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Avaliação em tempo real da microperfusão da medula espinhal em um modelo suíno de isquemia/reperfusão

Published: December 10, 2020 doi: 10.3791/62047
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 4, 1, 5, 1, 6, 6, 1
1Department of Anesthesiology, Center of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2University Department for Vascular Surgery and Department of Operative Medicine, Medical University of Innsbruck, 3Department of Medical Biometry and Epidemiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Vascular Medicine, University Heart and Vascular Center Hamburg (UHZ), 5Department of Cardiology, Rostock University Medical Center, 6University Department for Cardiac Surgery, Heart Center Leipzig

Summary

A microcirculação da medula espinhal desempenha um papel fundamental na lesão medular. A maioria dos métodos não permite a avaliação em tempo real da microcirculação da medula espinhal, essencial para o desenvolvimento de terapias voltadas à microcirculação. Aqui, propomos um protocolo usando sondas Laser-Doppler-Flow Needle em um grande modelo animal de isquemia/reperfusão.

Abstract

Lesão medular é uma complicação devastadora do reparo aórtico. Apesar dos desenvolvimentos para a prevenção e tratamento da lesão medular, sua incidência ainda é consideravelmente alta e, portanto, influencia o desfecho do paciente. A microcirculação desempenha um papel fundamental na perfusão tecidual e no fornecimento de oxigênio e muitas vezes é dissociada da macrohemodinâmica. Assim, a avaliação direta da microcirculação da medula espinhal é essencial para o desenvolvimento de terapias voltadas à microcirculação e para a avaliação das abordagens existentes em relação à microcirculação da medula espinhal. No entanto, a maioria dos métodos não fornece avaliação em tempo real da microcirculação da medula espinhal. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo padronizado para avaliação microcirculatória da medula espinhal em tempo real utilizando sondas de agulha laser-Doppler diretamente inseridas na medula espinhal. Utilizamos um modelo suíno de isquemia/reperfusão para induzir a deterioração da microcirculação da medula espinhal. Além disso, foi utilizada uma técnica de injeção de microesfera fluorescente. Inicialmente, os animais eram anestesiados e mecanicamente ventilados. Posteriormente, foi realizada a inserção da sonda de agulha laser-Doppler, seguida pela colocação da drenagem de fluidos cerebrospinais. Foi realizada uma esternotomia mediana para exposição da aorta descendente para realização de fixação cruzada aórtica. A isquemia/reperfusão foi induzida por fixação transversal aórtica supra-celíaca por um total de 48 min, seguida de reperfusão e estabilização hemodinâmica. O fluxo laser-doppler foi realizado em paralelo com a avaliação macrohemodinâmica. Além disso, a drenagem automatizada de fluidos cerebrospinais foi utilizada para manter uma pressão cefalorraquidiana estável. Após a conclusão do protocolo, os animais foram sacrificados, e a medula espinhal foi colhida para análise histopatológica e microesfera. O protocolo revela a viabilidade das medidas de microperfusão da medula espinhal usando sondas laser-Doppler e mostra uma diminuição acentuada durante a isquemia, bem como a recuperação após a reperfusão. Os resultados mostraram comportamento comparável à avaliação da microesfera fluorescente. Em conclusão, este novo protocolo pode fornecer um modelo animal grande útil para estudos futuros usando avaliação de microperfusão da medula espinhal em tempo real em condições de isquemia/reperfusão.

Introduction

Lesão medular induzida por isquemia/reperfusão (SCI) é uma das complicações mais devastadoras da reparação aórtica associada ao resultado reduzido1,2,3,4. As opções atuais de prevenção e tratamento para SCI incluem a otimização dos parâmetros macrohemodinâmicos, bem como a normalização da pressão do fluido cefalorraquidiano (CSP) para melhorar a pressão de perfusão da medula espinhal2,5,6,7,8,9. Apesar da implementação dessas manobras, a incidência de SCI ainda varia entre 2% e 31%, dependendo da complexidade do reparo aórtico10,11,12.

Recentemente, a microcirculação ganhou maior atenção13,14. A microcirculação é a área de captação de oxigênio celular e troca metabólica e, portanto, desempenha um papel crítico na função do órgão e na integridade celular13. O fluxo sanguíneo microcirculatório prejudicado é um dos principais determinantes da isquemia tecidual associada ao aumento da mortalidade15,16,17,18,19. O comprometimento da microcirculação da medula espinhal está associado à redução da função neurológica e ao desfecho20,21,22,23. Portanto, a otimização da microperfusão para o tratamento de SCI é uma abordagem mais promissora. A persistência de distúrbios microcirculatórios, apesar da otimização macrocirculatória, foi descrita26,27,28,29. Essa perda de coerência hemodinâmica ocorre frequentemente em várias condições, incluindo isquemia/reperfusão, enfatizando a necessidade de avaliação microcirculatória direta e terapias direcionadas à microcirculação26,27,30.

Até agora, poucos estudos utilizaram sondas laser-Doppler para avaliação em tempo real do comportamento microcirculatório da medulaespinhal 20,31. Estudos existentes têm frequentemente utilizado técnicas de injeção de microesfera, que são limitadas pelo uso intermitente e pela análise pós-morte32,33. O número de diferentes medidas usando a técnica de injeção de microesfera é limitado pela disponibilidade de microesferas com diferentes comprimentos de onda. Além disso, em contraste com as técnicas laser-doppler, a avaliação em tempo real da microperfusão não é possível, uma vez que o processamento e análise de tecido pós-mortem é necessário para este método. Aqui, apresentamos um protocolo experimental para avaliação em tempo real da microcirculação da medula espinhal em um modelo animal suíno de isquemia/reperfusão.

