Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å generere store mengder lipid innkapslede decafluorobutane mikrobubbles ved hjelp av sondespiss sonikering og deretter kondensere dem til fase-skift nanodroplets ved hjelp av høytrykk ekstrudering og mekanisk filtrering.
Abstract
Det er mange metoder som kan brukes til produksjon av fordampende faseskiftdråper for avbildning og terapi. Hver metode bruker forskjellige teknikker og varierer i pris, materialer og formål. Mange av disse fabrikasjonsmetodene resulterer i polydisperse populasjoner med ikke-ensartede aktiveringsterskler. I tillegg krever kontroll av dråpestørrelsene vanligvis stabile perfluorkarbonvæsker med høye aktiveringsterskler som ikke er praktiske in vivo. Å produsere ensartede dråpestørrelser ved hjelp av lavkokende punktgasser vil være gunstig for in vivo-avbildnings- og terapieksperimenter. Denne artikkelen beskriver en enkel og økonomisk metode for dannelsen av størrelsesfiltrerte lipidstabiliserte faseskift nanodråper med lavkokende punkt decafluorobutane (DFB). En vanlig metode for å generere lipidmikrobobler er beskrevet, i tillegg til en ny metode for å kondensere dem med høytrykksekstrudering i et enkelt trinn. Denne metoden er utformet for å spare tid, maksimere effektiviteten og generere større mengder mikrobubble- og nanodropletløsninger for et bredt spekter av applikasjoner ved hjelp av vanlig laboratorieutstyr som finnes i mange biologiske laboratorier.
Introduction
Ultralydkontrastmidler (UCAer) vokser raskt i popularitet for avbildnings- og terapiapplikasjoner. Mikrobobler, de opprinnelige UCAene, er for tiden de vanlige agentene som brukes i kliniske diagnostiske applikasjoner. Mikrobobler er gassfylte sfærer, vanligvis 1-10 μm i diameter, omgitt av lipid-, protein- eller polymerskall1. Imidlertid kan deres størrelse og in vivo-stabilitet begrense funksjonaliteten i mange applikasjoner. Faseskift nanodråper, som inneholder en overopphetet væskekjerne, kan overvinne noen av disse begrensningene på grunn av deres mindre størrelse og forbedret sirkulasjonslevetid2. Når den utsettes for varme eller akustisk energi, fordampes den overopphetde væskekjernen for å danne en gassmikrobubble2,3,4,5. Siden fordampningsterskelen er direkte relatert til dråpestørrelse5,6, vil det være svært ønskelig å formulere dråpesuspensjoner med jevn størrelse for å oppnå konsistente aktiveringsterskler. Formuleringsmetoder som produserer ensartede dråpestørrelser er ofte komplekse og kostbare, mens mer kostnadseffektive tilnærminger resulterer i polydisperse løsninger7. En annen begrensning er evnen til å generere stabile faseskiftdråper med lavkokende perfluorkarbongasser (PFC), noe som er avgjørende for effektiv aktivering i vivo8. I dette manuskriptet er det beskrevet en protokoll for å generere stabile filtrerte lavkokende punkter som fordamper faseskiftdråper for in vivo-avbildning og terapiapplikasjoner.
Det er mange metoder for å produsere monodispersed submikron fase-skift dråper7. En av de mest robuste metodene for å kontrollere størrelsen er bruk av mikrofluidiske enheter. Disse enhetene kan være kostbare, ha langsomme priser på dråpeproduksjon (~ 104-106 dråper / s) 7, og krever omfattende opplæring. Mikrofluidiske enheter krever også generelt høykokende punktgasser for å unngå spontan fordampning og tilstopping av systemet7. En nylig studie av de Gracia Lux et al.9 viser imidlertid hvordan kjøling av en mikrofluidisator kan brukes til å generere høye konsentrasjoner av submikronfaseskift (1010-1012/ml) ved hjelp av lavkokende punkt decafluorobutane (DFB) eller octafluoropropane (OFP).
