Aktivering och konjugation av lösliga polysackarider med 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Summary

Proteiner och aminer som innehåller ligander kan kovalent kopplas till polysackarider som aktiveras av cyanylationsreagenset, 1-cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluorborat (CDAP), för att bilda kovalentprotein (ligand)-polysackaridkonjugater. Denna artikel beskriver ett förbättrat protokoll för att utföra kontrollerad CDAP aktivering vid 0 °C och varierande pH och utföra efterföljande konjugation av aktiverade polysackarider.

Abstract

Konjugatvacciner är anmärkningsvärda framsteg inom vaccinologi. För beredning av polysackaridkonjugatvacciner kan polysackariderna bekvämt funktionaliseras och kopplas till vaccinbärarproteiner med 1-cyano-4-dimethylaminopyridintefluoreborat (CDAP), ett lätt hantera cyanylerande reagens. CDAP aktiverar polysackarider genom att reagera med kolhydrathydroxidgrupper vid pH 7-9. Cdap:s stabilitet och reaktivitet är mycket pH-beroende. Reaktionens pH minskar också under aktiveringen på grund av hydrolysen av CDAP, vilket gör bra pH-kontroll nyckeln till reproducerbar aktivering. Det ursprungliga CDAP-aktiveringsprotokollet utfördes vid rumstemperatur i obyggda pH 9-lösningar.

På grund av den snabba reaktionen under detta tillstånd (<3 min) och den medföljande snabba pH-droppen från den snabba CDAP-hydrolysen var det utmanande att snabbt justera och bibehålla målreaktions-pH under den korta tidsramen. Det förbättrade protokollet som beskrivs här utförs vid 0 °C, vilket saktar cdap hydrolys och förlänger aktiveringstiden från 3 min till ~15 min. Dimetyllaminopyridin (DMAP) användes också som buffert för att förjustera polysackaridlösningen till målaktiverings-pH innan CDAP-reagenset tillskom. Den längre reaktionstiden, i kombination med den långsammare CDAP-hydrolysen och användningen av DMAP-buffert, gör det lättare att upprätthålla aktiverings-PH under hela aktiveringsprocessen. Det förbättrade protokollet gör aktiveringsprocessen mindre frenetisk, mer reproducerbar och mer mottaglig för skalning.

Introduction

Konjugatvacciner, såsom de som består av polysackarider som är kovalely kopplade till ett bärarprotein, är bland de anmärkningsvärda framstegen inom vaccinologi^1,2. Polysackarider, som T-cellsoberoende antigener, är dåligt immunogena hos spädbarn och inducerar inte minne, klassväxling eller affinitetsmognad av antikroppar³. Dessa brister övervinns i polysackaridkonjugatvacciner⁴. Eftersom de flesta polysackarider inte har ett bekvämt kemiskt handtag för konjugation måste de först göras reaktiva eller "aktiveras". Den aktiverade polysackariden är sedan kopplad antingen direkt till proteinet (eller modifierat protein) eller är funktionell för ytterligare derivatisering före konjugation⁴. De flesta licensierade polysackaridkonjugatvacciner använder antingen reduktiv amination eller cyanylering för att aktivera polysackaridhydroxiler. Cyanogenbromid (CNBr), ett reagens som tidigare hade använts för att aktivera kromatografi hartser, användes ursprungligen för polysackaridderivatisering. CNBr kräver dock högt pH, vanligtvis ~ pH 10,5 eller mer, för att delvis avprotonera polysackaridhydroxiler så att de är tillräckligt nukleofila för att attackera cyanogruppen. Det höga pH-talet kan vara skadligt för baslabbila polysackarider, och varken CNBr eller den aktiva cyano-ester som ursprungligen bildades är tillräckligt stabil vid så högt pH.

CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborate; Figur 1) introducerades av Lees et al. för användning som cyanylerande medel för aktivering av polysackarider^5,6. CDAP, som är kristallint och lätt att hantera, visade sig aktivera polysackarider vid ett lägre pH än CNBr och med färre sidoreaktioner. Till skillnad från CNBr kan CDAP-aktiverade polysackarider konjugeras direkt till proteiner, vilket förenklar syntesprocessen. CDAP-aktiverade polysackarider kan funktionaliseras med en diamin (t.ex. hexandiamin) eller en dihydrazid (t.ex. adipic dihydrazide, ADH) för att göra amino- eller hydrazide-derivatiserade polysackarider. En hög koncentration av homobifunktionellt reagens används för att undertrycka korslänkning av polysackarider. Aminopolysackarider kan sedan konjugeras med någon av de otaliga tekniker som används för proteinkonjugation. Hydrazide-derivatized polysackarider är ofta kopplade till proteiner med hjälp av en karbodiimide reagens (t.ex. 1-etyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimide (EDAC))⁷. Ytterligare optimering av CDAP polysackarid aktivering har beskrivits av Lees et al.⁸ och ingår i protokollet beskrivs här.

Översikt över CDAP-konjugation
CDAP-protokollet kan konceptualiseras som två faser: (1) aktivering av polysackarid och (2) konjugation av den aktiverade polysackariden med ett protein eller ligand (Figur 2). Målet med det första steget är att effektivt aktivera polysackariden, medan målet med det andra är att effektivt konjugera till den aktiverade polysackariden. Den aktiverade polysackariden binder ihop de två stegen. Denna konceptualisering hjälper till att fokusera på de kritiska elementen i varje steg. Figur 2 expanderar på denna konceptualisering, som visar önskade aktiverings- och kopplingsreaktioner, tillsammans med hydrolysreaktioner och sidoreaktioner.

