Summary
כאן אנו מציגים שיטה אוטומטית לקביעה כמותית למחצה של מספר נוירון דופאמין בסובסטנציה חולדה nigra pars compacta.
Abstract
הערכה של מספר נוירונים דופאמין הסובסטנציה ניגרה היא שיטה מרכזית במחקר טרום קליני מחלת פרקינסון. נכון לעכשיו, ספירה סטריאולוגית לא משוחדת היא התקן לכימות של תאים אלה, אך היא נשארת תהליך מייגע וגוזל זמן רב, אשר לא יכול להיות ריאלי עבור כל הפרויקטים. כאן, אנו מתארים את השימוש בפלטפורמת ניתוח תמונה, אשר יכולה להעריך במדויק את כמות התאים המסומנים באזור מוגדר מראש של עניין. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לשיטת ניתוח זו במוח החולדה ומדגימים שהוא יכול לזהות ירידה משמעותית בנוירונים חיוביים טירוסין הידרוקסילאז עקב ביטוי של מוטציה α-סינוקלאין בסובסטיה ניגרה. אימתנו מתודולוגיה זו על ידי השוואה עם תוצאות שהושגו על ידי סטריאולוגיה משוחדת. יחד, שיטה זו מספקת תהליך יעיל ומדויק לגילוי שינויים במספר נוירון דופאמין, ולכן מתאים לקביעה יעילה של ההשפעה של התערבויות על הישרדות התא.
Introduction
מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעת תנועה נוירודגנרטיבית נפוצה המאופיינת על ידי נוכחות של אגרגטים חלבון המכיל α-synuclein (α-syn) ואת האובדן המועדף של נוירונים דופאמין הסובסטנציה ניגרה pars compacta (SNpc)1. כימות של מספר נוירון דופאמין הוא חלק חיוני של מחקר PD כפי שהוא מאפשר את ההערכה של השלמות של המערכת nigrostriatal, ובכך, מתן נקודת קצה חשובה כדי להעריך את האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים שינוי המחלה. נכון לעכשיו, התקן לכימות מספר תא הוא ספירה סטריאולוגית לא משוחדת, המשתמשת ב חתכים דו מימדיים (2D) של רקמה כדי להעריך תכונות נפחיות במבנים תלת מימדיים (3D)2,3,4. שיטות סטריאולוגיות מבוססות עיצוב מודרניות משתמשות בהליכי דגימה אקראיים מקיפים ומיישמות פרוטוקולי ספירה (הידועים כבדיקות) כדי למנוע חפצים פוטנציאליים ושגיאות שיטתיות, המאפשרים זיהוי אמין של הבדלים רק מעט יותר מאשר וריאציה בין בעליחיים 5. בעוד סטריאולוגיה מספקת כלי אנליטי רב עוצמה למחקרים היסטולוגיים in vivo, זה זמן אינטנסיבי, מניח הכנת דגימה אחידה, ודורש אימות במספר שלבים, אשר יכול להשפיע על היעילות הנדרשת יותר ויותר עבור חקירה תרגום פרה קליני.
ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה במדע הדיגיטלי מאפשרת לאמץ יישומים חדשניים להערכות יעילות יותר של פתולוגיה ללא סטריאומיקרוסקופ, תוך מילוי הצורך כפונדקאי של סטריאולוגיה לא משוחדת. שיטות אלה להגביר את המהירות, להפחית את השגיאה האנושית, ולשפר את הרבייה של טכניקות סטריאולוגיות6,7. HALO היא פלטפורמה כזו לניתוח תמונה לניתוח רקמות כמותיות בפתולוגיה דיגיטלית. הוא מורכב ממגוון מודולים שונים ומדווח על נתוני ביטוי מורפולוגיים ומולטי-אקסים על בסיס תא אחר תא על פני מקטעי רקמות שלמים באמצעות אלגוריתמים לזיהוי תבניות. מודול ה-FL הציטונוקלארי מודד את החיוביות האימונופלואורסצנטית של סמנים פלואורסצנטיים בגרעין או בציטופלסמה. הדבר מאפשר דיווח על מספר התאים החיוביים עבור כל סמן ועל ציון העוצמה עבור כל תא. המודול יכול להיות מותאם כדי לספק גדלי תאים בודדים ומדידות אינטנסיביות, אם כי תכונה זו אינה נדרשת לכימות של נוירונים דופאמין.
