Summary
Yağdaki su damlacık tahlilleri analitik kimya, enzim evrimi ve tek hücre analizi için yararlıdır, ancak tipik olarak damlacıkları oluşturmak için mikroakışkanlar gerekir. Burada, damlacık tahlillerini gerçekleştirmek için mikroakışkan içermeyen bir yaklaşım olan parçacık şablonlu emülsifikasyonu açıklıyoruz.
Abstract
Monodispersed damlacıklarda gerçekleştirilen reaksiyonlar, toplu olarak gerçekleştirilen eşdeğerlere kıyasla daha yüksek doğruluk ve hassasiyet gösterir. Bununla birlikte, mikroakışkanların kontrollü damlacıklar oluşturma gereksinimi, uzman olmayanlara bir engel getirerek kullanımlarını sınırlar. Burada, mikroakışkanlar olmadan monodisperse damlacıkları üretmek için bir yaklaşım olan parçacık şablonlu emülsifikasyonu açıklıyoruz. Templating hidrojel küreleri kullanarak, basit girdaplama ile monodispersed damlacıklarda örnekleri kapsülleriz. Mikroakışkan içermeyen dijital PCR gerçekleştirmek için kullanarak yaklaşımı gösteriyoruz.
Introduction
Damlacık mikroakışkanları, toplu reaksiyonlara kıyasla testlerin hassasiyetini ve doğruluğunu artırmak için picoliter damlacıklarında bölümlere ayırmadan yararlanır ve kimyasal tarama, protein mühendisliği ve yeni nesil dizilemede çok sayıda uygulamaya sahiptir1,2,3. Örneğin, dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR), kanserlerde genetik varyasyon uygulamaları, mutasyonlara neden olan hastalığın tespiti ve doğum öncesi teşhis4,5,6 ile toplu nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile karşılaştırıldığında daha fazla doğruluk sunmaktadır. Bununla birlikte, damlacık mikroakışkanlarının bir zorluğu, mikroakışkan cihazların numuneleri bölümleme gereksinimidir; mikroakışkanlar damlacık özellikleri üzerinde mükemmel kontrol sağlarken, 7,8'i inşa etmek ve çalıştırmak için özel uzmanlık gerektirirler. Sonuç olarak, damlacık tabanlı yöntemler büyük ölçüde uzman laboratuvarlarla veya nadir durumlarda ticari bir cihazın mevcut olduğu uygulamalarla sınırlıdır9,10. Damlacık testlerinin kullanımını genişletmek için, özel mikroakışkan enstrümantasyon gereksinimi aşılması gereken bir engeldir.
Bu makalede, monodispersed damlacıklarda reaksiyonları gerçekleştirmek için mikroakışkan içermeyen bir yöntem olan Parçacık Şablonlu Emülsifikasyonu (PTE) açıklıyoruz. PTE'de, templating parçacıkları basit girdaplama ile numuneyi taşıyıcı yağdaki damlacıklara sarar (Şekil 1). Sistem karıştıkça, sulu kısım, damlacıklar tek parçacıklar içerene kadar küçültme boyutundaki damlacıklara dönüşür, bu noktada daha fazla parçalanma mümkün değildir, çünkü parçacıkların kırılmasını gerektirir. Yutulan örnek, parçacıkları damlacıklarda bir kabuk olarak çevreler, böylece dağınık hücreleri, reaktifleri veya fonksiyonel moieties'leri kapsüller (Şekil 1D). Bu nedenle, PTE ortak bir girdabın ötesinde damlacık reaksiyonları gerçekleştirmek için ekipman veya uzmanlık gerektirmez. Ayrıca, damlacık üretimi mikroakışkanlarla dakikalara veya saatlere kıyasla saniyeler alır ve üretilen miktar cihaz çalışma süresiyle değil, kapsayıcı hacmiyle orantılıdır ve bu da onu son derece ölçeklenebilir hale getirir. Bu faydalar PTE'yi, mikroakışkanların pratik olmayan çeşitli durumlarda damlacık tahlillerini yapmak için ideal hale getirir. Burada PTE'yi gösteriyoruz ve ddPCR'yi yürütmek için kullanıyoruz.