Este estudo fez parte de um grande projeto animal que combina um estudo randomizado comparando a influência de crystalloids vs. coloides na microcirculação na isquemia/reperfusão, bem como um estudo exploratório randomizado sobre os efeitos dos fluidos versus vasopressores na microperfusão da medula espinhal. A calibração de 2 pontos da sonda de fluxo, bem como a calibração do cateter de ponta de pressão, foram descritas anteriormente34. Além do protocolo relatado, foram utilizadas microesferas fluorescentes para a medição da microperfusão da medula espinhal, conforme descrito anteriormente, utilizando-se 12 amostras de tecido medular para cada animal, com amostras 1-6 representando a medula espinhal superior e 7-12 representando a medula espinhal inferior35,36. A injeção de microesfera foi realizada para cada etapa de medição após a conclusão das gravações de Laser-Doppler e avaliação macrohemodinâmica. A avaliação histopatológica foi realizada utilizando-se o Kleinman-Score como descrito anteriormente37.

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Protocol

O estudo foi aprovado pela Comissão Governamental de Cuidado e Uso de Animais do Município de Hamburgo (Referência-nº 60/17). Os animais receberam cuidados em conformidade com o 'Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório' (publicação NIH nº 86-23, revisado 2011), bem como recomendações e experimentos da FELASA foram realizados de acordo com as diretrizes do ARRIVE24,25. Este estudo foi um ensaio agudo, e todos os animais foram eutanizados no final do protocolo.

NOTA: O estudo foi realizado em seis suínos do sexo masculino e feminino de três meses de idade (Landrace alemão) pesando aproximadamente 40 kg. Os animais foram levados para os estabelecimentos de cuidados com animais pelo menos 7 dias antes dos experimentos e foram alojados de acordo com as recomendações de bem-estar animal. Os animais receberam alimentos e água ad libitum, e seu estado de saúde foi regularmente avaliado pelo veterinário responsável. Um tempo de jejum de 12 h foi mantido antes dos experimentos. Todo o procedimento experimental e manuseio dos animais foi supervisionado pelo veterinário responsável.

1. Indução e manutenção da anestesia

  1. Para indução de anestesia e manutenção da anestesia, premedifique os animais e sede profundamente usando uma injeção intramuscular seguida de injeções intravenosas, se necessário, para realizar intubação endotraqueal. Depois disso, induzir e manter a anestesia usando uma combinação de um agente de anestesia volátil com uma aplicação contínua de opioides complementada com uma injeção adicional de bolus opioide.
  2. Realizar injeções intramusculares de cetamina 20 mg·kg-1, azaperona 4 mg·kg-1e midazolam 0,1 mg·kg-1 para premedicação e sedação.
  3. Coloque um cateter venoso em uma veia de ouvido, proteja a fixação adequada e avalie a funcionalidade por aplicação rápida de 10 mL de soro fisiológico.
  4. Coloque o animal em uma posição supina em um cobertor de aquecimento para evitar a perda de calor.
  5. Estabeleça o monitoramento básico com eletrocardiografia (ECG) e oximetria de pulso para monitorar o estado cardio-pulmonar dos animais e conectá-lo ao hardware básico de monitoramento.
  6. Administre 15 L·min-1 de oxigênio através de uma máscara em forma de porco para pré-xigenação.
  7. Injete boli intravenoso de 0,1 mg·kg-1 de 1% propofol, se necessário, e realize intubação endotraqueal.
  8. Fixar a colocação correta com capnografia e auscultação da maré final, administrar 0,1 mg•kg-1 de pancurônio e garantir a fixação adequada do tubo endotraqueal.
  9. Estabeleça ventilação controlada por volume usando volumes de maré de 10 mL·kg-1 bodyweight-1, uma pressão final-expiratória positiva de 10 cmH2O, e uma fração de oxigênio inspirado (FiO2)de 0,3 usando a máquina de anestesia. Ajuste a frequência do ventilador para manter uma tensão de dióxido de carbono expiratória final (etCO2) de 35-45 mmHg.
  10. Introduza uma sonda gástrica, realize a sucção de fluidos gástricos, conserte corretamente o tubo e conecte-o a um saco de coleta. Feche cuidadosamente os olhos do animal para evitar o ressecamento dos olhos durante a anestesia.
  11. Manter a anestesia por infusão contínua de fentanil (10 μg·kg-1·h-1) e sevoflurano (concentração vencida de 3,0%, fornecida pelo vapor). Assegurar um nível adequado de anestesia por meio da observação cuidadosa de sinais vitais e parâmetros de ventilação, bem como pela ausência de quaisquer movimentos durante todo o protocolo, prestando especial atenção às fases do estímulo cirúrgico. Dê doses adicionais de bolus de fentanil (50 μg) se houver qualquer indicação de dor ou angústia.
    NOTA: Certifique-se da presença de pesquisadores experientes em anestesia animal durante todo o procedimento e use a supervisão de um veterinário experiente para garantir a anestesia adequada.
  12. Administre uma taxa de infusão de linha de base de 10 mL·kg-1·h-1 cristaloides equilibrados para compensar as perdas de fluidos durante a anestesia, preparação cirúrgica e execução do protocolo experimental. Use um aquecedor de fluidos para evitar a perda de calor.
  13. Limpe suavemente a pele do porco usando água sabão. Use uma solução de desinfecção da pele contendo povidona-iodo para diminuir a contaminação da pele. Use luvas estéreis para preparações cirúrgicas. Aplique 300 mg de clindamicina como profilaxia antimicrobiana e repita a dosagem após 6h.