מטרת מחקר זה היא לאמת שיטה זו עם מודל חולדה α-syn וקטורי מאומת בעבר של ניוון עצבי ניגרל8,9,10. במודל זה, מוטציה אנושית A53T α-syn באה לידי ביטוי SNpc על ידי הזרקה סטראוטקטית של סרוטיפ היברידי וירוס הקשורים אדנו 1/2 (AAV1/2), וכתוצאה מכך ניוון עצבי משמעותי על פני תקופה של 6 שבועות. SNpc uninjected התווית עשוי, במחקרים מסוימים, לשמש שליטה פנימית עבור הצד מוזרק. בדרך כלל, הזרקת וקטור AAV-ריק (AAV-EV) בקבוצת שליטה של בעלי חיים משמש כפקד שלילי. אנו מציגים מדריך שלב אחר שלב להערכת הצפיפות של נוירונים דופאמין שנותרו SNpc מוזרק לאחר 6 שבועות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הבריאות האוניברסיטאית לטיפול בבעלי חיים ובוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.
1. הזרקה סטראוטקטית
- זוג בית נקבה בוגרת Sprague-Dawley חולדות (250-280 גרם) בכלובים עם מצעים עץ וגישה ad lib למזון ומים. שמור על מושבת בעלי החיים במחזור אור /כהה רגיל של 12 שעות (אורות ב-06:30) עם טמפרטורה ולחות קבועות.
- בצע הזרקה סטראוטקטית חד צדדית של AAV ישירות SNpc בצד ימין של המוח (צד ימין או שמאל, על פי ההעדפות של כל מעבדה) כפי שתואר קודם לכן8,10. להזריק 2 μL של AAV1/2 ב titer הסופי של 3.4 x 1012 חלקיקים גנומיים / מ"ל.
2. חתך במוח ואימונוהיסטוכימיה (IHC)
- הרדמה החולדה עם 5% isoflurane על ידי הצבת בתא הרדמה במשך 3 דקות. ניתן להשתמש בשיטות מאושרות אחרות עבור שלב זה לאחר בדיקה מוסדית מתאימה.
- לאחר החולדה הגיעה למישור כירורגי של הרדמה עמוקה, להעביר אותו חרוט האף מודבק בחוזקה לשולחן necropsy. אבטחו את כפות הרגליים של החולדה באמצעות סרט הדבקה והשתמשו בשיטת תגובה לצביטת בוהן כדי לקבוע את עומק ההרדמה. החיה חייבת להיות לא מגיבה לפני שהיא ממשיכה.
- בצע חתך לרוחב מתחת לעצם החזה וחתך דרך הסרעפת לאורך כל כל כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל הצלעות. להרים ולהדק את עצם החזה עם hemostat ומניחים מעל הראש.
- מהדקים את הלב באמצעות מלקחיים ומכניסים מחט פרפר המחוברת למשאבת זלוף לקצה האחורי של החדר השמאלי. לחלחל עכברוש transcardially עם 150 מ"ל של מלוחים הפריניזציה, או עד העיניים והעור ברורים. זלוף עם 4% paraformaldehyde (PFA), במקום מלוחים, ניתן להעדיף כדי להקל על immunostaining עם נוגדנים מסוימים או חתך מוח דק יותר.
- לאחר השלמת הזלוף, ערפו את ראשם עם גיליוטינה וחילצו את המוח למטריצת מוח, משטח גחוני הפונה כלפי מעלה.
- באמצעות סכין גילוח טרי, לעשות חתך במישור קורנל 2 מ"מ rostral כדי chiasm אופטי. החלק את הלהב מצד לצד כדי למנוע עיוות של המוח בעת החיתוך.
- לטבול את החלק האחורי של המוח בבקבוקון שכותרתו מראש המכיל כ 20 מ"ל של 4% PFA עבור 48 שעות של לאחר קיבוע בטמפרטורת החדר. החלק השני של המוח עשוי להיות פלאש קפוא 2-מתילבוטן מקורר -42 מעלות צלזיוס לפני אחסון ב -80 מעלות צלזיוס.
