Summary
Neste trabalho, descrevemos os protocolos usados em ensaios baseados em enzimas cílicas e virais para triagem de inibidores da replicação do vírus Zika em um formato de triagem de alto rendimento.
Abstract
A descoberta de medicamentos antivirais requer o desenvolvimento de ensaios bioquímicos e celulares confiáveis que podem ser realizados em formatos de triagem de alto rendimento (HTS). Acredita-se que as proteínas não estruturais do flavivírus (NS) se reúnem co-traduzindo nas membranas de rcúlumes endoplasmáticos (ER), formando o complexo de replicação (RC). O NS3 e o NS5 são as enzimas mais estudadas do RC e constituem os principais alvos para o desenvolvimento de drogas devido aos seus papéis cruciais na replicação do genoma viral. O domínio protease NS3, que requer o NS2B como seu cofator, é responsável pelo decote da imatura poliproteína viral nas proteínas NS maduras, enquanto o domínio NS5 RdRp é responsável pela replicação do RNA. Aqui, descrevemos em detalhes os protocolos usados em triagens baseadas em replicon e ensaios enzimáticos para testar grandes bibliotecas compostas para inibidores da replicação do vírus Zika (ZIKV). Os replicons são sistemas subgenômicos auto-replicante expressos em células mamíferas, nas quais os genes estruturais virais são substituídos por um gene repórter. Os efeitos inibitórios dos compostos na replicação viral do RNA podem ser facilmente avaliados medindo a redução da atividade proteica repórter. As triagens baseadas em replicon foram realizadas usando uma linha celular de replicon BHK-21 ZIKV expressando a luciferase de Renilla como um gene repórter. Para caracterizar os alvos específicos dos compostos identificados, estabelecemos ensaios baseados em fluorescência in vitro para protease NS3 e NS5 RdRp recombinantemente expressos. A atividade proteolítica da protease viral foi medida pelo uso do substrato de peptídeo fluorogênico Bz-nKRR-AMC, enquanto a atividade de alongamento do NS5 RdRp foi diretamente detectada pelo aumento do sinal fluorescente do SYBR Green I durante o alongamento do RNA, usando o modelo de auto-priming sintético 3'UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3').
Introduction
O vírus Zika (ZIKV) é um vírus emergente transmitido pelo artrópode do gênero Flavivirus, que inclui o vírus da dengue (DENV) intimamente relacionado, o vírus da encefalite japonesa (JEV) e o vírus da Febre Amarela (YFV), que representam constantes ameaças à saúde pública1. O surto de ZIKV 2015-16 nas Américas recebeu atenção global após seu surgimento no Brasil devido à associação com doenças neurológicas graves, como a microcefalia congênita associada ao ZIKV em recém-nascidos2,3 e síndrome de Guillain-Barré em adultos4. Embora o número de casos de infecção tenha diminuído ao longo dos dois anos seguintes, as transmissões autóctones transmitidas por mosquitos de ZIKV foram verificadas em 87 países e territórios em 2019, evidenciando, portanto, o potencial do vírus para ressurgir como uma epidemia5. Até o momento, não há vacinas aprovadas ou medicamentos eficazes contra a infecção pelo ZIKV.
A descoberta de medicamentos antivirais requer o desenvolvimento de ensaios celulares e bioquímicos confiáveis que podem ser realizados em formatos de triagem de alto rendimento (HTS). As triagens baseadas em replicon e ensaios baseados em enzimas virais são duas estratégias valiosas para testar compostos de pequenas moléculas para inibidores do ZIKV1. Acredita-se que as proteínas não estruturais (NS) do flavivírus são co-traduzinicamente montadas nas membranas de ânticulo endoplasmático (ER), formando o complexo de replicação (RC)6. O NS3 e o NS5 são as enzimas mais estudadas do RC e constituem os principais alvos para o desenvolvimento de drogas devido aos seus papéis cruciais na replicação do genoma viral. O domínio protease NS3, que requer o NS2B como seu cofator, é responsável pelo decote da imaturo poliproteína viral nas proteínas NS maduras, enquanto o domínio NS5 RdRp é responsável pela replicação do RNA6.