Under aktiveringsfasen är de tre största problemen CDAP-stabilitet, CDAP-reaktion med polysackaridhydroxiler och stabiliteten hos den aktiverade polysackariden (figur 3). CDAP-hydrolysen ökar med pH, liksom hydrolysen av den aktiverade polysackariden och sidoreaktionerna. CDAP-reaktionen med polysackarid underlättas dock genom att öka pH-talet. Effektiv aktivering av polysackarider med CDAP kräver en balans mellan 1) polysackaridens reaktivitet och CDAP och 2) hydrolys- och sidoreaktionerna hos både reagenset och den aktiverade polysackariden.

I det ursprungliga CDAP aktivering protokollet beskrivs av Lees et al.^5,CDAP aktivering av polysackarider utfördes vid rumstemperatur i obebyggd pH 9 lösning. Aktiveringshastigheten konstaterades vara snabb under detta tillstånd, och aktiveringen skulle vara klar inom 3 minuter. Reaktionen åtföljdes också av snabb hydrolys av CDAP, orsakar en snabb pH droppe av den obyggda reaktionslösningen. Det var utmanande att snabbt höja och behålla reaktions-pH vid målvärdet på så kort tid. I det beskrivna protokollet utfördes aktivering genom att cdap tillsatts från en 100 mg/ml stamlösning till den obebyggda polysackaridlösningen. PH höjdes 30 s senare med "en lika stor volym på 0,2 M trietylamin". Protein som ska konjugeras tillsattes sedan efter 2,5 min till aktiveringsreaktionen. I synnerhet var pH för aktiveringssteget inte välkontrollerat och överskred sannolikt initialt mål-pH. Den snabba reaktionen som krävde snabb pH-justering gjorde aktiveringsprocessen svår att kontrollera och utmanande att skala upp.

I motsats till det ursprungliga protokollet har det ändrade protokollet som beskrivs här två stora förbättringar. För det första är pH-enheten för polysackaridlösningen förjusterad till målaktiverings-pH, med DMAP som buffert, före tillsats av CDAP. DMAP har en pKa på 9,5 och har därmed god buffringseffekt runt pH 9, och till skillnad från många andra buffertar befanns DMAP inte främja CDAP-hydrolys⁸. Dessutom är DMAP redan en process mellanliggande och lägger därför inte till en ny komponent i reaktionsblandningen. Förjustering av pH-värde innan CDAP tillsätts eliminerar den stora pH-gungan i början av reaktionen och möjliggör ett effektivare underhåll av mål-pH under reaktionen. Den andra förbättringen är att utföra aktiveringsreaktionen vid 0 °C, där frekvensen av CDAP-hydrolys är markant långsammare än vid rumstemperatur. Med den längre reagenshalvtiden vid 0 °C ökas aktiveringstiden från 3 min till 15 min för att kompensera för den långsammare aktiveringshastigheten vid lägre temperatur. Den längre reaktionstiden gör det i sin tur lättare att bibehålla reaktions-pH. Användningen av 0 °C saktar också nedbrytningen av pH-känsliga polysackarider, vilket gör det möjligt att förbereda konjugat av denna typ av polysackarid. Förbättringarna i protokollet gör aktiveringsprocessen mindre frenetisk, lättare att kontrollera, mer reproducerbar och mer mottaglig för skalning.

Denna artikel beskriver det förbättrade protokollet för att utföra kontrollerad CDAP-aktivering av polysackarid vid 0 °C och vid ett angivet mål pH och utföra efterföljande derivatisering av aktiverade polysackarider med ADH. Också beskrivet är en trinitrobensulfonsyra (TNBS) analys, baserad på metoden Qi et al.⁹, för bestämning av hydrazid nivå på den modifierade polysackarid. En modifierad analys för hexoser baserad på resorcinol och svavelsyra¹⁰ beskrivs också, som kan användas för att bestämma ett bredare spektrum av polysackarider. För mer information om AKTIVERING och konjugation av CDAP hänvisas läsaren till tidigare publikationer^5,6,8 av Lees et al.

Protocol

OBS: Förbered polysackaridlösningen, ADH-lösningen, DMAP-lösningen och CDAP-stamlösningen i förväg innan du utför aktiverings- och funktionsförfarandena för polysackarid. Placera lösningarna och utrustningen på en organiserad, bekväm och logisk plats. Den beskrivna reaktionen är för 10 mg polysackarid och kan skalas upp eller ner. Vi rekommenderar att du utvärderar protokollet i liten skala innan du skalar upp.