2. Colocação da sonda

  1. Coloque o animal na posição lateral direita e flexione as costas do animal para ampliar o espaço entre as vértebras.
  2. Expor cirurgicamente a área paravertebral para a preparação de processos espinhosos e arcos vertebrais (Figura 1A).
  3. Coloque um cateter de veia periférica vascular de 14 G paramediana na medula espinhal ao nível de vértebra torácica (Th) 13/14 ou vértebra lombar (L) 1/2 entre dois arcos vertebrais(Figura 1B).
  4. Remova a agulha, insira a sonda de agulha laser/Doppler sobre o cateter venoso(Figura 1C),e teste a qualidade do sinal por conexão com o software e o software designados. Certifique-se de que há um sinal estável com pulsatilidade moderada.
  5. Fixar cuidadosamente a sonda com suturas(Figura 1D) e use estofamento para evitar deslocamento ou torção da sonda.
  6. Para colocação percutânea de drenagem de fluidos cefalorraquidianos para medição e controle da pressão cefalorraquidiana, identifique o nível de L 4/5 ou L 5/6, puna a pele e o espaço subcutâneo com a agulha introdutor e remova a agulha inlay.
  7. Coloque uma seringa cheia de soro fisiológico na agulha e introduza cuidadosamente a agulha com pressão constante sobre a seringa cheia de fluidos.
  8. Uma vez que uma perda de resistência é sentida como evidência para a posição peridural, reinsira a agulha inlay, e introduza a agulha 2-3 mm mais para perfurar a dura mater e remover a agulha inlay.
  9. Verifique a posição intrathecal pingando rapidamente de licor claro. Introduza a drenagem de até 20 cm de profundidade, conecte o adaptador Luer-lock e verifique a posição por aspiração cuidadosa de licor.
  10. Conserte cuidadosamente a drenagem com suturas e conecte-a ao sistema de drenagem de fluidos cefalorraquidianos.
  11. Exponha o crânio atrás da orelha esquerda e realize cuidadosamente uma trepanação de furo de broca da pele usando um acessório de broca de 6 mm.
  12. Introduza uma segunda sonda laser doppler diretamente no cérebro. Corrija cuidadosamente a sonda com suturas e teste a qualidade do sinal por conexão com o hard e o software designados. Novamente, certifique-se de que há um sinal estável com pulsatilidade moderada.
  13. Desconecte todas as sondas, coloque cuidadosamente o animal em uma posição supina, garantindo a posição da sonda não afetada. Certifique-se de que pelo menos 4-5 pesquisadores realizem essa manobra.
  14. Reconecte as sondas e ree verifico a qualidade do sinal.
  15. Conecte os canais de saída do hardware laser-Doppler ao amplificador e ao hardware e software de aquisição sincrônica para registrar adicionalmente o laser/Doppler Flux simultaneamente com sinais macrohemodinâmicos.
  16. Calibrar flux por unidade (PU) com calibração de 2 pontos.
    1. Pressione Enter para abrir o menu e selecione a configuração de saída analógica.
    2. Use o fator de conversão exibido (5,0 V = 1000 PU) para calibrar flux com calibração de 2 pontos para uso com o software de aquisição sincrônica.
    3. Selecione Retornar para retornar ao menu anterior e selecione Medição para continuar com a medição.
    4. Abra o software de aquisição sincromônica. Selecione zero todas as entradas do menu Configuração. Conecte todas as entradas com os dispositivos e sondas usados.
    5. Execute a calibração de 2 pontos para o Flux clicando no menu suspenso do canal Flux. Selecione calibração de 2 pontos. Defina a conversão de unidades e selecione BPU como unidades. Para o ponto 1, defina 0 V a 0 BPU. Para o ponto 2, defina 5,0 V a 1000 BPU. Selecione unidades definidas para todos e novos dados. Pressione OK para fechar o menu.
  17. Inicie a drenagem contínua de fluidos cefalorraquidianos com uma pressão alvo de 10 mmHg e volume de drenagem de 20 mL·h-1.

3. Colocação do cateter

  1. Exponha ambas as artérias femorais.
  2. Liga a parte distal da artéria femoral direita, oclua temporariamente o lúmen proximal da artéria usando um laço de vaso, realize um corte de 2 mm do vaso usando uma tesoura de Potts e introduza o fio-guia.
  3. Introduza ainda mais o fio guia, garantindo a inserção sem resistência e evitando qualquer torção do fio; introduzir o cateter sobre o fio.
  4. Conserte o cateter com suturas.
  5. Certifique-se de posição correta por aspiração de sangue arterial verificada com análise de gás arterial e medição de sinal arterial após conexão adequada com a pressão arterial e monitoramento trans-cardiopulmonar duro e software.
  6. Coloque uma sonda de fluxo de 5 mm na artéria femoral esquerda e teste a qualidade do sinal por conexão com o medidor de fluxo.
  7. Feche as duas virilhas com suturas.
  8. Exponha a artéria carótida direita, bem como a veia jugular interna direita para colocação de 8 bainhas introdutores.
  9. Para colocação do cateter, proceda da mesma forma descrita em 3.2-3.4.
  10. Conecte o lúmen lateral da baia introdutotal da artéria carótida ao monitoramento básico da pressão e ao hardware de termodiluição pulmonar para medição da pressão arterial.
  11. Introduza um cateter de ponta de pressão na aorta ascendente e verifique a posição por conexão com o amplificador e o software de aquisição sincrônica.
  12. Coloque um cateter de artéria pulmonar Swan-Ganz através da baia venosa na artéria pulmonar inflando o balão com ar a 20 cm de profundidade e inserindo-o suavemente até que uma pressão de cunha seja vista na curva hemodinâmica. Esvazie o balão e puxe o cateter para trás 2 cm. Certifique-se de satisfazer a qualidade do sinal da pressão pulmonar da artéria. Conecte os termistores ao monitoramento básico da pressão e ao hardware de termodiluição pulmonar.
  13. Use orientação sonográfica para colocação percutânea de um cateter venoso central de 12 Fr. 5-Lumen para administração de medicamentos e medição central de pressão venosa na veia jugular direita externa. Use a abordagem de 6 passos para colocação sonográfica38
  14. Conecte o lúmen distal do cateter à pressão arterial e ao monitoramento trans-cardiopulmonar. Troque todas as drogas e infusões para o cateter venoso central. Use lúmen diferente para analgésicos, fluidos e catecolaminas, e poupe o lúmen grande para administração de coloides durante etapas de carregamento de volume.

