Summary
헤드스페이스 고형 미세 추출 가스 크로마토그래피 플랫폼은 잘 익은 블랙커런트 과일의 빠르고 신뢰할 수 있으며 반자동 휘발성 식별 및 정량화를 위해 여기에 설명되어 있습니다. 이 기술은 과일 향에 대한 지식을 높이고 번식을 목적으로 향상된 맛으로 품종을 선택하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
강화된 유기성 특성을 가진 품종 이나 품종을 사육하기 위해 잘 익은 과일에 의해 방출되는 휘발성 유기 화합물(VOC)을 측정하는 데 관심이 증가하고 있으며, 따라서 소비자수용을 증가시키고 있다. 고처리량 메타볼로믹 플랫폼은 최근 과일 맛과 아로마 품질(volatilomics)을 담당하는 주요 화합물을 포함하여 다양한 식물 조직에서 다양한 대사산물을 정량화하기 위해 개발되었습니다. 가스 크로마토그래피 질량 분석법(GC-MS)과 결합된 헤드스페이스 고형미생물추출(HS-SPME)을 사용하는 방법은 잘 익은 블랙커런트 과일에 의해 방출되는 VOC의 식별 및 정량화를 위해 여기에 설명되어 있으며, 베리는 맛과 건강에 매우 높은 평가를 받고 있다.
블랙커런트 식물(갈비 니그럼)의 잘 익은 열매를 수확하고 액체 질소로 직접 냉동하였다. 미세 한 분말을 생산 하는 조직 균질화 후, 샘플을 해동 하 고 즉시 염화 나트륨 용액과 혼합 했다. 원심분리후, 상피제는 염화나트륨을 함유한 헤드스페이스 유리 유리병으로 옮겨졌다. VOC는 그 때 이온 트랩 질량 분광계에 결합된 고체 위상 마이크로추출(SPME) 섬유및 가스 크로마토그래프를 사용하여 추출하였다. 휘발성 정량화는 피크 영역을 통합하여 결과 이온 크로마토그램에서 수행되었으며, 각 VOC에 대한 특정 m/z 이온을 사용하여 정확한 VOC 음표는 샘플과 동일한 조건하에서 실행되는 순수 상용 표준의 보존 시간 및 질량 스펙트럼을 비교하여 확인하였다. 60개 이상의 VOC가 유럽의 대조적인 지역에서 자란 잘 익은 블랙커런트 과일에서 확인되었습니다. 확인된 VOC 중테페노이드 및 C6 휘발성 물질과 같은 주요 아로마 화합물은 블랙커런트 과일 품질을 위한 바이오마커로 사용될 수 있습니다. 또한, 미래의 개선을 포함하여 방법의 장점과 단점이 논의된다. 또한, 배치 보정 및 드리프트 강도 최소화를 위한 컨트롤의 사용이 강조되고 있다.
Introduction
맛은 모든 과일에 필수적인 품질의 특성으로 소비자의 수용에 영향을 미치므로 시장성에 큰 영향을 미칩니다. 맛 지각은 맛과 후각 시스템의 조합을 포함하고 식용 식물 부품에 축적 되는 화합물의 광범위한 의 존재와 농도에 화학적으로 의존, 또는 VOC의 경우, 잘 익은 과일에 의해 방출1,2. 전통적인 사육은 수율 과 해충 저항과 같은 농업 특성에 초점을 맞추고 있지만, 맛을 포함한 과일 품질 특성 개선은 오랫동안 유전적 복잡성과 이러한 특성을 적절하게 표현하기 어려운 것으로 인해 무시되어 소비자 불만3,4로 이어지고 있습니다. 메타볼로믹 플랫폼의 최근 발전은 과일 맛과 아로마5,6,7,8을 담당하는 주요 화합물을 식별하고 정량화하는 데 성공했습니다. 더욱이, 게놈 또는 전사 도구와 대사 산물 프로파일링의 조합은 차례로 향상된 조직특성2,4,9,10,11,12,13,14와 함께 새로운 품종을 개발하는 데 도움이 되는 과일 맛의 유전학의 해명성을 가능하게 합니다.
