Summary
Strukturbestemmelse af makromolekylære komplekser ved hjælp af kryoEM er blevet rutine for visse klasser af proteiner og komplekser. Her opsummeres denne pipeline (prøveforberedelse, screening, dataindsamling og -behandling), og læserne er rettet mod yderligere detaljerede ressourcer og variabler, der kan ændres i tilfælde af mere udfordrende prøver.
Abstract
Kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) er en kraftfuld teknik til strukturbestemmelse af makromolekylære komplekser via enkelt partikelanalyse (SPA). Den samlede proces indebærer i) vitrifying prøven i en tynd film understøttes på en cryoEM gitter; ii) screening af prøven for at vurdere partikelfordelingen og iskvaliteten iii) hvis nettet er egnet, indsamling af et enkelt partikeldatasæt til analyse og iv) billedbehandling for at give et EM-tæthedskort. I denne protokol findes der en oversigt over hvert af disse trin med fokus på de variabler, som en bruger kan ændre under arbejdsprocessen, og fejlfinding af almindelige problemer. Med fjernmikroskopdrift, der bliver standard i mange faciliteter, vil variationer på billeddiagnostiske protokoller for at hjælpe brugerne med effektiv drift og billeddannelse, når den fysiske adgang til mikroskopet er begrænset, blive beskrevet.
Introduction
Enkelt partikel CryoEM
For at undersøge livet på molekylært niveau må vi forstå struktur. Mange teknikker til sondeproteinstruktur er tilgængelige, såsom NMR, røntgenkrystallografi, massespektrometri og elektronmikroskopi (EM). Til dato er de fleste strukturer deponeret til Protein Databank (FBF) blevet løst ved hjælp af røntgenkrystallografi. Men fra ~ 2012 og fremefter blev kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) en mainstream-teknik til bestemmelse af proteinstruktur, og brugen af den steg dramatisk. Det samlede antal EM-kort, der blev deponeret i Electron Microscopy Databank (EMDB) (pr. december 2020), var 13.421 sammenlignet med 1.566 i 2012 (figur 1, www.ebi.co.uk). I 2012 var antallet af atomkoordinater modelleret i kryoEM-tæthedskort, deponeret til FBF, kun 67, men fra december 2020 er der indtil videre deponeret 2.309 strukturer, en 35-dobling. Denne underliggende vækst i kvaliteten og kvantiteten af de producerede kryoEM-tæthedskort, undertiden benævnt »resolutionsrevolutionen«1, skyldtes en sammenkrødning af fremskridt på flere områder: udvikling af nye kameraer til billedbehandling, såkaldte direkte elektrondetektorer; ny software; og mere stabile mikroskoper2,3,4.
Figur 1: Kumulative indsendelser til EMDB fra 2012 til december 2020. Klik her for at se en større version af dette tal.
Enkelt partikelanalyse (SPA) er et kraftfuldt værktøj til at generere biologisk indsigt i en lang række prøvetyper ved at belyse strukturer med høj opløsning af isolerede komplekser5,6, herunder vira7,8, membranproteiner9,10, spiralformede samlinger11 og andre dynamiske og heterogene makromolekskulære komplekser12,13, hvis størrelser varierer efter størrelsesordener (fra 39 kDa 14,15 til snesevis af megadaltons). Her beskrives en protokol for en standardrørledning til cryoEM SPA fra prøve til struktur.
Inden denne rørledning påbegyndes, bør en renset prøve underkastes biokemisk analyse for at vurdere dens chancer for downstream-succes. Forberedelse af en egnet prøve er uden tvivl den største hindring for SBO, især for forbigående og heterogene (både kompositoriske og kropslige) komplekser. Det makromolekylære komplekse præparat skal indeholde så få forurenende stoffer som muligt, i tilstrækkelig koncentration til at give mange partikler i hver kryoEM-mikrograf og i en buffersammensætning, der er velegnet til kryoEM-analyse. Visse bufferkomponenter, herunder saccharose, glycerol og høje (~> 350 mM saltkoncentrationer, afhængigt af prøvestørrelse, egenskaber og andre bufferkomponenter), kan forstyrre vitrificeringsprocessen eller reducere signal-til-støj-forholdet i billeder, hvilket hindrer strukturbestemmelse16.
Typisk, som et minimum, størrelse udelukkelse kromatografi (SEC) og SDS-PAGE gel analyse bør anvendes til at vurdere prøve renhed17,18, men cirkulær dichroisme, funktionelle assays, SEC kombineret med multi-vinkel lys spredning, og termisk stabilitet assays er alle nyttige værktøjer til kvalitativ analyse af makromolektære komplekse præparater forud for kryoEM analyse. Resultaterne fra disse biokemiske analyser giver dog kun ringe indsigt i prøvens strukturelle heterogenitet og dens adfærd på et kryoemgitter. Af denne grund bruges negativ plet EM rutinemæssigt som et hurtigt, billigt og kraftfuldt værktøj til vurdering af kompositorisk og kropslig heterogenitet, og derfor er en god måde at fastslå, hvilken elutionsfraktion fra en rensning der er mest lovende, eller screening af forskellige buffersammensætninger19,20. Når en lovende prøve er blevet identificeret, kan vi gå videre til SPA cryoEM rørledningen. Negativ plet er ikke altid i overensstemmelse med de efterfølgende resultater, der ses i cryoEM; nogle gange ser en prøve dårlig ud af negativ plet, men forbedres, når den ses i glasagtig is i kryoEM. I modsætning hertil ser nogle gange prøver fremragende ud under negative plettrin, men kræver betydelig yderligere optimering, når de udvikler sig til cryoEM. Men i de fleste tilfælde giver negativ plet et nyttigt kvalitetskontroltrin.
Forglasning
Det barske miljø i elektronmikroskopets vakuumsystem forårsager både dehydrering og strålingsskader på faste biologiske prøver21. For at afbilde prøven i en oprindelig tilstand skal den biologiske prøve derfor bevares før billeddannelse. For rensede præparater af makromolekylære komplekser er vitrificering den foretrukne metode til at muliggøre dens visualisering ved cryoEM, samtidig med at kompleksets atomdetaljer bevares. Opdagelsen af vitrifikation som en metode til prøvepræparat var et grundlæggende fremskridt inden for elektronmikroskopi af biologiske prøver, for hvilken Dubochet blev anerkendt i Nobelprisen i kemi i 2017. Prøve vitrifikation indebærer at skabe et tyndt lag af opløsning, der indeholder prøven af interesse, typisk snesevis af nm tyk, suspenderet på en cryoEM gitter støtte. Den tynde film fryses derefter ekstremt hurtigt i en cryogen som flydende ethan ved ~ -175 °C. Frysehastigheden er ~ 106 ° C / s, hurtig nok til, at amorf eller glasøs is dannes, suspendere prøven i en tynd, solid film22.
Den oprindelige variabel til at overveje, er cryoEM gitter støtte valgt23. Et EM-gitter består typisk af en amorf carbonfilm med perforeringer (enten almindelige eller uregelmæssige) over en støttestruktur. Støttestrukturen er typisk et cirkulært metalgitter med en diameter på 3,05 mm, normalt fremstillet af kobber, men andre metaller som guld eller molybdæn (som har foretrukket termiske ekspansionsegenskaber24) kan anvendes. Nogle gange påføres en ekstra tynd, kontinuerlig støtte på tværs af gitteret, såsom grafen, grafenoxid eller et tyndt (~ 1-2 nm) amorf kulstoflag. Mens standard kryoEM gitre (oftest 400-200 mesh kobber med en perforeret (1,2 μm runde huller adskilt af 1,3 μm (r1.2/1.3), eller 2 μm adskilt af 2 μm kulstof (r2/2)) kulstof støtte- selv om mange forskellige mønstre er tilgængelige) er blevet anvendt i langt de fleste strukturer rapporteret til dato, nettet nye teknologier med forbedret ledningsevne og reduceret prøvebevægelse er blevet rapporteret25 . Udvalgte gitre udsættes for en glow-udledning/plasmarensningsbehandling for at gøre dem hydrofile og modtagelige for prøveudbringning26.
