nästa dag för konvertering. - Dagen efter sådd, kontrollera fibroblasterna under mikroskopet och verifiera celltätheten (mellan 70-85%) och även sådd genom brunnen för optimala resultat.
- Transducera en brunn med alla fyra retrovirala vektorer (Okt3/4, Klf4, Sox2 och c-Myc) - använd en multiplicitet av infektion (MOI) på 10 för snabbväxande eller 15 för långsamt växande fibroblaster (transduktionseffektivitet bör överstiga 70% eller fler positiva celler för varje vektor). Tillsätt vanlig fibroblastmedel till viral blandning till en total volym på 1 ml per brunn och inkubera över natten vid 37 °C i en 5% CO2 vävnadskulturinkubator. Lämna den andra brunnen obehandlad och returnera celler till vävnadskulturinkubatorn.
OBS: Retrovirala vektorer kan köpas av en leverantör eller göras internt, protokoll finns tillgängliga online32. - Dagen efter transduktion, tvätta cellerna 1x med PBS och tillsätt 1 ml färskt fibroblastmedium.
- Nästa dag, ändra medium till konverteringsmedium. Tvätta celler 1x med PBS för att bli av med restfibroblastmediet och tillsätt sedan 1 ml konverteringsmedium. Ändra media av den obehandlade brunnen till konverteringsmedier också.
OBS: Vissa morfologiska förändringar kan observeras även genom att ändra media på fibroblasterna som inte fick retroviral vektorbehandling, vilket innebär att en obehandlad brunn (valfritt) kommer att vara till hjälp vid bestämning av effekterna av virusvektorerna. Celler bör börja ändra morfologi 2-4 dagar efter byte till konverteringsmedia. - Observera celler under mikroskopet och se efter förändringar i morfologin (figur 1). Cellmedier bör bytas ut dagligen under hela konverteringsprocessen (1-2 ml konverteringsmedier, tabell 1) och för efterföljande iNPC-kultur. Byt medium genom att försiktigt ta bort 70% av mediet från brunnen samtidigt som du ser till att cellerna förblir täckta av de återstående 30% av mediet.
OBS: Media med tillväxtfaktorer i det måste konsumeras inom 1 vecka efter förberedelse.- Fortsätt att observera celler och ändra media dagligen (1-2 ml konverteringsmedia).
- Vissa cellinjer börjar bilda lösa förhöjda runda formationer som växer i bollliknande strukturer eller lösa neuronalasfärer (kompletterande figur 1 och 19,33). Var noga med att inte ta bort dessa celler. Om bollarna lossar kan de samlas in och pläteras om i en ny fibronectinbelagd brunn av en 6-brunnsplatta.
OBS: Om de utökas på egen hand kommer cellerna att ha minskad mångfald jämfört med den ursprungliga plattan och kan representera en tydligt annorlunda cellinje. Vi rekommenderar att du kombinerar dessa celler med resten av de konverterade cellerna vid nästa delningsrunda.
- Efter ca 5-6 dagar i konverteringsmedier (upp till 12 dagar för svåra cellinjer) eller när cellerna blir mycket täta, passage dem 1:2 eller högst 1:3.
OBS: Det är mycket viktigt att hålla cellerna med hög densitet under hela konverteringsprocessen.
2. Omvandlings- och iNPC-delningsförfarande
- Värm upp cellavlossningslösning (t.ex. Accutase) och täck ett lämpligt antal brunnar med en 6-brunn med fibronectin (1:200 i PBS, 1 ml beläggningsvolym) i 15-20 min vid rumstemperatur. Fibronectinbeläggningen kan vara längre utan negativ påverkan, men var noga med att inte förkorta beläggningstiden.
- Tvätta cellerna noggrant med PBS utan att ta bort några celler (använd brunnens vägg för att applicera PBS försiktigt på cellerna). Ta försiktigt bort PBS med pipetter eller genom aspiration.
- Tillsätt 0,5 ml cellavlossningslösning och inkubera 2-3 min vid 37 °C i en inkubator för vävnadskultur. Kontrollera under mikroskopet att de flesta celler har lossnat. Om alla celler har lossnat, tillsätt 2 ml färskt konverteringsmedier och försiktigt pipett upp och ner 2-3 gånger för att skilja klumpar (om det behövs).