블랙커런트(Ribes nigrum) 베리는 유럽, 아시아 및 뉴질랜드15의 온대 구역에서 널리 재배되는 맛과 영양특성으로 높이 평가받고 있습니다. 생산의 대부분은 주로 열매의 조직 성 특성으로 인해 북유럽 국가에서 매우 인기있는 식품 및 음료에 대해 가공됩니다. 과일의 강렬한 색상과 맛은 잘 익은 과일16,17,18에 존재하는 안토시아닌, 설탕, 산 및 VOC의 조합의 결과입니다. 블랙커런트 휘발성 물질의 분석은 1960년대19,20,21로 거슬러 올라갑니다. 최근에는 블랙커런트 VOC에 초점을 맞추고 과일 향 인식에 중요한 화합물을 식별하고 VOC 콘텐츠5,17,18,22,23에 대한 유전자형, 환경 또는 저장 및 처리 조건의 영향을 평가했습니다.
수많은 장점 때문에 고처리량 휘발성 프로파일링을 선택하는 기술은 HS-SPME/GC-MS24,25입니다. 폴리머 상으로 코팅된 실리카 섬유는 주사기 장치에 장착되어 평형 상에 도달할 때까지 섬유내의 휘발성 물질의 흡착을 허용합니다. 헤드스페이스 추출은 matrix24에 존재하는 비휘발성 화합물로부터 섬유를 보호합니다. SPME는 고가농축(10억분의 1~100만 개당 부품)에 존재하는 많은 VOC를 성공적으로 격리할 수 있습니다(100만 개당 부품). 또한, 제한된 시료 처리를 요구하는 용매가 없는 기술이다. HS-SPME의 다른 장점은 자동화의 용이성과 상대적으로 저렴한 비용입니다.
그러나, 그 성공은 VOC의 화학적 특성, 추출 프로토콜(시간, 온도 및 소금 농도 포함), 샘플 안정성 및 충분한 과일 조직의 가용성에 따라 제한될 수 있다26,27. 이 논문은 HS-SPME에 의해 격리되고 이온 트랩 질량 분광계와 결합된 가스 크로마토그래피에 의해 분석된 블랙커런트 VOC에 대한 프로토콜을 제시합니다. 식물 재료의 양, 샘플 안정성 및 추출 및 크로마토그래피 의 지속 시간 사이의 균형은 블랙 커런트 샘플의 높은 숫자를 처리 할 수 있도록 달성되었다, 그들 중 일부는이 연구에서 제시. 특히 5개의 품종('안데가', '벤 트론', '벤 게른', '벤 티란', '티호프'의 VOC 프로필 및/또는 크로마토그램)을 예로 들 며소개하고 논의할 예정이다. 또한 딸기(프라가리아 x 아나나사), 라즈베리(루비시다우스), 블루베리(Vaccinium spp)와 같은 다른 과일 베리 종에서 VOC 측정을 위한 동일한 프로토콜이 성공적으로 시행되고 있습니다.
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Protocol
1. 과일 수확
- 충분한 과일 재료와 가변성을 보장하기 위해 유전자형 및/또는 치료당 4~6개 식물을 재배합니다.
- 가능하면 같은 날짜에 샘플을 수확하십시오. 과일 재료가 충분하지 않은 경우, 다른 날짜에 수확 샘플을 함께 풀.
참고: 수확 시간(아침, 정오, 오후)은 VOC 프로파일이 주간/circadian 리듬28,29,30,31의 영향을 받는 것과 거의 동일하게 유지되는 것이 좋습니다. - 시각적 관찰32에 의해 과일 익는 단계를 평가합니다. 숙성 상태가 VOC 방출에 큰 영향을 미치기 때문에 동일한 숙성 단계에서 과일을 풀링합니다. 손상되거나 병원균에 감염된 과일을 버리십시오.
참고: 과일 익음을 더 잘 평가하기 위해 텍스처 분석을 수행할 수 있습니다33. 또한, 꽃 후 일 계산을 사용하여 풀링 된 과일이 유사한 성숙 단계에 속하도록 할 수 있습니다. - VOC 분석을 위해 생물학적 복제당 최소 10-15과일(3~5개)을 포함한다.
