Method Article

인간 종양 세포 및 종양-xenografted 마우스에 있는 매크로 피노세포증에 의해 중재된 ATP 내재화를 위한 형광 현미경 검사법

DOI:

10.3791/62768

⸱

June 30th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ohio University, 2Molecular and Cellular Biology Program, Ohio University, 3Neuroscience Program, Ohio University, 4Edison Biotechnology Institute, Ohio University, 5Translational Biomedical Sciences Program, Ohio University, 6Honors Tutorial College, Ohio University, 7Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 높은 세포 분해능을 가진 ATP 대리인 비수성 아데노신 삼위산염(ATP)의 내재화를 시각화하는 재현 가능한 방법을 개발했습니다. 우리는 독립적인 체외 및 생체 내 분석-인간 종양 세포주 및 면역결핍 마우스 를 사용하여 인간 종양 조직과 이식된 우리의 방법을 검증했습니다.

Abstract

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세포외 ATP(eATP)를 포함한 아데노신 트리호스페이트(ATP)는 약물 내성, 상피-중간엽 전이(EMT) 및 전이와 같은 종양 발생의 다양한 양상에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 종양 내 eATP는 정상 조직보다 농도가 103 ~ 104 배 높다. eATP는 EMT 유도를 위한 순수성 신호 전달을 활성화하기 위한 메신저로서 기능하지만, 또한 특정 유형의 내분세포증인 고세포증을 통해 암세포에 의해 내면화되어 다양한 생물학적 기능을 수행한다. 이러한 기능에는 ATP가 요구하는 생화학 반응에 에너지를 제공하고, 신호 변환 중에 인산염 그룹을 기증하고, 전사 보조 인자로서 유전자 발현을 촉진하거나 가속화하는 것이 포함됩니다. ATP는 쉽게 사용할 수 있으며 암 및 기타 분야에서의 연구는 의심 할 여지없이 증가 할 것입니다. 그러나 eATP 연구는 초기 단계에 남아 있으며 eATP와 내부화된 세포내 ATP가 연주하는 중요하고 다재다능한 활동이 완전히 해명되기 전에 해결되지 않은 질문은 여전히 답이 없습니다.

이러한 초기 eATP 연구에 대한 이러한 저자의 실험실의 기여는 비 가수분해성 형광 ATP의 현미경 이미징을 포함하며, 고분자 및 저분자 형광 덱스트랜스와 결합하여 거시피노세포증 및 내세포 증산 억제제뿐만 아니라 다양한 내세포증 억제제역할을 하며, 내부화를 감시하고 특성화합니다. 이러한 이미징 양식은 종양 세포주 및 면역형 마우스에 적용되었으며, 인간 암 종양과 이식된 이노노이식, 체외 및 생체 내eATP 내재화를 연구하였다. 이 백서는 이러한 체외 및 생체 내 프로토콜을 설명하며, 매크로피노시토시스/내세포 매개 eATP 내분비분석 분석이 다른 시스템에서 성공적으로 수행될 수 있도록 분석 조건을 수정및 미세 조정하는 데 중점을 두고 있습니다.

Introduction

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종양 외 세포 (즉) 영양소의 기회적 섭취는 최근 암 대사1의핵심 특징으로 명명되었습니다. 이러한 중요한 영양소 중 하나는 ATP이며, ieATP의 농도는 정상 조직에서 발견되는 것보다 103 및 104 배 더 높으며, 수백 μM에서 낮은 mM2,3,4,5에있다. 주요 에너지 및 신호 분자로서 ATP는 암과 건강한 세포에서 세포 대사에 중심적인 역할을 한다6,7,8. 세포외 ATP는 암세포 성장에 관여할 뿐만 아니라 약물 내성9도촉진한다. 이전에는 수중성 활동과 같은 ATP의 인식되지 않은 기능이 확인되어 알츠하이머10과같은 질병에 ATP가 관여하는 것을 연루시킨다. 실제로, ATP의 우리의 이해와 암세포에 있는 그것의 기능, 건강한 ....

