Summary
该协议提出了一种在结构上保存的染色质 中原位 复制位点的高分辨率映射技术,该技术采用预包埋EdU-链霉亲和素 - 纳米金标记和ChromEMT的组合。
Abstract
细胞核中DNA折叠的原理及其在基本遗传功能(转录,复制,分离等)实现过程中发生的动态转化仍然知之甚少,部分原因是缺乏实验方法来高分辨率地可视化结构上保存的细胞核中的特定染色质位点。在这里,我们提出了一种方案,用于 原位单层细胞培养中复制结构域的可视化,通过将新合成DNA的EdU标记与随后的标记检测与纳米金颗粒的Ag扩增和染色质的ChromEM染色相结合。该协议允许高对比度,高效率的预包埋标记,与传统的戊二醛固定兼容,为室温样品处理提供染色质的最佳结构保存。预嵌入标记的另一个优点是可以预先选择感兴趣的单元格进行切片。这对于分析异质细胞群,以及与电子断层扫描方法的兼容性,以高分辨率3D分析复制位点的染色质组织,以及分析复制后染色质重排和相间姐妹染色单体分离尤为重要。
Introduction
DNA复制是在细胞分裂过程中忠实复制和传递遗传信息所需的基本生物学过程。在高等真核生物中,DNA复制受到严格的时空调节,这表现为复制起源1的顺序激活。同步触发的相邻复制源形成 replicon2 的簇。在光学显微镜水平上,正在进行的DNA复制的位点被检测为各种数量和大小的复制焦点。复制病灶显示细胞核内空间分布的特定模式,这取决于标记的DNA3,4的复制时间,这反过来又与其基因活性密切相关。由于明确定义的DNA复制序列,在空间和时间上严格排序,复制标记是一种强大的精确DNA标记方法,不仅用于研究复制过程本身,还用于区分具有定义的转录活性和压实水平的特定DNA亚级分。复制染色质的可视化通常通过检测DNA复制机制的主要蛋白质成分(通过免疫染色或通过荧光蛋白标签5,6的表达)或通过掺入修饰的DNA合成前体7,8,9,10进行.其中,只有基于将修饰的核苷酸掺入新复制的DNA中的方法才能在复制过程中捕获染色质的构象变化,并在复制完成后跟踪复制结构域的行为。
在高等真核生物中,DNA包装成染色质为基本遗传功能(转录,复制,修复等)的调节增加了另一个层次的复杂性。染色质折叠影响DNA对调节反式因子的可及性和模板合成所需的DNA构象变化(双螺旋放卷)。因此,人们普遍认为,细胞核中DNA依赖性的合成过程需要染色质的结构转变,从其浓缩的抑制状态到更容易获得的开放构象。在细胞学上,这两种染色质状态被定义为异染色质和真染色质。然而,关于细胞核中DNA折叠的模式仍然没有达成共识。假设的范围从“聚合物熔体”模型11,其中核小体纤维表现为随机聚合物,其堆积密度由相分离机制控制,到分层折叠模型假设连续形成厚度增加12,13的染色质纤维样结构。分层折叠模型最近获得了基于 原位 DNA-DNA接触分析的分子方法的支持(染色体构象捕获,3C),证明了染色质结构域层次结构的存在14。重要的是要注意,复制单元与这些染色质结构域15的相关性非常好。对这些模型的主要批评是基于样品制备程序引起的潜在的人工染色质聚集,例如细胞膜的透化和非染色质成分的去除,以改善超微结构研究的染色质对比度,同时提高染色质对各种探针(例如抗体)的可及性。最近通过DNA结合荧光团介导的二氨基联苯胺光氧化(ChromEMT6)进行选择性DNA染色电子显微镜检查的技术进展已经消除了这一障碍。然而,同样的考虑也适用于复制DNA17,18的电子显微镜可视化。在这里,我们描述了一种技术,该技术允许在完整的醛交联细胞中同时对新合成的DNA和总染色质进行高分辨率超微结构图谱。该技术通过点击化学检测EdU标记的DNA与生物素化探针和链霉亲和素纳米金以及ChromEMT相结合。
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Protocol
该方案针对贴壁细胞进行了优化,并在HeLa,HT1080和CHO细胞系上进行了测试。
1. 细胞标记和固定
- 在3厘米培养皿中酸性清洁的盖玻片上板细胞。将推荐用于细胞系的培养基中的细胞生长至70%汇合度。
- 从10mM储备液中加入EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)至10μM终浓度,并将细胞置于培养箱中10分钟或更长时间(取决于实验目的)。对于较短的脉冲(长达2分钟),用预热的新鲜培养基制备培养皿,并补充10μM EdU,并在其中转移盖玻片,而不是直接向细胞中添加EdU。
注意:如果没有其他说明,则所有后续步骤均在室温下进行。 - 用2.5%戊二醛固定标记的细胞,通过将25%储备稀释在100mM二甲苯磺酸盐缓冲液中新鲜制成,持续1小时。
注意:随后的EdU检测步骤对注视时机敏感。较长的固定时间可能会对EdU标记产生不利影响,从而导致较低的信噪比。 - 通过用补充5mM MgCl2 (此后的PBS*)洗涤样品来去除戊二醛。每次洗涤3次,孵育10分钟。