참고: 2018년 여름, '안데가', '벤 트론', '벤 게른', '벤 티란', '티호프' 품종의 13~20개의 과일(생물학적 복제)의 3개의 별도 풀이 2018년 여름 두 곳(폴란드과 스코틀랜드)에서 수확되어 액체 질소로 직접 냉동되었습니다. 샘플은 실험실로 보내져 아래에 설명된 대로 처리되었습니다. - 일단 수확되면 모든 과일을 액체 질소에 즉시 얼리고 처리 될 때까지 -80 °C에 보관하십시오.
참고: 가능하면 수확 후 과일을 직접 가공할 수 있습니다. 이 경우 신선한 과일은 믹서에서 균질화되고, 계량및 직접 분석할 수 있다(3.1단계 이후). 그러나, 과일이 수확 후 열화 공정에서 방지하려면, 신선한 재료는 쿨러 (4 °C)에 저장하고 가능한 한 빨리 처리되어야한다. 제대로 처리되지 않으면 액체 질소는 차가운 화상을 일으킬 수 있으며 통풍이 잘되지 않는 공간에서 질식을 일으킬 수 있습니다.
2. 과일 샘플 및 시약 준비
- 과일을 미세 한 분말로 갈아서 항상 액체 질소의 도움으로 얼어 붙은 상태를 유지하십시오. 극저온 밀, 비드 밀 또는 박격포와 유봉을 사용하여 균질화를 하십시오. 시료 해동을 피하기 위해 액체 질소로 프리쿨 스테인리스 연삭 항아리 또는 박격포 및 유봉.
참고: 적절한 VOC 추출을 보장하기 위해 샘플을 미세 분말로 균질화하는 것이 중요합니다. - 이전에 액체 질소로 냉각된 5mL 튜브에서 냉동 물질 1g(2.1단계에서)을 계량하고 정확한 무게를 기록합니다. 처리 단계 3.1까지 -80 °C에서 재료를 유지합니다.
- VOC 추출 및 HS-SPME/GC-MS 성능을 포함한 기술적 변화를 확인하기 위해 분석에 '참조' 또는 '제어' 샘플을 포함합니다. 이를 위해 무작위로 선택된 과일 샘플의 혼합물을 함께 풀을 짜고 VOC 분석을 위해 하루에 하나 이상의 제어 샘플을 포함합니다. 또한 2.5단계에서 설명한 대로 내부 표준을 사용하여 강도 드리프트의 영향을 최소화합니다.
- 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등급물(이하 NaCl 용액이라고 함)에서 염화나트륨 용액 20%(w/v)를 준비한다. 자기 교반기의 도움으로 NaCl을 녹입니다. 샘플당 1mL의 솔루션가용성을 보장합니다.
- 순수한 상용 표준(이하 내부 표준이라고 함)으로부터 N-펜타데칸(D32, 98%)의 HPLC 등급 메탄올1 ppm 솔루션을 준비한다.
참고: N-펜타데칸-d32는 내부 표준으로 사용되며 샘플당 5μL이 필요합니다. 메탄올은 연기 후드 아래에서 조작되어야 합니다. - VOC 식별을 위한 순수한 상용 표준의 HPLC 등급 메탄올에 1 ppm 솔루션을 준비하십시오(이 연구에서 사용되는 상용 표준 목록에 대한 표 1 참조).
- 필요한 각 바이알에 0.5g NaCl을 추가하여 10mL 나사 캡 헤드스페이스 바이알을 준비합니다. 스크류 캡에는 오염을 방지하기 위해 내부쪽에 얇은 폴리테트라플루오로로틸렌 필름이 있는 부드러운 재료, 즉 실리콘으로 구성된 중격이 포함되어 있는지 확인하십시오.
3. 샘플 준비
- 계량 된 냉동 샘플을 포함하는 5 mL 튜브에 NaCl 용액 1 mL을 추가합니다. 샘플이 완전히 해동되고 균질화 될 때까지 튜브를 흔들어 주세요.