Şekil 1. Parçacık şablonlı emülsifikasyon işlemine genel bakış. (A) Templating parçacıkları reaktiflerle karıştırılır. (B) Santrifüjlemeden sonra fazla reaktifler çıkarılır. (C) Şablon moleküllerinin eklenmesi yağ ilavesinden önce gerçekleşir. (D) Girdap, tek şablon molekül içeren damlacıklar üretir. (E) Sonraki termosiklon ve görüntüleme, hedef şablonun dijital damlacık analizine izin verir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
1. Parçacık şablonlanmış emülsifikasyon için hidrojel parçacıkların hazırlanması.
Parçacık şablonlı emülsifikasyon için kullanılan hidrojel parçacıklar iki farklı yöntem kullanılarak hazırlanabilir.
- Piyasada bulunan parçacıklar kullanılarak hazırlık
- PTE (örneğin, Bio-Gel P-60 Jel (Bio-Rad), 45-90 μm çapında) ile uyumlu 0,5 g kurutulmuş poliakrilamid parçacıklarını 50 mL konik tüpte 30 mL steril suya ekleyin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatır.
- Parçacıkların mikroakışkan imalatı kullanılarak hazırlık
NOT: PTE ile uyumlu poliakrilamid parçacıkları, piyasada bulunan damla yapıcılar (örneğin, QX200 Damla Jeneratörü (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent) vb.) veya özel mikroakışkan tasarım kullanılarak hazırlanabilir.- Özel master imalatı
- Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanarak yumuşak bir fotolithografi maskesi tasarlayin. Fotoğraf maskesini devre kartı filmine 10 μm çözünürlükte yazdırın.
- Silikon gofrette 3'ün ortasına 1 mL fotoresist dökün. 30 saniye boyunca 500 rpm'de ve ardından 30 sn için 1250 rpm'de döndürerek 50 μm fotoresist katmanı oluşturmak için bir spin kaplama kullanın. Çözücüyü buharlaşmak için gofretleri 15 dakika boyunca 95 °C'ye ayarlanmış bir ocak üzerine yerleştirin.
- Fotokütleyi bir kapak camı kaydırağı ile silikon gofrete sabitleyin ve gofreti 2,5 dakika boyunca 190 mW, 365 μm UV LED'in altında maruz kalın. Gofret, pozlama sonrası pişirme için 5 dakika boyunca 95 °C'ye ayarlanmış bir ocak üzerine yerleştirin.
- Fotoresist-silikon gofreti% 100 propilen glikol monometil eter asetat (PGMEA) banyosuna 15 dakikaya kadar batırarak geliştirin. Gofret taze % 100 PGMEA ve ardından% 100 izopropanol ile durulayın. Hava gofret kurutun.
- Gofreti 95 °C'ye ayarlanmış bir ocakta 1 dakika boyunca kurutarak kalan izopropanolleri çıkarın. Gofretleri Petri kabında temiz bir 3'e yerleştirin.
- Özel mikroakışkan cihazın imalatı
- Polidimetilsiloksinan (PDMS) silikon tabanını karıştırın ve reaktifi kütleye göre 10:1 oranında kürlayın. Hava kabarcıkları gözlenemeyene kadar ev vakumunun altında bir kurutucu kullanarak karışık PDMS'yi gazdan arındırın.
- Gazdan arındırılmış PDMS'yi petri kabındaki ananın üzerine dökün ve silikon gofretin tamamen batırılmasını sağlayın. Dökme sırasında oluşmuş olabilecek hava kabarcıklarını gidermek için silikon gofret ve PDMS'yi degaz.
- Silikon gofret ve PDMS'yi en az 60 dakika boyunca 65 °C'ye ayarlanmış bir fırına yerleştirerek PDMS'yi iyileştirin. Neşter kullanarak petri kabından mikroakışkan özellikleri içeren bir PDMS bloğunu dışarı atın. Silikon master'da bulunan herhangi bir özelliğe zarar vermemek için ekstra özenyi edin.
- 0,75 mm biyopsi zımbası kullanarak mikroakışkan cihazdaki giriş ve çıkışlara karşılık gelen PDMS bloğuna girişleri ve çıkışları delme. Tekrarlayan uygulama ve ambalaj bandının PDMS bloğunun yüzeyine çıkarılmasıyla toz ve partikülleri çıkarın.