Os replicons são sistemas subgenômicos auto-replicante expressos em células mamíferas, nas quais os genes estruturais virais são substituídos por um gene repórter. Os efeitos inibitórios dos compostos na replicação viral do RNA podem ser facilmente avaliados medindo a redução da atividade proteica repórter7. Aqui, descrevemos os protocolos usados para os inibidores de triagem da replicação ZIKV em um formato de placa de 96 poços. Os ensaios baseados em replicon foram realizados usando uma linha celular BHK-21 ZIKV Rluc replicon que desenvolvemos recentemente8. Para caracterizar os alvos específicos dos compostos identificados, estabelecemos ensaios in vitro baseados em fluorescência para protease NS3 recombinantemente expresso usando o substrato de peptídeo fluorogênico, Bz-nKRR-AMC, enquanto para NS5 RdRp medimos o alongamento do modelo de auto-priming sintético 3'UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3'), usando o corante intercalante SYBR Green I.
O zikv protease (45-96 resíduos de cofator NS2B ligados a resíduos 1-177 de domínio protease NS3 por um linker rico em glycina [G4SG4]) foi obtido, conforme descrito para YFV9, enquanto a polimerase (276-898 resíduos de domínio RdRp) foi clonada e expressa, conforme detalhado em10. Ambas as sequências enzimáveis foram derivadas do GenBank ALU33341.1. Como triagens antivirais primárias, os compostos são testados a 10 μM e aqueles que mostram atividades ≥ 80% são então avaliados de forma dependente de dose, resultando nas concentrações efetiva/inibição (EC50 ou IC50) e nas concentrações citotóxicas (CC50). No contexto dos resultados representativos, são mostrados os valores EC50 e CC50 de NITD008, um conhecido inibidor de flavivírus11, a partir de triagens baseadas em replicon. Para os ensaios enzimáticos, são mostrados os valores IC50 de dois compostos da Caixa de Resposta Pandêmica MMV/DNDi, uma biblioteca composta por 400 moléculas com atividades antibacterianas, antifúnggicas e antivirais. Os protocolos descritos neste trabalho poderiam ser modificados para triagem de inibidores de outros flavivírus relacionados.
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Protocol
1. Ensaio de atividade de luciferase
NOTA: Certifique-se de que todos os procedimentos envolvendo cultura celular sejam realizados em capas de biossegurança certificadas (ver Tabela de Materiais).
- Prepare a mídia de crescimento composta pelo DMEM (Modified Eagle's Medium, do Dulbecco) complementado com 10% de FBS e 500 μg/mL G418.
- Prepare uma solução de estoque de 10 mM de compostos testados em 100% DMSO e, em seguida, dilua-os para 1 mM em 100% DMSO.
- Cultura ZIKV Células de replicon zikv em mídia de crescimento em um frasco de cultura de 75 cm2 a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2(ver Tabela de Materiais) até atingirem 70-90% de confluência.
- Descarte o meio. Adicione 5 mL de trippsin-EDTA ao frasco por 5 a 10 min e, em seguida, centrifugar as células a 125 x g por 5 min.
- Descarte o supernascimento, resuspense as células em 5 mL de DMEM 10% FBS e conte 10 μL de células resuspended em um hemocitômetro.
- Ajuste as células para 2 x 104 células/bem em DMEM 10% FBS e sementes 100 μL de células por poço em uma placa de cultura celular de 96 poços (ver Tabela de Materiais).
- Incubar a placa por 16 h a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2(ver Tabela de Materiais).
- Em seguida, descarte o meio com uma micropipette multicanal e adicione 100 μL/poço de DMEM 2% FBS à placa.
- Adicione 1 μL dos compostos por poço para resultar em uma concentração final de 10 μM 1% DMSO no meio de ensaio. Na primeira coluna, adicione apenas 1% DMSO como controle sem inibição e NITD008 na última coluna, como controle positivo (100% de inibição).