Efter glød-udledning, den næste fase er tynd film dannelse. Denne tynde film er mest almindeligt dannet ved hjælp af filterpapir til at fjerne overskydende væske fra nettet. Mens dette kan udføres manuelt, en række springet frysning enheder er kommercielt tilgængelige, herunder Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) og CP3 (Gatan). Med disse enheder påføres ~3-5 μL prøve i opløsning på EM-gitteret, efterfulgt af blotting væk overskydende opløsning ved hjælp af filterpapir. Gitteret, med en tynd film suspenderet på tværs af det, er derefter kastet i flydende ethan afkølet af flydende nitrogen (LN2) til ~ -175 °C. Når nettet er frosset, holdes det ved en temperatur under devitrifikationspunktet (-137 °C) før og under billeddannelse.
Prøvescreening og dataindsamling
Efter vitrificering af et kryoEM-gitter er næste fase at screene nettet for at vurdere dets kvalitet og afgøre, om nettet er egnet til at fortsætte med dataindsamling i høj opløsning. Et ideelt kryoEM gitter har glasagtig is (i modsætning til krystallinsk is) med istykkelsen lige tilstrækkelig til at rumme den længste dimension af prøven, hvilket sikrer, at den omgivende is bidrager med så lidt støj til det resulterende billede som muligt. Partiklerne i isen skal have en størrelse og (hvis kendt) form i overensstemmelse med biokemi, og ideelt set være monodisperse med en tilfældig fordeling af partikel orienteringer. Endelig bør nettet have tilstrækkeligt mange områder af tilstrækkelig kvalitet til at opfylde den ønskede dataindsamlingslængde. Afhængigt af prøven kan dette tage mange gentagelser af vitrifikation og screening, indtil der produceres optimale gitre. Både heldigvis og desværre er der et stort udvalg af variabler, der kan empirisk testes for at ændre partikelfordelingen på kryoEM-gitre (gennemgået i16,27). I dette manuskript vises repræsentative resultater for et membranproteinprojekt10.
Når et passende gitter er blevet identificeret, kan dataindsamlingen fortsætte. Flere modeller af kryo-transmission elektronmikroskoper til biologiske prøver er optimeret til at indsamle data med høj opløsning på en automatiseret måde. Typisk indsamles data på 300 kV- eller 200 kV-systemer. Automatiseret dataindsamling kan opnås ved hjælp af software, herunder EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 og SerialEM31,32. En automatiseret dataindsamling med moderne detektorer resulterer typisk i terabyte (TB) af rå data i en 24 timers periode (gennemsnitlige datasæt er ~ 4 TB i størrelse).
På grund af covid-19-restriktionerne i store dele af verden (skrivetid december 2020) er mange mikroskopifaciliteter flyttet til at tilbyde fjernadgang. Når gitrene er blevet indlæst i autoloaderen af et mikroskop, kan dataindsamling udføres eksternt.
Billedbehandling og modelbygning
Hvis en dataindsamlingssession typisk kan være 0,5-4 dage, kan efterfølgende billedbehandling tage mange uger og måneder, afhængigt af tilgængeligheden af computerressourcer. Det er standard for indledende billedbehandling trin, nemlig bevægelse korrektion og kontrast overførsel funktion (CTF) skøn til at finde sted 'on the fly' 33,34. Til downstream-behandling er der en overflod af softwarepakker til rådighed. Partikler 'plukkes' og udvindes af mikrografer35,36. Når partikler er ekstraheret, en standard protokol ville være at behandle partiklerne gennem flere runder af klassificering (i begge to dimensioner (2D) og tre dimensioner (3D) og / eller fokuseret på specifikke regioner af interesse) for at nå en homogen delmængde af partikler. Denne homogene delmængde af partikler er derefter gennemsnit sammen for at producere en 3D-rekonstruktion. På dette tidspunkt korrigeres data ofte yderligere for at producere det højest mulige kvalitetskort, for eksempel gennem CTF-raffinement, distortionkorrektioner37 og bayesisk polering38 . Resultatet af denne billedbehandling er et 3D cryoEM-kort over den biologiske prøve af interesse. Opløsningsområdet, der nås i et 'standard' automatiseret enkeltpartikeleksperiment fra et gitter af tilstrækkelig kvalitet, med data indsamlet på et 300 kV mikroskopsystem er typisk mellem 10 Å og 2 Å afhængigt af proteinkompleksets størrelse og fleksibilitet. Med en ideel prøve er opløsninger på ~ 1,2 Å nu nået ved hjælp af SPA-arbejdsgange5. Mens denne protokol detaljer skridt i retning af at opnå en EM tæthed kort, når dette er i hånden det kan fortolkes yderligere ved montering og raffinering af en protein model (hvis opløsningen er < 3,5 Å) eller building de novo39. Data i forbindelse med strukturbestemmelseseksperimenter kan deponeres i online offentlige depoter, herunder EM-tæthedskort (Electron Microscopy Data Bank)40, deraf følgende atomkoordinater (Protein Data Bank)41 og rå datasæt (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
I denne protokol bruges det ydre membranproteinkompleks RagAB (~340 kDa) fra Porphyromonas gingivalis som et eksempel på makromolekylær kompleks10 (EMPIAR-10543). For de nye til cryoEM, støtte til prøver gennem denne rørledning fra prøve til struktur er tilgængelig, med forbehold for peer review, gennem finansierede adgangsordninger såsom iNEXT Discovery og Instruct.
Protocol
1. Grid Vitrification
BEMÆRK: For alle trin i trin 1 og 2 skal du sikre, at alt værktøj er rent, tørt og ved stuetemperatur, før du køler dem til LN2-temperatur ved hjælp af frisk dekanteret LN2 for at reducere isforurening. Hvor det er muligt, arbejde i et fugtighedsstyret miljø med < 20% relativ luftfugtighed. Sørg for, at der er passende personlige værnemidler og H&S-dokumentation på plads, inden arbejdet påbegyndes.
- Sørg for, at prøven af interesse er klar til prøveforberedelse.
- Vælg passende kryoEM-gitre, og sørg for, at disse er blevet gjort hydrofile ved hjælp af glødeudladning eller plasmabehandling. En bred vifte af systemer og variationer til protokollen er tilgængelige, men alle indebærer at placere gitre i en glød udledning / plasma rengøringssystem og kører et program, som vil pumpe kammeret til et ønsket vakuum niveau, før der indføres en bestemt gas blanding / kemisk damp eller luft i systemet. En elektrisk strøm ledes gennem systemet, iioniserer gaspartiklerne og inducerer overfladen af de gitre, der skal gøres mere hydrofile.
- Start stempelfrysningsenheden til netvitrificering ved at tænde for systemet ved hjælp af strømkontakten på bagsiden, og vent på, at berøringsskærmen indlæses.
- Ved hjælp af den medfølgende pen eller fingre, i konsollen, indstille den ønskede arbejdstemperatur i kammeret (rækkevidde til rådighed er 4-60 °C, anbefales til de fleste makromolekyler 4-6 °C).
- Fyld luftfugteren med 50 mL type II laboratorievand ved hjælp af en sprøjte, via gummislangen i bunden af luftfugter. Sørg for at fjerne eventuel fanget luft i sprøjten, inden du fylder. Pas på ikke at overfylde luftfugter eller vand vil udstråle ind i kammeret. Når luftfugteren er fyldt, trække sig tilbage sprøjten stempel med 5-10 mL at skabe et vakuum forsegling.
- I Konsol skal du indstille den ønskede relative luftfugtighed for kammeret (det tilgængelige interval er 0-100%, fugtighed på 95-100% bruges typisk). Lad fugtigheden være indstillet til at 'slukke' indtil umiddelbart før gitterfremstilling, så kammeret ikke bliver for vådt.
- Få fat i stempelfrysning enhed pincet og filter papir skåret til den korrekte størrelse til at passe på puder, enten købt eller ved hjælp af et stempel til at skære en blænde af den passende størrelse.
- Forbered cryogen til frysning af dyk.