- 50 mm x 75 mm'lik cam kaydırağı % 100 izopropanol ile durulayarak ve daha sonra yüzeyi havayla kurutarak temizleyin. Plazma, hem cam slaydı hem de PDMS'yi (yukarı bakan özellikler) plazma yapıştırıcısı kullanarak 1 mbar O2 plazma kullanarak 1 dakika boyunca tedavi eder.
- Plazma işlem görmüş PDMS'yi cam kaydırağa bakan özelliklere, plazma işlem görmüş tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirerek PDMS'yi cam kaydırağa yapıştırın. Yapıştırma işlemini tamamlamak için kaydırağı en az 30 dakika boyunca 65 °C'ye ayarlanmış bir fırına yerleştirin.
- Yüzey hidrofobikliğini sağlamak ve ıslanmayı önlemek için tüm mikroakışkan kanalları florlu yüzey işleme ile tedavi edin. Cihazı 65 °C'de en az 10 dakika pişirin.
- Templating parçacıklarının imalatı
- % 6.2 akrilamid, % 0.18 N,N′-metilennebis (akrilamid) ve% 0.3 amonyum persülfatdan oluşan bir poliakrilamid (PAA) çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi 28G iğne ile 1 mL şırıngaya yükleyin.
- Damlacıkların üretimi ve stabilizasyonu için hidrofloroether (HFE) yağda %5 (w/w) floroşirürekant ve %1 N,N,NN-tetrametilenilenediamin (TEMED) oluşan çözünmeyen bir sürekli faz hazırlayın. Çözeltiyi yeni 1 mL şırınna yükleyin.
- Şırıng içeren PAA ve HFE solüsyonlarını şırıng pompalarına yükleyin (örneğin, NE-501). Şırıngaya ve cihaza yerleştirilen polietilen boruyu kullanarak her iki şırıngayı mikroakışkan cihaza bağlayın. Bağlantıdan önce, pompaları borudaki havayı çıkarmak için astarın.
NOT: Modele bağlı olarak, şırıngır pompaları yerleşik giriş, üretim yazılımı veya özel bir komut dosyasıyla kontrol edilebilir (https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program mevcuttur). - Damla üretim cihazını PAA ve HFE yağ girişleri ile sırasıyla 300 μL/h ve 500 μL/h'de çalıştırın. Damlacıkların 1 mL'lik bir 15 mL toplama tüpünde toplayın ve polimerizasyon için oda sıcaklığında 3 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, pipetleme ile alt yağ tabakasını çıkarın.
- Kimyasal bir demülatör olarak 15 mL toplama tüpüne HFE yağına %20 (v/v) perfloro-1-sekizlik (PFO) 1 mL ekleyin. Karıştırdıktan sonra, 2000 x g'daki 15 mL toplama tüpünü 2 dakika boyunca aşağı çevirin. PFO/HFE üstnatantını pipetleme ile çıkarın. 1x'i tekrarlayın.
- Karıştırmak için 15 mL toplama tüpüne ve girdabına hekzanda% 2 sorbitan monooleat 2 mL ekleyin. Tüpü 3 dakika boyunca 3000 x g'da döndürün. Yüzey aktif madde/heksam çözeltisini çıkarmak için pipetleyarak süpernatantı çıkarın. 2x'i tekrarlayın.
- 5 mL TEBST tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 274 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 20 mM EDTA, %0.2 Triton X-100) ekleyin ve iyice karıştırın. 3 dakika boyunca 3.000 x g'da aşağı çevirin. Pipet ile üstnatant çıkarın. 3x'i tekrarlayın.
- 5 mL TEBST'te yeniden dirildi. Bu çözelti süresiz olarak 4 °C'de saklanabilir.
- Özel master imalatı
2. Parçacık şablonlı emülsifikasyon.
Templating parçacıklarının hazırlanmasını takiben, PTE numuneyi ve reaktifleri damlacıklarda kapsüllemek için kullanılır.
- Parçacıkları peletmek için 6000 x g'da 1 dakika santrifüjleme yaparak parçacık şablonlu emülsifikasyon için poliakrilamid parçacıkları hazırlayın, ardından süpernatantı pipetleme ile çıkarın ve steril su kullanarak yeniden ıslatın. Kalan TEBST'lerden arındırılmasını sağlamak için 3x'i tekrarlayın.