Generelt er lavkokende punktgasser som DFB eller OFP lettere å håndtere ved hjelp av forhåndsformede gassbobler. Vaporizable dråper kan produseres fra forløper lipidstabiliserte bobler ved å kondensere gassen ved hjelp av lave temperaturer og forhøyet trykk5,10. Konsentrasjonen av dråper produsert ved hjelp av denne metoden avhenger av forløper mikrobubble konsentrasjon og effektivitet av konvertering av bobler til dråper. Konsentrerte mikrobobler er rapportert fra spiss sonikering nærmer seg > 1010 MB / ml11, mens en egen studie har rapportert dråpekonsentrasjoner fra ~ 1-3 x1011 dråper / ml fra kondensert OFP og DFP bobler12. Når monodisperserte dråper ikke er en bekymring, er kondensmetoder de mest enkle og rimeligste metodene for å generere lipidstabiliserte faseskiftdråper ved hjelp av lavkokende punkt PFCer. Metoder for å generere bobler i jevn størrelse før kondens kan bidra til å skape mer monodisperse populasjoner av dråper. Det er imidlertid også vanskelig å generere monodisperse forløperbobler, noe som krever dyrere tilnærminger som mikrofluidikk eller gjentatte differensialsentrifugeringsteknikker11. En alternativ tilnærming til produksjon av DFB og OFB nanodråper har nylig blitt publisert ved hjelp av spontan kjernedannelse av dråper i liposomer13. Denne metoden, ved hjelp av en "Ouzo" -effekt, er en enkel måte å generere lavkokende PFC-dråper uten å måtte kondensere bobler. Størrelsesfordelingen av PFC-dråpene kan styres av delikat titrering og blanding av PFC-, lipid- og etanolkomponenter som brukes til å starte kjernedannelse av dråpene. Det er også verdt å merke seg at blanding av perfluorkarboner kan brukes til å kontrollere stabilitets- og aktiveringsterskler av nanodråper14,15. Nyere arbeid av Shakya et al. demonstrerer hvordan nanodropletaktivering kan stilles inn ved å emulgere høykokende PFCer i et hydrokarbon endoskeleton for å lette heterogen kjernedannelse i dråpekjernen16, som er en tilnærming som kan vurderes sammen med andre former for dråpestørrelsesfiltrering.
Når de er dannet, kan faseskiftdråper ekstruderes etter dannelse for å skape flere monodispersiske populasjoner. Faktisk har en lignende protokoll til metoden beskrevet her blitt publisert tidligere av Kopechek et al.17 ved hjelp av høy kokepunkt dodecofluorpentane (DDFP) som dråpekjerne. Lesere som ønsker å bruke faseskiftdråper med høykokende punktperfluorkarboner (stabile ved romtemperatur) bør referere artikkelen ovenfor i stedet. Generering og ekstrudering av dråper med lave kokepunktgasser, som DFB og OFP, er mer komplisert og nærmer seg best ved å kondensere preformerte gassbobler.
I denne protokollen beskrives en vanlig metode for å generere forhåndsformede lipidmikrobobler med en DFB-gasskjerne ved hjelp av sondespiss sonikering. Deretter brukes en kommersiell ekstruder til å kondensere forhåndsformede mikrobobler til submikronfase-skift nanodråper (figur 1). De resulterende dråpene er da aktivatable av varme og ultralyd. Denne metoden kan produsere større mengder nanodropletløsning enn konvensjonelle kondensmetoder med smalere størrelsesfordelinger uten behov for dyre mikrofluidiske enheter. Produksjon av nanodropletløsninger med smale størrelsesfordelinger kan sannsynligvis generere mer ensartede fordampningsterskler. Dette vil maksimere potensialet for mange applikasjoner som avbildning, ablasjon, legemiddellevering og embolisering1,3,4,6.