4. Preparação cirúrgica

  1. Faça uma mini-laparotomia, mobilize a bexiga, insira um cateter foley para drenagem de urina, infle o balão com soro fisiológico e conserte o cateter com suturas de bolsa.
  2. Conecte o cateter a um saco de coleta de urina exibindo a quantidade de urina em mL.
  3. Aumente a FiO2 para 1.0, e reassistam 0,1 mg·kg-1 pancurônio por via intravenosa.
  4. Realize uma esternotomia mediana usando eletrocauteria para preparar até o esterno. Disseque suavemente o esterno do tecido circundante. Realize a colocação retroesténal de uma compressa para evitar lesões.
  5. Pare a ventilação e divida o osso com uma serra oscilante. Continue a ventilação e reduza a FiO2 para 0,3. Use eletrocauteria para reduzir o sangramento e sele o esterno com cera óssea.
  6. Mobilize cuidadosamente o ápice do pulmão esquerdo e divida a parte lateral esquerda do diafragma para facilitar a exposição cirúrgica.
  7. Exponha a aorta descendente proximal ao tronco celíaco por uma leve retração do pulmão esquerdo, garantindo ventilação não perturbada e evitando traumas no pulmão esquerdo(Figura 2A)e divida o tecido circundante(Figura 2B). Administre 7 mL·kg-1 coloide de amido hidroxitil se for necessária estabilização hemodinâmica.
  8. Coloque uma sobreposição ao redor da aorta descendente para garantir a exposição adequada(Figura 2C).
  9. Anexar uma sonda de fluxo ao redor da aorta torácica descendente(Figura 2D). Garanta a qualidade adequada do sinal por conexão com o módulo de fluxo e a aquisição sincrônica de software. Use gel de contato para melhorar a qualidade do sinal, se necessário.
  10. Conecte um laço de vaso ao redor da aorta descendente, distal à sonda de fluxo para marcar a área de fixação cruzada aórtica.

5. Avaliação e aquisição de dados

  1. Zero todos os cateteres e cateteres de nível usando linhas cheias de fluidos colocadas no nível atrial direito.
  2. Coloque eletrodos ECG de agulha e conecte-os à aquisição sincrônica e software.
  3. A avaliação da termodilução trans-cardiopulmonar, bem como as medidas de fluxo aórtico e pressão foram previamente descritas 34.
  4. Para medição da saída cardíaca utilizando termodilução da artéria pulmonar, realize 3 injeções com 10 mL de soro fisiológico frio, e observe o valor médio exibido pelo hardware básico de monitoramento.
  5. Inicie o software laser-Doppler simplesmente pressionando Start, e defina uma marca para cada etapa de medição, rotulando cuidadosamente as etapas como M0 a M5.

6. Protocolo experimental

  1. Realizar medições de linha de base (M0).
  2. Realize a otimização hemodinâmica utilizando etapas de carregamento de volume de 7 mL·kg-1 coloide de amido hidroxitil. Realize cada passo de carregamento de volume acima de 5 minutos usando infusões pressurizadas. Após a conclusão de cada etapa de carregamento de volume, deixe 5 minutos para o equilíbrio. Inicie a carga de volume até que o aumento da produção cardíaca seja <15%.
  3. Reinpita as medidas (M1) após a conclusão da otimização hemodinâmica.
  4. Induzir isquemia/reperfusão para um total de 48 min de fixação cruzada aórtica supra-celíaca colocando um grampo aórtico na área marcada.
  5. Aplique fixação aórtica em ordem ascendente de intervalos de 1, 2, 5, 10 e 30 minutos para melhorar a sobrevivência dos animais durante o protocolo de estudo.
  6. Continue aórtico de fixação cruzada após cada intervalo após um máximo de 5 minutos ou após a normalização do fluxo da artéria femoral.
  7. Realize a oclusão manual de entrada da veia cava inferior para evitar aumentos da pressão arterial de > pressão arterial média de 100 mmHg.
  8. Administre injeções de bolos de norepinefrina ou epinefrina durante a fase de fixação, se necessário, para evitar diminuição da pressão arterial média abaixo de 40 mmHg.
  9. Repita as medidas no final do intervalo de fixação de 30 min antes da reperfusão (M2).
  10. Abra gradualmente o grampo para garantir a estabilidade hemodinâmica. Feche o grampo se a pressão sanguínea cair muito rapidamente e permita a estabilização.
  11. Administre 7 mL·kg-1 de coloides de amido de hidroxitila, bem como injeções adicionais de bolus de 10-20 μg de norepinefrina e/ou epinefrina para estabilização. Administrar 2 mL kg-1 de 8,4% de bicarbonato de sódio se o pH cair abaixo de 7,1. Certifique-se de ajuste adequado da taxa respiratória para garantir a normocánia.
  12. Repita as medidas 1h após a reperfusão (M3).
  13. Repita a otimização hemodinâmica conforme descrito abaixo de 6,2 e repita as medidas (M4).
  14. Realizar medições finais 4,5 h após a indução de isquemia/reperfusão (M5).

7. Eutanásia

  1. Administre 40 mmol de cloreto de potássio por via intravenosa para eutanásia para induzir fibrilação ventricular e asstole.
  2. Termine a ventilação e remova todos os cateteres.

8. Colheita de órgãos

  1. Coloque o animal em uma posição propensa e remova as sondas de agulha, bem como a drenagem.
  2. Expor a coluna por incisão da pele e remoção de tecido muscular usando um bisturi e fórceps.
  3. Use uma serra oscilante para dividir o arco vertebral paramediano em ambos os lados, e remova a parte dorsal do osso vertebral movendo cuidadosamente o processo espinhoso para lateralmente para afrouxar as conexões restantes.
  4. Use fórceps para levantar cuidadosamente a medula espinhal das extremidades caudais para as extremidades cranianas, e use um bisturi para cortar os nervos espinhais para remover a medula espinhal.
  5. Armazene a medula espinhal em 4% de formalina até uma utilização adicional para avaliação histopatológica ou quantificação da microesfera.