- Placer metal kryo-grid boksholderen, cryogen kop og metal edderkop ben i kølevæske beholderen.
- Køle beholderen af ved at fylde det ydre kammer med LN2. Hold det ydre kammer toppet op for at dække toppen af kryogitterboksholderen. Tilsæt ~ 1 cm ekstra LN2 til cryogen kop til at hjælpe ekvilibrering af systemet til LN2 temperatur.
BEMÆRK: Anti-forureningsringen kan bruges til at begrænse fugtig luft, der kondenserer omkring kryogenkoppen, og som fører til kryokølingsmiddel/ethanforurening. Dette er generelt ikke påkrævet i et fugtighedsstyret miljø. Hvis du bruger antikontamineringsringen, skal du passe på ikke at overfylde beholderen med LN2 , eller den kan spildes, når ringen trykkes ind i beholderen senere i processen. - Vent 3-5 minutter for at observere kogningen af edderkoppebenene, og vent derefter yderligere 3 minutter for at sikre, at cryogen koppen er tilstrækkelig kold til at kondensere vitrifikationsmediet.
- Flydende cryogen (flydende ethan) i cryogen kop.
- Tag ethancylinderrøret med tynde slanger og en dyse for at dispensere gassen. En P200 pipette tip med blænden åbnet ved at afskære selve spidsen ved hjælp af et barberblad er ideel her. En bredere blænde er nødvendig for at forhindre ethan størkne på spidsen og blokere strømmen af gas.
- Sørg for cryogen kop ikke indeholder nogen resterende LN2, tage ethan gas dyse og placere den i cryogen kop. Brug gasflaske regulator, starte en lav strømning og dispensere cryogen gas ind i cryogen kop til at kondensere gassen. Hold spidsen, hvorfra gassen strømmer direkte presset mod væggen i cryogen kop, men flytte den forsigtigt frem og tilbage i en tappe bevægelse mod overfladen. Regulere strømmen af gassen til at tillade en lav, stabil strømning til at begynde at kondensere / blødgøre på en kontrolleret måde i cryogen kop.
- Fyld koppen til lige under sølv edderkop fælg og stoppe gasstrømmen, derefter fjerne gasledning omhyggeligt for at undgå at forurene de omkringliggende LN2 med ethan.
- Fyld kølevæskebeholderen op med LN2, idet du er meget omhyggelig med ikke at spilde nogen i den flydende ethan.
- Lad edderkopperne stå på plads i ~ 3-5 min for at sikre, at den flydende ethan er ekvilibreret til en tilstrækkelig kold temperatur. Cryogen vil begynde at se overskyet / lidt uigennemsigtig. Dette indikerer, at det er tæt på sit frysepunkt. På dette stadium skal du bruge pincet til at fjerne edderkoppen. Så længe LN2 holdes inden for beholderen omkring cryogen kop, vil ethanen nu forblive flydende og egnet til vitrificering for 1-2 timer. Til formål dog at afslutte proceduren så hurtigt som muligt, især i ikke-fugtighedskontrollerede rum, for at reducere isforurening.
BEMÆRK: Hvis edderkoppen ser ud til at være 'fast på', skal du bruge en metalgenstand som en møtrik og holde fast i edderkoppens ben for at varme dem lidt op og derefter fjerne benene.
- Forbered stempelfrysningsanordningen og tilbehøret til prøvevitrificering.
- Tilføj gitter opbevaring kasser til metal cryo-grid boks indehaveren og i hele proceduren sikre LN2 holdes toppet op til lige over niveauet af gitter kasser (normalt hver ~ 5 min).
- På skærmen med stempelfrysningsanordningen i feltet Procesparametre input de valgte parametre, herunder: blot tid (det tidspunkt, hvor springet fryser enhed pads vil komme sammen), kraft (afstanden af blotting pads fra nettet, som ændrer gradienten af isdannelse) og total (antal gange blotting pads vil komme ind for at opfylde). Vælg disse parametre baseret på makromolekylets individuelle frysningsanordning og adfærd. Typiske værdier er en blot kraft mellem 0 og 5, blot tid fra 1-6 s og en blot i alt 1. Typisk ventetid (tid mellem påbegyndelse af blot, og blot begyndelsen) og dræn tid (tid efter blotting før kaster) er 0-2 s.
BEMÆRK: Afhængigt af brugerindstillinger kan der vælges yderligere indstillinger i sektionen Indstillinger, diverse , herunder Brug fodpedal til at gå videre til næste trin på hvert tryk, Spring gridoverførsel over (springer det sidste trin over, hvor pincetarmen hæves lidt), slår fugtighed fra under processen (mens prøven anvendes, stopper aktiv befugtning af kammeret, hvilket kan gøre det sværere at se gitteret) og autoraise Ethanelift (kombinerer trin af pincet bliver rejst ind i kammeret og hæve kølevæske beholder-springer Raise ethan container trin). Her er alle disse muligheder slået til. - Sæt kølevæskebeholderen sikkert på den bevægelige platformarm under kammeret
- Indsæt frisk blotting papir på hver blotter arm og sørg for plast ring klip er sikret. Hvert filterpapir tillader 16 blotter (armene roterer blotting papir). Tryk på knappen Nulstil blot papir i sektionen Kontrolelementer .
- Kør 1 fuld cyklus af den springet frysning enhed vitrifikation proces for at sikre, at hver bevægelig del opfører sig som forventet.
- Tryk (eller brug fodpedal) for at placere nyt gitter, derefter startprocessen, og derefter behandle derefter Fortsæt. På dette stadium skal du se for at sikre, at blottingarmene kontakter hinanden som forventet.
- Tænd '' luftfugteren. Vanddamp vil blive produceret (så længe den indstillede fugtighed er højere end i øjeblikket i kammeret).
- Prøven af interesse kan nu vitrified. Brug fodpedalen eller Placer New Grid og kaste stangen vil stige ned af kammeret tillader pincet, der skal fastgøres i mount.
- Ved hjælp af stempelfrysningsanordningen pincet skal du afhente det ønskede glødudledte / plasmarensede kryoEM-gitter og sørge for at bemærke, hvilken side der er den rigtige side, der skal bruges til prøveapplikation ifølge gitterproducenten. Saml nettet op ved fælgen, idet du sørger for at undgå overdreven / unødvendig kontakt med pincet, da dette vil beskadige støtten. Fastgør gitteret i pincet ved at flytte det sorte klip ned til den ridged del af pincet. Gitteret skal holdes sikkert, men klippet bør ikke være for langt nede, da det vil kontakte blotting pads, hvilket fører til uudslettelig blotting, og senere skal pincet holdes under dette punkt, når du slipper klippet.
- Placer den springende fryseanordning pincet holder cryoEM gitter på pneumatiske arm med den korrekte side vender din dominerende hånd. Udformningen af den springet frysning enhed pincet og kammer er sådan, at prøven kan anvendes gennem enten højre eller venstre side af kammeret, i henhold til handedness af brugeren.
BEMÆRK: Anvendelse af prøven på forskellige sider med de samme blotting parametre sjældent resulterer i sammenlignelige resultater, så venstrehåndede forskere kan være nødvendigt at tune deres blotting parametre uafhængigt af deres højrehåndede kolleger. - Tryk på Startproces, og gitteret i pincet vil blive taget ind i kammeret, og kølevæskebeholderen vil blive hævet.
- Tryk på Proces , og pincet flytter gitteret til det sted, hvor en pipette kan bruges til at anvende prøven på gitteret. Åbn sideporten mod den korrekte side af gitteret, og anvend prøven ved pipettering, og sørg for, at pipettespidsen ikke rører gitteret, da det kan føre til beskadigelse af gitterstøtten/bøjningen af gitteret, men dispenser væsken tæt nok, så dråben dispenserer på gitteret. Typisk påføres 3-5 μL.
- Tryk på Fortsæt , og bruger foruddefinerede parametre vil blotte gitteret og derefter kaste pincet med gitteret monteret i kølevæskekoppen til prøvevitrificering. Pincet vil stige ned i forbindelse med armen holder kølevæskebeholderen og kølevæsken, så gitteret nedsænkes i kryogen.