Figur 1: Skjematisk for ekstruderingsoppsett med høyt trykk for kondensering av forhåndsformede mikrobobler i nanodråper med faseskift. Mikrobubble-løsningen legges til og finnes i ekstruderkammeret, og 250 psi, fra nitrogentanken, påføres gjennom kammerinntaksventilen. Nitrogengassen vil skyve mikrobubble-løsningen gjennom filteret ved bunnen av kammeret, og kondensere prøven til nanodråper. Løsningen skyves til slutt ut av ekstruderen gjennom prøveuttaksrøret og samles inn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lage lipidfilmer
- Forbered lipidfilmer for mikroboblegenerering ved hjelp av 90% DSPC og 10% DSPE-PEG2K ved å blande lipidene i riktig forhold ved hjelp av følgende retninger:
- Lag lager lipider av DSPC og DSPE-PEG2K i kloroform. Vei 50 mg av hvert lipidpulver i separate hetteglass. Tilsett 1 ml kloroform til hvert hetteglass med en 1 ml glasssprøyte.
- Tilsett 287 μL DSPC-lager og 113 μL DSPE-PEG2K-lager (begge 50 mg/ml) i et 20 ml scintillasjonsflaske ved hjelp av en glasssprøyte.
- Tørk de blandede lipidene for å fjerne kloroform ved hjelp av nitrogen. Ved hjelp av en passende lengde på slangen som er koblet til husets nitrogen, strømmer nitrogengass lett over hetteglassets hoderom mens du blander. Fortsett til ingen kloroform blir observert, og den gjenværende lipidfilmen begynner å bli hvit. Bruk polypropylenskruehetter, dekk prøven mens du introduserer nitrogen i hoderommet.
- Plasser hetteglassene under vakuum over natten ved hjelp av en vakuumdesiccator for å fjerne eventuell gjenværende kloroform. En tynn gjennomsiktig film vil forbli som dekker bunnen av hetteglasset.
- Oppbevar hetteglassene ved -20 °C til det er nødvendig.
2. Generere mikrobobler fra lipidfilmer
- For å lage mikrobobler, tilsett 10 ml 1x fosfatbuffer saltvann (PBS) som inneholder 20% v / v Propylene Glykol og 20% v / v Glycerol (endelig pH 7,2-7,4) til en tørr lipidfilm.
- Hette prøven og varm prøven til 65 °C i 30 minutter på en varmeblokk (eller oppvarmet vannbad).
- Mens prøven varmer opp, klargjør du badesonatoren ved å øke badetemperaturen til 65 °C.
MERK: Denne prosessen er raskere hvis vannet er forvarmet i en mikrobølgeovn eller kokeplate før du setter i badekarets lyddemper. - Plasser hetteglasset med scintillasjon som inneholder den oppvarmede prøven i badekarets soniker, slik at bare den delen av hetteglasset som inneholder lipidoppløsningen, er nedsenket i vannbadet.
- Soniker den varme lipidoppløsningen i minst 15 min. Sørg for at vanntemperaturen holder seg ved 65 °C. Fortsett å sonikere i intervaller på 10-15 min til oppløsningen er helt klar (figur 2).
MERK: Hvis en badesoniker ikke er tilgjengelig, kan oppløsningen vippes med 10 % effekt til den er klar. Mikrotipset vil imidlertid slites ut raskere og er dyrere å erstatte.
Figur 2: Eksempel på hydrerte lipidfilmer. Eksempel på hydrert lipidfilm (A) før og (B) etter bad sonikering for å danne uni-lamellar vesicles. Etter bad sonikering, bør lipidoppløsningen skifte fra en mer ugjennomsiktig til gjennomsiktig løsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Mens det fortsatt er varmt, fjern hetten og klem hetteglasset inn i lydisolatorens lydisolerte kabinett, slik at mikrotuppfestet til lydskriveren senkes like under luft-/væskegrensesnittet (figur 3).
- Plasser tanken med decafluorobutane ved siden av lydisolert innhegning av sonikeren.
- Forbered et isbad og plasser det ved siden av det lydisolerte kabinettet. Dette vil bli brukt senere i trinn 2.14.
- Slå på strømbryteren for lydskriveren.
- Når systemet har startet, setter du effektnivået til 70 %. Ikke overskrid 70 % amplitude med mikrotupptilbehøret. Ikke start sonikeren nå.