- 실온에서 5 분 동안 5000 × g 의 원심 분리기.
- 1000 μL 파이펫 끝으로 상체를 NaCl 함유 헤드스페이스 바이알로 옮길 수 있습니다. 이 프로세스를 용이하게 하기 위해 팁의 끝을 잘라냅니다.
- 각 샘플 함유 헤드스페이스 바이알에 5μL의 내부 표준을 추가합니다.
4. HS-SPME/GC-MS 데이터 수집
- 4절에 설명된 자동화된 HS-SPME/GC-MS 실행을 위해 실온에서 폐쇄된 헤드스페이스 유리병을 실온에서 GC-MS 자동 샘플러에 배치합니다. 자동 샘플러의 연속적인 위치에 생물학적 복제를 배치하지 마십시오. 대신 강도 드리프트의 영향을 최소화하기 위해 무작위로 배포합니다.
참고: 약 10-12개의 바이알은 시료 안정성에 영향을 주지 않고 자동 샘플러에 한 번에 배치할 수 있습니다. - 헤드 스페이스 바이알을 50°C에서 10분 전에 17 x g로 배양합니다.
- 17 x g에서 교반과 50 °C에서 30 분 동안 VOC 추출을위한 헤드 스페이스에 섬유를 노출하는 유리병에 SPME 장치를 삽입합니다.
- 휘발성 탈착을 위한 스플릿리스 모드에서 250°C에서 1분 동안 분 동안 섬유를 주입 포트에 도입한다.
- 250°C에서 5분 동안 질소(1바 N2, ≥ 99.8% 순)로 SPME 클리닝 스테이션에서 섬유를 청소하십시오. 섬유를 약 100배 재사용하십시오.
- 이온 트랩 질량 분광계에 결합된 가스 크로마토그래프로 VOC를 분석하고( 재료의 표 참조) 1mL/min의 일정한 흐름 ≥하에서 크로마토그래피를 수행하고, 60m x 0.25 mm x 1 μm 두께의 치수를 가진 컬럼을 갖는다. 오븐 온도 프로그램을 사용하여 40°C에서 3분 동안, 8°C/min 경사로에서 250°C로, 5분 동안 250°C에서 유지한다. 질량 분석의 경우, 각각 260°C 및 230°C로 이송 선 및 이온 소스 온도를 설정합니다. 이온화 에너지를 70 eV로 설정하고 기록된 질량 범위는 s당 6개의 스캔에서 m/z 35-220으로 설정합니다.
- 위에서 설명한 바와 같이 1ppm 의 상업 표준 솔루션을 추출하고 분석합니다. 또한, 300 μL NaCl 용액과 900 μL HPLC 등급 물과 혼합된 모든 희석된 상업 표준을 포함하는 혼합물을 실행하여 샘플 데이터 수집 전에 장비의 올바른 교정을 확인한다. 또한 모든 배치에 NaCl 솔루션을 단독으로 포함하는 빈 샘플을 포함합니다.
5. GC-MS 프로파일 크로마토그램 분석: VOC 식별 및 반정량
- 제조업체에서 제공하는 소프트웨어와 함께 원시 GC-MS 프로필 파일을 엽니다. 화합물을 식별하려면 시료의 크로마토그램에서 결정된 보존 시간 및 질량 스펙트럼 및 Kovats 선형 보존 지수를 정통 표준에서 얻은 보존 지수와 비교합니다. 각 상용 표준에 대해 보존 시간과 가장 풍부한 m/z 이온에 음부합니다. 그런 다음 각 VOC(표 1)에 대해 특정 m/z 이온을 선택합니다.
- 표준 보존 시간과 선택한 GC-MS 원시 파일의 선택된 m/z 이온에 따라 VOC 피크를 자동으로 통합합니다. 이를 위해 각 VOC에 보존 시간과 선택한 m/z 이온목록을 제공합니다. 소프트웨어는 시퀀스 설정에 제공된 것과 동일한 보존 시간 및 m/z 이온에 해당하는 피크 영역을 자동으로 통합하지만 각 피크의 올바른 통합을 확인하고 필요한 경우 수동으로 수정합니다.