- לאחר 48 שעות, להעביר את המוח הקבוע בקבוקון שכותרתו המכיל 30% סוכרוז מלוחים אגירה פוספט (PBS) ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד שהם שוקעים (48-72 שעות).
- הכן microtome על ידי הצבת קרח יבש בשוקת של שלב הדגימה, ואחריו 100% אתנול. לאחר קירור הבמה, לסחוט טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) תרכובת על הבמה עד שהוא יוצר עיגול 2 ס"מ קוטר ו 0.5 ס"מ עובי. ברגע שהוא קפא חלקית, בזהירות להוריד את המוח על התל של OCT, להבטיח את משטח חיתוך striatal נשאר במקביל לשלב.
- מוסיפים עוד קרח יבש לשלב כדי לעזור למוח לקפוא. ברגע שהמוח הפך צבע שמנת, לנקות את השלב של קרח יבש.
- לתקוע חור בצד ימין של המוח עם מחט 25G להבחין בחצי הכדור הימני והשמאלי. היזהר לא להעביר את המחט דרך מבנים אנטומיים של עניין.
- חיתוך סדרתי של 40 מיקרומטר במישור הקורונה החל מ bregma -3.8 ומסתיים ב bregma -6.8.
- יש לאחסן שש סדרות בצינורות מסומנים בתמיסה נגד הקפאה (40% PBS, 30% 2-ethoxyethanol, 30% גליצרול). כל סדרה צריכה להכיל 12 חלקי מוח.
- בחר קבוצה אחת של מקטעים עבור כתמים אימונוהיסטוכימיים, ולשטוף את פתרון נגד הקפאה עם 3 x 10 דקות שוטף ב 0.2% PBS-T.
- חסום למשך שעה ב- RT עם אגוזים עדינים בתמיסת חסימה (סרום עיזים רגיל 10% (NGS), 2% אלבומין סרום שור (BSA) ב- 0.2% PBS-T). בצע את זה עם דגירה עם נוגדן ארנב אנטי טירוסין הידרוקסילאז (TH) (1:500) ועכבר נגד α-syn נוגדן (1:500) ב 2% NGS ב 0.2% PBS-T לילה בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הנוגדן העיקרי עם 3 x 5 דקות שוטף ב 0.2% PBS-T, ואחריו 1 דגירה h עם עז אנטי ארנב אלקסה פלואור 488 נוגדן משני (1:500) ו עז נגד העכבר אלקסה פלואור 555 נוגדן משני ב 2% NGS ב 0.2% PBS-T. ודאו שהקטעים מוגנים מפני אור ואגוזים בעדינות.
- לשטוף את הנוגדן המשני עם 3 x 5 דקות שוטף ב 0.2% PBS-T ולהרכיב את הסט המלא של מקטעים על שקופיות מוגן מפני אור ואבק באמצעות מברשת צבע צרה. מכסה עם פלואורסצנטיות הרכבה בינונית וחותמת עם לכה ציפורניים ברורה.
3. מיקרוסקופיה קונפוקלית ורכישת תמונה
- לכוד תמונות IHC באמצעות תוכנה המצמדת למיקרוסקופ קונפוקאלי בהגדלה של פי 10. פתח את חור הסיכה ל 1.5 AU כדי ללכוד מטוס רחב בהיקף ~ 1.5 מיקרומטר ולהגדיר את המיקוד בצד מוזרק של המוח.
- בכרטיסיה רכישה, סמן את האפשרות דימות סריקת אריחים והגדר את הממדים ל- 10 x 4.
- תחת החלונית 'מצב רכישה', הגדר את גודל התצוגה ל- 1.1. פעולה זו מסייעת למנוע סימני תפירה ברורים בין תמונות סריקת אריחים.
- הגדר את גודל המסגרת ל- 1024 x 1024 פיקסלים ואת הממוצע ל- 2 כדי להבטיח רכישת תמונה באיכות גבוהה.
- בלוח ערוצים, הגדר מסלול 1 אל Alexa488 ומסלול 2 אל Alexa555.
- טען את השקופית על הבמה ובחר מקטע עם כתמי TH חזקים. לחץ על בשידור חי בפאנל הרכישה.
- בחלונית 'ערוצים', הגדר את עוצמת הלייזר והרווח לרמות שמגדילות את האות ומגבילות את הרעש מהרקע. השתמש במחוון הטווח כדי להבטיח שהאותות לא יתמלאו יתר על המידה (כפי שצוין בשכבת-על אדומה כהה).