9. Análise estatística

  1. Use software estatístico.
  2. Garanta a distribuição normal por meio da inspeção de histogramas e variáveis de transformação de tronco, se necessário.
  3. Sujeito as variáveis dependentes- medula espinhal Fluxo, saída cardíaca, frequência cardíaca, volume de derrame, pressão arterial sistólica, pressão arterial média, pressão arterial diastólica, pressão venosa central, resistência vascular sistêmica - bem como microperfusão da medula espinhal superior e inferior avaliada com microesferas fluorescentes, se desejar - para análises gerais de modelos mistos lineares, utilizando a rotina GENLINMIXED para dados contínuos com uma função de ligação de identidade.
  4. Use ajustes de linha de base.
  5. Especifique modelos com efeitos fixos para linha de base variável e ponto de medição. Considere o ponto de medição como medidas repetidas dentro dos animais.
  6. Relatório p-valores de efeitos fixos para ponto de medição para cada parâmetro.
  7. Para análise da microesfera fluorescente da medula espinhal, use região (medula espinhal inferior, medula espinhal superior) além de efeito fixo e interação entre região e ponto de medição para avaliar interações entre regiões e ponto de medição, e relatar valores p de efeitos fixos para interação também.
  8. Computação base ajustada marginal significa com intervalo de confiança de 95% (IC) para todas as variáveis dependentes nos pontos de medição M1-M5, seguido por comparações pareiras através de testes de diferença menos significativos.
  9. Variáveis expressas como média (IC 95%). Expresse o peso animal como ± desvio padrão.
  10. Apresentar valores p não ajustados.

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Representative Results

Todos os seis animais sobreviveram até a conclusão do protocolo. O peso animal foi de 48,2 ± 2,9 kg; cinco animais eram machos, e um animal era fêmea. A inserção da sonda da agulha da medula espinhal, bem como a medição do fluxo da medula espinhal, foram viáveis em todos os animais.

Exemplos de gravações microcirculatórias da medula espinhal em tempo real em combinação com gravações microcirculatórias e macrohemodinâmicas cerebrais durante a fixação cruzada aórtica para indução de isquemia, bem como durante a desagregação e reperfusão são mostrados na Figura 3A, Figura 3B. A interrupção do fluxo aórtico descendente foi seguida por uma diminuição acentuada do fluxo da medula espinhal, enquanto a pressão no aórtico ascendente aumentou(Figura 3A). A reperfusão levou a efeitos opostos(Figura 3B).

A análise estatística dos parâmetros macro e microcirculatórios é mostrada na Tabela 1. Meios marginais estimados em modelo misto e seus intervalos de confiança indicam redução acentuada do fluxo da medula espinhal durante a isquemia. Em contrapartida, o fluxo cerebral aumentou significativamente durante a isquemia, conforme indicado pelos meios marginais estimados e seus intervalos de confiança. Isso foi acompanhado pelo aumento da pressão arterial, da frequência cardíaca e da resistência vascular sistêmica, enquanto a produção cardíaca e o volume de derrame diminuíram. A análise da microesfera fluorescente revelou uma diminuição acentuada no fluxo sanguíneo microcirculatório da medula espinhal na medula espinhal inferior, enquanto não houve alteração significativa na medula espinhal superior, como indicado pelos meios marginais estimados e seus intervalos de confiança. A reperfusão levou a efeitos opostos. Embora tenha havido uma diminuição adicional na produção cardíaca, no volume de derrame e na pressão arterial no final do protocolo, o fluxo de flux da medula espinhal, bem como o fluxo sanguíneo microcirculatório da medula espinhal, foram estáveis.

Os resultados deste estudo mostram a capacidade das sondas de agulha Laser/Doppler de detectar alterações em tempo real na microperfusão da medula espinhal. Como esperado, a diminuição da microcirculação da medula espinhal durante a isquemia foi drástica com o mínimo de fluxo microcirculatório. Recuperação da medula espinhal O fluxo ocorreu após a reperfusão. A menor perfusão medular, avaliada com microesferas fluorescentes, mostrou comportamento comparável, apoiando assim o método. Como esperado, a perfusão da medula espinhal superior e o fluxo cerebral apresentaram comportamentos diferentes. Embora a microcirculação da medula espinhal tenha sido estável, a macrocirculação diminuiu no final do protocolo, mostrando perda de coerência hemodinâmica. Enquanto o fluxo na aorta descendente era zero durante a isquemia, a reperfusão levou a uma recuperação do fluxo aórtico. A análise histopatológica revelou necrose leve da medula espinhal com escores de Kleinman para a medula espinhal inferior entre 0 e 2 e para a medula espinhal superior entre 0 e 1.

Figure 1
Figura 1: Colocação da sonda de agulha laser/doppler na medula espinhal. (A) Exposição cirúrgica de estruturas vertebrais. (B) Punção da medula espinhal usando um cateter venoso. (C) Inserção da sonda da agulha após a remoção da agulha inlay. (D) Fixação da sonda de agulha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Exposição da aorta descendente e colocação da sonda de fluxo e loop do vaso. (A) Exposição da aorta descendente após mobilizar o ápice do pulmão esquerdo e dividir a parte lateral-esquerda do diafragma. (B) Divisão do tecido circundante para exposição cirúrgica. (C) Colocação de uma sobreposição ao redor da aorta descendente para garantir a exposição circular adequada. (D) Colocação da sonda de fluxo, bem como loop de embarcação ao redor da aorta descendente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Registros amostrais de sinais microcirculatórios e macrohemodinâmicos durante a isquemia, bem como a reperfusão. Registros amostrais de ECG, pressão na aorta ascendente medida por meio de um microtip-cateter, fluem na aorta descendente medida usando uma sonda de fluxo ultrassônico, medula espinhal e fluX microcirculatório cerebral medida usando sondas de agulha laser/Doppler. (A) Amostra de 50 s durante a indução de isquemia por fixação cruzada aórtica supra-celíaca. (B) Amostra de 20 s durante a indução de reperfusão por reabertura suave do grampo cruzado aórtico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