- Bir hemositometre (veya eşdeğeri) kullanarak templating parçacıklarının konsantrasyon ve çapını belirleyin. Çapları piksel cinsinden ölçerek ve mikronlara dönüştürerek tek tek parçacık çapını hesaplayın. Piksellerin mikronlara dönüştürülmesi, kalibrasyon slaytı olarak hemositometre (veya eşdeğeri) kullanılarak ve bilinen ızgara mesafesinin piksel cinsinden ölçülmesiyle hesaplanabilir.
- Tablo 1'e göre bir PCR master mix, uygun astarlar ve floresan hidroliz probu kullanarak dispersiyon fazını taze bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın. Bileşenlerin homojen dağılımını sağlamak için bir tüp rotator kullanarak nazik ajitasyon (10 rpm) altında oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yaslayın.
NOT: Parçacıkların hacmi ve hedef konsantrasyonu Poisson yüklemeye dayanmaktadır. Genel kural olarak, parçacık sayısı kapsüllenecek numune sayısından daha büyük bir sıra olmalıdır. Bilinmeyen konsantrasyon örnekleri için, Poisson yüklemesini sağlamak için bir seyreltme serisi gereklidir.
| Hacim | Reaktif |
| 100 μL | Parçacıklar (450 parçacık / μL) |
| 200 μL | 2x PCR ana karışımı |
| 18 μL | 10 μM ileri astar |
| 18 μL | 10 μM ters astar |
| 18 μL | 10 μM prob |
| 0,8 μL | Triton X100 |
| 45,2 μL | Nükleazsız su |
Tablo 1. Dijital damlacık PCR için PTE ile kullanılan PCR master karışımının hazırlanması.
- Dispersiyon fazını 6000 x g'da 1 dakika santrifüj edin ve üst yapıyı çıkarın. Çıkarılan süpernatantın hacmini kaydedin ve 2,3'te hesaplanan toplam dispers faz hacmini kullanarak pelet hacmini belirleyin.
NOT: Çıkarılan süpernatant miktarı, beklenen minimum hacim 300 μL olan partikül paketleme, çap ve konsantrasyona bağlı olarak değişecektir. - Peletin içine 2.4'ten itibaren 1.62 pg /μL Saccharomyces cerevisiae genomik DNA'sı ekleyin ve pipetleme veya kuvvetli dokunma ile iyice karıştırın.
NOT: Fazla sulu içeriğin varlığı kapsülleme verimliliğini azaltabilir. Numune hacmi pelet hacminin % 1'ini aşarsa, numuneyi konsantre edin. Numune konsantre edilemezse, PCR ana karışımını ve elde edilen pelet hacmini numune hacmine göre ölçeklendirin. PTE, küçük (10 μL) ila büyük (2 mL) hacimli templating parçacıklarının emülsifikasyonuna izin sağlar. PCR ana karışımı (2.3) ve yağ (2.6) sırasıyla parçacık peletinin hedefine (2.3) ve ölçülebilir (2.4) hacmi. - Emülsifikasyon için çözünmeyen sürekli faz olarak tüpe HFE yağına 200 μL%2 florosurfactant ekleyin. Boruyu pipetle vurarak veya boruya dokunarak/titreyerek peletin yerinden fırladığından emin olun. Sonra 30 saniye boyunca 3000 rpm'de girdap.
NOT: 3000 rpm'ye karşılık gelen ayar marka ve modele bağlı olarak değişebilir. - Emülsiyonların 1 dakikaya yerleşmesine izin verin. Alt yağ fazının 100 μL'sini çıkarın ve bu hacmi HFE yağından taze% 2 florosurfactant ile değiştirin. Karıştırmak için tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin. 3-5x veya küçük uydu damlacıkları çıkarılana kadar tekrarlayın.
3. Dijital damlacık PCR ve analizi.
- 2-5 dakikalık çökeltme sonrasında, alt yağ fazını çıkarın. Bu hacmi florokarbon yaydında %5 florosurfactant ile değiştirin (örneğin, FC-40).