- חזור על השלב לעיל עם שקופיות מרובות כדי להבטיח כתמים עקביים בין שקופיות כמו כוח לייזר / רווח לא ניתן להתאים בין שקופיות.
- בכרטיסיה רכישה, סמן את התיבה מיקומים.
- בשלב זה, אתה מוכן להתחיל הדמיה. באמצעות העינית, לבחור את החלק הראשון מראה כתמי TH חיוביים, להגדיר את המוקד בנקודת העניין (כלומר, SNpc) ולאחר מכן להעביר את הבמה לקו האמצע של המקטע. פעולה זו שומרת את המיקום בצירים x, y ו- z ותדמיין סריקת אריח הלוכדת את המקטע כולו.
- חזור על השלב לעיל עבור כל המקטעים ברחבי SNpc נותן קבוצה שלמה של תמונות של SNpc. אם נדרש ניתוח מפורט של הצד הלא מודבק, יש לחזור על שלבים 3.10 עד 3.11 על-ידי הגדרת המוקד בצד הלא מודבק.
4. ניתוח תמונה וכימות
- הפרד קבצי תמונה באמצעות תוכנה מתאימה וייבא קבצי תמונה לתוכנה אוטומטית לניתוח תמונות.
- הגדר אזור מעניין על-ידי בחירה בכלי ביאור עט כדי לצייר ביאור סביב ה- SNpc.
הערה: במקטעים שבהם יש כמות גדולה של אובדן נוירון דופאמין, הגדלה זמנית של פליטה/ספיגה יכולה לעזור להגדיר בבירור את SNpc (איור 2). - מעבר לכרטיסיה ניתוח ומהתפריט הנפתח ניתוח, בחר כוונון בזמן אמת. פעולה זו פותחת חלון נפרד בתמונת המקטע המאפשר שינוי בזמן אמת של פרמטרי ניתוח (איור 3).
- תחת המקטע הגדלה של ניתוח, בחר את גודל התצוגה המתאים של התמונה.
- תחת סעיף זיהוי תאים, בחר צבע גרעיני כצבע המשמש לכתם TH (Alexa Fluor 488).
- להתאים את סף הניגוד הגרעיני, עוצמה גרעינית מינימלית, תוקפנות פילוח גרעיני, והגדרות גודל גרעיני תוך צפייה זהירה בחלון כוונון בזמן אמת.
הערה: ייצוג מדויק של כל תא בודד כתא יחיד בחלון הכוונון בזמן אמת חיוני לדיוק. הגדרות אלה נמצאות בקנה מידה שרירותי בהתאם לתוכנה שבה נעשה שימוש, אך יש צורך בהתאמה נכונה כדי לאפשר לתוכנה להבחין במדויק בין תאים בודדים ובין תאים לרקע (איור 3). - חזור על תהליך זה עם מינימום של 10 דגימות נפרדות כדי להבטיח הסכמה אחידה של מה מהווה תא על פני סעיפים שונים.
הערה: ניתן לזהות סמני תאים נוספים (כגון α-syn או NeuN) באותה פלטפורמת ניתוח באמצעות המקטעים סמן 1 או סמן 2 בכרטיסיה ניתוח. - לאחר שנדגמו מספר מתאים של תמונות וכוונון בזמן אמת הותאם בהתאם, שמור את הגדרות הניתוח בתפריט הנפתח פעולות הגדרות.
- בחר את כל התמונות שיש לנתח ולחץ על נתח.
- בחר בהגדרת הניתוח ששמרת זה עתה ובחלון אזור הניתוח, סמן את התיבה שכבות ביאור. לאחר מכן, בדוק את שכבה 1 ולחץ על נתח.
הערה: עבור מוח יחיד, הניתוח נמשך בדרך כלל כ-5 דקות. התוצאה שהושלמה תציג בבירור כל פריט שנספר כתא (איור 4). - לאחר השלמת, יצא את נתוני ניתוח הסיכום עבור כל המקטעים. קיימת אפשרות לייצא נתוני ניתוח אובייקטים, אשר יספק נתונים מפורטים, כולל גודל התא של כל תא בודד שזוהה. ערכת נתונים זו יכולה לשמש לבחינת שינויים בגודל התא בתגובה לרעלן/טיפולי.