1. Förbered 5 mg/ml polysackaridlösning, 2 ml.

1. För lyofiliserad polysackarid
   1. Låt polysackaridbehållaren komma upp i rumstemperatur innan den öppnas. Väg ut 10 mg polysackarid inuti ett skruvlocksrör med hjälp av en analytisk balans. Använd en statisk eliminator för enklare provtagning och mer exakt vägning av pulvret.
   2. Tillsätt 2 ml natriumklorid (NaCl) på 0,15 M för att lösa upp polysackariden. Keps och virvelröret.
      OBS: Natriumklorid påverkar inte CDAP-reaktionen, men det kan påverka den sekundära polysackaridstrukturen. Vissa polysackarider är mer lösliga vid olika saltkoncentrationer.
   3. Blanda röret genom end-over-end rotation i 12-24 h, beroende på polysackaridens molekylvikt, så att polysackariden kan hydrera helt. Värm vid behov röret försiktigt för att främja löslighet.
2. För löslig polysackarid i buffrad lösning
   OBS: För effektiv CDAP-aktivering bör polysackaridlösningen inte innehålla någon buffert, särskilt fosfatjon. Följ proceduren nedan för att ersätta bufferten med vatten eller en saltlösning och för att justera polysackaridkoncentrationen till 5 mg/ml.
   1. Erhåll en filteranordning på 4 ml eller 15 ml centrifugalspinn av lämplig molekylviktsskärning (MWCO).
      OBS: MWCO är idealiskt 5-10 gånger mindre än polysackaridens molekylvikt.
   2. Tillsätt en volym av den buffrade polysackaridlösningen som innehåller ~20 mg polysackarid till filterinsatsen. Fyll till full mark med vatten eller en saltlösning. Kapa filtret ordentligt. Blanda efter end-over-end några gånger.
   3. Centrifugera filteranordningen vid den centrifugalkraft som tillverkaren föreslår. Se till att centrifugeringstiden är tillräckligt lång för att uppnå minst 5-faldig volymreduktion efter varje snurr. Kassera genomflödet. Sätt ihop filterenheten igen.
   4. Fyll på filterinsatsen till full mark med färskvatten eller saltlösning. Kapa filtret ordentligt. Blanda innehållet i filtret genom slutrotation ~10 gånger eller genom skonsam virvel; upprepa snurret.
      OBS: Polysackarid kan ackumuleras längst ner på filterinsatsen på centrifugalanordningen och bilda en gel. Vi rekommenderar att retenten i filterinsatsen blandas med den färska påfyllningen före nästa snurr.
   5. Upprepa påfyllnings- och spinncykeln minst 3 gånger.
   6. Följ övningen nedan för att återställa polysackaridrettenten från filterinsatsen.
      1. Tillsätt färskvatten eller saltlösning i filterinsatsen så att volymen är ~1 ml. Blanda genom att leda upp och ner eller genom skonsam virvel.
      2. Överför allt blandat retentant till ett 5 ml-rör. Tillsätt 1 ml färskvatten eller saltlösning i filterinsatsen. Skölj filtret genom att leda upp och ner eller genom skonsam virvel. Överför och kombinera alla sköljningar med den återvunna polysackariden.
   7. Bestäm polysackaridkoncentrationen (se polysackaridtestet i avsnitt 7.3). Späd polysackariden med extra vatten eller saltlösning till 5 mg/ml.
3. När polysackaridlösningen är beredd, kyl röret som innehåller polysackaridlösningen i en ishink.

2. Förbered 0,5 M adipic acid dihydrazide (ADH) lösning, 10 ml.

1. Väg 0,87 g ADH i en analytisk balans och löslighet i 8 ml 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyra), pH 8.
2. Justera till mål pH med 1 M natriumhydroxid (NaOH), övervakas av en pH-mätare. Ta till 10 ml med extra buffert och bekräfta pH-talet igen.

3. Förbered 2,5 M DMAP-lösning, 10 ml.

OBS: DMAP är giftigt och tränger in i huden. Använd nitrilhandskar när du utför proceduren.

1. Väg försiktigt 3 g DMAP i ett koniskt rör på 50 ml. Tillsätt 5 ml vatten till DMAP och blanda genom att virvla i 5 minuter för att få en grumlig lösning (~ 7 ml).
2. Tillsätt 50 μL-steg på 10 N saltsyra (HCl) till DMAP-lösningen under blandningen. Blanda mellan varje tillägg. Sluta lägga till när lösningen blir klar.
3. Tillsätt 10 N NaOH i steg om 25 μL för att få DMAP-lösningen till ~pH 8.
4. Ta DMAP-lösningen till 10 ml med vatten för att ge en 2,5 M lösning.
5. Finjustera pH-värde för 2,5 M DMAP-lösningen.
   OBS: DMAP-lösning pH förändras med koncentration och jonisk styrka. Denna övning är att finjustera 2,5 M DMAP-beståndet till ett specifikt pH-värde så att när det blandas med 10 volymer polysackarid ligger den resulterande lösningen nära mål pH för aktivering.
   1. Förbered en serie 1,5 ml-rör som innehåller 1 ml vatten eller NaCl-lösningen, beroende på vilket som användes för att förbereda polysackaridlösningen. Kyl rören på is.
   2. Tillsätt 100 μL DMAP till ett kylt rör. Vortex och mät pH med en pH-mätare. Kassera sedan det uppmätta röret.
   3. Om det uppmätta pH-värdet inte ligger nära målvärdet justerar du DMAP-lagrets pH-värde med 1 M NaOH eller HCl, i förekommande fall. Upprepa steg 3.5.2 och 3.5.3 tills det uppmätta pH-värde är nära mål-pH.Repeat steps 3.5.2 and 3.5.3 until the measured pH is close to the target pH.

4. Förbered 100 mg/ml CDAP-stamlösning

OBS: CDAP-pulver ska hållas tätt stängt och förvaras vid -20 °C och får komma upp i rumstemperatur innan det öppnas. Använd nitrilhandskar när du utför proceduren.

1. Tara ett 1,5 ml snap-cap mikrocentrifugrör på en analytisk balans. Använd en liten spatel, väg ut 10-140 mg CDAP i röret. Observera CDAP:s faktiska vikt.
2. Bestäm volymen acetonitril som behövs för att förbereda 100 mg/ml CDAP. Öppna acetonitril i en rökhuva.
3. Använd en lämplig volymrör, dra och släpp acetonitrilen för att balansera sin ånga i rörspetsen. Vänta tills lösningsmedlet droppar ut ur rörspetsen efter några sekunder och var beredd att överföra det till CDAP-röret direkt. Dra den beräknade volymen acetonitril och överför den direkt till CDAP-röret. Knäpp locket igen.
   OBS: Acetonitrile kan också överföras till CDAP-röret med en Hamilton-spruta eller dess motsvarighet till lämplig storlek.
4. Vortex för att helt lösligisera CDAP. Placera CDAP-röret i en ishink.
   CDAP är stabilt i acetonitril i kylan. Lösliga lager får hållas på -20 °C i >1 vecka. Det är dock att föredra att förbereda nya CDAP-lösningar.