M1 M2 M3 M4 M5
Fluxo da Medula Espinhal 61.35 (41.96-89.70) 6.78 (4.63-9.91) 58.97 (40.33-86.22) 66.05 (45.17-96.57) 59.09 (40.41-86.40)
Ponto de medição do efeito principal: p < 0,001 Comparação em pares M1 p < 0,001 p = 0,878 p = 0,777 p = 0,886
Fluxo cerebral 41.12 (28.17-60.04) 71.73 (49.13-104.73) 60.34 (41.33-88.10) 59.91 (36.93-78.71) 49.82 (34.12-72.74)
Ponto de medição do efeito principal: p = 0,023 Comparação em pares M1 p = 0,001 p = 0,045 p = 0,173 p = 0,341
Microperfusão da Medula Espinhal (ml/min/g) Medula espinhal superior 0.071 (0.058-0.087) 0.063 (0.052-0.078) 0.088 (0.072-0.11) 0.082 (0.067-0.100) 0.083 (0.068-0.102)
Comparação em pares M1 p = 0,420 p = 0,146 p = 0,344 p = 0,281
Ponto de medição do efeito principal: p < 0,001
Medula espinhal inferior 0.079 (0.065-0.097) 0.031 (0.026-0.039) 0.111 (0.090-0.136) 0.089 (0.073-0.110) 0.105 (0.086-0.129)
Ponto de medição de interação · Região da Medula Espinhal: p < 0,001 Comparação em pares M1 p < 0,001 p = 0,021 p = 0,400 p = 0,051
Saída cardíaca (l/min) 4.15 (3.69-4.61) 3.13 (2.67-3.60) 3.30 (2.84-3.76) 3.67 (3.20-4.13) 2.67 (2.00-2.93)
Ponto de medição do efeito principal:: p < 0,001 Comparação em pares M1 p < 0,001 p = 0,007 p = 0,125 p < 0,001
Frequência cardíaca (bpm) 74.42 (53.70-95.15) 131.09 (110.36-151.82) 88.92 (68.19-109.65) 80.62 (59.89-101.35) 99.38 (78.65-120.11)
Ponto de medição do efeito principal: p = 0,002 Comparação em pares M1 p < 0,001 p = 0,314 p = 0,666 p = 0,092
Volume de traçado (ml) 55.50 (49.20-61.81) 25.33 (19.03-31.64) 37.00 (30.69-43.31) 45.33 (39.03-51.64) 27.17 (20.86-33.47)
Ponto de medição do efeito principal: p < 0,001 Comparação em pares M1 p < 0,001 p < 0,001 p = 0,004 p < 0,001
Aorta ascendente da pressão arterial sistólica (mmHg) 94.36 (85.20-103.52) 122.05 (112.89-131.20) 76.72 (67.56-85.88) 88.36 (79.20-97.52) 73.36 (64.20-82.52)
Ponto de medição do efeito principal: p < 0,001 Comparação em pares M1 p < 0,001 p = 0,006 p = 0,321 p = 0,002
Aorta ascendente de pressão arterial média (mmHg) 78.18 (68.68-87.67) 107.29 (97.80-116.78) 59.08 (49.58-68.57) 70.38 (60.89-79.87) 58.35 (48.85-67.84)
Ponto de medição do efeito principal: p < 0,001 Comparação em pares M1 p < 0,001 p = 0,005 p = 0,217 p = 0,004
Aorta ascendente da pressão arterial diastólica (mmHg) 59.20 (49.41-69.00) 93.76 (83.97-103.56) 45.18 (35.38-54.98) 52.48 (42.69-62.28) 45.33 (35.54-55.13)
Ponto de medição do efeito principal: p < 0,001 Comparação em pares M1 p < 0,001 p = 0,038 p = 0,302 p = 0,040
Resistência Vascular Sistêmica (dyn x sec x cm-5) 1421.13 (1236.94-1632.74) 208089.94 (181128.10-239085.87) 1335.36 (1162.29-1534.21) 1412.62 (1229.54-1622.97) 1807.46 (1573.21-2076.60)
Ponto de medição do efeito principal: p < 0,001 Comparação em pares M1 p < 0,001 p = 0,407 p = 0,938 p = 0,005
Fluxo (l/min) Aorta Descendente 3.27 (0.96-5.58) 0 3.27 (0.96-5.58) 3.54 (1.23-5.85) 4.54 (2.32-6.85)
Ponto de medição do efeito principal: p = 0,003 Comparação em pares M1 p = 0,998 p = 0,844 p = 0,381

Tabela 1: Alterações nos parâmetros hemodinâmicos durante o protocolo. Os valores são dados como meios marginais estimados ajustados pela linha de base com intervalos de confiança de 95%. Valores p não ajustados dos testes F dos principais efeitos do ponto de medição são dados para cada parâmetro, bem como para efeitos de interação entre a região e o ponto de medição para microperfusão da medula espinhal superior e inferior. Também são apresentados valores p não ajustados de comparações pares de pontos de medição individuais com M1. Os pontos de medição são: M1 = Otimização hemodinâmica isquemia prévia/reperfusão, M2 = Durante isquemia, M3 = 1 h após reperfusão M4 = Otimização hemodinâmica após isquemia/reperfusão, M5 = 4,5 h após indução de isquemia/reperfusão.

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Discussion

A CZL induzida pela isquemia da medula espinhal é uma complicação maior do reparo aórtico com tremendo impacto no desfecho do paciente1,2,3,4,10,11,12. As terapias direcionadas à microcirculação para prevenir e tratar o SCI são as mais promissoras. O protocolo fornece um método reprodutível para avaliação microcirculatória da medula espinhal em tempo real e oferece a capacidade de avaliar efeitos de novas abordagens terapêuticas sobre microcirculação da medula espinhal sob condições de isquemia/reperfusão.

Existem algumas etapas metodológicas críticas neste modelo experimental. Para evitar a perda de animais, os pesquisadores devem ser experimentados em técnicas anestésicas (inserção de drenagem de fluidos cefalorraquidianos, acesso vascular sonográfico e terapia hemodinâmica durante exposição aórtica, retração aórtica e reperfusão) bem como em técnicas cirúrgicas (esternotomia, exposição do vaso, exposição cirúrgica da aorta descendente). A inserção da sonda da agulha da medula espinhal requer experiência, profundo conhecimento da anatomia e habilidades técnicas sonoras. No entanto, em nossa experiência, a curva de aprendizado é consideravelmente íngreme, e a maioria dos pesquisadores experientes alcançará o sucesso em pouco tempo, embora múltiplas tentativas devem ser evitadas para evitar lesões na medula espinhal que possam afetar a metodologia.