- Samla cellerna i ett 15 ml-rör och tillsätt ytterligare 3 ml media för att ytterligare späda ut cellavlossningslösningen. Tvätta brunnen med extra media först för att säkerställa att alla celler har samlats in.
- Centrifugera i 4 min vid 200 x g vid rumstemperatur.
OBS: Konvertering av celler eller iNPC:er är extremt känsliga för förekomsten av cellavlossningslösning i mediet. Det är absolut nödvändigt att ta bort restenzymet genom centrifugation och tillbakadragande av supernatant. - Ta bort supernatant från cellpellet och återanvänd cellerna i 1 ml färskt medium. Rörett upp och ner 2-3 gånger för att lösa cellklumpar. Ta bort fibronectin från belagda 6-brunnar och tillsätt omedelbart 1 ml färskt medium till varje brunn (låt inte fibronectin torka). För ett delat förhållande på 1:2, tillsätt 0,5 ml av cellfjädringen i en brunn och den andra 0,5 ml i en andra brunn.
- Odlingsceller vid 37 °C i en inkubator för vävnadskultur.
- Fördela cellerna genom att försiktigt skaka 6-brunnen i nord-syd-syd-västlig riktning (inte cirkulär) och sätt i vävnadskulturinkubator.
- Observera cellerna under mikroskopet nästa dag och byt media (1-2 ml). Ändra media varje dag tills cellerna är redo att delas igen.
OBS: Vid denna tidpunkt bör cellproliferationen börja accelerera, och cellerna bör vara redo för en andra delning inom 2-3 dagar (4 dagar för mycket långsamma växande linjer).- Vid denna nya delning, kärna ur en brunn av celler i konverteringsmedier och den andra brunnen i NPC-media som endast innehåller FGF vid ökad koncentration utan EGF/heparin (Tabell 1).
Vissa cellinjer når ett stillastående tillstånd i konverteringsmedier efter cirka 10 dagar och att byta till NPC-media kan hjälpa till med celltillväxt. Dessutom har nödlidande lån en mer specifik, mindre form när de odlas i NPC media19. Vid denna tidpunkt är iNPC: erna redo för differentiering och vidare användning.
- Vid denna nya delning, kärna ur en brunn av celler i konverteringsmedier och den andra brunnen i NPC-media som endast innehåller FGF vid ökad koncentration utan EGF/heparin (Tabell 1).
- Fortsätt att byta media (1-2 ml) av iNPC:erna dagligen.
- Expandera NPC:er till 10 cm rätter genom att kombinera två eller tre sammanflödesbrunnar med en 6-brunn. Medievolymen för 10 cm rätter är vanligtvis 12-15 ml.
- Vid nästa delning, expandera ytterligare dessa celler till tre eller fyra 10 cm rätter (12-15 ml media) för generationer av stort antal cellbestånd. 10 cm rätter delas vanligtvis vid 1:3 eller 1:4 var 3-4 dagar beroende på spridningshastighet.
3. Generera inducerade astrocyter från nödlidande lån
- För att göra astrocyter av färska iNPCs, frö iNPC (i 10 cm fibronectinbelagda plattor) direkt i 10 ml astrocyt medium (tabell 1) så att de är cirka 10% confluency följande dag. Odlingsceller vid 37 °C i en 5% CO 2 vävnadskulturinkubator.
OBS: Den rekommenderade såddtätheten är vanligtvis 50 μL av cellresuspensionen för en 10 cm skål med NPC: er, förutsatt att de späds till en slutlig volym baserat på deras delningsförhållande (t.ex. 3 ml för en 1:3-delning, 4 ml för en 1:4-delning osv.). - Ändra medium (10 ml astrocyt media) av iAs tre dagar efter plätering. Håll cellerna differentierande i 5-7 dagar.
OBS: IAs tolererar inte flera passager väl, därför är det bättre att göra färska astrocyter varje gång du delar NPC: erna. - Om du vill dirigera för experiment delar du astrocyterna med trypsin- eller cellavlossningslösning enligt beskrivningen i steg 2.1-2.7. Rekommenderade såddtätheter ingår i tabell 2.
| Typ av plåt | Astrocyter per Brunn |
| 384-brunn | 2500 |
| 96-brunn | 10000 |
| 24-brunn | 40000 |
| 6-brunn | 150000 |
Tabell 2. Rekommenderad såddtäthet av iAs per plåtområde. Typiskt antal iAs sådd för att generera ett monoskikt på de vanligaste vävnadskulturplattorna.