- Fest en passende lengde på slangen for å lede gassen fra DFB-tankutløpet inn i den varme lipidløsningen som holdes i kabinettet. Røret skal plasseres like i halsen på hetteglasset slik at gassen kan strømme inn i hoderommet under sonikering (figur 3).
- Åpne tankventilen langsomt til gassen kan sees strømmende over lipidløsningen. Dette vil forårsake små krusninger på overflaten av væsken. Hvis gassstrømmen er for høy, vil løsningen overløpe under mikrobobleformulering.
- Start sonikeren og kjør i 10 s kontinuerlig for å generere mikrobobler. Hvis bobleoppløsningen begynner å overløpe under sonikering, må du umiddelbart stoppe sonikeren.
- Slå av lydskriveren og lukk umiddelbart DFB-tankventilen.
- Kapp raskt mikrobubble-løsningen og senk hetteglasset i isbadet for å avkjøle prøven under 55 °C (glassovergangstemperatur på DSPC)
- La mikrobobleprøvene ligge i isbadet til det er nødvendig.
Figur 3: Plassering av sondespiss i lipidløsning for å optimalisere mikrobobledannelse. Pass på at probespissen ikke berører glasset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Klargjøring av ekstruder for mikrobubble kondens
- Monter høytrykksekstruderen som beskrevet i brukerhåndboken ved hjelp av et keramisk filter på 200 nm (leveres fra produsenten).
- Plasser ekstruderen i midten av en vanntett beholder slik at utløpsrøret ikke presses mot siden eller krympes.
- Koble ekstruderen til nitrogengasstanken ved hjelp av adapteren som leveres av produsenten.
- Lag et -2 °C saltet isbad i den vanntette beholderen rundt ekstruderen ved hjelp av 400 ml vann og 10 g natriumklorid.
- Plasser enden av utløpsrøret i et scintillation hetteglass for å samle den ekstruderte prøven.
MERK: Fest røret til beholderen med tape hvis det ikke ligger flatt eller holder seg innenfor hetteglasset.
4. Påfylling av ekstruderen for mikrobobblekondensasjon
- Åpne og lukk utløserventilen for å sikre at det ikke er noe trykk i ekstruderen.
- Fjern kammerlokket og tilsett 5 ml 1x PBS til ekstruderkammeret.
- Sett på lokket igjen og pass på at det klikker godt på plass igjen.
- Åpne nitrogengasstanken slik at trykkmåleren leser 250 psi. Kontroller at trykkreguleringsventilen er i lukket stilling.
- Lukk bensintanken og åpne ekstruderkammerets innløpsventil. PBS-oppløsningen skyves gjennom systemet og ut av prøveuttaksrøret inn i hetteglasset med scintillasjon.
- Når bare gass går ut av slangen, åpner du utløserventilen og lar trykket falle til 0 psi.
- Fjern hetteglasset med scintillasjon.
5. Forkjølende mikrobobler for ekstrudering
- Åpne og lukk utløserventilen for å sikre at det ikke er noe trykk i ekstruderen. Plasser et nytt scintillation hetteglass på enden av utløpsrøret.
- Fyll en stålbeholder med 2-metyl butan og tilsett tørris for å bringe temperaturen ned til -18 °C.
- Sett mikrobubble-løsningen inn i den avkjølte 2-metylsanen slik at prøven er nedsenket i 2 minutter. Beveg hetteglasset med scintillasjon gjennom hele 2 min for å blande boblene forsiktig. Tilsett tørris etter behov for å opprettholde temperaturen mellom -15 og -18 °C. Pass på at du ikke overstiger -20 °C, ellers vil hjelpeløsningen fryse og ødelegge bobleprøven.
MERK: Trinn 5.2 og 5.3 kan også gjøres ved å kjøle ned bobleprøven i en laboratoriefryser over en lengre tidsperiode. Forsiktighet bør imidlertid brukes til å nøye overvåke temperaturen på fryseren og unngå å fryse prøven. - Etter 2 min, fjern mikrobubbles fra den avkjølte 2-metyl butan, rist forsiktig hetteglasset for å blande mikroboblene og bruk en kjølt 10 ml sprøyte for å overføre løsningen til ekstruderen.