- 기악 변동 및 강도 드리프트를 최소화하기 위해 내부 표준에 비해 각 VOC의 피크 영역을 계산합니다.
참고: 다양한 유전자형 또는 성장 및 보관 조건에서 과일을 분석할 때, 수분 함량의 차이로 인한 희석 효과를 배제하기 위해 과일 건조 중량 함량에 비해 VOC 함량을 결정하는 것이 좋습니다. - 배치 효과 보정의 경우 각 샘플의 VOC 피크 영역을 동일한 실행으로 분석된 제어 샘플의 해당 피크 영역으로 정규화합니다.
참고: 상대적인 VOC 정량화가 얻어진다. 그러나, 실험의 목적을 위해, VOC 콘텐츠는 모든 샘플(예: 처리되지 않은 과일이 VOC 수준에 따라 저장의 효과를 비교하기 위해)에 대해 결정될 수 있다.
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Representative Results
다양한 조건이나 위치에서 재배되거나 뚜렷한 유전자형에 속하는 큰 과일 작물 세트에서 고처리량 VOC 프로파일링은 정확한 아로마 표현형에 필요합니다. 여기서, 블랙커런트 품종의 상대적인 VOC 정량화를 위한 빠르고 반자동 HS-SPME/GC-MS 플랫폼이 제시된다. VOC 검출 및 식별은 베리 과일 종을 프로파일로 개발된 라이브러리(표 1)를 기반으로 하였다. 전술한 조건에서 HS-SPME/GC-MS에 의해 얻어진 전형적인 잘 익은 블랙커런트 과일 휘발성 프로파일(총 이온 크로마토그램)은 도 1A에 도시된다. 총 63개의 VOC가 여러 화학 클래스에 속하는 것으로 확인되었으며, 대부분은 에스테르(27), 알데히드(12), 알코올(8), 케톤(7), 테르펜(5), 푸란(3) (표 1)이다.
테르페노이드 화합물, 에스테르 및 C6 화합물은 블랙 커런트 볼라티로메를 지배하고 신선한 과일의 향기에 중요한 것으로 설명되었습니다5,17. 이러한 이전 연구에 동의하여, 도 1A에서 관찰된 가장 풍부한 봉우리 중 일부는 2개의 단테르펜(linalool 및 terpineol)과 2개의 C6 화합물((E)-2-헥세날 및 (Z)-3-헥세날)에 해당한다. 블랙커런트 프로파일에서 얻은 예 질량 스펙트럼및 순수한 상업 표준의 스펙트럼과의 비교는 도 1B 및 도 1C에서 (E)-2-헥세날 및 테르피놀에 대해 각각 도시된다.
그림 1: HS-SPME/GC-MS('안데가' 품종)가 획득한 잘 익은 블랙커런트 과일의 대표적인 크로마토그램. (A) 토탈 이온 크로마토그램. (Z)-3-헥세날(보유 시간 14.33분), (E)-2-헥세날(15.86분), 리날로올(21.65분), 테르피놀(24.01분) 피크는 각각 숫자 1, 2, 3, 4로 표시됩니다. (B) 블랙커런트 프로파일에서 (E)-2-헥세날 피크에 대응하는 질량 스펙트럼및 순수한 상용 표준과의 비교. (C) 블랙커런트 프로파일에서 테르피놀 피크에 대응하는 질량 스펙트럼및 순수한 상용 표준과의 비교. 약어: HS-SPME/GC-MS = 헤드스페이스 고체-위상 미세추출과 가스 크로마토그래피 질량 분광법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
테르펜은 블랙커런트 과일 신선도의 지표로 묘사되었지만 C6 화합물은 '녹색 잎 휘발성'으로 알려져 있으며 과일과 채소 아로마34에 '녹색'노트를 부여합니다. 따라서, 상이한 블랙커런트 품종의 잘 익은 열매에 의해 방출되는 이러한 VOC의 반정량화는 맛 관련 특성을 향상시키는 첫 번째 단계가 될 수 있다. 또한, 환경과 식물 성장 조건이 아로마 사육의 주요 단점 중 하나인 과일 VOC 함량에 큰 영향을 미치면서, 이 연구의 목적 중 하나는 동일한 품종에서 확인된 VOC의 반정화가 ('벤 트론', '벤 기른', '벤 티란', '티호프'와 같은 유럽 의 역동성을 반대했다. 예상대로, 4개의 다른 블랙커런트 품종의 VOC 프로파일의 주 성분 분석(PCA)은 주 성분(PC) 1이 자신의 위치에 따라 샘플을 분리함에 따라 환경이 휘발성 함량에 강하게 영향을 미치는 것으로 나타났다(그림 2). 그러나, 유전자형의 효과는 PC2로 관찰될 수 있으며, '벤 티란'은 나머지 품종으로부터 명확하게 분리되기 때문에(도 2).