- Incubar a placa por 48 h a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2(ver Tabela de Materiais).
- Descongele o kit renilla luciferase Assay System à temperatura ambiente, prepare uma solução de trabalho 1x Renilla luciferase Lysis Buffer e um volume apropriado de reagente Renilla Luciferase (tampão de ensaio + substrato; 100 μL por poço), de acordo com as instruções do fabricante.
- Descarte o supernacido das células com uma micropipette multicanal e adicione 25 μL de 1x Tampão de Luciferase Renilla por poço.
- Incubar a placa em temperatura ambiente por 15 min e, em seguida, transferir 20 μL de lisecelulares com uma micropipette multicanal para uma placa branca opaca de 96 poços (ver Tabela de Materiais) contendo 100 μL/bem de Renilla luciferase Assay Reagent.
- Leia os sinais luminescentes em um luminômetro ou em qualquer equipamento que tenha a opção de ler luminescência (ver Tabela de Materiais).
- Para cada placa, calcule o valor do fator Z 12, da seguinte forma: Z′ = 1 - ((3SD de amostra + 3SD de controle)/│Mean da amostra - Média de controle│); SD - desvio padrão. Um fator Z entre 0,5 e 1.0 significa um ensaio de boa qualidade 12.
- Para determinar os valores EC50 dos compostos, proceda como descrito nas etapas 1.3 a 1.8 e, em seguida, adicione os compostos diluídos em série às células, juntamente com os controles negativos (1% DMSO) e positivos (NITD008 a 10 μM). Realize o ensaio duas vezes em duplicatas.
- Plote os valores médios das taxas de inibição por concentração composta e use um software de análise de gráficos para realizar um encaixe sigmoidal e obter os valores EC50.
2. Ensaio MTT baseado em proliferação celular
- Prossiga conforme descrito no item 1 passos 1.1 a 1.8.
- Adicione os compostos inicialmente a 10 μM e o controle 1% DMSO às células.
- Prepare uma solução de 5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromide) em soro fisápio tamponado fosfato (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4; pH 7.4) e vórtice até a solubilização completa do MTT.
- Adicione a solução MTT às células a um décimo do volume do poço (10 μL/well).
- Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2(ver Tabela de Materiais) por 3-4 h.
- Descarte o supernatante com uma micropipette multicanal e adicione 100 μL de DMSO (100%) a cada poço.
- Solubilize os cristais formazan, pipetando para cima e para baixo e, em seguida, leia a absorvência a 570 nm em um espectrofotômetro (ver Tabela de Materiais).
- Para determinar os valores cc50 dos compostos, proceda como descrito no item 1 passos 1.1 a 1.8 e, em seguida, adicione os compostos diluídos em série às células, juntamente com o controle negativo (1% DMSO). Realize o ensaio duas vezes em duplicatas.
- Plote os valores médios das taxas de inibição por concentração composta e use um software de análise de gráficos para realizar um encaixe sigmoidal e obter os valores cc50.
3. Ensaio de atividade protease NS2B-NS3
- Descongele uma alíquota de proteína no gelo.
- Defina a temperatura do leitor de placas (ver Tabela de Materiais) até 37°C.
- Prepare a quantidade apropriada de proteína diluída a 80 nM (5 μL/well). A concentração final de proteínas é de 4 nM.
- Descongele a quantidade apropriada de substrato Bz-nKRR-AMC no gelo (solução de estoque de 300 μM diluída no buffer de ensaio, 10 μL/well).
- Em uma placa branca de 96 poços (ver Tabela de Materiais),dispense 84 μL de tampão de ensaio (20 mM Tris pH 8,5, 5% glicerol e 0,01% Triton X-100) em cada poço.
- Para fazer a reação de controle positiva, a cada poço da última coluna dispense 1 μL de Aprotinina para alcançar a concentração final de 1 μM (solução de estoque 100 μM diluída em água)
- Para fazer a reação de controle negativo, à primeira coluna dispense 1 μL de DMSO (concentração final 1%).