- הוסף את סה"כ התאים מכל מקטע שנותח לכל בעל חיים ואת האזור המנותח הכולל (מ"מ2). חלק את המספר הכולל של תאים לפי האזור הכולל שנותח כדי לחשב את מספר התאים/מ"מ2 ב- SNpc עבור כל עכברוש
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על ידי יישום השיטות לעיל על רקמת המוח שנאספו 6 שבועות לאחר זריקות AAV, הוכחנו כי הזרקה סטריאוטקטית של AAV המבטא מוטציה A53T α-syn (AAV-A53T) ב SNpc של המוח החולדה תוצאות ירידה משמעותית בצפיפות של נוירונים דופאמין לעומת הזרקה של AAV וקטור ריק (AAV-EV) כפקד (איור 5A, B). המספר הממוצע של נוירונים חיוביים TH / מ"מ2 ב SNpc של חולדות מוזרק עם AAV-EV היה 276.2 ± 34.7, וב SNpc של חולדות מוזרק עם AAV-A53T היה 41.2 ± 17 (P = 0.0003). כימות של מספר נוירונים דופאמין /mm2 ב SNpc דומה דוחות שפורסמו בעבר10,11. עבור השיטות המתוארות כאן, 4 קטעים רציפים לכל בעל חיים נותחו. מחקרים קודמים הראו הבדלים משמעותיים עם מעט כמו 3 חלקים, אבל ניתוח יכול להיות גדל עוד יותר עד 12 סעיפים כדי להקיף את כל SNpc בהתאם למודל והתערבות הנחקרים על ידי החוקר.
סטריאולוגיה לא משוחדת בוצעה גם כפי שתואר קודם לכן12 על קבוצה אחרת של חלקי מוח מאותם בעלי חיים. בשיטה זו, הוכחנו גם כי הזרקה סטראוטקטית של מוטציה A53T α-syn ב- SNpc של מוח החולדה גורמת לירידה משמעותית במספר הכולל המשוער של נוירונים חיוביים TH ב- SNpc, בהשוואה להזרקה של EV-AAV (איור 5C). חשוב לציין, היה מתאם חזק בין צפיפות הנוירון הדופאמינרגי המוערך באמצעות תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית ומספר נוירון דופאמין מוערך באמצעות סטריאולוגיה משוחדת (r = 0.8819, P = 0.0007) (איור 5D).
יישמנו גם את השיטות שלנו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית כדי לקבוע את מספר הנוירונים החיוביים של TH /mm2 בצד הלא משוילב של חולדות מוזרק עם AAV-A53T או AAV-EV. המספר הממוצע של נוירונים חיוביים TH / מ"מ2 ב SNpc לא מופק של חולדות מוזרק עם AAV-A53T היה 123.2 ± 26.4, אשר היה גדול משמעותית מאשר SNpc מוזרק, אשר היה 44.0 ± 15.8 (P = 0.0331)(איור משלים 1A). המספר הממוצע של נוירונים חיוביים TH / מ"מ2 ב SNpc לא מוזרק של חולדות מוזרק עם AAV-EV (215.6 ± 35.5) לא היה שונה באופן משמעותי SNpc מוזרק (276.2 ± 34.7), המאשר לא היה ניוון עקב הזרקה עם AAV-EV (איור משלים ). חישבנו את התוצאות הללו כאחוז מבעלי חיים מוזרקים/לא מנוכרים ומצאנו שבעלי חיים שהוזרקו ל-AAV-A53T היו בירידה של 69% בהשוואה לבעלי החיים AAV-EV(איור משלים 1C).