- Geniş bir delikli pipet ucu kullanarak, 100 μL numuneyi 200 μL PCR tüplerine dikkatlice pipetlayın. PCR tüplerini bir termosikçiye yerleştirin ve Tablo 2'ye göre çalıştırın.
| Adım | Sıcaklık | Süre | Notlar |
| 1 | 95 °C | 2 dk | |
| 2 | 95 °C | 30 sn | |
| 3 | 50 °C | 90 sn | |
| 4 | 72 °C | 60 sn | |
| 5 | x34 adım 2 ile 4 arasında yinele | ||
| 6 | 72 °C | 2 dk | |
| 7 | 4 °C | tutmak |
Tablo 2. PTE emülsiyonları kullanarak dijital damlacık PCR için termosiklonlama koşulları.
- Floresan görüntüleme için geniş delikli pipet ucu kullanarak örneği bir sayım kaydırağı üzerine pipetleyin. Örneği 490 nm ekscitasyon ve 525 nm emisyon algılama dalga boylarına sahip bir floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin.
- Pozitif damlacıkların (Np/ NT) ve Poisson istatistiklerinin fraksiyonunu kullanarak varlığı doğrulamak ve şablon moleküllerinin sayısını (φ) hesaplamak için pozitif floresan damlacıkları (Np) ve toplam damlaları (NT) ölçün:
- %95 güven aralığını (zc = 1,96) aşağıdakilere göre hesaplayın:
- Aşağıda verilen denklemi kullanarak, 2,5 adımda eklenen numunenin hacmini (μL olarak ν) kullanarak numune konsantrasyonu (moleküller/μL) hesaplayın. Teknik çoğaltmalar kullanarak numune konsantrasyonunun ortalama ve standart sapması belirlenir.
Representative Results
Şekil 2. Parçacık şablonlı emülsifikasyon kullanarak numunenin damlacıklara kapsüllenmesi. (A) parçacık templating emülsifikasyon için kullanılan parçacıkları templating. (B) Santrifüjlemeden sonra templating parçacık peletinin süperndan ayrılması. (C) (D) tanımlanabilir sulu kabuklu parçacık şablonlu emülsifikasyondan kaynaklanan damlacıklar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
PTE'de, emülsiyonların monodispersitesi, sıcaklıklandırıcı parçacıklarınki tarafından dikte edilir, çünkü damlacıklar parçacıklardan biraz daha büyük bir çapa sahiptir. Bu nedenle, tekdüze parçacıklar kontrollü PTE kapsüllemenin merkezidir11. Kimyasal (sol-jel, emülsiyon polimerizasyonu), hidrodinamik (membran emülsifikasyonu, homojenizasyon) ve filtrasyon yöntemleri dahil olmak üzere tek tip templating parçacıkları üretmek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Özellikle mikroakışkan yaklaşımlar, üstün monodispersite (Şekil 2A) sağlar ve PTE12'deki işlevlerini geliştirmek için ek parçacık mühendisliğine izin verir. Alternatif olarak, tekdüzelikleri yeterli olsa da, tipik olarak mikroakışkan nesil11'den daha az olmasına rağmen, templating parçacıkları satın alınabilir.
PTE gerçekleştirmek için, parçacıklar kapsüllenecek örnekle karıştırılır (Şekil 1A) ve fazla süpernatant, bir PCR tüpünün altındaki parçacık peletinin fotoğrafında gösterildiği gibi santrifüjleme ve pipetleme ile çıkarılır (Şekil 1B). Stabilize edici bir yüzey aktif madde içeren kapsülleme yağı daha sonra eklenir (Şekil 1C) ve emülsiyon oluşturmak için örnek 30 saniye boyunca girdaplamadan önce hafifçe pipetlenir (Şekil 2C). Elde edilen damlacıklar, reaktiflerin, hedef moleküllerin ve reaksiyon için gerekli hücrelerin bulunduğu ilk numuneden oluşan bir parçacık çekirdeği ve sulu kabuk içerir (Şekil 2D). Damlacık mikroakışkan kapsüllemede olduğu gibi, küçük boncuklar veya hücreler gibi ayrık varlıklar rastgele ve poisson dağılımına uygun olarak kapsüllenir, ancak neredeyse tüm damlacıklar PTE fiziğinin doğası gereği templating bir parçacık içerir.