5. Polysackaridaktivering och hydrazidfunktionalisering

1. Se till att alla följande föremål är klara och lösningar kylda på is innan aktiveringen påbörjas: 2 ml av en 5 mg/ml polysackaridlösning i en behållare med platt botten, bred mun som innehåller en omrörare, placerad ovanpå en magnetisk omrörare; 100 mg/ml CDAP-stamlösning; 2,5 M DMAP-stamlösning; En pH-mätare med en halvmikrosond, såsom sonden med diametern 6 mm, kalibrerad för 0 °C enligt tillverkarens instruktioner. En rörledning på 100 μL som är klar att användas. En timer som är rensad och klar att användas. Ett autotitratordispenserhuvud placerat eller 10 μL rör klart att använda. 0,5 M ADH-lösning.
2. Förjusterade polysackaridens pH-fel till mål-pH med DMAP.
   1. Placera pH-sonden i polysackaridlösningen och lämna den i lösningen under hela aktiveringsproceduren.
   2. Överför 200 μL av DMAP-stamlösningen till polysackaridlösningen genom dropwise-tillsats under omrörning. Justera lösningens pH-fördr till målaktiverings-pH.Adjust the pH of the solution to the target activation pH. Tillsätt 0,1 M HCl för att sänka pH och 0,1 M NaOH för att öka pH-talet. Undvik att överskrida mål pH med mer än 0,1 pH-enhet och håll reaktionen kyld i ett isvattenbad under aktiveringens varaktighet.
3. CDAP-aktivering
   1. Rör 100 μL CDAP upp och ner för att balansera ångan i rörspetsen. Överför 100 μL CDAP till polysackaridlösningen med omrörning.
      OBS: Denna aktivering använder 1 mg CDAP för 1 mg polysackarid som utgångsförhållande. Förhållandet kan ökas eller minskas vid optimering av aktiveringen.
   2. Starta timern och övervaka pH-ändringen under hela aktiveringen. Behåll reaktionen vid mål pH genom att snabbt lägga till 10 μL steg om 0,1 M NaOH till reaktionen, med hjälp av en autotitrator dispenser (eller pipet).
      OBS: Det kan bidra till att minska pH-svarstiden för att röra om med en pH-sond försiktigt. PH sjunker snabbare i början, och det kan vara nödvändigt att lägga till 0,1 M NaOH oftare. När reaktionen fortsätter blir pH-minskningen långsammare, och tillägget blir mindre frekvent. PH bör förbli i stort sett oförändrat när den närmar sig optimal aktiveringstid, vilket är 10-15 min för pH 9-aktivering.
4. ADH-funktionalisering
   1. När den optimala aktiveringstiden har uppnåtts, tillsätt 2 ml 0,5 M ADH samtidigt till den aktiverade polysackariden under omrörning. Kontrollera att pH-skaen ligger inom målområdet (pH 8-9 för ADH).
      OBS: Ett tillägg med snabb blandning minimerar sannolikheten för att båda ändarna av dihydraziden reagerar med den aktiverade polysackariden, vilket förhindrar polysackaridkorslänkning.
   2. Fortsätt att röra om reaktionsblandningen i minst 1 timme. Överför reaktionsblandningen till 4 °C, men 0-20 °C är acceptabelt.
      OBS: ADH-funktionaliseringsreaktionen är inte starkt beroende av temperatur. Eftersom det stora överskottet av dihydrazid fungerar som släckningsreagenset är det inte nödvändigt att ytterligare släcka den aktiverade polysackariden. Men när man direkt frammanar proteiner bör reaktionen släckas, vanligtvis med 1 M glycin, pH 8-9.

6. Rening av ADH-funktionaliserad polysackarid genom dialys

OBS: Råprodukten från ADH-funktionaliseringsreaktionen innehåller en hög koncentration av ADH (0,5 M), som kan avlägsnas mest effektivt genom omfattande dialys. Gelfiltrering, antingen med en kolonn eller en spinnavsaltningsenhet, är inte lika effektiv, särskilt när det krävs för att avlägsna det återstående ADH-föroreningarna.

1. Bestäm dialysmembranets MWCO. Använd en 3 kDa cutoff för mindre polysackarider.
   OBS: Dialysmembranets MWCO är idealiskt 5-10 gånger mindre än MW polysackarid.
2. Välj önskat dialysformat (kassetter eller slangar) och rätt enhetskapacitet. Se till att enhetens kapacitet är 2 gånger större än provvolymen. Se tillverkarnas instruktioner för användning av enheten.
3. Hydrera dialysmembranet i vatten före användning. Överför den råa derivatiserade polysackaridlösningen till dialysanordningen enligt tillverkarens instruktioner.
   OBS: Använd nitrilhandskar för att undvika kontakt med DMAP.
4. Dialysera i en behållare fylld med 2-4 L 1 M NaCl och en omrörningsstång. Placera behållaren på en omrörplatta i ett kylrum eller inuti ett kylskåp. Rör om dialysatet försiktigt och kontinuerligt under dialysen.
5. Efter dialysning i minst 4 timmar, byt till färsk 1 M NaCl och dialys i minst 12 timmar. Dialysera mot 2 förändringar på 0,15 M saltlösning, var och en i minst 12 timmar. Om så önskas, dialys mot 2 förändringar av vatten.
6. Kontrollera om all ADH tas bort genom att testa dialysatet över natten med ett snabbt TNBS-test.
   1. Få 3 borosilikatrör, märk dem som negativ kontroll (ctrl), positiv ctrl respektive prov.
   2. Tillsätt 975 μL 0,1 M borat till det negativa ctrl-röret, pH 9.
   3. Tillsätt 100 μL 0,05 mM ADH (0,1 mM hydrazid) och 875 μL 0,1 M borat till det positiva ctrl-röret, pH 9.
   4. Tillsätt 500 μL av det över natten dialysatet och 475 μL 0,1 M borat till provröret, pH 9.
   5. Tillsätt 25 μL 1% TNBS till alla tre rören. Blanda väl. Placera i mörkret i 1 timme.
   6. Jämför färgintensiteten hos de 3 rören i 1 h. Se till att provrörets färgintensitet ligger mellan den positiva ctrl och den negativa ctrl, vilket indikerar att ADH-föroreningen är nere på 0,01 mM eller lägre. Dialys en gång till.
      OBS: Det är klokt att minska nivån på ADH-föroreningen så mycket som möjligt så att ADH-hydraziden står för mindre än 1% av den totala hydraziden i den renade hydrazid-polysackariden.
   7. Återställ den derivatiserade polysackariden från dialys. Bestäm koncentrationen av polysackarider och hydrazid. Beräkna förhållandet mellan hydrazid och polysackarid (se avsnitt 7). Om den dialyserade polysackariden måste koncentreras till 5–10 mg/ml, se avsnitt 1.2.