- Overfør nettet fra cryogen kop til nettet opbevaringsboks nedsænket i LN2.
- Tag pincet fra pincetarmen og pas godt på ikke at kontakte det vitrified gitter med siderne af cryogen koppen. Juster grebet, så pincet holdes behageligt. Så hurtigt og omhyggeligt som muligt, flytte nettet fra cryogen til LN2. Med den ene hånd skal du holde pincet lukket ved hjælp af fingrene og med den anden hånd skubbe det sorte klip opad af vejen og holde pincet lukket. Juster grebet, og du kan manipulere gitteret ind i gitterlagerboksen.
- Gentag trin 1.10-1.19, indtil alle gitre er lavet (en typisk session vil indebære at gøre 4-12 gitre). Gem alle gitterlagringsbokse, der indeholder gitre, i LN2-dewar indtil næste faser.
2. Klipning gitre til lastning i en autoloader mikroskop
- Klip gitre i autogrid-assemblyen i henhold til den protokol, der tidligere er beskrevet 28.
3. Fastgør fjernlog på mikroskoper
BEMÆRK: Med COVID-19-kontroller i skrivende stund, men også med miljøhensyn i forbindelse med internationale rejser, har flere mikroskopifaciliteter tilbudt tjenester, hvor brugeren opererer eksternt. Implementeringsmetoden for dette vil variere afhængigt af den lokale it-konfiguration af hver facilitet og behovene i dens interne og eksterne brugerfællesskab. Her beskrives processen med fjernadgang til cryoEMs hos eBIC og styring af mikroskopet via EPU-software.
- Fjernadgang logge ind på cryoEM's. Fjernlogon medieres via NoMachine-software for at få adgang til mikroskopunderstøttelses-pc'en og er konfigureret til kun at give adgang til brugere, der er registreret ved et besøg via brugernes FedID-logonoplysninger. Access forbliver kun aktiv i hele sessionens varighed.
- Åbn NoMachine, og start en ny NX-forbindelse for at nx-cloud.diamond.ac.uk med adgangskodegodkendelse.
- Åbn forbindelsen, og log ind med adgangskoden til brugernavnet fedid@fed.cclrc.ac.uk og FedID. Dobbeltklik på det ikon, der svarer til det relevante mikroskop, fra de tilgængelige indstillinger for at åbne en forbindelse til den relevante support-pc.
- Angiv brugernavn clrc\FedID og adgangskode på Windows-logonskærmen.
- Åbn TeamViewer-software fra skrivebordsikonet, og opret forbindelse til PartnerID: TEM med den medfølgende adgangskode. Dette opretter forbindelsen fra support-pc'en til TEM-pc'en. Knappen Næste skærm på båndet TeamViewer kan bruges til at skifte mellem brugergrænsefladen i mikroskopet og EPU-vinduet.
- Mikroskopfunktioner kan derefter styres af brugere direkte via EPU-grænsefladen.
4. Omladning af prøver i et autoloadermikroskop og screening for is- og prøvekvalitet
BEMÆRK: I dette afsnit bruges et mikroskop med en autoloader og EPU-software til prøvescreening, men dette kan opnås ved hjælp af anden software og et sideindgangssystem og cryoEM'er fra andre producenter.
- Indlæs udklippede gitre i autoloaderen til mikroskopet som tidligere beskrevet28.
- Under fanen Autoloader i brugergrænsefladen i mikroskopet skal du gå ud med dialogboksen Indstillinger ved hjælp af pilen og trykke på knappen Lager . Dette vil sekventielt kontrollere hver position i kassetten for at afgøre, om der er en patron til stede. Besatte slots vil blive mærket med blåt. Hvis alle besatte pladser er tilknyttet, skal du trykke på knappen Lager igen for at stoppe efter den aktuelle position, ellers lade den køre, indtil alle besatte pladser er tilknyttet. Mærk alle besatte pladser med prøvedetaljerne i de medfølgende kasser.
- Marker det gitter, der skal overføres til mikroskopkolonnen, og klik på Indlæs. Slotetiketten bliver fra blå til gul, når gitteret er blevet indlæst på scenen. Fortsæt med at screene gitrene.
- Åbn EPU-software. Vælg Anskaffelsesoptik og indstillinger på siden Forberedelse, og vælg derefter atlasforudindstillingen i rullemenuen. Vælg passende forudindstillinger for stråleindstilling (f.eks. 64x nominel mag, spotstørrelse 5, Microprobe, med et oplyst område i det parallelle område til Falcon-detektor - for yderligere information at vælge stråleindstillingsforudindstillinger se28). Tryk på Indstil for at skubbe parametrene til mikroskopet.
- Tryk på Åbn kolonneventiler , og indsæt FluScreen. Kontroller, at en stråle er synlig og tilstrækkeligt spredt og centreret til at dække detektoren. Hvis det er nødvendigt, skal du navigere til et tyndere område af gitteret ved hjælp af joysticket eller scenemenuen for at styre scenebevægelser i X og Y.
- Løft FluScreen, og tag et billede ved hjælp af knappen Eksempel i EPU. Baseret på det erhvervede billede kan dosis øges ved at flytte til et lavere antal spotstørrelse og omvendt.
- Gå til Atlas-siden på EPU, og tryk på Ny session. Vælg MRC-billedformatet, og angiv et passende mappenavn og en passende placering til lagring af screeningssessionen, og klik derefter på Anvend.
- Vælg Screening i menuen til venstre. Markér afkrydsningsfelterne ud for hvert gitter for at få en atlasmontage anskaffet. Start screeningssessionen på EPU. Der vil blive anskaffet et atlas for hvert kontrolleret gitter, og en række tilgængelige gitterkvaler vil blive angivet efter færdiggørelsen. Hvert atlas kan ses ved at fremhæve det på screeningssiden, komplet med en mark-up, der viser gitter firkanter med en lignende forudsagt istykkelse grupperet efter farve.
- Når du er færdig, skal du gennemgå de indsamlede atlasser og identificere de net, der er egnede til at vurdere prøvekvaliteten ved højere forstørrelser (dvs. dem med et passende antal gitterkvaler, som hverken er tørre eller tilslørede af tyk is). Fremhæv det valgte gitter i EPU-screeningsmenuen, og klik på Indlæs eksempel.
- Brug forudindstillingerne for bjælkeindstilling (se 28 for at få en forklaring på forudindstillinger for bjælkeindstilling, der ønskes for hvert trin) og eksempelfunktionen til at undersøge de ønskede gitterkvartaler mere detaljeret.
- Vælg det gitter, der i øjeblikket er indlæst, i Atlas-screeningsmenuen, og flyt scenen til en gitterklud, der indeholder udfyldte huller, ved at højreklikke over den ønskede placering på gitterbilledet og vælge flyt til gitterklud.
- Gå tilbage til EPU, Forberedelse side og vælg GridSquare forudindstillet.
- Åbn siden EPU, Autofunktioner, og kør Auto-eucentrisk efter trin tilt med GridSquare forudindstillet for at flytte prøven til eucentrisk højde.
BEMÆRK: Auto-eucentrisk af stråle tilt er også tilgængelig, hvilket er hurtigere, men typisk mindre præcis end auto-eucentrisk af fase tilt. - Tag et nyt GridSquare Preview-billede i EPU, Forberedelse. Bemærk de forskellige grå værdier på tværs af forskellige huller, der angiver forskellige istykkelser. Flyt scenen hen over et hul ved hjælp af højreklik > flyt fase her. Vælg indstillingen Hul/Eucentric højde og Eksempel.
BEMÆRK: Afhængigt af den molekylvægt og form af partiklen af interesse, kan det være muligt at identificere det på Hole / Eucentric Height forstørrelse. - Vælg Forudindsamling af data , og angiv en forstørrelse, der gør det nemt at identificere partiklerne (svarende til et objektudtagning af generelt <2 Å/pixel). Indstil defokusforskydningen til ~-3 til -5 μm med en eksponeringselektrondosis på ~40-80 e-/ Å2.