- Para realizar a triagem composta, dispense 1 μL de cada composto para alcançar concentração final de 10 μM (concentração de estoque de 1 mM), excluindo poços de controle positivos e negativos.
- Dispense 5 μL da solução protease.
- Incubar a placa a 4 °C por 30 minutos.
- Para iniciar a reação, dispense 10 μL de solução de estoque Bz-nKRR-AMC (concentração final de 30 μM).
- Defina o comprimento de onda de excitação para 380 nm e emissão para 460 nm e leia a fluorescência por 30 minutos a cada 1 min em um leitor de microplaca (ver Tabela de Materiais). Realize o experimento inteiro a 37 °C.
- Calcule os valores médios da fluorescência para reações positivas e negativas de controle. Definido como 100% da atividade protease o valor médio da fluorescência para reações de controle negativas subtraídas do valor médio do controle positivo e calcular os percentuais de atividade para cada composto.
- Para cada placa, calcule o valor do fator Z, conforme descrito na etapa 1.15.
- Proceder com a determinação do IC50 para compostos que apresentaram uma taxa de inibição superior a 80%.
- Realize o ensaio em triplicados conforme descrito nas etapas 3.1-3.13, usando uma diluição serial do composto.
- Plote os valores médios das taxas de inibição por concentração composta e use um software de análise de gráficos para realizar um encaixe sigmoidal e obter os valores ic50.
4. Ensaio de alongamento do NS5 RdRp
NOTA: Todos os materiais utilizados neste ensaio são certificados RNase, DNase e pyrogenase free.
- Prepare tanto o tampão de ensaio (50 mM Tris pH 7.0, 2,5 mM MnCl2, 0,01% Triton X-100) quanto a solução de estoque ATP de 200 mM com 0,1% de ditilpirocarbonato (DEPC) de água tratada.
- Anneal a 5 μL aliquot de 200 μM 3'UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') em água tratada pcr incubando-a por 5 minutos a 55 °C em um termociclador.
- Descongele a solução de ações do NS5 RdRp, ATP de 200 mM e x10.000 SYBR Green I no gelo.
- Diluir a proteína para uma concentração final de 250 nM em 3 mL de tampão de ensaio.
- Prepare a solução de substrato diluindo as soluções de estoque da ATP, 3'UTR-U30 e SYBR Green I em 3 mL de tampão de ensaio para uma concentração final de 1 mM, 300 nM e 1X, respectivamente.
- Em uma placa PCR de 96 poços (ver Tabela de Materiais),adicione 24,5 μL de proteína diluída nas colunas 1 a 11 de cada linha. Adicione o mesmo volume de tampão de ensaio nos poços restantes.
- Para controle e reação em branco, adicione 0,5 μL de DMSO nas colunas 1 e 12. Adicione 0,5 μL de composto diluído em DMSO a uma concentração final de 10 μM 1mM solução de estoque).
- Sele a placa com um filme de vedação e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos.
- Inicie a reação adicionando 25 μL de solução de substrato e sele novamente a placa.
- Incubar a 30 °C em um sistema PCR em tempo real (ver Tabela de Materiais) e monitorar a fluorescência por 1 hora, medindo a fluorescência a cada 30 s com o filtro FAM (Emissão:494 nm/Excitação:521 nm).
- Para cada placa, calcule o valor do fator Z, conforme descrito na etapa 1.15.
- Prossiga com a determinação do IC50 para compostos que apresentaram uma taxa de inibição superior a 80%, conforme descrito na etapa 3,15.
- Plote os valores médios das taxas de inibição por concentração composta e use um software de análise de gráficos para realizar um encaixe sigmoidal e obter os valores ic50.