도 3은 평가된 4개의 블랙커런트 품종에서 리날로올 및(E)-2-헥세날의 상대적 함량을 나타낸다. 두 위치모두 VOC 함량이 동일한 대조군 샘플로 정규화되었으며, 반정량화는 폴란드에서 리날로올 함량이 일반적으로 스코틀랜드보다 높았으며(E)-2-헥세날은 반대 추세를 나타낸다(그림 3). 이 결과는 블랙커런트 과일의 VOC 함량에 대한 환경적 영향을 보여 주지만, 평가된 4개의 품종에 존재하는 두 휘발성자의 비율은 일정했지만, '벤 티란'과 '벤 트론' 품종은 리날로올과 (E)-2-헥세날의 가장 높은 양을 각각 보여줍니다(그림 3). 종합하면, 이러한 결과는 제안된 방법이 표현형 VOC 함량에 유효하며 유전적 접근법과 결합되어 과일 품질 사육을 목적으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
그림 2: PCA는 폴란드와 스코틀랜드에서 자란 4개의 블랙커런트 품종에서 VOC 프로파일 간의 차이를 평가합니다. PC1(환경)은 가변성의 46.2%를 설명하고 PC2(유전자형)는 데이터 집합의 분산의 24.8%를 기여합니다. 약어: PCA = 주요 구성 요소 분석; PC1 = 첫 번째 주 성분; PC2 = 두 번째 주성분; VOC = 휘발성 유기 화합물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 스코틀랜드와 폴란드에서 수확한 블랙커런트 아로마 프로파일-리날로올과 (E)-2-헥세날의 두 대표적인 VOC의 상대적 내용. 네 가지 블랙커런트 품종('벤 게언', '벤 티란', '벤 트론', '티호프')이 평가되었다. 막대는 두 개의 생물학적 복제값의 평균 값을 나타내며 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 통계 비교는 단방향 ANOVA에 의해 수행되었고, 투키의 포스트 혹은 컬트와 국가 간의 VOC 콘텐츠에 상당한 차이를 결정했습니다. 동일한 소문자(a, ab, b)가 있는 VOC 내용의 경우 P < 0.05에서 큰 차이가 관찰되지 않았습니다. 약어 : VOC = 휘발성 유기 화합물; ANOVA = 분산 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: HS-SPME/GC-MS가 블랙커런트 과일로 식별한 VOC 목록입니다. 유지 시간(분), VOC 식별 및 반정화를 위해 선택된 m/z 이온, 아로마 설명, 화학 등급 및 포뮬러 및 CAS 번호가 표시됩니다. 약어: HS-SPME/GC-MS = 헤드스페이스 고체-위상 미세추출과 가스 크로마토그래피 질량 분광법; VOC = 휘발성 유기 화합물; KRI = 코바츠 보유 지수; CAS 번호 = 화학 추상 서비스 레지스트리 번호입니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
과일 향을 위한 사육은 휘발성 화합물의 합성및 적당한 현상조에 대한 기술의 부족의 근본적인 복잡한 유전학 및 생화학에 의해 오랫동안 방해되었습니다. 그러나, 유전체 도구와 결합 된 메타 볼로믹 플랫폼의 최근 발전은 마침내 소비자 선호도에 대한 책임이있는 대사 산물의 식별을 허용하고 개선 된 맛3로 작물을 사육합니다. 대부분의 발전은 모델 과일에서 달성되었지만, tomato9,10, 유사한 결과는 딸기, 사과, 또는 blueberry2,12,35,36와 같은 다른 경제적으로 관련된 작물 종에서 달성 될 수있다.