- Gentage gennem trin i 4.4 for at vurdere en række istykkelser til partikelfordeling, orientering og forurening på tværs af nettet. Partikelfordelingen kan variere tæt på kanterne versus hullets centrum, og derfor er det vigtigt at undersøge forskellige steder med hullet.
- Screen alle gitre, der viser løfte fra atlasser som havende tilstrækkelige gitter firkanter. Opbevar disse i mikroskopet og fortsæt til dataindsamling ved hjælp af EPU, eller fjern prøverne fra mikroskopet og opbevares under LN2 , indtil dataindsamlingen er planlagt.
5. Indsamling af enkeltpartikel kryoEM-dataindsamling (med fokus på fjerndrift)
BEMÆRK: En detaljeret protokol for dataindsamling med EPU er beskrevet i producentens manual og andre steder28. Her fremhæves ændringer af denne protokol til fjerndrift (nemlig reduktion af brugen af håndpanelerne til at udføre opgaver og ved hjælp af softwarebaserede alternativer).
- Medmindre man allerede er blevet indsamlet under sessionen, skal du indsamle et Atlas til gitteret.
- Definer hver af de bjælke indstilling presets i henhold til de eksperimentelle behov i projektet.
- Udfør kalibreringer af billedskift28.
- Konfigurer EPU-sessionen.
- I EPU skal du vælge EPU-siden og derefter sessionsopsætningen, vælge Ny session og derefter Ny fra indstillinger.
- Vælg Ny session , som vises en pop op-up med mulighed for at bruge tidligere indstillinger. Ja indlæser automatisk indstillingerne fra den forrige EPU (dvs. prøvebærer, defokuseringsområde, autofokusindstillinger, gittertype) i den aktuelle EPU-session. Hvis du vælger Ny fra indstillinger, kan brugeren vælge en fil med gemte indstillinger (dvs. defokuseringsområde, indstillinger for autofokus, gittertype), og disse oplysninger forudindlæses i EPU.
- Udfyld sessionsnavnet med noget informativt. Den lokale facilitet kan foreslå en navngivningskonvention.
- Vælg Manuel i Type.
- I anskaffelsestilstand skal du vælge nøjagtig hulcentrering eller hurtigere anskaffelse.
- Vælg det ønskede format i billedformat .
- Vælg en passende lagermappe, og EPU opretter en mappe med sessionsnavnet.
- Vælg den relevante prøvebærer, afhængigt af hvilken gittertype og hulafstand der anvendes (f.eks. Quantifoil 1.2/1.3), og tryk på Anvend. I denne protokol beskrives processen til generering af en skabelon til en almindelig række huller
- Vælg en indledende gitterplads, og angiv en anskaffelsesskabelon.
- Gå Firkantet markering, hvis alle firkanter er grønne, skal du klikke på Fjern markeringen af alt øverst til venstre.
- Åbn felter (højreklik > åbne felt). Vælg en firkant (højreklik > tilføje, højreklik > Flyt fase til gitter firkant).
- Gå til Hole udvælgelse og tryk auto eucentrisk. Vent, indtil dette er færdigt, og der er taget et Grid Square-billede. Hvis autofunktionen mislykkes, kan det skyldes, at højden er betydeligt slukket. hvis det er tilfældet, kan den justeres manuelt ved hjælp af FluScreen på Grid Square-forstørrelsen.
- Mål hulstørrelse. Flyt og juster de gule cirkler, så de er over hullerne med korrekt størrelse og afstand.
- Tryk på Find huller. Kontroller, at hullerne er fundet korrekt. Hvis ikke ændre hullet størrelse og finde huller igen. Gentag dette, indtil det finder hullet korrekt. Hvis det konsekvent mislykkes, kan du overveje at flytte til et lavere tal (lysere) staffagestørrelse ved gitterkvartal forstørrelse.
- Brug filteriskvalitets histogrammet til højre for at justere hulvalg. Dette kan være nyttigt at udelukke områder med tyk is og tynd is. Dette vil blive husket for fremtidige gitter firkanter valgt under denne session.
- Optimer hulvalg med værktøjerne i menuen Vælg øverst. Klik f.eks. på Fjern huller tæt på gitterbjælken.
- Gå til Skabelondefinition, og tryk på Hent.
- Klik på Find og centrer hullet. Der vil nu være et billede af et hul med en gul cirkel rundt om hullet.
BEMÆRK: Hvis det kæmper for at finde hullet, skal du indsætte den objektive blændeåbning. Hvis det stadig ikke kan finde hullet, kan du prøve at øge eksponeringstiden for den forudindstillede højde i hullet/eucentrisk højde eller øge defokuseringen for denne forudindstillede eller placering af billedet. En stor defokuseringsændring kan ændre justeringen af billedskiftet. - Skift forsinkelsen efter faseskift og forsinkelsen efter billedskifttiderne til 1-5'ere.
- Check Maximum Image shift værdi (hvis indstillingen er tilgængelig) er som ønsket. Hvis der anvendes aberrationfri billedskiftsamling, defineres denne værdi i EPU-konfigurationsfilen, ellers er 5 μm en standardværdi.
- Klik på Tilføj anskaffelsesområde, og klik derefter et vilkårligt sted på billedet. Flyt anskaffelsesområdet til den ønskede placering (dvs. ved kanten af et hul), så erhvervelsesområder ikke dobbelt eksponeres med strålen (pladsen i den grønne cirkel repræsenterer detektorområdet, den grønne cirkel er strålediameteren).
- Øverst til højre skal du tilføje defokusområdet. Tilføj derefter andre anskaffelsesområder. En typisk defokuseringsliste for et membranproteinprojekt er -0,8 til -3 μm defocus.
- Klik på Tilføj autofokusområde , og klik et vilkårligt sted på billedet. Flyt autofokusområdet til kulstofet omkring et hul. Standard praksis er at autofokusere efter centring, når du bruger AFIS, eller hver 5-15 μm, afhængigt af z-højde variation på tværs af pladsen.
- Klik på Tilføj afdriftsmålingsområde, afdriftsmåling udført én gang pr. gitterkvart med en fast tærskel på 0,05 nm/s er en standardindstilling. Afdriftsmålingsområdet kan (og det er en god ide at) overlappe direkte med autofokusområdet. Sørg for, at hverken drift eller autofokus område overlapper med et anskaffelsesområde.
BEMÆRK: Skabelonen kan kontrolleres ved hjælp af funktionen til skabelonkørsel. Dette er en god idé at se, om erhvervelse områder skal flyttes (f.eks for meget / ikke nok kulstof i billeder), men er ikke nødvendigt. - Gå tilbage til Square-markeringen, og vælg de felter, der skal vælges til anskaffelse, på gitteret. Brug antallet af anskaffelsesområder og den forventede dataindsamlingshastighed (fra facilitet baseret på detektorer og eksperimentel opsætning) til at forudsige, hvor mange anskaffelsesområder der kræves.
- Når alle ønskede firkanter er markeret, skal du trykke på Forbered alle pladser.
- Når hver firkant er indsamlet, navigere mellem gitter firkanter og finjustere hullerne ved hjælp af markeringen børste.
- Flyt til et scenested over prøve og brug automatiske funktioner til at indstille eucentrisk højde. Udfør mikroskopjusteringer som tidligere beskrevet28, men i stedet for at udføre komafri justering og korrigere for objektiv bygningsfejl manuelt, skal du gøre brug af justeringsværktøjer i softwaren. Kort sagt, indstille erhvervelse stråle betingelser, sikre den objektive blænde (OA) er fjernet, og scenen er placeret over en stråle stabilt område af prøven i eucentrisk højde. Udfør komafri justering inden for auto-funktioner, før genindsætte og centrering af OA og korrigere den objektive linse bygningsfejl med EPU. Sørg for, at begge justeringer konvergerer på passende værdier (< 150 nm koma og tæt på nul bygningsfejl.
- Før du starter den automatiserede erhvervelse køre, sikre autoloader turbo pumpen er slukket, og den objektive blænde er indsat.