4. Beredning och avfrostning av delar för differentiering av astrocyter från frysta NPC-lager (alternativ till steg 3)
OBS: Som ett alternativ till att upprätthålla iNPC i kulturen kan astrocyter också produceras direkt från ett fryst lager. För att göra det fryses iNPC: erna i mindre portioner. Tabell 3 visar föreslagna frys- och upptiningsvolymer för portioner som ska tinas upp till en 10 cm skål som innehåller 10 ml Astrocyt-media.
| Portionsstorlek | Cellfjädring (μL) | Frysmedier (μL) | Total volym (μL) | Avfrostningar till |
| 4x | 400 | 400 | 800 | Två 10 cm rätter |
| 2x | 200 | 200 | 400 | En 10 cm skål |
Tabell 3. Instruktioner om hur du delar iNPC för att generera iAs. Andel iNPC-suspension och frysmedia för att generera portioner. Observera att den slutliga DMSO-koncentrationen är 10% när cellfjädring blandas med frysande media.
- För att göra astrocyter från frysta iNPC-lager, ta bort portionsflaskan från vätskekvävetanken och tina snabbt vid 37 °C. Så snart cellerna tinas upp, pipettcellslösning i ett 15 ml-rör som innehåller 5 ml astrocytmedier.
- Centrifugera i 4 min vid 200 x g och rumstemperatur. Ta bort supernatanten och återanvänd i 1 ml färskt astrocytmedium.
- Tillsätt 9 ml färskt astrocytmedium till en fibronectinbelagd 10 cm skål och tillsätt 1 ml celllösning. Fördela försiktigt celler i nord-syd-öst-västlig rörelse. Odlingsceller vid 37 °C i en 5% CO 2 vävnadskulturinkubator.
Representative Results
Detta protokoll tillåter snabb och enkel generering av iNPC direkt från mänskliga hudfibroblaster med retrovirus som innehåller Yamanaka-faktorerna. Denna metod gör det möjligt att kringgå stamcellstillståndet och behovet av klonurvalet och därigenom undvika klonurvalet. Viktiga steg att tänka på medan celler genomgår konverteringsprocessen är fibroblastfrötätheten, media pH och att hålla cellerna vid optimalt sammanflöde. Exempel på optimal delning av sammanflöde och morfologiska förändringar under konverteringsprocessen finns i figur 1.
Figur 1. Representativa bilder av konverteringsprocessen efter att ha lagt till retroviral blandning av Yamanaka faktorer. Fibroblaster såddes och transduced tjugofyra timmar senare med Yamanaka faktorer. Två dagar efter virus (DPV), media ändrades till konverteringsmedia. Celler odlades i konverteringsmedia tills de var redo att passera (13 DPV). Celler såddes efter passage för att nå 80% sammanflöde följande dag (14 DPV). Efterföljande passager bibehöll denna densitet tills neuronala stamceller börjar snabbt dela sig. Skalbaren är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
När konverteringsprocessen är klar visar NPC:erna kraftigt nedsatt uttryck eller inget uttryck för fibroblastmarkörer och morfologi och uttrycker NPC-specifika cellmarkörer (figur 2). Dessutom kan de också användas för att generera olika cellinjer, som iNs, iOs och iAs.
Figur 2. Celler som genomgår konverteringsprocessen uttrycker cellspecifika markörer. Patienten fibroblaster (A), inducerad neuronal stamceller (iNPCs (B) och inducerad Astrocytes (IAs (C) celler såddes på glas täcklips i en 24 väl vävnad kultur behandlade plattan. Cellerna var immunstained för: fibroblast specifika cell markörer (A), Vimentin (grön) och TE7 (röd), iNPC specifika cell markör (B), Nestin (röd) och iAs cell markör (C) GFAP (lila) och iNPC markör Nestin (grön). Skalbaren är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Enligt vår erfarenhet är iAs i synnerhet mycket värdefulla för testning av läkemedels- och sjukdomsmekanismer eftersom de kan genereras i rena populationer (98% eller mer GFAP-positivaceller 29) vid reproducerbara stora antal. iAs kan skiljas från iNPC genom att ta en liten alikvot av celler under delning eller en tidigare frusen iNPC-del och direkt plätera i astrocytmedier. Viktiga överväganden under denna process är att bibehålla iNPC:ernas initiala såddtäthet låg (figur 3 och figur 4), eftersom en hög densitet har visat sig hindra differentieringsprocessen (figur 4) och ägna ytterligare uppmärksamhet åt mediepH, eftersom försurning kan aktivera även friska astrocyter.