7. Analys av hydrazidderivatiserade polysackarider

OBS: Syftet med analysen som beskrivs här är att bestämma polysackaridkoncentrationen, hydrazidkoncentrationen och nivån av hydrazidderivatisering i termer av förhållandet mellan hydrazid och polysackarid.

1. Provberedning
   OBS: Polysackarider som ska analyseras måste vara fria från kolhydrater, aminer eller hydrazidförstöringar med låg molekylvikt. Lyofiliserade prover bör vara torra och saltfria för att säkerställa noggrann viktmätning. Vanligtvis är ~ 1 ml av en 1-2 mg / ml lösning tillräcklig för analyser.
   1. Väg minst 10 mg av det lyofila polysackaridprovet på en analytisk balans med hjälp av en icke-statisk spatel eller en statisk eliminator. Lös upp polysackariden i vatten eller saltlösning till en koncentration (t.ex. 2 mg/ml) så att analyssignalerna faller inom standardkurvans linjära intervall.
   2. Blanda slutet och ge provet tillräckligt med tid för att upplösas helt. Utför hydrering över natten beroende på polysackaridens molekylvikt.
2. Polysackaridanalys: metoden resorcinol/svavelsyra
   OBS: Lämplig analys för polysackarider beror på polymerernas kolhydratsammansättning. Den ursprungliga analysen av resorcinol/svavelsyra var avsedd för hexossocker¹⁰. Analysen ändrades här genom att höja temperaturen på värmesteget från 90 °C till 140 °C. Vid denna högre temperatur förlorar analysen viss specificitet men kan användas för att analysera många sockerarter. Det är dock fortfarande nödvändigt att fastställa lämpligheten av analysen för en viss polysackarid. Triplikat rekommenderas för varje punkt, men vissa boenden kan vara nödvändiga på grund av värmeblockens kapacitet.
   1. Förbered 75% svavelsyra
      OBS: Koncentrerad svavelsyra är extremt frätande och kan orsaka svåra brännskador. Utför denna procedur i en kemisk rökhuv. Häll alltid koncentrerad syra i vatten, inte tvärtom!
      1. Tillsätt 50 ml vatten till en 200 ml glasflaska. Placera flaskan i ett kallt vattenbad. Tillsätt långsamt 150 ml svavelsyra. Kapa flaskan så att den ventileras.
      2. Låt lösningen balansera till rumstemperatur. Använd lösningen inom 3 månader.
   2. Förbered kolhydratstandarder
      1. Förbered den omodifierade polysackaridlösningen vid 1 mg/ml som ska användas som standard. Alternativt kan du använda en blandning av enskilda sockerarter i förhållandet som finns i polysackaridens upprepade enhet vid 1 mg/ml av den totala sockerkoncentrationen som standard.
         OBS: Även om sockerblandningen vanligtvis ger samma resultat som kolhydratpolymeren med identisk sockersammansättning, bör detta bekräftas experimentellt.
   3. Se till att värmeblocket med rörhållare för 13 x 100 borosilikat provrör fungerar. Använd en skyddsplatta under och runt värmeblocket vid syraspill. Förvärm värmeblocket till 140 °C i minst 1 timme för att uppnå stabil och jämn temperatur genom alla block som används.
   4. Etikett 13 x 100 borosilikat provrör, triplicate för varje standard och varje prov. Tillsätt 0, 2,5, 5, 7,5, 10 μg (eller μL) av kolhydratstandarden 1 mg/ml till motsvarande märkta standardrör. Tillsätt vatten till varje rör för att få volymen till 100 μL.
      OBS: Färgen som genereras är beroende av specifika sockerarter. Eftersom vissa sockerarter kräver mer massa för att generera hela absorbansintervallet kan de faktiska mängder som används för standardkurvan variera.
   5. Ställ in provanalyser genom att tillsätta en volym som innehåller ~5 μg av den derivatiserade polysackariden i tre provrör och föra den totala volymen till 100 μL med vatten. Alternativt, om polysackaridkoncentrationen i provet är okänd, utför en serie 4-faldiga utspädningar. Test 100 μL av varje utspädning i tre exemplar.
   6. Förbered färsk resorcinol vid 6 mg/ml i avjoniserat (dI) vatten omedelbart före användning. Virvel tills resorcinol är i lösning. Tillsätt 100 μL 6 mg/ml resorcinol till varje rör.
   7. Häll försiktigt den uppskattade mängden 75% svavelsyra i en liten bägare.
      OBS: Använd labbrock, nitrilhandskar och skyddsglasögon. Var försiktig med droppar, spill och stänk. Håll våta pappershanddukar till hands för att torka upp eventuella droppar. Eftersom svavelsyran förändras vid förlängd exponering för luft, använd en enhetlig blandning av svavelsyra för hela analysen.
   8. Använd en upprepad pipetor och tillsätt 300 μL 75 % svavelsyra till varje rör. Virvel rören kraftigt för att blanda väl, peka bort röret medan du virvlar. Placera rören i ett värmeblock i jämn takt i sekventiell ordning. När alla rör är i, ställ in timern på 3 min omedelbart.
   9. Vid 3 min, ta bort rören i jämn takt i samma ordning och placera dem direkt i ett rack i ett isvattenbad. Lämna rören tills de är iskalla. Ta bort rören och låt dem balansera till rumstemperatur i ~ 5 min för att förhindra kondens på cuvette under avläsningen.
   10. Ställ in en UV/VIS-spektrofotometer för att avläsa absorbansen vid 430 nm med en 10 mm pathlength cuvette. Tom med ett noll standardrör. Läs absorberandet av alla rör vid 430 nm.
       OBS: Engångsplast cuvettes är praktiska att använda.
   11. Konstruera en standardkurva genom att rita μg kolhydratstandard jämfört med_{A 430}. Se figur 4 för en typisk standardkurva med glukos som referensstandard.
   12. Använd provanalysrören med_{A 430-värden} som faller inom standardkurvans linjära intervall, beräkna μg-mängden av den okända polysackariden i provanalysrören från standardkurvekvationen. Bestäm koncentrationen av den okända polysackariden från volymen av det okända tillsatta, som står för utspädningar. Omvandla koncentrationen till mg/ml- eller μM-repetitionsenheter efter behov.