- Fjern ekstruderkammerlokket og tilsett mikrobubble-løsningen i kammeret ved å skyve stempelet langsomt på sprøyten. Sett ekstruderhetten på plass igjen, og pass på at den klikker godt tilbake på plass.
- Kontroller at trykkreguleringsventilen og ekstruderens utløserventil er i lukket stilling.
- Åpne nitrogengasstanken til trykkmåleren viser 250 psi, lukk gasstanken og vri trykkreguleringsventilen til åpen stilling.
- Når oppløsningen har fylt scintillation hetteglasset ved utgangsslangen, og bare gass går ut av røret, åpner du trykkavlastningsventilen sakte og lar trykket falle til 0 psi.
- Plasser hetteglasset med scintillasjon i et isbad eller kjøleskap for oppbevaring.
- For langvarig lagring og minimering av spontan fordampning, lagre prøven i en standard fryser. Forsikre deg om at temperaturen er -20 °C eller høyere for å unngå frysing av prøven (den hjelpende løsningen på 20 % PPG og 20 % Glyserol vil forhindre at prøven fryser i de fleste laboratoriefrysere).
6. Separere dråper fra liposomer ved sentrifugering
- Overfør 10 ml av den ekstruderte dråpeløsningen til et 15 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger den ekstruderte prøven ved 1500 x g i 10 min ved 4 °C. En pellets bestående av DFB nanodråper vil være tydelig på bunnen av røret (figur 4). Spontant fordampede dråper vil vises på toppen av løsningen og skal kastes.
Figur 4: Eksempel på faseskift DFB-dråper pelletering etter sentrifugering. DFB nanodråper er tettere enn liposomer og vil samle seg på bunnen av sentrifugerøret i en pellets, (rød boks). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Fjern supernatanten og resuspend pellet i 2 ml 1x PBS med 20% glyserol og 20% propylenglykol.
- Bland røret forsiktig for å oppnå en homogen løsning og overfør dråpene til et mindre 2 ml sentrifugerør.
- Vask prøven to ganger til i 2 ml sentrifugerør.
- Etter siste vask, resuspend pellet i 100 μL av 1x PBS med 20% glyserol og 20% propylenglykol og lagre på is eller i fryseren til nødvendig.
7. Mikroskopi verifisering av dråpedampisering
- Lag en fortynnet dråpeløsning ved å tilsette 2,5 μl konsentrerte dråper til 7,5 μl 1x PBS.
- Forbered et mikroskopsklie med 10 μl av den fortynnede prøven. Bruk en 40x målsetting til å observere prøven og lagre bilder.
- Fjern gliden fra mikroskopet og legg den på en 65 °C varmeplate i 1 min for å fordampe nanodråper i mikrobobler.
- Bruk samme 40x mål for å observere prøven etter oppvarming for å bekrefte dråpedampning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative resultater av størrelsesfordelingen er inkludert ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS) og justerbar resistiv pulssensoranalyse (TRSP). Figur 5 viser størrelsesfordelingen av kondenserte bobleløsninger med og uten ekstrudering. Uten ekstrudering avsluttes protokollen i trinn 5.3. De avkjølte boblene kondenseres ved å ventilere prøven til atmosfærisk trykk mens de er kalde. Den kondenserte eneste prøven har en mye bredere fordeling sentrert nær 400 nm. Den ekstruderte prøven har en smalere fordeling sentrert ved 200 nm. Begge prøvene inkluderer både liposomer og dråper, som ikke kan skilles ved hjelp av DLS. Figur 6 viser et representativt utvalg av faseskiftdråper etter at de er vasket av sentrifugering for å fjerne overflødige liposomer (trinn 6.7). TRPS ble brukt til denne analysen for å evaluere både størrelsesfordeling og konsentrasjon av dråpene alene. I likhet med DLS viser TRPS dråpestørrelsene nær 200 nm. Konsentrasjonene varierer mellom 1011-1012 dråper per ml etter å ha resuspendert alle 100 μL sluttdråpeoppløsning i 1 ml. TRPS-data er i gjennomsnitt tre målinger per prøve.