Bild 3. Representativa bilder av iAs-genereringsprocessen från iNPC: er. iNPC:er sås i Astrocyt-media (tabell 1) med låg såddtäthet. En bra såddtäthet är ca 10% på den första dagen efter sådd (DPS) (vänster); Denna densitet kan dock justeras beroende på cellernas tillväxttakt. Typisk iAs morfologi kan observeras efter 5 DPS (mitten). I vissa fall kan avvikande astrocytmorfologi observeras, med långa, spikiga förlängningar. Denna förändring är ett tecken på astrocytaktivering och kan vara sekundär till sjukdomstillstånd eller felaktiga odlingstekniker (höger). Skalbaren är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. iNPC-såddtäthet påverkar iAs differentieringseffektivitet. Kontroll iNPC linjer såddes vid låg (A) och hög (B) densitet i Astrocyte media för att påvisa effekter av sådd densitet på differentiering. 5 DPS, lågdensitetslinjen uttryckte astrocytspecifika markörer, medan högdensitetslinjen visar en blandning av iNPC- och iAs-markörer med en markerad iNPC-liknande morfologi. Skalbaren är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1. Ytterligare siffror av konverteringsprocessen efter att ha lagt till den retrovirala blandningen av Yamanaka-faktorer. Bilder av konverteringsprocessen vid 12 DPV (1 dag före passage) och 19 DPV (6 dagar efter passage). Observera skillnaden på morfologi mellan celler före och efter passage, vid 12 DPV-celler har en bollliknande strukturmorfologi. Efter en passage och flera dagar på konverteringsmedier (tabell 1) börjar celler visa en NPC-liknande morfologi. Skalbar är 200 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Sammanfattningsvis är den direkta omvandlingen en snabb och enkel metod för att generera inducerade neuronala stamceller från patientens hudfibroblaster. Denna metod är fördelaktig på grund av dess hastighet samt det stora antalet celler som genereras som är lätta att underhålla. Dessutom tyder ökande bevis på att direkta omprogrammeringsmetoder tar bort mindre epigenetiska märken jämfört med klassisk iPSC-omprogrammeringsteknik, vilket gör sjukdomsmiljönmer intakt 4,7,8. Differentiering av iNPC till astrocyter är mycket rakt fram och mycket reproducerbar även mellan flera oberoendelaboratorier 19,29,33. iNPC:er kan frysas i små portioner och tinas direkt för differentieringsändamål, vilket bidrar till att minska variationen mellan experiment eftersom passagenummer kan hållas likartade. Astrocyter spelar en avgörande roll i sjukdomsprogression i många neurologiska sjukdomar och är därför en intressant celltyp att arbeta med. Astrocyterna kan användas för mekanistiska studier, metaboliska studier eller drogtestningsanalyser och odlas vanligtvis som monoskikt. Dessutom kan astrocyter kombineras i samkultursystem med mus eller mänskliga nervceller för att bedöma astrocyternas inverkan på neuronal överlevnad och morfologi, som båda är bra avläsningar fördrogtestning 34.
För att kunna använda detta protokoll måste några punkter och potentiella begränsningar hållas i åtanke. Den mänskliga huden fibroblaster till exempel varierar kraftigt i deras celldelningshastighet samt svar på virusvektorer. Eftersom dessa inte är standardiserade cellinjer är de lika varierande som mänskligheten själv, varje rad är annorlunda. När det gäller många omprogrammeringsmetoder är det lättare att omprogrammera fibroblaster som har en måttlig till snabb celldelningshastighet jämfört med celler som knappt replikerar. Replikeringshastigheten kan påverkas av hudens biopsikvalitet och bearbetning i sig, genom passagenumret för fibroblasterna samt hanteringen. När du arbetar med primära hudfibroblaster är det viktigt att inte låta cellerna bli för täta för att undvika induktion av senescens. Om fibroblasterna inte växer bra är det bäst att prova ett nytt lager eller en lägre passage, även om sjukdomen i vissa fall också kan spela en roll. Celldelning kan ibland förbättras genom att använda 15% eller 20% FBS i fibroblastmedierna jämfört med standard 10%.