איור 1: זרימת עבודה של פעולת השירות. זרימת עבודה המדגימה את השלבים הדרושים להזרקת AAVs, מקטע ורקמת כתם, הגדרת אזור מעניין ואופטימיזציה של התוכנה לספירת תאים. תמונות מייצגות של סריקת אריחים קונפוקלית, הגדרת החזר על ההשקעה וכימות תאים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרת אזור העניין. (A) קטע המוח Coronal, כולל SNpc immunostained עבור TH (ירוק) מעכברוש מוזרק עם AAV-A53T α-syn. בחולדות עם ניוון עצבי חמור (כגון מוצג כאן), זה יכול להיות קשה לזהות את SNpc. (B) באופן זמני להגדיל את ספיגת התמונה יכול לזהות את המבנה ולאפשר זיהוי מדויק של אזור העניין. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיטוב זיהוי תאים בשיטה הציטוטוקלרית ב- HALO. כוונון בזמן אמת של מודול cytonuclear מאפשר למשתמש לראות שינויים בזיהוי תאים בזמן אמת על ידי שינוי סף ניגודיות גרעינית, עוצמה גרעינית מינימלית, אגרסיביות פילוח גרעיני, וגודל גרעיני. (A) תמונה מייצגת עם אזור עניין מוצג. (B)כוונון בזמן אמת המציג תת-דגימה שבה התוכנה אינה מזהה את כל התאים בחלון הכוונון. (C)דגימת יתר שבה התוכנה מזהה יותר תאים ממה שניכר בחלון הכוונון. (D) כוונון ממוטב שבו מספר התאים הנכון נספר. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הגדרות ממוטבות של HALO באזור מעניין מוגדר. תמונות מייצגות של ניתוח שהושלם באמצעות הגדרות ממוטבות לזיהוי ציטונוקלארי ב- HALO. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ביטוי של מוטציה אנושית A53T α-syn ב SNpc תוצאות ניוון עצבי חמור ב 6 שבועות כמומת על ידי HALO סטריאולוגיה משוחדת. (A) תמונות מייצגות המציגות ניוון של נוירונים חיוביים TH ב SNpc 6 שבועות לאחר הזרקה סטראוטקטית של AAV-A53T α-syn ב titer של 3.4 x 1012 חלקיקים ויראליים / מ"ל. כתמים אימונופלואורסצנטיים עם נוגדנים אנטי-TH (ירוק) ואנטי-α-סינ (אדום). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) כימות של מספר נוירונים חיוביים TH ב SNpc של חולדות מוזרק עם AAV-A53T α-syn או AAV-EV מדגים כי ביטוי של מוטציה α-syn תוצאות אובדן נוירון דופאמין משמעותי. לא משויכים t-מבחן; n = 5 חולדות /קבוצה. גרף מראה ממוצע ± SEM, ***P < 0.001. (C) תמונות מייצגות של כתמים צבעוניים של נוירונים דופאמין ב SNpc של AAV-A53T (שמאל) או AAV-EV (ימין) חולדות מוזרקות המשמשות לביצוע סטריאולוגיה משוחדת. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (D) מתאם משמעותי בין ספירת HALO של נוירונים חיוביים TH / מ"מ2 (ציר y) ומספרי תאים סטריאולוגיה משוחדים (ציר x). מתאם פירסון (r = 0.8819, P = 0.0007). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: ניוון עצבי חד-צדדי משמעותי נצפה ב- SNpc של חולדות שקיבלו הזרקת AAV-A53T. (A) כימות של מספר נוירונים חיוביים TH ב SNpc מוזרק או לא מופק של חולדות שקיבלו זריקה סטראוטקטית AAV-A53T חד צדדי מראה ירידה משמעותית בצד מוזרק. (B)כימות של מספר הנוירונים החיוביים TH ב SNpc מוזרק או לא מופק של חולדות שקיבלו הזרקה סטראוטקטית AAV-EV חד צדדית מראה אין שינויים משמעותיים. (C) נורמליזציה לצד הנגדי uninjected להפגין ירידה של >50% עם הזרקה עם AAV-A53T α-syn לעומת AAV-EV. לא משויכים t-מבחן; n = 5 חולדות /קבוצה. גרפים מראים ממוצע ± SEM, *P < 0.05, ***P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון משלים זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההערכה האמינה של שלמות המערכת הדופאמינרגית במודלים פרה-קליניים של PD היא קריטית כדי לקבוע את האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים לשינוי מחלות. לכן, חשוב לשלוט ולמזער מבלבלים פוטנציאליים שעשויים להפחית את האמינות והשחזור של נתונים היסטופטולוגיים. תוצאות כמותיות זהירות יכולות לספק מידע רב יותר מתיאורים איכותיים או חצי כמותיים בלבד. במקביל, עלינו להכיר בכך שאילוצים בזמן ובמשאבים עלולים להקשות על ביצוע ספירה סטריאולוגית בלתי משוחדת לכימות שינויים פתולוגיים או אובדן תאים. עם זאת, עם ההתקדמות האחרונה, רבים של קריטריונים אלה ניתן למלא באמצעות פלטפורמות הדמיה ממוחשבת ואוטומטית6.