Outro passo crítico é a mudança da posição lateral direita para supina para evitar a luxação ou dano da sonda da agulha da medula espinhal. Para esta manobra, 4-5 pessoas são recomendadas, o preenchimento adequado do local de inserção é essencial, e deve-se tomar cuidado para não deslocar a sonda. A exposição da aorta descendente requer alguns passos críticos também. O ápice do pulmão esquerdo deve ser mobilizado para permitir a retração suave do pulmão esquerdo para expor o campo cirúrgico. Além disso, a parte lateral-esquerda do diafragma deve ser dissecada para facilitar a exposição. Durante a preparação aórtica, é necessária uma comunicação ideal entre os pesquisadores que realizam a cirurgia e aqueles que fornecem anestesia e hemodinâmica para garantir a estabilidade cardiopulmonar adequada. Durante a fixação cruzada aórtica, recomenda-se a compressão manual da cava vena inferior para reduzir o retorno venoso. Sem essa manobra, podem ocorrer aumentos severos de pós-carga que podem levar a uma lesão desletante miocárdio39,40.

A reperfusão deve ser realizada com cautela com fluidos, vasopressores e inotropos prontos para uso. Durante a reperfusão, ocorrem mudanças dramáticas que podem levar a hipotensão grave, arritmias cardíacas e falha circulatória41. No entanto, a observação cautelosa do comportamento hemodinâmico, o início imediato das intervenções, bem como o uso de uma atuação estruturada e suave durante esta fase crítica podem evitar a perda de animais. Além disso, o uso de intervalos ascendentes de fixação cruzada aórtica, seguido de períodos de tempo para melhorar a regeneração, como usado no protocolo, induz efeitos isquêmicos pré-condicionamento que aumentam a estabilidade hemodinâmica durante a reperfusão42,43.

O modelo proporciona a capacidade de monitorar a microcirculação da medula espinhal, além da avaliação macrocirculatória. Devido à perda de coerência hemodinâmica frequentemente observada em cirurgias de alto risco e pacientes gravemente doentes, a avaliação direta da microcirculação da medula espinhal é necessária13,30. A microcirculação sublingual é frequentemente utilizada para substituir a avaliação microcirculatória direta no órgão de interesse44. No entanto, tem sido demonstrada a dissociação entre microcirculação sublingual e órgãos vitais, enfatizando o valor da avaliação microcirculatória direta na medula espinhal, conforme utilizado no modelo experimental45. Por fim, o modelo tem a vantagem do monitoramento em tempo real do fluxo sanguíneo da medula espinhal em comparação com a avaliação da microesfera fluorescente, que é limitada pelo uso intermitente e pela análise pós-morte46. O impacto da avaliação em tempo real pode ser melhor visto quando se olha para gravações de exemplo durante a isquemia, bem como indução de reperfusão, mostrando mudanças rápidas na microperfusão da medula espinhal. No entanto, deve-se considerar que a inserção da sonda laser-Doppler na medula espinhal pode levar a pequenas, mas consideráveis, lesões da medula espinhal.

Como a integridade da medula espinhal poderia possivelmente influenciar os parâmetros hemodinâmicos, isso poderia ser uma desvantagem do método. No entanto, o uso de técnicas laser-Doppler para avaliar a microperfusão da medula espinhal tem sido utilizado anteriormente47,48,49,50. Além disso, embora não tenhamos observado alterações hemodinâmicas após a inserção da sonda, não podemos descartar efeitos hemodinâmicos induzidos por este método. Deve-se notar que alterações hemodinâmicas também podem ser induzidas pelo uso de injeções de microesfera, que seriam, no entanto, de menor importância em animais de grande porte51. Além disso, a função sensorial ou motora pode ser afetada pela inserção da sonda e, portanto, o uso de avaliação potencial sensorial ou evocada pelo motor deve ser realizado com cautela em combinação com a avaliação laser-Doppler.

Nesse sentido, a técnica de injeção de microesfera pode ser vantajosa. Além disso, as técnicas não devem ser utilizadas para ensaios crônicos; no entanto, isso também é verdade para as injeções de microesfera, que se limitam a ensaios agudos porque dependem da análise de tecido pós-morte. A maioria dos estudos utilizando técnicas de laser-Doppler foi realizada em pequenos animais47,48,49,50 Aqui, descrevemos uma técnica de uso em suínos, como um grande modelo animal, o que poderia facilitar a tradução para estudos clínicos. A técnica de introdução paramediana supera o problema de grandes processos espinhosos em suínos, o que complica a colocação adequada de sondas de medula espinhal. Além disso, a técnica tem a vantagem de que a laminectomia ou remoção do tecido dura não é necessária, evitando uma perda constante de álcool. Como a pressão do fluido cefalorraquidiano tem um tremendo impacto na perfusão da medulaespinhal 32,o modelo tem a vantagem de medir e otimizar a pressão do fluido cefalorraquidiano, além da microperfusão da medula espinhal e abordará o efeito da pressão do fluido cefalorraquidiano na microperfusão da medula espinhal em projetos futuros.

O protocolo tem algumas limitações que devem ser mencionadas. Os valores absolutos da medula espinhal O fluxo difere consideravelmente entre os animais devido a diferenças na posição exata da sonda e na proximidade de vasos maiores da medula espinhal. Portanto, os ajustes da linha de base devem ser realizados ao comparar valores. No entanto, as diferenças intra-individuais entre os pontos de medição são altamente consistentes, desde que seja exercida cautela meticulosa para evitar movimentos da sonda da agulha durante o protocolo. Além disso, este estudo não foi concebido como um estudo de comparação entre o Laser-Doppler e os métodos de microesfera fluorescente. Dado o número de animais, não realizamos uma análise de correlação entre esses dois métodos.