Figur 7 viser representative mikroskopidata for nanodråpedampning ved oppvarming. I figur 7A (før fordampning) er noen mikrobobler tydelige innen synsfeltet (hvite piler). Dette skyldes de overopphetede nanodråpenes spontane fordampning når mikroskopsklier er forberedt og avbildet ved romtemperatur. Etter oppvarming observeres store mikrobobler (figur 7B). Dataene her fanger ikke boblene umiddelbart etter fordampning. Det er sannsynlig at koalescensen av bobler oppstår etter fordampning før de kan avbildes på nytt. Denne strategien er nyttig for å bekrefte tilstedeværelsen av nanodråper før TRPS-størrelse eller bruk in vivo.
Kjøling av boblene før kondens er et kritisk skritt for å maksimere dråpeutbyttet. Figur 8 viser representative bilder av dråper etter fordampning når det ikke utføres kjøling (figur 8A), ekstruderen avkjøles til 0 °C, men mikroboblene avkjøles ikke til -18 °C (figur 8B), og når protokollen følges nøyaktig (figur 8C).
Denne protokollen ble også implementert, som skrevet, for å kondensere ofp-bobler med lavt kokepunkt. Figur 9 viser representative bilder av OFP-dråper før og etter fordampning fra varme. Som med DFB-dråpene er en betydelig mengde koalescens sannsynligvis etter oppvarming. Dermed er boblestørrelsene sannsynligvis ikke representative for de første dråpene eller boblene ved fordampning. Pelletering og mikroskopi bekrefter tilstedeværelsen og aktiviteten til faseskift OFP-dråper.
Figur 5: Dynamiske lysspredningsdata som sammenligner dråpesuspensjoner med (heltrukket linje) og uten (stiplet linje) ekstrudering. Prøver ble målt umiddelbart etter kondensering og ekstrudering ved hjelp av et DLS lysspredningssystem. Dataene som vises her, er i gjennomsnitt tre målinger per prøve. Analyse utføres før vask. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Størrelsesfordeling av størrelsesfiltrert decafluorobutane-dråper fra TRPS-analyse. Data kommer fra et gjennomsnitt på tre målinger i ett enkelt utvalg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Eksempelmikroskopibilder av faseskiftdekafluorobutanedråper før og etter fordampning. (A) Noen bobler kan observeres før fordampning, sannsynligvis på grunn av spontan fordampning av lavkokende punkt DFB-dråper i bobler (mikroskopi utført ved romtemperatur). (B) En betydelig økning i mikrobobler observeres etter oppvarming. Skalastenger er 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Eksempelmikroskopibilder etter fordampning av faseskiftdråper kondensert ved varierende temperaturer. (A) Mikrobobler settes direkte inn i ekstruderen uten forkjøling. (B) Ekstruderen avkjøles til 0°C i et isbad og mikrobobler settes inn i kammeret og får likevekt i 2 min. (C) Ekstruderen avkjøles til 0 °C i et isbad, og mikroboblene er forhåndskjølt til -18 °C i 2 minutter før de plasseres i ekstruderen. Forhåndskjølte mikrobobler vil generelt ha mindre størrelser og et høyere utbytte av dråper. Skalalinjene er 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Eksempel på mikroskopibilder fase-skift oktfluorpropandråper før og etter fordampning. Skalastenger er 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En omfattende litteratur er tilgjengelig som diskuterer formulering, fysikk og potensielle anvendelser av mikrobobler og faseskiftdråper for in vivo-avbildning og terapi. Denne diskusjonen gjelder eksplisitt å generere lipidmikrobobler og konvertere dem til submikronfase-skiftdråper ved hjelp av et lavt kokepunkt DFB gass og høytrykksekstrudering. Metoden som er skissert her er ment å gi en relativt enkel metode for å produsere store mengder lipidmikrobobler og DFB faseskiftdråper ved å kombinere tidligere mikrobubble kondenseringsmetoder med dråpeekstrudering i et enkelt trinn. Denne metoden har fordelen av å generere høye konsentrasjoner av bobler som brukes til å danne DFB-dråper med smale størrelsesfordelinger basert på filtervalg. Den smale størrelsesfordelingen er betydelig på grunn av de resulterende konsistente prøvedamperterskler. Denne metoden er enklere og mindre kostbar enn andre vanlige metoder som brukes til å generere en smal størrelsesfordeling. I tillegg er det potensielle løsningsvolumet større enn andre sammenlignbare metoder. Protokollen kan deles inn i tre hovedkategorier: (1) Generere lipidmikrobobler, (2) Kondensere og ekstrudere mikrobobler, (3) Skille faseskiftdråper fra liposomer ved sentrifugering.