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Protocol

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여기에 보고된 모든 절차는 오하이오 대학의 IACUC 및 NIH에 따라 수행되었습니다.

1. 비가수성 형광 ATP (NHF-ATP) 및 덱스트랜스 의 선택

  1. 형광파장(예를 들어, 적절한 필터가 장착된 이미징 시스템)을 기반으로 한 비소-공주 NHF-ATP(도1A)및 내분비 추적기, 고분자 및 저분자형 형광 덱스트랜스(TMR-HMWFD 및 TMR-LMWFD)(도1B)를선택한다.

2. ATP 현지화 연구, 시험관 내 (그림 2)

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그림 2: ATP 내산화를 검사하는 시험관 내 절차. 형....

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Results

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시험관 내 연구
NHF-ATP의 세포 내산화는 HMWFD 또는 LMWFD(그림4)를가진 NHF-ATP의 공동 국소화에 의해 입증되었다. 이 절차의 성공은 주로 NHF-ATP 및 덱스트랜스의 적절한 농도의 사용과 덱스트랜스(폴리 리신 대 중립)의 적절한 유형(들)을 결정하는 데 의존합니다. 예를 들어, 매크로피노시토시스를 조사하기 위해 HMWFD는 매크로피노솜(13,14,15,16)에의해서만 내면화됨에 따라 선택되었다. 대안적으로, 클래트린 및/또는 카폴라 매개 내분비토가 연구되는 경우, LMWFD는 이러한 내세포증 관련 내분모의 작은 크기만 LMWFD

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Discussion

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비수성 ATP의 세포 내산화의 공간적, 시간적 및 정량적 분석을 위해 개발되었다. 이 방법은 기술 교육 및 대표 데이터를 제공하는 다양한 종양 유발 모델을 포함한 다양한 생물학적 시스템에서 사용하기 에 광범위하게 적용됩니다. 생체 내 ATP 내재화 연구(프로토콜의 섹션 4)에서 해석 가능한 데이터를 획득하려면 종양 내 주사에서 극저온-포함으로 경과된 실험 시간을 제한하는 것이 중요합니다. 조직 슬라이드 후 종양 절개 고정 -형광 현미경 이미징 전에 필요한 단계입니다. 함께, 이 2개의 중요한 단계는 종양 세포가 화상 진찰 과정 도중 내재된 ATP를 유지한다는 것을 확인합니다. ATP 내재화 분석 중 또 다른 중요한 고려 사항은 이종 이식 종양의 이질성을 설명하는 것입니다. 종양 발생이 암세포 유형 중 다르게 진행됨에 따라, 다른 암세포에 대한 이상적인 실험 조건을 결정하기 위해이 방법의 측면을 해결하는 것이 필요할 수 있습니다. 종양에서 ATP의 대식세포증에 대한 포괄적인 평가를 보장하기 위해서는 상주 세포 와 .......

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Disclosures

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저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