Embora ambos os métodos tenham apresentado um comportamento comparável com reduções significativas durante a isquemia e a recuperação após a reperfusão para ambos, uma comparação dos métodos deve ser abordada utilizando estudos devidamente projetados no futuro. No entanto, o uso de microesferas permitiu ainda a avaliação de diferentes comportamentos para microperfusão da medula espinhal superior e inferior. Além disso, a análise histopatológica revelou apenas necrose medular moderada em comparação com outros modelos de isquemia medular37. Prolongar a duração da isquemia, bem como omitir medidas de pré-condicionamento pode levar a mudanças mais graves que podem ser desejadas por alguns pesquisadores. Embora tenhamos avaliado apenas alterações histopatológicas leves, isso pode ser diferente com uma maior duração de isquemia. Nesse sentido, um período mais longo após a isquemia/reperfusão antes do término do protocolo também pode ter levado a alterações histopatológicas mais graves. No entanto, o protocolo permitiu a estabilidade hemodinâmica uma hora após a reperfusão sem a necessidade de aplicação adicional ou mesmo contínua de inotropo ou vasopressor.

Para a avaliação de diferentes intervenções hemodinâmicas, este modelo proporciona condições ideais. Embora tenhamos utilizado a otimização de fluidos como exemplo de intervenção hemodinâmica, outras abordagens podem ser avaliadas com este método. Embora este protocolo forneça avaliação microcirculatória em um modelo de isquemia/reperfusão, a duração da isquemia limita a avaliação de abordagens terapêuticas durante a isquemia antes da reperfusão. Além disso, durante a isquemia, ocorreu uma variação nas alterações hemodinâmicas (por exemplo, hipertensão, hipotensão, taquicardia, bradicardia, bem como arritmias cardíacas). A oclusão manual de entrada afeta ainda mais as variáveis hemodinâmicas durante esta fase. Portanto, o protocolo não é recomendado para a avaliação de abordagens terapêuticas durante a isquemia antes da reperfusão. No entanto, outras configurações experimentais, como o uso de técnicas de embolização ou ligaduração, podem ser combinadas com a avaliação da sonda de agulhas doppler/laser da medula espinhal, conforme descrito neste protocolo.

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Disclosures

Constantin J.C. Trepte recebeu um prêmio honorário por palestras de Maquet. Todos os outros autores não declaram conflitos de interesse. Este estudo foi apoiado pela Sociedade Europeia de Anestesiologia Jovem Investigador Start-Up Grant 2018.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Lena Brix, V.M.D, Instituto de Pesquisa Animal, Hannover Medical School, bem como à Sra. Jutta Dammann, Facility of Research Animal Care, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Alemanha, por fornecer cuidados animais pré e perioperatórios e sua assistência técnica no manejo animal. Os autores gostariam ainda de agradecer ao Dr. Daniel Manzoni, Do Departamento de Cirurgia Vascular, Hôpital Kirchberg, Luxemburgo, por sua assistência técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CardioMed Flowmeter Medistim AS, Oslo, Norway CM4000 Flowmeter for Flow-Probe Femoral Artery
CardioMed Flow-Probe, 5mm Medistim AS, Oslo, Norway PS100051 Flow-Probe Femoral Artery
COnfidence probe,  Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA MA16PAU Flow-Probe Aorta
16 mm liners
DIVA Sevoflurane Vapor Dräger Medical, Lübeck, Germany Vapor
Hotline Level 1 Fluid Warmer Smiths Medical Germany GmbH, Grasbrunn, Germany HL-90-DE-230 Fluid Warmer
Infinity Delta Dräger Medical, Lübeck, Germany Basic Monitoring Hardware
Infinity Hemo Dräger Medical, Lübeck, Germany Basic Pressure Monitoring and Pulmonary Thermodilution Hardware
LabChart Pro ADInstruments Ltd., Oxford, UK v8.1.16 Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Software
LiquoGuard 7 Möller Medical GmbH, Fulda, Germany Cerebrospinal Fluid Drainage System
Millar Micro-Tip Pressure Catheter (5F, Single, Curved, 120cm, PU/WD) ADInstruments Ltd., Oxford, UK SPR-350 Pressure-Tip Catheter Aorta
moor VMS LDF moor Instruments, Devon, UK Designated Laser-Doppler Hardware
moor VMS Research Software moor Instruments, Devon, UK Designated Laser-Doppler Software
Perivascular Flow Module Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA TS 420 Flow-Module for Flow-Probe Aorta
PiCCO 2, Science Version Getinge AB, Göteborg, Sweden v. 6.0 Blood Pressure and Transcardiopulmonary Monitoring Hard- and Software
PiCCO 5 Fr. 20cm Getinge AB, Göteborg, Sweden Thermistor-tipped Arterial Line 
PowerLab ADInstruments Ltd., Oxford, UK PL 3516 Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Hardware
QuadBridgeAmp ADInstruments Ltd., Oxford, UK FE 224 Four Channel Bridge Amplifier for Laser-Doppler and Invasive Blood Pressure Aquisition
Silverline Spiegelberg, Hamburg, Germany ELD33.010.02 Cerebrospinal Fluid Drainage
SPSS statistical software package  IBM SPSS Statistics Inc., Armonk, New York, USA v. 27 Statistical Software
Twinwarm Warming System Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany 12TW921DE Warming System
Universal II Warming Blanket Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany 906 Warming Blanket
VP 3 Probe, 8mm length (individually manufactured) moor Instruments, Devon, UK Laser-Doppler Probe
Zeus Dräger Medical, Lübeck, Germany Anesthesia Machine

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Medicina Problema 166 Lesão medular isquemia medular perfusão medular terapia hemodinâmica microcirculação pressão de fluido cefalorraquidiano Laser-Doppler
Avaliação em tempo real da microperfusão da medula espinhal em um modelo suíno de isquemia/reperfusão
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Behem, C. R., Friedheim, T., Wipper, … More

Behem, C. R., Friedheim, T., Wipper, S. H., Pinnschmidt, H. O., Graessler, M. F., Gaeth, C., Holthusen, H., Rapp, A., Suntrop, T., Haunschild, J., Etz, C. D., Trepte, C. J. C. Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion. J. Vis. Exp. (166), e62047, doi:10.3791/62047 (2020).

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