Mikrobobblegenerering ved hjelp av sondespiss sonikering er en av de vanligste måtene å lage lipidmikrobobler på. Det finnes mange publikasjoner som beskriver denne fremgangsmåten. Denne protokollen er tilpasset fra Feshitan et al.11 og optimalisert for å lage 10 ml mikrobubble-løsning, som er den maksimale kapasiteten til benk-topp ekstruderen. Denne metoden kan også skaleres opp for å generere større mengder lipid mikrobobler løsning ved å fjerne mikrotip vedlegg og øke lipid løsning volum til 100 ml eller mer, som demonstrert av Feshitan et al11. På samme måte kan større kommersielle ekstrudere som rommer volumer fra 100 ml til 800 ml brukes til å imøtekomme økte mikroboblevolumer, og dermed maksimere dråpeproduksjonen. Metodens resultater er bare begrenset av utstyret som brukes, som kan endres for å øke volumet tilsvarende. Størrelsesfiltrert dråpeproduksjon er gunstig for ulike bruksområder på grunn av mer ensartede fordampningsterskler. Fremtidige modifikasjoner av protokollen kan gjøres for å individualisere resultatene for spesifikke behov, for eksempel funksjonalisering av mikrobubble og dråpeskall for antistoffbelastning og molekylær målretting.
Metoden for ekstrudering som brukes her, brukes ofte til monodispersed liposompreparat. En lignende metode har også tidligere blitt brukt til å generere faseskiftdråper ved hjelp av høyere kokepunkt DDFP-dråper17. Det er noen kritiske forskjeller i denne beskrevne metodikken, nemlig (1) som genererer forhåndsformede mikrobobler med lavkokende punktgasser (DFB), (2) kjøling av bobleløsningen og ekstrudersystemet for effektivt å danne dråper og (3) rask påføring av trykk for å maksimere kondenseffektiviteten for dråper og unngå boblegassoppløsning10.
Kjøling av mikrobubble-prøven for ekstrudering er et kritisk skritt i å generere høye konsentrasjoner av stabile DFB-dråper. I denne protokollen plasseres hele ekstruderen i et salt som inneholder isbad og opprettholdes ved -2 °C. Ekstruderen har innløps- og utløpsporter for sirkulerende væske for å muliggjøre mer effektiv og raskere kjøling, noe som krever en sirkulerende pumpe. For DFB-dråpeproduksjon kan høye konsentrasjoner av dråper (1011-1012 dråper / ml) genereres uten et sirkulerende vannsystem. Det forventes imidlertid at dråpeproduksjonseffektiviteten kan forbedres enda mer ved å inkludere et kaldt sirkulerende bad, noe som reduserer ventetiden for kjøling. Denne eksakte protokollen har også blitt brukt til OFP-mikrobobler. Interessant nok så OFP-boblene ut til å være mer tallrike og mindre når de ble observert ved hjelp av mikroskopi (figur 9), selv om utbyttet av dråper er merkbart mindre etter vask og innsamling av pellets. Kjøling av ekstruderen ytterligere og øke trykket fra nitrogentanken vil sannsynligvis forbedre OFP-dråpeproduksjonen. OFP-dråper er også notorisk ustabile og krever skånsom håndtering og riktige lagringsforhold for å minimere spontan fordampning.