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저온절균은 오하이오 대학 조직 병리학 코어에서 현장에서 수행되었습니다. 이 작품은 C 닐슨에 창업 기금 (오하이오 대학 예술 과학 대학)에 의해 부분적으로 지원되었다; NIH는 R15 CA242177-01 및 RSAC 상을 X Chen에 부여합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A549 세포, 인간 폐 상피, 암종국립 암 연구소n/a저렴한 출처
아세톤피셔 사이언티픽S25904
알루미늄 호일, 레이놀즈그레인저6CHG6
수성 장착 매체, ProLong Gold 퇴색 방지 시약ThermoFisherP36930
ATP 아날로그Jena BiosciencesNK-101
오토클레이브, 살균기Grainger33ZZ40
블레이드, 저온 유지 장치, 하이 프로파일CL Sturkey, Inc.
캘리퍼스, 버니어그레인저4KU77
세포 배지, Ham's Nutrient Mixture F12, 무혈청Millipore Sigma51651C-1000ML
원심분리기, 스윙 버킷 로터Eppendorf5810R
ChloroformAcros Organics423555000
Conical tube, 15 mLVWR21008-216
원뿔형 튜브, 50 mLVWR21008-242
커버슬립, 유리, 12 mmCorning2975-245
Cryostat, Leica CM1950Leica BiosystemsCM1950
섬세한 작업 와이프, Kim WipesKimberly-Clark34155
Dextran, 라이신 고정성, 고분자량(HMW)InvitrogenD1818MW = 70,000, Tetramethylrhodamine
Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW)InvitrogenD1819
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 무혈청Fisher Scientific11885076
Dry ice현지 배송맞춤 주문
Epifluorescent imaging system, Nikon NiU 및 Nikon NIS Elements 수집 소프트웨어Nikon맞춤 주문
에탄올피셔 사이언티픽BP2818-4
태아 소 혈청 (FBS)ThermoFisher16000044
집게, Dumont #7, 곡선Fine Science Tools11274-20
집게, Dumont #5, 직선Fine Science Tools11254-20
장갑 (소형, 중형, 대형)MicroflexN191, N192, N193
장갑, MAPA Temp-Ice 700 보온(드라이아이스 처리용)Fisher Scientific19-046-563
혈구계DaiggerEF16034F EA
인큐베이터, 세포 배양EppendorfGalaxy 170 S
라벨링 테이프Fisher Scientific159015R
마킹 펜, Sharpie(초미세)스테이플
Mice, immunodeficient (Nu/J)Jackson Laboratory2019
Microcentrifuge, accuSpin Micro17Fisher Scientific13-100-675
Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL)AxygenMCT-150-C
microscope slide boxFisher Scientific50-751-4983
Needle, 27 gaugeBecton-Dickinson752 0071
페인트 브러시Grainger39AL12
종이 타월스테이플33550
파라포름알데히드아크로스 유기물416785000
페니실린/스트렙토마이신Gibco15140122
천공 스푼, 직경 15mm, 길이 135mmRoboz Surgical Instrument Co.RS-6162
인산염 완충 식염수 (PBS)Fisher ScientificBP3991
피펫 팁 (10 μ L)Fisher Scientific02-707-438
피펫 팁 (200 μ L)Fisher Scientific02-707-411
피펫 팁 (1000 μ L)Fisher Scientific02-707-403
피펫, 혈청학적(10mL)VWR89130-910
피펫터, Gilson P2DaiggerEF9930A
피펫터 스타터 키트, Gilson(2-10 μ L, 20-200 μ L, 200-1000 &뮤; L)DaiggerEF9931A
Platform shaker - 오비탈, 벤치탑Cole-ParmerEW-51710-23
양전하 현미경 슬라이드, SuperfrostFisher Scientific12-550-15
메스, 크기 10, Surgical Design, Inc.Fisher Scientific22-079-707
가위, 외과용 - 날카롭고 구부러진Fine Science Tools14005-12
이미지 분석용 소프트웨어, Nikon ElementsNikon맞춤 주문
소프트웨어, ImageJ (FIJI)National Institutes of Healthn/a온라인 다운로드(무료)
검체 디스크 30mm(척 홀더), 저온 유지 장치 액세서리Leica Biosystems14047740044
염색 트레이, 245 mm BioAssay DishCorning431111
Syringe, 1 ccBecton-Dickinson309623
Tape, 실험실, 19 mm 너비Fisher Scientific15-901-5R
타이머Fisher Scientific14-649-17
조직 배양 접시, 직경 100 x 15 mmFisher Scientific08-757-100D
조직 배양 플라스크, 225 cm2ThermoFisher159933
조직 배양 플레이트, 24-웰Becton-Dickinson353226
조직 매립 금형, 스테인리스강Tissue Tek4161
조직 동결 매체, 최적 절단 온도(OCT)Fisher Scientific4585
트립신-EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산), 0.25%Gibco25200072
수조, 정밀 GP2S ThermoFisherTSGP2S
DT554550형 642736 이미지 분석용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. ....

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