Kvaliteten på omprogrammering av virusvektorer är av stor betydelse för framgång. I våra händer var retrovirala vektorer effektivare jämfört med lentivirala vektorer eller andra icke-integrerande virus; Detta kan dock vara beroende av den virala vektorkvaliteten och renheten. Kommersiella retrovirala vektorsatser anger vanligtvis virusvektorkoncentrationen och ofta också en multiplicitet av infektion för en viss cellinje. Det är viktigt att komma ihåg att primära fibroblaster skiljer sig från den cellinje som används av företagen för att bestämma viral vektorupptag. Dessutom är variation mellan partier vanligt även vid beställning av samma kommersiella kit. Dessutom varierar upptaget av virusvektorer också mellan fibroblast cellinjer. Vissa linjer kan vara känsligare och därför kan transduced celler dö, medan andra cellinjer kan vara mer resistenta mot viralt upptag. Att bestämma omlastningseffektiviteten för en viss cellinje kan därför vara viktigt, särskilt om cellinjen växer långsamt eller tidigare konverteringsförsök misslyckades. I våra händer är det bästa sättet att utvärdera hur mycket av en specifik retroviral vektor som behövs för konvertering att utföra en immunofluorescerande färgning med flera utspädningar av virusvektorn. Antalet celler som uttrycker transgenen för varje vektor kan sedan räknas, med målet att en transduktionseffektivitet på 70% eller högre. Enligt vår erfarenhet kan liknande MOIs användas för de flesta cellinjer men MOI kan justeras om det behövs.
Under konverteringsprocessen är det viktigt att inte dela cellerna för tidigt. Tiden tills cellerna är redo att delas beror på flera faktorer, inklusive den primära cellinjen och dess egenskaper, kvaliteten på den virusvektor som används och mediekvaliteten. Viktigt är att konverteringens framgångsgrad är mycket högre när cellerna hålls med hög densitet. Även om cellerna börjar ändra morfologi är det bättre att lämna cellerna i den första brunnen längre än att dela dem i förtid. Om delningen sker för tidigt kan omvandlingen stoppas i dess framsteg och leda cellerna att skilja tillbaka till fibroblastliknande form och beteende. Dessutom kan utspädning av dem för tidigt resultera i mer långsträckta cellkroppar jämfört med de små och kompakta cellkropparna i de NPC som observerats tidigare. Således bör de första uppdelningarna alltid vara konservativa; det är bättre att hålla cellerna för täta med en 1:1 eller 1:2 split jämfört med att späda ut dem för mycket. En del celldöd förväntas efter den första delningen. Observera att cellerna alltid ser värre ut (plattare) den första dagen efter delning, vilket är normalt. Bästa bedömningar av cellform bör göras 2-3 dagar senare. Viktigt är att kvaliteten på tillväxtfaktorerna och mediekomponenterna också är avgörande. Det är viktigt att förbereda små mängder media som innehåller tillväxtfaktorer så att de fullt förberedda medierna endast kommer att användas i högst 5-7 dagar. Förvara inte media i rumstemperatur eller 37°C under längre tidsperioder. Använd snabbt och kyl så snart mediebytet utförs. Dessutom kan det hjälpa särskilt för cellinjer som är mer resistenta mot konvertering att hålla medievolymen låg vid 1 ml istället för 2 ml. Om cellerna förbrukar mediet snabbt, vilket kan observeras genom en förändring i mediefärgformen röd till gul (försurningshastighet), justera mediets volym till upp till 2 ml. Snabb mediekonsumtion är ett positivt tecken och observeras ofta i senare stadier av konverteringen tillsammans med ökad spridning.