Rask påføring av trykk er et annet kritisk skritt i denne prosedyren. Bruk av ekstrudering i denne protokollen avhenger av en opphopning av trykk og umiddelbar påføring av dette trykket til mikroboblene i ekstruderkammeret. I standard lipidekstruderingsprotokoller økes trykket sakte til prøven begynner å passere gjennom membranfilteret. Eksperimentelle observasjoner indikerte at langsom påføring av trykk kan føre til gassoppløsning fra boblekjernen, i stedet for kondensering av bobler i dråper. Derfor ble det besluttet å "prime" ekstruderinntaksrørene med nitrogengass ved å lukke gassinntaksventilen og sette tanktrykket til 250 psi. Tanken må da stenges av før innløpsventilen åpnes på ekstruderen. Unnlatelse av å følge denne delen av prosedyren vil resultere i rask utvisning og tap av prøve fra ekstruderens utløp. Trykk høyere enn 250 psi kan også forårsake prøvetap på grunn av rask utvisning av prøven, selv når tanken ble lukket ordentlig. Ved klargjøring, fullføring av trinn eller bruk av ekstruderen på noen måte, bør det tas hensyn til å kontrollere trykkmålere og ventiler. Hvis trykket ikke faller til null eller løsningen ikke går ut av ekstruderen som forventet, må du først kontrollere at alle ventilene er i riktig posisjon; Trykkutløsningsventilen kan alltid åpnes for å frigjøre trykket uten å påvirke kammerinnholdet. Det er også viktig å lytte etter gass som slipper ut og se på trykkmålerne når trykket påføres ekstruderen. Generelt, hvis trykk påføres, vil enten løsningen begynne å komme ut av utgangsslangen, eller det er en lekkasje i systemet. Sørg alltid for å klargjøre systemet for å sikre at ekstruderen er riktig montert før du legger til en mikrobubble-løsning i kammeret. Over tid kan O-ringene slites ned og forhindre at systemet forsegles riktig. For best resultat, sørg for at alle deler fungerer som de skal og at det opprettes en tett forsegling. I protokollen som er skissert her, ble bare en enkelt ekstrudering utført. Det er mulig å begrense størrelsesfordelingen ytterligere ved å gjeninnføre dråpeprøven i ekstruderen og utføre flere ekstruderingstrinn (vanligvis mellom 5 og 10). Multippel ekstrudering vil sannsynligvis redusere det totale utbyttet av dråper. Gitt størrelsesfordelingene fra DLS og TRSP, er en enkelt ekstrudering sannsynligvis tilstrekkelig for de fleste applikasjoner. Til slutt er denne protokollen optimalisert for 200 nm-filtre. Trykket må sannsynligvis optimaliseres for større eller mindre filterstørrelser.
Etter at prøven er ekstrudert, bør den testes for å sjekke om boblene ble riktig kondensert i dråper. Submikrondråper er ikke synlige ved hjelp av standard lysavbildningsteknikker, så de må først fordampes for å bli mer synlige6. Det er fortsatt viktig å avbilde prøven før fordampning for å verifisere fraværet av mikrobobler eller bestemme nivået av spontan fordampning før oppvarming av dråpene. Bildebehandlingsprogramvare kan brukes til å telle og endre størrelsen på mikroboblene i bildet for å gi data om nanodråpene indirekte. Det skal imidlertid bemerkes at etter fordampning vil boblene raskt samle seg under oppvarming. Boblestørrelse og antall fra mikroskopianalyse gjenspeiler derfor sannsynligvis ikke de opprinnelige dråpestørrelsene og konsentrasjonene. Direkte målinger av dråpefordelingen og konsentrasjonen utføres best ved hjelp av justerbar resistiv pulssensor (TRPS) hvis tilgjengelig. Det er gitt representative leveringsdata fra TRSP (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil takke Dominique James i Dr. Ken Hoyts laboratorium for å gi TRSP-analyse av fordampende faseskift nanodråper
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | - | - | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | - | - | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | - | - | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | - | - | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).
- Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).
- Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects. Scientifica. 2014, 579684 (2014).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
- Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
- de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
- Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).
- Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Wu, S. -Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Li, D. S., et al. Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents. Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
- Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting. Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).
- Shakya, G., et al. Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions. Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).
- Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).