פרוטוקול זה מתאר מספר צעדים חשובים בקביעת ההערכה הסטרולוגית של נוירונים דופאמין/מ"מ2 במוח מכרסמים. יש לציין כי השתמשנו בהזרקה סטראוטקטית כדי לספק AAVs ל- SNpc, אשר מייחס חשיבות לאספקה מדויקת של וירוסים אלה על מנת לקבוע את ההשפעה של כל טיפול. הקואורדינטות המשמשות למחקר שלנו הן bregma -5.2 מ"מ (צד שני-אחורי), -2 מ"מ (מדיאלי-לרוחב מימין) ו -7.5 מ"מ (גחון הגבי מהגולגולת) על חולדות נקבה בוגרות במשקל ~ 275 גרם. מסירה נכונה של הנגיף באמצעות מתאמים אלה תבטיח מסירה של AAVs ל SNpc.
בנוסף לכך, יש להקפיד בעת הכנת רקמות להכתמת. בראש ובראשונה, יש להקפיד לסמן איזה צד הוא ימין / שמאל. בידיים שלנו, הכי קל והכי
דרך לשחזור לעשות זאת הייתה להשתמש במחט 25G לתקוע חור מעת לעת באמצע הגב השמאלי תוך זיהוי הצד הלא מודבק. ידע מעמיק של האזורים הנוירואנטומיים של מוח המכרסמים חשוב להבדיל מתי להתחיל לחתוך, ומאוחר יותר לזהות את SNpc בעת ציור אזור של עניין. חשוב לציין כי כתמי TH אינו מכתים באופן בלעדי נוירונים של SNpc, ויש להבדיל בין נוירונים חיוביים TH באזור tegmental הגחוני ושדה retrorubal. אטלס מוח חולדה הוא מדריך שימושי עבור אלה חסרי ניסיון נוירואנטומיה מכרסמים. זמני הדגירה של הנוגדנים אחידים לאורך כל הפרוטוקול והמיקוד נקבע בזמן המינימלי האפשרי כדי למנוע פוטובלצ'ינג.
יש שונות נמוכה בין דגימות פעם תכונות נוירואנטומיות עקביות משמשים כדי להבחין בין חלקים. לאחר צופה מנוסה, עיוור לצייר את האזור של עניין חשוב לשמור על עקביות על פני החלקים שיש לנתח. ניתוח הצד הלא מנוכר כפי שמוצג באיור משלים 1 ממחיש שיש עקביות בשיטה. עם זאת, יש להקפיד בעת פירוש נתונים באופן זה. מוחות חותכים מסתמכים באופן עקבי על השוואת הנוכחות של תכונות נוירואנטומיות ידועות בכל צד של המוח. הבדלים עדינים עשויים משמעם שהצד הלא מודבק בחלק נתון עשוי להיות אחורי/חיצוני יותר מהצד המוזרק, ולכן אינו השוואה ישירה מדויקת. ניתוח נוסף של הנתונים המוצגים מדגיש מגבלה של שיטה זו. יש מידה רבה של שונות בספירת נוירונים דופאמין בצד uninjected (123.2 בקבוצת AAV-A53T לעומת 215.6 ב AAV-EV), אשר לא ניתן היה לצפות בין בעלי חיים בגיל דומה. ישנן מספר סיבות אפשריות לפער זה, כולל גודל המדגם הקטן המשמש במחקר זה וההבדלים האנטומיים הנ"ל מצד לצד. בנוסף לכך, המוקד עבור אות פלואורסצנטי מוגדר בצד מוזרק, כלומר שינוי קל במישור z יכול להשאיר את הצד uninjected מחוץ למיקוד, ולכן תאים מסוימים לא יהיה לזיהוי על ידי תוכנת ספירת תאים. מסיבה זו, מומלץ להשוות את מספר נוירונים דופאמין /mm2 בצד אחד באמצעות תכונות נוירואנטומיות ידועות, והיכן המוקד נקבע על מיקרוסקופ במיוחד עבור אזור זה. אם יש צורך בהשוואה לצד הלא מודבק, יש לחזור על ההדמיה כאשר המוקד מוגדר בצד זה.