3. Hydrazidtest med trinitrobensulfonsyra (TNBS)
   1. Bered 0,9% NaCl som innehåller 0, 02% natriumazid (provbuffert) genom att lösa upp 9 g NaCl och 200 mg natriumazid i dI H₂O till en slutlig volym på 1 L.
   2. Bered 0,1 M natriumråt, pH 9 (analysbuffert), genom att blanda 100 ml natriumtråta på 0,5 M, pH 9, med 400 ml dI H₂O. Bekräfta att lösningen pH är 9 ± 0,1; vid behov justera.
   3. Förbered 1% TNBS genom att späda ut 200 μL 5% 2,4,6-trinitrobensulfonsyralösning till 1 ml med dI H₂O. Markera röret som 1% TNBS och förvara vid 4 °C i mörkret i en vecka.
   4. Förbered 50 mM ADH-lager (motsvarande 100 mM hydrazid).
      1. Väg ut 871 mg adipic dihyrazidpulver (ADH) med hjälp av en analytisk balans. Lös upp pulvret i en reagensflaska genom att tillsätta provbuffert till 100 ml med hjälp av en topplastarbalans.
      2. MM hydrazid/50 mM ADH. Lock flaskan tätt och förvara vid 4 °C i 1 år.
   5. Förbered hydrazidstandarder (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 och 0,6 mM hydrazid).
      1. Förbered 6 hydrazidstandarder genom att späda ut 100 mM hydrazidlager med provbuffert med hjälp av en topplastarbalans. Förbered 100 ml av varje standard för att minimera koncentrationsfel. Stäng flaskorna ordentligt och förvara vid 4 °C i 1 år.
   6. Ställa in analysreaktioner
      OBS: TNBS-analysen körs med en reaktionsvolym på 1 ml. Varje analysrör består av 100 μL av ett prov (eller en standard), 875 μL analysbuffert och 25 μL 1% TNBS-lösning. Alla analysreaktioner (för både prover och standarder) är inställda i tre exemplar.
      1. Etikett 3 borosilikatglasrör (12 x 75 mm) för varje standard, inklusive nollstandarden. Sortera och ordna standardrören i rörställ för att öka koncentrationen. Använd en kalibrerad 100 μL eller 200 μL mikropipett för att exakt lägga till 100 μL av standarderna till varje motsvarande rör. För nollstandarden, använd 100 μL provbuffert.
      2. Etikett 3 borosilikatglasrör (12 x 75 mm) för varje utspädt prov som ska analyseras. Sortera och ordna provrören i rörstället i enlighet därmed. Använd en kalibrerad 100 μL eller 200 μL mikropipett för att exakt tillsätta 100 μL av provet till varje motsvarande provrör.
      3. Använd en kalibrerad 1000 μL mikropipett för att exakt lägga till 875 μL analysbuffert till alla analysrör: standarderna och proverna.
   7. För att starta analysreaktionen, använd en kalibrerad 100 μL mikropipett för att exakt lägga till 25 μL 1% TNBS till varje analysrör. Börja från nollstandardrören, flytta till standardrören i ordning efter ökande koncentration, sedan till provrören enligt den förutbestämda ordningen. Byt tips när du startar en ny standard eller ett nytt prov och håll tiden för att lägga till TNBS i alla rör inom 5 minuter.
      1. Virvel alla analysrör i 2 s vid hög hastighet eller vid en hastighetsinställning så att vätskan inuti analysröret kan virvla uppåt för att nå en höjd av 1/2 tum från röröppningen.
      2. Registrera analysens starttid och ställ in timern på 2 timmar. Placera analysrörsstället i mörker vid rumstemperatur i 2 timmar. När tiden är över virkar du alla rör en gång till och fortsätter till datainsamlingen.
   8. Datainsamling
      1. Låt UV/VIS-spektrofotometern värmas upp och baslinjen stabiliseras. Ställ in detektionsvåglängden på 500 nm för hydrazidanalysen. Använd en 1 ml kvarts cuvette på 1 cm väglängd för alla absorbansmätningar för hela analysen.
      2. Starta datainsamlingen genom att överföra en nollstandardanalys till cuvetten. nollställ instrumentet (ställ in absorbansen på noll).
      3. Utför en enda avläsning på varje rör och registrera absorbansvärdena i en datatabell. Ta bort eventuell restvätska från cuvetten innan du läser ett nytt prov. Börja från nollstandarderna, gå över till standarderna för ökad koncentration och sedan till proverna. När du har startat, utför alla steg effektivt utan att stoppa och läsa alla rör inom 10 min.
   9. Analysera exempeldata
      1. Skapa en standardkurva genom att rita mM hydrazidstandard jämfört med A₅₀₀. Hitta standardkurvekvationen i form av y =a x + b, där y representerar mM-hydrazid och x representerar A₅₀₀. Se figur 4 för en typisk standardkurva.
      2. Beräkna mM-hydrazid i proverna med hjälp av standardkurvekvationen och justera för utspädningsfaktorerna. Välj endast provanalysrören med A_500-värden som ligger inom standardkurvans linjära intervall för beräkningen.
      3. Beräkna molarförhållandet mellan hydrazid/polysackarid med hjälp av ekvation (1).
         Hydrazid/polysackarid = h / c × MW (1)
         Där h är mM-hydraziden är c mg/ml-koncentrationen av polysackariden, och MW är polysackaridens molekylvikt i kDa.
      4. Beräkna hydrazidmärkningsdensiteten per 100 kDa polysackarid med hjälp av ekvation (2).
         Märkningstäthet per 100 kDa polysackarid = h / c × 100 (2)
         Där h är mM-hydraziden, och c är mg/ml-koncentrationen av polysackariden.
         OBS: För bekvämlighet kan polysackariderna anses ha en molekylvikt på 100 000 dalton. Detta gör det möjligt att överväga en "märkningstäthet" för att jämföra nivån av derivatisering av olika polysackarider.
      5. Beräkna hydrazidmärkningstätheten som viktprocent ADH.
         1. Bestäm den effektiva mg/ml-koncentrationen av ADH med hjälp av ekvation (3).
            mg/mL ADH = (mM hydrazid / 1000) × 174 (3)
            där 174 är ADH:s MW.
         2. Beräkna vikten % ADH med hjälp av ekvation (4).
            vikt vikt vikt % ADH = (mg/ml ADH) / (mg/ml polysackarid) × 100 (4)