Şekil 3. Parçacık şablonlı emülsifikasyon damlacıklarının tanımlanması ve temizlenmesi. (A) Yetersiz girdaptan damlacık başına birden fazla parçacık içeren tekdüze olmayan damlacık üretimi örneği. (B) Parçacık şablonlu emülsifikasyon ve (C) yağdaki su fraksiyonunu takiben uyduların ve damlacıkların beklenen varlığı. (D) Yağ yıkamadan sonra elde eden emülsiyon. (E) Parçacık şablonlı emülsifikasyon sırasında artık süpernatanttan kaynaklanan aşırı uydu üretimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Başarılı PTE'de bile, çift veya üç çekirdekli damlacıklar vardır, ancak genellikle nadir olmaları koşuluyla reaksiyona ihmalkar bir şekilde katkıda bulunurlar. Yeterli mermileri korurken düşük bir çok çekirdekli damlacık frekansı elde etmek, yüzey gerilimi, parçacıklar arası yapıştırma kuvvetleri, numune viskozitesi, konteyner boyutu ve girdap gücü ve zamanı dahil olmak üzere proses parametrelerinin optimizasyonu gerektirir. Örneğin, kötü optimize edilmiş bir emülsifikasyon, birçok templating parçacığına sahip polidispersed damlacıklar içerebilir (Şekil 3A), girdabın numuneyi tamamen emülsifiye etmek için yetersiz olduğunu gösterir. Bu gibi durumlarda, parçacıklar arası yapışıklık ve daha düşük yüzey gerilimini azaltmak için deterjanlar eklenebilir veya girdap gücü veya zamanı artırılabilir. Bir diğer yaygın konu, küçük boş damlacıklar olan aşırı uyduların üretilmesidir (Şekil 3B). Uydular, PTE emülsiyonlarında, numune ve taşıyıcı yağın interfacial gerilimine ve reolojik özelliklerine bağlı olarak kaçınılmaz olabilir. Bununla birlikte, genellikle emülsifikasyondan önce fazla numunenin yeterince çıkarılmaması (Şekil 2B) veya çok fazla güçle girdaplanma, kabukları damlacıklardan sıyırma sonucu ortaya çıkarlar. Başarılı bir PTE emülsifikasyonunda, uydular toplam kapsüllenmiş örnek hacminin ~% 10'undan fazlasını içermelidir (Şekil 3C)11. Bu seviyede, genellikle reaksiyona ihmalkar bir şekilde katkıda bulunurlar ve göz ardı edilebilirler. Estetik amaçlı olarak taze yağ ile yıkanarak emülsiyondan temizlenebilirler (Şekil 3D).
Şekil 4. Parçacık şablonlı emülsifikasyon dijital damlacık PCR'nin değerlendirilmesi. (A) Damlacıkların floresan görüntülemesi pozitif floresan damlacıkları ve negatif floresan olmayan damlacıkları tanımlar. (B) Dijital damlacık PCR ile nadir şablonun veya düşük şablon konsantrasyonlarının tanımlanması. (C) Damlacık başına değişken sayıda şablon molekülü ile sonuçlanan bol miktarda şablon kapsülleme üzerinde. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
PTE'nin yardımcı programını göstermek için mikroakışkan içermeyen dijital PCR11 gerçekleştirmek için kullandık. İşlemi kullanarak, S. cerevisiae genomik DNA'sını içeren bir örneği kapsülledik ve termosikal olarak kapsülledik. Dijital PCR'de, güçlendirilmiş hedefler içeren damlacıklar floresan olurken, loş kalmayanlar. Bu nedenle, floresan damlacık, pozitif damlacıkları sayarak hedeflerin doğrudan nicelliğini sağlayan bir hedefi gösterir (Şekil 4A). Floresan damlacıkların sayısı böylece hedef moleküllerle ölçeklenerek hedef nadir olduğunda birkaç pozitif verir (Şekil 4B) ve bol olduğunda çok fazla pozitif verir (Şekil 4C). Diğer ayrı bileşenlerin kapsüllenmesinde olduğu gibi, hedef kapsülleme bir Poisson dağılımını takip eder ve pozitif damlacık fraksiyonunun hedef konsantrasyona (Şekil 4D) dönüştürülmesini sağlar ve böylece PTE11 ile dijital PCR gerçekleştirme yeteneğini gösterir.