- I Automatiseret anskaffelse skal du trykke på Startkørsel for at påbegynde automatisk dataindsamling.
6. Billedbehandling for at give EM-tæthedskort
BEMÆRK: De fleste cryoEM-faciliteter tilbyder forbehandling af mikrograffilm 'i farten'. Der er en bred vifte af softwarepakker og tilgange til rådighed for dette, herunder RELION-rørledninger28,33, cryoSPARC43, Scipion34 og WarpEM44. En RELION-baseret pipeline er beskrevet her, og det antages, at brugeren har flyttet mikrograffilmene til et passende lagersted med adgang til computerressourcer. Der gives en oversigt over processen og de repræsentative resultater for et membranproteinprojekt, en detaljeret beskrivelse og trinvis vejledning kan findes på RELION's hjemmeside: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion.
- Udfør 'on the fly' analyse af mikrograf bevægelse korrektion og CTF skøn. Start RELION i projektmappen. Planlæg import-, bevægelseskorrektions- og CTF-estimeringsjob for at sløjfe, så de er samtidige med dataindsamling og -overførsel. Et mikrografanalysescript28 giver visuel feedback i realtid om bygningsfejl og estimerede defokuseringsværdier (se repræsentative resultater).
- Pluk partikler fra forbehandlede mikrografer. Der er en række automatiserede partikel picking softwarepakker at vælge imellem. Gratis og skabelonbaserede plukindstillinger er tilgængelige under fanen Automatisk pluk i RELION37. Andre programmer kan bruges til forskellige trin, for eksempel ved hjælp af crYOLO til partikelplukning35.
- Udtræk partikler fra ctf-korrigerede mikrografer.
BEMÆRK: For at reducere den beregningstid, der kræves til tidlig oprydning, behandling af trin, nedskalering/bin partiklerne ved udvinding. Detaljer om, hvordan køre uddrag job kan findes i RELION 3.1 tutorial. Til dette projekt blev partikler oprindeligt binned med en faktor 2. - Udfør 2D-klasse gennemsnit. Klassificering på tværs af 100-200 klasser fungerer godt for de fleste datasæt, der indeholder ≥ 100.000 partikler. Det anbefales ikke at bruge mange mere end 200 klasser eller færre end 50 klasser, selv hvor datasæt er små, medmindre prøven har høj symmetri (dvs. icosahedral virus), i hvilket tilfælde færre end 50 klasser stadig kan give et godt resultat. Indstil maskediameteren stor nok til at rumme den længste dimension af partiklen, men stram nok til at udelukke eventuelle tilstødende partikler (dette kan kræve en vis trial and error).
- Vælg gode klasser (dvs. dem med strukturelle detaljer) ved hjælp af delsættets udvælgelsesjob. Eksempler på gode og dårlige 2D-klasse gennemsnit kan findes i den repræsentative resultater sektion.
- Generer en indledende model de novo ud fra dataene ved hjælp af 3D's oprindelige modeljob i RELION.
BEMÆRK: Mindre rene partikelstakke kan drage fordel af multireference ab initio SGD (stokastisk gradient nedstigning) raffinement, da dette giver en ekstra mulighed for at finkæmme junk / sub-optimale partikler. Vælg en maskediameter, der kan rumme den partikel af interesse, og lad standardværdierne for felter i 'SGD' fanen, da disse rutinemæssigt fungerer godt. Sørg for, at den oprindelige model ser rimelig ud i Chimera (eller et andet passende visualiseringsprogram) (se repræsentative resultater). - Udfør 3D-klassificering for at håndtere heterogenitet i dataene ved hjælp af outputtet fra trin 6.6 som referencemodel. Vurder de resulterende kort i Chimera. Behandl partikelstakke, der svarer til unikke kropsbygningstilstande uafhængigt. Brug delsættets udvælgelsesjob til at vælge en klasse/interesseklasser og generere particles.star-filer til de tilknyttede partikelstakke.
- Kør 3D auto-raffinement. Brug 3D-klassegennemsnittet opnået i det foregående trin som referencer til raffinement af deres tilsvarende partikelstakke. Hvis opløsningen af raffinement nærmer nyquist grænsen for data, re-udtrække partiklerne uden nedskalering. Efter re-ekstraktion, gentag 3D auto-forfine job med unbinned partikel stak. I dette tilfælde skal 3D-referencemodellerne omskaleres, så pixel- og kassestørrelserne er i overensstemmelse med de genvundne partikelbilleders. Brug kommandolinjeværktøjet relion_image_handler til at udføre denne handling.
- Udnyt symmetri i raffinement, hvis det er relevant. Hvis et rekonstrueret kort har symmetri, skal du justere kortet på den relevante symmetriakse ved hjælp af kommandolinjeværktøjet relion_align_symmetry. Brug det resulterende justerede kort som reference i et nyt 3D-autoraffineringsjob med den relevante symmetrioperator, der er angivet under referencefanen.
- Gør kort skarpere fra 3D auto-raffinement. Dette gøres ved hjælp af efterbehandlingsjobbet i RELION, men først skal der oprettes en passende maske ud fra det raffinerede kort. Trinene til maskeoprettelse og efterbehandling er beskrevet i RELION-selvstudiet (se også repræsentative resultater).
BEMÆRK: Opløsningen af mange rekonstruktioner kan forbedres yderligere ved hjælp af bayesiske polerings- og CTF-raffinementsfunktioner i RELION. Brug CTF raffinement job-type til at estimere og korrigere for højere orden afvigelser (stråle tilt, trefoil aberrations og 4th ordre afvigelser) og, som separate job, anisotropisk forstørrelse og per-partikel defocus. Derefter skal du bruge bayesisk poleringsjob (uddannet eller med standardværdier) til at adressere stråleinduceret bevægelse pr. partikel. Som behandlet i RELION 3.1 tutorial, vil disse job sandsynligvis drage fordel af en iterativ tilgang (CTF-raffinement → Bayesian polering → 3D auto-raffinement → efterbehandling → ... løkke), da begge nyder godt af modeller med højere opløsning. - Ret afleveret EM-tæthedskort, hvis det er nødvendigt. Undersøg kortene for at afgøre, om handedness er korrekt enten ved at forsøge at passe en eksisterende atommodel, eller vurdere handedness af alfa spiralformede regioner. Hvis det er nødvendigt, skal du vende kortet langs z-aksen i UCSF Chimera45 ved hjælp af kommandoen 'vop zflip'.
Representative Results
Ved screening kan gitre kasseres i atlasstadiet, hvor funktioner, der er løst ved lav forstørrelse, markerer nettet som ikke egnet til dataindsamling. Hvis et gitter f.eks. har været udsat for betydelige mekaniske skader, hvor størstedelen af gitterkvartalerne er brudt (figur 2A), eller hvor nettet ser ud til at være »tørt«, uden glasis (figur 2B). Sådanne gitre kan typisk identificeres, da kanterne af gitterkvarterne fremstår skarpe og tydelige. På tværs af de fleste gitre, der er lavet ved hjælp af frysningsanordningen, observeres en gradient af is (Figur 2C, D). Partikelfordeling, afhængigt af prøven af interesse, kan variere dramatisk med istykkelse og så screening en række gitter firkanter til at vurdere partikelfordeling anbefales. Værktøjer er blevet implementeret inden for EPU-software under atlasscreeningstrinnet for at hjælpe brugeren med at identificere gitter firkanter med lignende eller forskellig istykkelse, hvilket kan være særligt nyttigt for brugere, der er nye til at undersøge kryoEM-gitre (Figur 2E, F).