이 논문은 섬세한 맛과 놀라운 영양가에 대해 높이 평가받는 과일인 블랙커런트(blackcurrant)를 포함하여 다양한 베리 종의 VOC 함량을 측정하는 데 성공적으로 사용된 빠르고 재현 가능한 HS-SPME/GC-MS 기반 플랫폼을 제공합니다. 이전에 발표된 방법에 비해 총 크로마토그래피 런타임을 줄임으로써 주요 개선이 이루어졌습니다. 실제로, 적절한 해상도로 온도 경사로를 5°C/min에서 8°C/분으로 증가시켜 크로마토그래피 시간을 50분에서 35분으로 감소시킬 수 있었다(그림 1A)27. 더욱이, 샘플에 첨가된 NaCl의 높은 양(20% NaCl 용액 + 0.5 g의 고체 NaCl)은 시간이 지남에 따라 샘플 안정성에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 보인다. 실제로, 휘발성 단면도는 시간이 지남에 따라 안정되었고, 빠른 크로마토그래피와 결합하여 하루에 최대 20-22개의 샘플을 측정할 수 있었습니다.
N-펜타데칸-d32와 같은 내부 표준의 사용과 함께 실행을 따라 생물학적 복제물의 적절한 분포가 필요하며, 강도 드리프트37을 방지하기 위해 필요하다. 또한 일괄 처리 보정을 위해 제어 또는 참조 샘플을 하루에 한 번 이상 실행해야 합니다. 배치 간의 변화는 주로 검출기 민감도 의 변화 또는 섬유 노화에 의해 발생합니다27. 이 프로토콜은 잘 익은 블랙커런트 과일의 헤드 스페이스에 존재하는 60 개 이상의 VOC를 감지 할 수 있지만, 독자는 제안 된 라이브러리 (표 1)에 순수한 상업 표준을 추가하여이 숫자를 쉽게 증가 할 수 있다는 점을 고려해야합니다. 예를 들어, 발표된 연구는 이 분석에 포함되지 않은 많은 수의 테르페노이드 화합물을 검출했습니다5,17. 이러한 의미에서, 필요한 경우, 더 블랙 커런트 아로마 특정 VOC 라이브러리를 쉽게 함께 넣을 수 있습니다. 그러나 이 연구의 목적은 라즈베리, 딸기 및 블랙커런트 과일을 포함한 다양한 베리에서 VOC 측정을 위해 이전에 확립된 library27을 조정하는 것이었습니다.
여기에 제시된 프로토콜에는 이미 다른 곳에서 논의된 다른 HS-SPME/GC-MS 플랫폼과 같은 몇 가지 장점과 단점이 있습니다25,26,38. 자동화의 용이성을 제공하지만 많은 수의 샘플을 분석해야 할 때 선택되는 기술이 지만, 주요 단점은 매트릭스 효과에 대한 감수성입니다38. 또한, SPME 섬유 코팅 선택 과 대상 VOCs25,27의 화학적 특성에 따라 샘플링 조건과 함께 특별한주의를 기울여야 한다. 결론을 위해 베리 과일 헤드 스페이스의 VOC 프로파일링을 위한 신속하고 반자동 프로토콜이 여기에 제공되며 필요한 경우 라이브러리 크기가 증가하는 데 사용하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 이 플랫폼은 다른 과일 종에 적응 할 수 있으며 유전체 연구 및 / 또는 감각 분석 패널과 결합하면 아로마 프로파일링 및 개선을 자르는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 HS-SPME / GC-MS 측정에 대한 말라가 대학에서 세르비시오 센트럴 드 아포요 라 Investigación 감사합니다. 우리는 휘발성 정량화에서 사라 페르난데스 - 팔라시오스 캄포스의 도움을 인정합니다. 우리는 또한 과일 재료를 제공 굿 베리의 컨소시엄 구성원에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
References
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