Representative Results

För att illustrera aktivering och derivatization av en polysackarid med hjälp av CDAP kemi aktiverades dextran vid 0,25 och 0,5 mg CDAP/mg dextran. För varje reaktion kyldes en 10 mg/ml dextran lösning i vatten på is och 1/10^th volym av en 2,5 M DMAP bestånd (beredd enligt beskrivningen i avsnitt 3) lades till. Den slutliga lösningen kom till pH 9 genom tillägg av 0,1 M NaOH i 10 μL alikvoter. Lösningen kyldes och rördes om, tillade CDAP, och pH-värde vid pH 9 genom att lägga till 10 μL alikvoter på 0, 1 M NaOH i 15 min. Endast 0,25 ml 0,5 M ADH vid pH 9 tillsattes (mindre än det vanliga beloppet) och reaktionen tilläts fortsätta över natten vid 4 °C.

Den märkta dextran var sedan sekventiellt dialyserad mot 1 M NaCl, 0,15 M NaCl och vatten enligt beskrivningen i avsnitt 6. ADH-dextran analyserades sedan för dextran med hjälp av resorcinol/svavelsyraanalys (avsnitt 7. 2). En typisk standardkurva med glukos som sockerstandard visas i figur 4A. Hydrazidhalten fastställdes med hjälp av TNBS-analysen som beskrivs i avsnitt 7.3. En typisk hydrazidstandardkurva med ADH som standard anges i figur 4B.

Representativa beräkningar från aktiveringen av dextran på de två aktiveringsnivåerna visas i figur 4A,B. Uppgifterna presenteras som både hydrazider per 100 kDa dextranpolymer och som en viktprocent av ADH till dextran, enligt beskrivningen i avsnitten 7.9.3.4 respektive 7.9.3.5 i figur 4C. Graden av derivatization fördubblades ungefär som CDAP förhållandet fördubblades.

Figur 1:Cdaps kemiska struktur. CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborate. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2:Process för aktivering och konjugation av CDAP. Processen är konceptuellt uppdelad i två faser, med den aktiverade polysackariden gemensam för båda. Under grundläggande förhållanden aktiverar CDAP polysackaridhydroxiler och släpper DMAP (reaktion 1). CDAP hydrolys släpper också DMAP (reaktion 3). Även om en cyano-ester visas, kanske detta inte är den faktiska mellanliggande. Mellanstadiet kallas därför (CDAP) "aktiverad" polysackarid. Under den första aktiveringsfasen kan den aktiverade polysackariden hydrolysera (reaktion 4) eller genomgå sidoreaktioner (reaktion 5). I den andra konjugationsfasen (reaktion 2) reagerar den aktiverade polysackariden med en aminer för att bilda en stabil isoureabindning utöver reaktionerna 4 och 5. Förkortningar: CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborate; DMAP = 4-dimethylaminopyridin; R-NH₂ = aminer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Bild 3:AKTIVERING och konjugation av CDAP. Processen kräver balansering av CDAP-reaktivitet med polysackariden, cdap-enhetens stabilitet och aktiverad polysackarid, samt reaktiviteten hos den aktiverade polysackariden med amningens. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 4: Representativa resultat för CDAP-aktivering av dextran. Typiska standardkurvor för(A)resorcinol/svavelsyra och( B) TNBS-analyser. Analysresultaten för dextran aktiverade med 0, 25 och 0, 5 mg CDAP/mg dextran visas. Glukos användes som standard för resorcinol-analysen. Dextran, i mg/ml, delas med 100 kDa för att ge en molarkoncentration. Hydrazidkoncentrationen bestäms med ADH som standard och resultaten uttryckta som μM Hz. (C) Beräkning av hydrazid: dextranförhållanden. Nivån av derivatization beräknades som hydrazider per 100 kDa dextran för att underlätta jämförelsen mellan polymerer med olika genomsnittliga molekylvikter. Viktförhållandet % för g ADH/g dextran beräknades med en MW på 174 g/mol för ADH. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