Figur 2: Eksempel på lave forstørrelses -atlas-montager fra screeningssessioner. A) Et gitter, der har lidt betydelig skade med de fleste gitter firkanter brudt - uegnet til indsamling. B) Et tørt gitter uden glasagtig is - uegnet til opsamling. C) Et gitter, der viser en isgradient med ~ 50% af nettet brugbart. D) En isgradient med ~ 33% af nettet brugbart. Både C og D er velegnede til dataindsamling, hvis de brugbare gitter firkanter har en istykkelse, der passer til indsamling, og der er nok erhvervelsesområder til at opfylde den mindste varighed af en samling (f.eks. 24 timer) E) Et eksempel atlas med vifte af istykkelser. F) Det samme atlas præsenteret i E, men med gitter firkanter kategoriseret og farvet af EPU software i henhold til is tykkelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Ved screening af partikelfordeling skal det sikres, at billeddiagnostiske parametre, såsom forstørrelse og total elektrondosis, svarer til dem, der forventes anvendt under dataindsamlingen, for at give et nøjagtigt billede af de forventede resultater. Under screening er en ideel partikelfordeling monodisperse med en række partikelretninger synlige (afhængigt af prøven og den eksisterende viden om partiklens morfologi kan dette være udfordrende at fastslå) (Figur 3A). Isen skal være så tynd som muligt, samtidig med at partiklernes største dimension imødekommes, hvis isen er for tynd, kan den smelte, når den lyser med elektronstrålen. Dette medfører overdreven bevægelse i mikrografen, og områder, der viser denne egenskab, bør undgås (figur 3B). Fra kollektiv erfaring observeres denne effekt oftest, når der er vaskemiddel i bufferen. Dette kan resultere i meget tynd is i midten af hullet, og så partikler kan fysisk udelukkes og tvinges mod kanten. Denne effekt observeres i figur 3C, men i dette tilfælde er det ikke et ekstremt eksempel, og disse billeder vil stadig med fordel bidrage til et datasæt. Endelig skal isen være glasagtig; udelukke områder af nettet (eller gitre), hvor størstedelen af eller alle de billeder, der er taget, viser krystallinsk is (Figur 3D) fra dataindsamling. Ofte observeres ikke-glasagtig is i kanten af gitter firkanter. Læserne henvises til detaljerede gennemgange af de variabler, der kan ændres under gitter vitrifikation16 og beskrivelser af partikeladfærd i den tynde film miljø46,47 for yderligere information.
Figur 3: Repræsentative mikrografer, der viser forskellige partikelfordelinger. A) En 'ideel' fordeling af monodisperse partikler vedtage en række orienteringer. B) Alt for tynd is i midten af hullet, at det deformerer ved eksponering for elektronstrålen forårsager overdreven bevægelse i mikrografen. Denne effekt observeres oftest, når vaskemiddel er til stede i bufferen C) Hvor is er tyndere i midten af hullet, udelukker dette fysisk partikler fra midten, hvilket forårsager fortrængning af partikler mod hulkanten. I dette tilfælde er det ikke ekstremt nok til at forhindre, at disse billeder er nyttige, men det tyder på, at det er værd at screene lidt tykkere områder. D) Is er ikke glasagtig, bør data ikke indsamles på områder, der ligner dette eksempel mikrograf. Klik her for at se en større version af dette tal.
On-the-fly billedbehandling kan bidrage til at afhente fejl og problemer med dataindsamling og så anbefales altid, hvor det er muligt. For eksempel kan overdreven bevægelse i mikrografer indikere, at autoloader turbopumpen er aktiv, eller data indsamles på en revnet gitterplads, hvor isen bevæger sig betydeligt i elektronstrålen, hvilket indikerer, at gitterpladsen skal springes over. På flue CTF skøn kan afsløre omstændigheder, hvor et positivt fokuspunkt (snarere end defokuseret) anvendes (hvor CTF skøn programmer og parametre for at finde disse punkter anvendes), og bestemme fase skift, hvor en Volta fase plade48 anvendes. På fluebilledbehandlingsrørledningerne indeholder de ofte en grafisk oversigt over dataene (Figur 4A) for at gøre det lettere for brugerne hurtigt at vurdere mikrografkvaliteten og beslutte, om der er behov for ændringer af dataindsamlingen.
Valg af partikler fra mikrografer, samtidig med at man undgår "falske positiver", såsom forurening eller netstøttefilmen, kan kræve optimering. Partikelplukkere som crYOLO fungerer imidlertid ofte tilstrækkeligt godt ved hjælp af standardparametre for et "first pass" af dataene (Figur 4B), hvilket gør det muligt at gå videre til 2D-klassen i gennemsnit, hvor det kan være lettere at vurdere dataenes kvalitet og sandsynligheden for downstream-succes. For de fleste projekter, bør 2D klassificering af ~ > 10k partikler begynde at afsløre klasser, der har sekundær struktur detaljer. For at gå videre til 3D bør 2D-klassificeringsfasen typisk afsløre klasser, der repræsenterer en række partikelretninger. Hvis der afsløres en foretrukken orientering, kan det være nødvendigt at flere gentagelser af prøveforberedelse16 eller yderligere dataindsamling med den prøve, der vippes,49. Alle klasser, der viser sekundære strukturdetaljer, bør vælges til at gå videre til 3D-analyse, mens "junk"-partikler kasseres (Figur 4C).
Figur 4: Indledende trin til billedbehandling. A) Output fra et 'on the fly' billedbehandlingsscript. B) Eksempel mikrograf (venstre) med passende auto-plukket partikler identificeret ved hjælp af crYOLO generelle model (højre, med partikler afgrænset af røde firkanter) Skala barer (hvid) er 50 nm. C) Resultater fra 2D-klassificering, der viser klasser, der blev kasseret i det røde felt, og klasser, hvorfra partikler blev udvalgt til videre behandling i grønt. Klik her for at se en større version af dette tal.
En lille delmængde af partikler kan bruges til at generere en indledende model (Figur 5A). Denne oprindelige model kan derefter bruges som en startmodel i 3D-klassificering og raffinement. For RagAB's vedkommende indeholdt datasættet tre forskellige konforme, som kan adskilles under 3D-klassificering (figur 5B). Partikler, der bidrager til hver af disse klasser, kan derefter behandles uafhængigt og bruges til at forfine et EM-tæthedskort, som derefter kan underkastes yderligere fortolkning og modelopbygning.
Figur 5: Generering af 3D EM-tæthedskort. A) Typisk startmodel genereret ved hjælp af RELION. B) 3D-klassificering over 5 klasser, der viser adskillelse af partikler i tre forskellige kropsbygningstilstande: åben (grøn), åben (blå), lukket (lilla). C) Proces med maske skabelse. Kortet fra 3D raffinement (venstre) skal visualiseres i kimær. Volumenfremviseren kan derefter bruges til at identificere den laveste tærskel, hvor kortet er fri for usammenhængende, støjende tæthed (midten). Denne tærskelværdi er input som den første placeringstærskel i oprettelsesjobbet for RELION Mask. Et eksempel maske output er vist i grå (højre). D) EM-tæthedskort med høj opløsning over ragAB's åbne lukkede tilstand (EMD-10245), filtreret og farvet efter lokal opløsning (Å). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
I denne protokol har vi beskrevet en grundlæggende rørledning, der gælder for prøver, der kan bruges til rutinemæssige SBO'er. Mens dette filter papir blotting metode til tynd film dannelse og vitrification er utvivlsomt en succes i betragtning af dens anvendelse i langt de fleste SPA-projekter til dato, det kommer med en række ulemper. Disse omfatter prøvespild, de langsomme tidsskalaer (sekunder), der kræves for at danne den tynde film og fryse prøven, rapporterede uudholdelighed27 og rapporterede negative virkninger af at bruge filterpapir til at fjerne overskydende væske50. For nylig er der udviklet nye teknologier for at forbedre reproducerbarheden af tyndfilmsproduktion51,52. Der er udviklet andre teknologier, som reducerer tiden mellem prøveudbringning og vitrificering53,54,55. Mens filter papir-baserede metoder til tynd film dannelse fortsat mest allestedsnærværende metode til SPA cryoEM prøve forberedelse i skrivende stund, kan disse nye teknologier bringe en række fordele med hensyn til effektivitet og reproducerbarhed af nettet vitrification, samt skabe nye muligheder for at bringe i yderligere eksperimentelle dimensioner, såsom tidsopløsning og hurtig blanding forud for vitrification.