אנו מציגים נתונים שהושגו ונותחו עם אחת מחבילות התוכנה מספר המספקים ניתוח תמונה כמותית עם הכשרה משתמשמינימלית 13. תוכניות אחרות זמינות והם מאומצים יותר ויותר ללמוד נוירופתולוגיה, כולל כימות של אובדן נוירון דופאמין במודלים ניסיוניים של PD6. בעוד שחלקם מציעים אלגוריתמים מובנים לביצוע פונקציות ספציפיות (למשל, ספירת לוח עמילואיד), רבות מחבילות התוכנה חולקות מספר תכונות נפוצות שהופכות אותן לשימושיות במיוחד עבור מעבדות המבצעות ניתוח חוזר. בנוסף לאזור של זיהוי עניין, ניתן להסיר צעדים מקדימים המפריעים לאות (קפלי רקמות, חפצי קצה, סימני דיו, כתמים וכו ') מאזור העניין באמצעות כלים ידניים וזיהוי תבניות. יתר על כן, ניתן להשתמש בקריאות הניתנות בשילוב עם ערכים כמותיים המתקבלים ממחקרים חלבונים, תאיים או התנהגותיים כדי לחקור מערכות יחסים ומתאמים פוטנציאליים בין משתנים.
השיטה המתוארת לעיל מספקת הליך מדויק, חצי כמותי וזול יחסית להערכת מספרי נוירונים בחלקי מוח מוכתמים אימונוהיסטוכימית. תכונת הכוונון בזמן אמת מאפשרת התאמה של השיטה לכל המקטעים ומבטיחה עקביות גם עם שונות קלה בשיטות השיוך. לאחר משקיף עיוור לזהות אזורים של עניין SNpc מפחית אישור או הטיות בחירה התוכנה מספקת קריאה פשוטה המאפשרת חישוב של נוירונים / מ"מ2. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לספק ספירות מדויקות של נוירונים באזורי מוח שונים תוך שמירה על יעילות ויתרונות עלות על פני פרוטוקולים סטריאולוגיים מבוססים יותר. קידום טכנולוגיית סריקת שקופיות עבור מקטעים עבים יותר יאפשר גם זמן עיבוד יעיל יותר עבור השיטה המתוארת לעיל.
מגבלות
לשיטה המתוארת יש מספר יתרונות ברורים במהירותה וביכולתה לזהות שינויים גדולים בצפיפות הנוירונים, אך גם מציבה אתגרים משלה. שלא כמו סטריאולוגיה, השיטה אינה יכולה לספק הערכה של מספרי תאים מוחלטים, אלא מחשבת את צפיפות התאים בתוך ה- SNpc. ההערכות של צפיפות התא הן מאוד, אבל לא בצורה מושלמת, בקורלציה עם מספרי תאים המתקבלים באמצעות סטריאולוגיה משוחדת. בנוסף, השיטה מסתמכת על כוונון גודל התא וצורה על ידי המשתמש לפני תחילת הניתוח. הדבר אינו יכול להבטיח שהתאים לא יחסרו עקב היותם במישור המוקד, או שתאים בגודל ו/או צורה יוצאי דופן יחסרו לתוכנה. מניסיונם של המחברים, השיטה שימושית במיוחד לבחינת היעילות של טיפולים פוטנציאליים לשינוי מחלות במודלים טרום קליניים מכרסמים. לסיכום, בעוד שיטות סטריאולוגיות לכמת מספרי תאים להישאר בשימוש נרחב במדעי המוח, ההאצה המהירה של דיגיטציה עולה כי פלטפורמות ניתוח תמונה אוטומטי יאומץ יותר ויותר ללמוד נוירופתולוגיה, במיוחד כפי שהם ממשיכים להשתפר. חשוב שהחוקר יבין את המגבלות הטכניות של גישה זו ויישם מתודולוגיה זו לאחר שיקול דעת זהיר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מדווחים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לכל הצוות במתקן מיקרוסקופיה אופטי מתקדם (AOMF) ברשת הבריאות האוניברסיטאית על זמנם וסיוע בפיתוח פרוטוקול זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