CDAP är ett bekvämt reagens för att derivatera och konjugera polysackarider. I den här artikeln beskrivs den allmänna metoden för att använda CDAP för att härleda polysackarider med hydrazider (PS-ADH) och innehåller nyligen publicerade förbättringar⁸. För det första betonar tekniken vikten av att upprätthålla mål pH för att styra aktiveringsprocessen. Vi fann att även om många vanliga buffertar stör CDAP-aktiveringsreaktionen, kan DMAP framgångsrikt användas som buffert för att hantera pH⁸. Dessutom är DMAP redan en reaktionsbiprodukt av CDAP-aktivering. Slutligen underlättar buffring av polysackaridlösningen med DMAP innan CDAP tillsätts exakt inriktning och underhåll av reaktions-pH. Som vi beskriver är det användbart att justera pH-et för den koncentrerade DMAP-stamlösningen så att den vid utspädning når det riktade pH-skat. För det andra saktade utförandet av processen i kylan reaktionstiden, vilket gjorde aktiveringsprocessen mindre frenetisk och mer förlåtande. Lägre temperatur minskade frekvensen av CDAP-hydrolys, och den optimala aktiveringstiden vid pH 9 ökar från ~ 3 min till ~ 15 min. Dessutom krävs mindre CDAP för att uppnå samma aktiveringsnivå som vid rumstemperatur.

ADH-derivatiserade polysackarider kan konjugeras till proteiner med hjälp av karbodiimider (t.ex. EDAC)⁷. Till exempel använder flera licensierade Haemophilus influenzae b (Hib) vacciner polyribosylribitolfosfat (PRP) derivatized med ADH för att konjugera till stelkramp toxoid med EDAC. CNBr var ursprungligen anställd, men CDAP är ett mycket lättare reagens att använda för detta ändamål. Enligt vår erfarenhet är ett bra målintervall för ADH-derivatisering 10-30 hydrazider per 100 kDa polysackarid eller ~ 1-3% ADH i vikt.

Samma process kan användas för att härleda polysackarider med primära aminer genom att ersätta ADH för en diamin. Det rekommenderas att använda hexandikamin för att derivatera polysackarider med aminer⁸. Den aminerade polysackariden (PS-NH₂₎kan konjugeras med reagenser utvecklade för proteinkonjugation¹¹. Vanligtvis härleds PS-NH₂ med en maleimid (t.ex. succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) eller N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester (GMBS)), och proteinet är tämjt (t.ex. med succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)). Thiol-maleimid kemi är mycket effektiv.

Proteiner kan också kopplas direkt till CDAP-aktiverade polysackarider via aminer på lysiner. Medan aktiveringsprotokollet som används i allmänhet liknar det som beskrivs här, är det nödvändigt att optimera aktiveringsnivån, polysackarid- och proteinkoncentrationen, liksom proteinet: polysackaridförhållandet^5,6,8.

Dextran är en av de enklaste polysackariderna att aktivera med CDAP på grund av dess relativt höga densitet av hydroxylgrupper, men vissa polysackarider, såsom Vi-antigen, kan vara utmanande. Följaktligen finns det inget enda "bästa" protokoll för CDAP-konjugation direkt till proteiner. Vi föreslår först att utveckla ett protokoll för att uppnå lämpliga nivåer av aktivering, som bestäms av omfattningen av hydrazide derivatization, och sedan fortsätta att rikta protein konjugation till CDAP-aktiverade polysackarid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Sigma	34851
Adipic acid dihydrazide	Sigma	A0638	MW 174
Amicon Ultra 15 10 kDa	Millipore	UFC901008	MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS
Analytical balance
Autotitrator or electronic pipet
Beaker  2-4 L
CDAP	SAFC	RES1458C	Sigma
DMAP	Sigma	107700	MW 122.2
Flake ice
HCl 1 M	VWR	BDH7202-1
Micro stir bar	VWR	76001-878
Microfuge tube (for CDAP)	VWR	87003-294
NaCl	VWR	BDH9286
NaOH 1 M	Sigma	1099130001
NaOH 10 M	Sigma	SX0607N-6
pH meter
pH probe	Cole Parmer	55510-22	6 mm x 110 mm Epoxy single junction
pH temperature probe
Pipets & tips
Saline or PBS
Small beaker 5-20 mL	VWR	10754-696	A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet
Small ice bucket
Small spatula
Stir plate
Resorcinol assay
Combitip	Eppendorf	10 ml
DI water
Dialysis tubing	Repligen	132650T	Spectra/Por 6-8kDa
Dialysis tubing clips	Repligen	142150
Heating block
Nitrile gloves	VWR
Repeat pipettor	Eppendorf	M4
Resorcinol	Sigma	398047
Sugar standard		As appropriate
Sulfuric acid 75%	VWR	BT126355-1L
Timer
TNBS assay
Adipic dihydrazide	Sigma	A0638	MW 174
Borosilcate test tubes 12 x 75	VWR	47729-570
Sodium borate, 0.5 M pH 9	Boston Biologicals	BB-160
TNBS 5% w/v	Sigma	P2297	MW 293.17