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Representative Results
Todos os protocolos aqui descritos foram estabelecidos em placas de 96 poços e permite a avaliação de 80 compostos por placa em uma triagem primária de uma única concentração, incluindo os controles negativos e positivos colocados na primeira e última coluna das placas, respectivamente. As triagens baseadas em replicon estão representadas na Figura 1, que inclui o construto de RNA desenvolvido para obter a linha celular BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo(Figura 1A),a representação esquemática dos ensaios(Figura 1B) e as curvas de dose-resposta de NITD008 (EC50 de 0,28 μM, CC50 > 10 μM) (Figura 1C). Os valores EC50 e CC50 dos compostos atingidos são determinados como as concentrações necessárias para inibir 50% da atividade Rluc e causar 50% de citotoxicidade, respectivamente. Com relação ao ensaio da luciferase, o DMSO 1% é usado como controle sem inibidor (inibição de 0%) e o NITD008 é usado como controle positivo (100% de inibição), como descrito anteriormente8.
A atividade protease NS2B-NS3 é medida pelo monitoramento de fluorescência da AMC liberado devido à atividade proteolítica do protease (Figura 2A). A protinina, proteína que atua como inibidor de trippsina e já é descrita como inibidora de proteases flavivírus13,14,15, foi utilizada neste ensaio como um controle positivo experimental (IC50 de 0,13 ± 0,02 μM, dados não mostrados). A Figura 2B ilustra uma curva de inibição dose-resposta de uma molécula voltada para a atividade protease, o composto MMV1634402 (IC50 de 0,36 ± 0,08 μM). A atividade de alongamento do NS5 RdRp é medida em tempo real pelo aumento da intensidade de fluorescência do SYBR Green I quando intercalado com o dsRNA sintetizado(Figura 2C). A curva de inibição dose-resposta de uma molécula atingida visando ZIKV RdRp, o composto MMV1782220 (IC50 de 1,9 ± 0,8 μM), é mostrada na Figura 2D. Uma vez que os inibidores analógicos nucleosídeos, como o NITD008, não são adequados para ensaios enzimáticos, pois os fosfatos precisam ser incorporados intracelularmente à molécula16,não usamos nenhum controle positivo para ensaio de alongamento de NS5 RdRp. No entanto, clofazimine, um antibiótico comercial, que recentemente identificamos como um inibidor da polimeraseviral 8,poderia ser usado como um controle experimental nos próximos ensaios.
Figura 1: Triagens baseadas em replicon. A) Representação esquemática do edifício zikv replicon contendo uma sequência Rluc no terminus UTR de 5' e um gene Neo no terminus UTR de 3' utr, que desenvolvemos para obter a linha celular BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo linha 8. B) Representação esquemática do ensaio de atividade da luciferase e do ensaio MTT baseado em proliferação celular realizado para triagem para inibidores da replicação ZIKV. )As curvas dose-resposta (EC50 e CC50) de NITD008. O ensaio foi realizado em duplicatas. As barras de erro representam desvios padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ensaios baseados em enzimas virais. A) Representação esquemática do ensaio de atividade protease NS2B-NS3. B) A curva de inibição dose-resposta (IC50) do composto MMV1634402. C) Representação esquemática do ensaio de atividade de polimerase NS5 RdRp RNA. )A curva de inibição dose-resposta (IC50) do composto MMV1782220. Os ensaios foram realizados em triplicados. As barras de erro representam desvios padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os protocolos aqui descritos poderiam ser prontamente adaptados para exibições em formatos 384 ou 1536-well. Para triagens bioquímicas e/ou baseadas em células realizadas em formato HTS, o valor fator Z, um parâmetro estatístico, é calculado para cada placa para garantir a sensibilidade, reprodutibilidade e precisão desses ensaios12. Um valor fator Z de 0,5 ou mais é esperado para triagens baseadas em replicon, enquanto um valor de 0,7 ou mais é esperado para os ensaios de atividade NS3 e NS5. Para o HTS baseado em replicon, desenvolvemos as células BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo, uma linha celular estável que abriga um replicativo zikv replicon contendo uma sequência de Renilla luciferase(Rluc) na região UTR de 5' e um gene de fosfotransferase (Neo) replicante impulsionado por um local interno de entrada ribossômica (IRES) no UTR de 3'UTR. Retivemos 38 resíduos de capsídeos e 30 resíduos de genes envolvedores que são necessários para o início correto da tradução de RNA, para manter níveis de replicação comparáveis e sensibilidade à droga entre as passagens celulares8. Devido à falta de genes estruturais, os replicons não produzem virions progêneros, eliminando assim o risco de infecção viral adquirida em laboratório17.