Nödlidande lån är också mycket känsliga för förekomsten av accutas i medierna, och det är mycket viktigt att hålla inkubationstiden för accutas kort. Vi rekommenderar en inkubationstid på 2-4 minuter, kontrollera celler ofta under mikroskopet för att se när de har lossnat. Det är viktigt att centrifuga cellerna efter delning för att ta bort enzymblandningen från mediet. Det är också viktigt att hålla passagenumret i åtanke eftersom cellinjer kan ändras vid utökad odling som leder till förändring av uttrycksprofiler. Således är det viktigt att frysa många celllager vid tidiga passager. Cellerna ska frysas i 10% DMSO och 90% NPC-media och lagras långsiktigt i flytande kväve. På grund av bristen på serum i detta medium är det viktigt att säkerställa en långsam frysning med fryskammare och när den har frusit över natten, överför omedelbart till flytande kväve. Även om inget klonurvalet utförs i detta protokoll, är det möjligt att utökad odling och passaging leder till naturligt urval av en initial cellpopulation med gynnsam tillväxt och överlevnad. Därför är det viktigt att hålla passagenummer och hantering i åtanke när du utför experiment. Vi föredrar att använda lägre passager för experiment, om möjligt överskrider vi inte passande cellinjerna mer än 20 gånger. Eftersom nödlidande lån växer snabbt kan ett stort antal lager frysas vid lägre passager för experiment. Cellinjer med särskilt hög tillväxttakt har högre risk för medieförsurning. I takt med att cellinjerna växer med olika hastighet kan mängden media behöva justeras baserat på spridning. Om cellerna kontinuerligt lämnas i mycket surgjorda medier kan det påverka hälsan hos både kontroll- och sjukdomscelllinjer. Detta orsakar även friska astrocyter att bli reaktiva, vilket påverkar deras användning i ytterligare differentiering och experiment.
För astrocyt differentiering är det viktigt att hålla cellerna med låg densitet eftersom hög densitet kommer att förhindra att cellerna differentierar och de kommer att fortsätta att sprida sig i högre takt. Således måste såddtätheten justeras för varje cellinje som är beroende av deras spridningshastighet. Vi rekommenderar att du provar olika såddtätheter och utför färgningar/RT-PCR med astrocytmarkörer för att säkerställa korrekt differentiering. IAs kvalitet kan bedömas tillsammans med friska kontroller med hjälp av co-culture analyser med nervceller. Förutsatt att sjukdom patologi inte leder till en reaktiv fenotyp, nervceller bör förbli livskraftiga i kontakt med iAs i flera dagar. Astrocyt morfologi kan variera kraftigt mellan enskilda cellinjer och kan påverkas av sjukdomen fenotyp samt. Dessutom, i sjukdomar där astrocyter påverkas kraftigt, kan de visa en reaktiv fenotyp med stora, långsträckta förlängningar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla patienter och friska frivilliga för att de donerat kritiska prover till forskningsstudier. Dessutom tackar vi Rochelle Rodrigo för kontinuerlig teknisk hjälp inom vävnadskultur och Laura Ferraiuolo för att självständigt ha bekräftat tekniken i hennes labb som samarbetspartner. Detta arbete fick finansiering från US National Institutes of Health Grants R01 NS644912-4 och RC2 NS69476-01 (till A.L.S.) och Packard Center for ALS Research Grant P2ALS och Helping Link Foundation. K.M. fick också finansiering från Swiss National Science Foundation samt Young Investigator Development Award från Muscular Dystrophy Association, The Rett Syndrome Research Trust och familjerna till SCN2A-stiftelserna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
| Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
| DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
| EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
| Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
| Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
| Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
| Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
| Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
| Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |
References
- Leenaars, C. H. C., et al. Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223 (2019).
- Rhrissorrakrai, K., et al. Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge. Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).
- Hartung, T. Thoughts on limitations of animal models. Parkinsonism & Related Disorders. 14, Suppl 2 81-83 (2008).
- Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability. PLoS Genetics. 8 (8), 1002913 (2012).
- Stricker, S. H., Gotz, M. Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming. Neurobiology of Disease. 148, 105174 (2020).
- Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359 (2017).
- Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state. Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).
- Kim, E., Tae, G. Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate. Biomaterials Research. 20, 39 (2016).
- Kim, J., et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).
- Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).
- Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. Direct lineage reprogramming to neural cells. Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors. Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).
- Grath, A., Dai, G. Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Biological Engineering. 13, 14 (2019).
- Meyer, K., et al. Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).
- Lee, M., et al. Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson's Disease Patients. International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).
- Meyer, K., Kaspar, B. K. Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish. Brain Research. 1656, 27-39 (2017).
- Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M.
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Ferraiuolo, L., et al. Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).
- Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington's Disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258 (2019).
- Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).
- Hautbergue, G. M., et al. SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits. Nature Communications. 8, 16063 (2017).
- Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).
- Gatto, N., et al. Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease. Aging Cell. , (2020).
- Caiazzo, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors. Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
- Pear, W. Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9 Unit 9 11 (2001).
- Boczonadi, V., et al. Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons. Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).
- Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).