Şekil 5. Ticari olarak kullanılabilen PAA kullanılarak dijital damlacık PCR gösterimi. (A) Damlacıkların floresan görüntülemesi, negatif floresan olmayan damlacıkları tanımlar. (B) Dijital damlacık PCR ile düşük şablon konsantrasyonlarının tanımlanması. (C) Dijital damlacık PCR ile yüksek konsantrasyonlarda şablonun tanımlanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu sonuçlar ticari olarak mevcut poliakrilamid parçacıkları kullanılarak tekrarlanabilir (Şekil 5) ve PTE'nin ticari olarak mevcut poliakrilamid parçacıklarıyla standart dijital PCR gerçekleştirme yeteneğini gösterir ve aynı aralıkta doğru ölçümler elde eder.
Discussion
PTE, monodispersed damlacıklardaki örnekleri girdapla kaplayarak kapsüllemek için parçacıklar kullanır. PTE, basitliğine ve erişilebilirliğine ek olarak, büyük hacimlerde damlacıkların anında oluşturulmasına izin vermek de dahil olmak üzere çeşitli ek avantajlar sağlar. Ayrıca, süreç izole bir tüpte gerçekleştirilebilir, numunelerin mikroakışkan cihazlara aktarılması ihtiyacını ortadan ortadan, genel iş akışını kolaylaştırır ve numune kirlenmesi veya kaybı için fırsatları sınırlar. Templating parçacıkları ayrıca ortaya çıkan damlacık reaksiyonlarının içeriğini tasarlamak için bir araç sağlar. Örneğin, parçacık boyutu, kimya ve ıslanabilirlik hedeflenen biyomolekül veya hücre yakalama için tasarlanmış olabilirken, enzimler, aktifler veya nükleik asitler gibi fonksiyonel moieties, tek hücre dizilimi veya fonksiyonel karakterizasyon gibi reaksiyonları kolaylaştırmak için parçacık üzerinde görüntülenebilir. Yaklaşım esnek olsa da, kullanımı için önemli kısıtlamalar vardır. Örneğin, şu anda, tüm reaksiyon bileşenlerinin kapsüllemeden önce tanıtılmasını gerektiren mikroakışkanlarla sıklıkla yapıldığı gibi damlacık eklemeleri yapmak mümkün değildir; bu, damlacıklar üretilene kadar reaktiflerin uyumlu ve kararlı olmasını gerektirir ve zahmetli kombinasyonlar durumunda, numunenin buz üzerinde hızlı bir şekilde karıştırılması ve emülsiyonu ile ele alınabilir. Alternatif olarak, ışık veya ısı ile harici olarak tetiklenebilen reaktif bileşenler kullanılabilir13. PTE böylece uzman olmayanların erişebileceği damlacık tahlillerini yürütmek için esnek ve ölçeklenebilir bir yöntem sağlar. Bu, doğuştan gelen basitliği ve esnekliği ile birleştiğinde, PTE'yi çok sayıda damlacık uygulamasının yürütülmesi ve geliştirilmesi için ideal hale getirir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu protokolü geliştiren bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-EB019453-02), Ulusal İstihbarat Direktörlüğü tarafından desteklenmiştir. Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507) aracılığıyla İstihbarat İleri Araştırma Projeleri Faaliyeti, Chan-Zuckerberg Biohub Araştırmacı Programı, Texas A&M Üniversitesi (W911NF1920013) aracılığıyla Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı ve Johns Hopkins Üniversitesi Aracılığıyla Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri Başvurdu Fizik Laboratuvarı (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Burada yer alan görüşler ve sonuçlar yazarların görüşleridir ve yukarıdaki kuruluşların veya ABD Hükümetinin ifade edilen veya ima edilen resmi politikalarını temsil ettiği şeklinde yorumlanmamalıdır. ABD Hükümeti, herhangi bir telif hakkı ek açıklamasına bakılmaksızın, resmi amaçlarla yeniden baskıları çoğaltmaya ve dağıtmaya yetkilidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
| 0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| 1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
| 27 gauge needles | BD | 305109 | |
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| 3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
| Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
| FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
| fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
| SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
| Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
| Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
| Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
| EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
| EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
| SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
| Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |
References
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology. Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Gielen, F., et al. Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS). Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).
- Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing. Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).
- Olmedillas-López, S., García-Arranz, M., García-Olmo, D. Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology. Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).
- Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).
- Yan, Y., et al. Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).
- Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y.
- The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P.
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9, 541-544 (2012).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).
- Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology. Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).
- Panda, P., et al. Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles. Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).
- Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts. ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).