Os ensaios antivirais utilizando as células de replicon ZIKV consistem na atividade da luciferase e nos ensaios MTT (citotoxicidade) baseados em proliferação celular realizados em paralelo. Isso é necessário para excluir os golpes falso-positivos, compreendendo moléculas que interferem diretamente na expressão e/ou atividade da proteína repórter e aquelas que afetam negativamente a saúde celular7. Os sistemas de replicon permitem a descoberta de moléculas que inibem a replicação do RNA, mas não as necessárias para a entrada viral e a montagem/liberação de virion. Alternativamente, os replicons podem ser embalados para produzir partículas de replicon vírus (VRPs) fornecendo as proteínas estruturais em trans17. As partículas infecciosas de uma rodada (SRIPs) são infecciosas, mas o vírus progênero não pode se propagar, pois o genoma do pacote não tem genes estruturais. Portanto, os VRPs poderiam ser usados para testar inibidores de entrada/replicação viral medindo os níveis da proteína repórter7.
Além das triagens baseadas em replicon, também detalhamos aqui os protocolos usados em ensaios baseados em enzimas virais para o recombinante NS3 protease e NS5 RdRp. A atividade proteolítica da protease viral foi medida usando o substrato de peptídeo fluorogênico Bz-nKRR-AMC, que contém o reconhecimento de protease ZIKV e a sequência de decote, juntamente com a tag fluorescente 7-amine-4-metilcoumarina (AMC). Devido à atividade de protease, a tag fluorescente é liberada e a taxa de reação é diretamente medida pelo monitoramento da fluorescência em um espectrofotômetro18,19. Este ensaio é altamente sensato, relativamente barato, rápido e adequado para triagem de grandes bibliotecas compostas20,21. A maior desvantagem é a possível extinção entre compostos testados e o fluoróforo que pode levar a ataques falso-positivos. No entanto, essa questão poderia ser tratada por uma medida adicional de fluorescência na presença da AMC. Além disso, compostos que mostram emissão ou absorção no mesmo comprimento de onda do fluoróforo não podem ser avaliados por este método18,20.
Em relação ao NS5 RdRp, sua atividade de alongamento é diretamente detectada pelo aumento do sinal fluorescente do SYBR Green I durante o alongamento de um modelo de 3'UTR-U30 auto-estriante. O protocolo foi adaptado a partir de ensaios com corantes intercalantes como Pico Green e SYTO 9 que têm sido amplamente utilizados para avaliar compostos para diferentes polímeras virais22,23,24,25,26. Embora tenhamos usado um modelo biotining auto-priming27 no ensaio, outros modelos, como poliU, podem ser usados também25. A principal desvantagem deste método é o alto número de acertos falso-positivos que interagem com o corante, seja interferindo na fluorescência ou diminuindo a intercalação dsRNA28. Portanto, os compostos atingidos precisam ser validados com contra-ensaios como métodos biofísicos ou comparando a fluorescência SYBR™ Green I no dsRNA com e sem o composto29. No entanto, a fácil implementação, a medição direta e a acessibilidade são pontos-chave para o uso de métodos baseados em fluorescência como plataformas HTS, em comparação com ensaios rotulados por rádio ou acoplados que são difíceis de implementar em campanhas de média/grande escala27,30,31.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), concessão do CEPID 2013/07600-3 para GO, conceder 2018/05130-3 à RSF e 2016/19712-9 à ASG, e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (subvenção 88887.516153/2020-00) à ASG. Gostaríamos de agradecer agradecendo à Medicina para a Malária Ventures (MMV, www.mmv.org) e à iniciativa Drogas para Doenças Negligenciadas (DNDi, www.dndi.org) pelo apoio, pelo projeto da Caixa de Resposta Pandêmica e pelo fornecimento dos compostos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | - | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarin) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | - | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
References
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