Processen med netscreening for de fleste brugere er i øjeblikket en kvalitativ proces, der indebærer erhvervelse af lave forstørrelsesatlaser efterfulgt af at tage billeder med høj forstørrelse på tværs af nettet for at vurdere partikelfordelingen. Selv om dette er en tilstrækkelig robust tilgang til nogle typer af prøve, kan det være svært at vurdere med øjet, hvis prøven er faktisk, hvad forskeren håber at billede eller har en foretrukken orientering, for eksempel med små (<200 kDa) prøver, eller hvor lav opløsning morfologi gør det svært at identificere ved øjet, hvis en række partikelfordelinger er til stede. For nogle projekter er det umuligt at afgøre, om prøven er som ønsket, f.eks. når en ligand er bundet, eller hvor prøven screenes for at vurdere, om en lille (f.eks. 10 kDa) underenhed stadig er til stede i forbindelse med et kompleks. For disse projekter vil fuldautomatiske pipelines til dataanalyse kombineret med en "kort" 0,5 - 1-h samlinger, der kan fortsætte gennem billedbehandling trin til 2D-klassificering eller endda 3D-klassificering og raffinement hjælpe effektivt med at afgøre, om en længere samling er berettiget. Disse rørledninger er stadig under udvikling og er ikke almindeligt implementeret i øjeblikket, men de har potentiale til at forbedre effektiviteten af cryoEM-netscreening, især for udfordrende prøver.
Forbedringer i direkte elektrondetektorer samt ændringer i mikroskopi kombineret med fremskridt inden for billedbehandling såsom indsamling af billedskiftdata har øget gennemløbet og kvaliteten af billeder, der produceres under dataindsamling. Denne stigning i antallet af data, der indsamles, understreger behovet for en grundig screening af kryoEM-net forud for mange TB data, der indsamles.
CryoEM SPA er blevet en virkelig mainstream strukturel biologi teknik, og i mange tilfælde 'gå til' tilgang for nogle klasser af prøver, såsom heterogene og labile makromolekylær komplekser. Mens protokollen her beskriver en grundlæggende oversigt over SPA-rørledningen, er hvert afsnit, der er dækket her (gittervitrificering og screening, cryoEM og billedbehandling) et emne i sig selv og værd at udforske under udviklingen af et SPA-projekt. Efterhånden som prøveforberedelses- og mikroskopiteknologier skrider frem, og nye algoritmer og tilgange til billedbehandling kommer online, vil SPA fortsætte med at udvikle sig som en pipeline, der hjælper forskere med at få indsigt i komplekse biologiske systemer.
Disclosures
Der rapporteres ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af iNEXT-Discovery (Grant 871037), der blev finansieret af Horizon 2020-programmet fra Europa-Kommissionen. J B. R. White er finansieret af Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). FEI Titan Krios mikroskoper blev finansieret af University of Leeds (UoL ABSL award) og Wellcome Trust (108466 / Z / 15 / Z). Vi takker M Iadanza for brugen af hans mikrograf analyse script. Vi anerkender Diamond Light Source for adgang til og støtte af cryo-EM faciliteter på Storbritanniens nationale Electron Bio-imaging Center (eBIC) finansieret af Wellcome Trust, MRC og BBRSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt tweezers | Agar Scientific | AGT5022 | |
| Cryo EM round storage box | Agar Scientific | AGG3736 | |
| CryoEM autogrid boxes | ThermoFisher Scientific | 1084591 | |
| CryoEM grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Ethane gas | Boc | 270595-F | |
| LN2 foam dewar | Agar Scientific | AG81760-500 | |
| LN2 storage dewar | Worthington industries | HC 34 | |
| Pipette | Gilson | 10082012 | |
| Pipette tips | Star labs | s1111-1706 | |
| Syringe | BD | BD 300869 | |
| Type II lab water | Suez | select fusion | |
| Vitrobot | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Vitrobot styrophome container assembly | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot tweesers | ThermoFisher Scientific | 72882-D | |
| Software | |||
| EPU | ThermoFisher Scientific | 2.8.1.10REL | |
| TEM server | ThermoFisher Scientific | 6.15.3.22415REL | |
| Tia | ThermoFisher Scientific | 5.0.0.2896REL | |
| Titan krios microscope | ThermoFisher Scientific | Titan Krios G2 |
References
- Kuehlbrandt, W.
- McMullan, G., Faruqi, A. R., Henderson, R.
- Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: the nuts and bolts. Current Opinion in Structural Biology. , (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. , (2020).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. , (2020).
- Conley, M. J., et al. Calicivirus VP2 forms a portal-like assembly following receptor engagement. Nature. 565 (7739), 377-381 (2019).
- Hesketh, E. L., et al. The 3.3 Å structure of a plant geminivirus using cryo-EM. Nature communications. 9 (1), 2369 (2018).
- Malone, L. A., et al. Cryo-EM structure of the spinach cytochrome b6 f complex at 3.6 A resolution. Nature. 575 (7783), 535-539 (2019).
- Madej, M., et al. Structural and functional insights into oligopeptide acquisition by the RagAB transporter from Porphyromonas gingivalis. Nature Microbiology. , (2020).
- Gallardo, R., et al. Fibril structures of diabetes-related amylin variants reveal a basis for surface-templated assembly. Nature Structural and Molecular Biology. , (2020).
- Scarff, C., et al.
- Scarff, C. A., et al. Structure of the protective nematode protease complex H-gal-GP and its conservation across roundworm parasites. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008465 (2020).
- Wu, M., Lander, G. C. How low can we go? Structure determination of small biological complexes using single-particle cryo-EM. Current Opinion in Structural Biology. , (2020).
- Khoshouei, M., Radjainia, M., Baumeister, W., Danev, R. Cryo-EM structure of haemoglobin at 3.2 Å determined with the Volta phase plate. Nature Communications. , (2017).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 74, Pt 6 560-571 (2018).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological procedures online. 6, 23-34 (2004).
- Baker, L. A., Rubinstein, J. L.
- Dubochet, J., et al.
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. , (2019).
- Sgro, G. G., Biosciences, T. R. D. C. F. 2018 Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. researchgate.net. , Available from: http://www.researchgate.net/profile/Tiago_Costa12/publication/326710861_Cryo-EM_Grid_Preparation_of_Membrane_Protein_Samples_for_Single_Particle_Analysis/links_EM-Grid-Preparation-of-Membrane-Protein-Samples-for-Single-Parti (2018).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with sub-1 Å specimen movement. Science. , (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in Enzymology. , (2016).
- Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. , (2009).
- Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. , (2003).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. , (2019).
- Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 73, Pt 6 496-502 (2017).
- Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Wagner, T., et al. SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM. Communications biology. 2 (1), 213-218 (2019).
- Bepler, T., et al. TOPAZ: A Positive-Unlabeled Convolutional Neural Network CryoEM Particle Picker that can Pick Any Size and Shape Particle. Microscopy and Microanalysis. , (2019).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 163 (2018).
- Zivanov, J., Nakane, T., Scheres, S. H. W. A Bayesian approach to beam-induced motion correction in cryo-EM single-particle analysis. IUCrJ. , (2019).
- Cianfrocco, M. A., Kellogg, E. H. What Could Go Wrong? A Practical Guide to Single-Particle Cryo-EM: From Biochemistry to Atomic Models. Journal of Chemical Information and Modeling. , (2020).
- Tagari, M., Newman, R., Chagoyen, M., Carazo, J. M., Henrick, K. New electron microscopy database and deposition system. Trends in Biochemical Sciences. , (2002).
- Berman, H. M., et al.
- Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: A public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. , (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. , (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. , (2019).
- Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for Speed: Examining Protein Behavior during CryoEM Grid Preparation at Different Timescales. Structure. , (2020).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 32 (2018).
- Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Zi Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EMthrough tilting. Nature Methods. , (2017).
- Armstrong, M., Han, B. -G., Gomez, S., Turner, J., Fletcher, D. A., Glaeser, R. M. Microscale Fluid Behavior during Cryo-EM Sample Blotting. Biophysical Journal. 118 (3), 708-719 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. , (2017).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 75, Pt 12 1063-1070 (2019).
- Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. bioRxiv. , (2020).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: From sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2020).