- 用PBS*中的1%Triton X-100渗透质膜(此后为PBS * T)。每次洗涤洗涤两次,孵育5分钟。
- 用PBS*广泛洗涤样品。进行五次更换,并在每次更换中孵育5分钟。
- 用PBS*中的20mM甘氨酸淬灭无残留醛基,每次两次,每次10分钟。
- 在PBS*中阻断1%BSA中的样品30分钟。
2. 点击反应
注意:此过程是从以前发布的协议19 修改而来的。
- 使用前立即准备用于EdU检测的点击反应混合物:在微量离心管中,混合430μL100mM Tris-HCl(pH = 8.5),20μL100mM CuSO4,1.2μL生物素叠氮化物(DMSO中10mM)和50μL0.5M抗坏血酸。为了在荧光显微镜水平上对复制标记和点击程序进行质量控制,生物素叠氮化物可以被AlexaFluor 488-叠氮化物取代。
注:上述反应中组分的添加顺序很重要。 - 在潮湿的腔室中进行点击反应,以最大限度地减少反应混合物中的蒸发和浓度变化。通过在培养皿的底部放置一张湿的滤纸并用石蜡膜覆盖它来准备潮湿的腔室。将盖玻片放在薄膜表面上,使细胞朝上,并将50-100μL反应混合物层到盖玻片上。在室温下反应需要30分钟。
- 通过在PBS*(PBS* T)中洗涤0.1%Triton X-100样品来停止反应,每次5次,每次5分钟。
- 在室温下在PBS * T中阻断1%BSA 30分钟。
- 用含有1%BSA的PBS * T制备链霉亲和素 - 纳米金溶液。将样品与链霉亲和素一起孵育,与1.4nm纳米金颗粒(纳米探针)在1%BSA + PBS * T中结合,在新制备的潮湿室中在+ 4°C下过夜。
- 停止反应并在PBS * T中洗涤样品,每次5次,每次10分钟。
- 通过在PBS*中的1%戊二醛中后固定30分钟来稳定生物素链霉亲和素复合物。
- 用去离子水强力洗涤除去戊二醛,并在PBS*中洗涤样品,每次5次,每次20分钟。
- 用新鲜制备的1mg / mL NaBH4 在水中淬灭游离醛基,每次两次,每次10分钟。在孵育过程中,形成H2 的气泡,可以提升盖玻片。用镊子小心地把它们推下来。
- 用去离子水洗涤五次,每次5分钟。
注意:为了在标记步骤进行质量控制,建议使用荧光标记的链霉亲和素进行对照标记(图2)。这将在切换到繁琐且容易出现伪影的后续步骤之前提供标记强度和背景水平的估计。
3. 银扩增
注:此过程是从Gilerovitch等人,1995年修改的(见 20,21)。
- 将50克金合欢粉重悬于100毫升去离子水中。溶解3天,脱气,过滤四层干酪布。将冷冻的5 mL等分试样储存在50 mL管中。使用前立即解冻。
- 在5 mL解冻的阿拉伯胶粉溶液中加入2 mL 1 M MES(pH = 6.1)的等分试样,在阿拉伯胶粉溶液中制成7 mL 0.28 M MES(pH = 6.1)。通过缓慢摇动管子30分钟混合。用铝箔包裹管子以防止光线照射。
- 与步骤3.2.同时,用洗涤缓冲液(50mM MES,pH = 5.8,200mM蔗糖)洗涤盖玻片,每次3次,每次10分钟。
- 准备没食子酸N-丙酯(NPG)的新鲜溶液。在15mL管中,将10mg NPG溶解在250μL96%乙醇中,并用去离子水调节至5mL。
- 将36毫克乳酸银放入铝箔包裹的15毫升管中。
- 在步骤 3.2 之后。完成后,向阿拉伯胶粉混合物中加入1.5毫升NPG溶液,再摇匀3分钟。
注意:所有后续步骤都在暗室中执行。使用非光化安全灯(黄色或红色)。 - 用洗涤缓冲液平衡样品并进入暗室。同时,向乳酸银中加入5mL去离子水,剧烈摇动溶解1-2分钟。
- 向阿拉伯胶粉混合物中加入1.5mL乳酸银溶液,缓慢摇晃1分钟。避免气泡形成,因为混合物中的氧气会减慢反应速度。
- 用盖玻片从培养皿中沥干溶液,并将3mL乳酸银 - 阿拉伯胶粉混合物倒在细胞上。摇动培养皿几次,孵育2-5分钟。孵育时间取决于阿拉伯胶粉批次和温度。这应该通过实验来定义。
注意:较长的孵育时间可能导致不特定的银结合。 - 为了停止反应,沥干反应混合物并用三到五次去离子水广泛洗涤培养皿,然后再进行三次更换,每次5分钟。
- 在明场显微镜下检查染色。良好的染色应该是浅棕色到深棕色,背景非常淡黄色。
注意:如果染色没有发展,则可以立即重复已经制成的混合物(如果保持在黑暗中,混合物活性约15分钟)。但是,在这种情况下,染色可能会发展得太快。
4. 黄金色调
注意:为了保护银纳米颗粒在随后的程序中不被OsO4 氧化溶解,在此步骤中使用金浸渍(Sawada,Esaki,1994)22。
- 用去离子水冲洗盖玻片。
- 为了保护银纳米颗粒不被OsO4 氧化溶解,将样品在0.05%四氯金酸中在黑暗中孵育2分钟。
- 用去离子水彻底清洗10分钟。
注意:在此阶段,向含有DNA的材料添加额外的对比度。样品的颜色应从棕色变为黑色。
5. 铬
注意:该协议是从Ou等人,201716修改而来的。
- 将盖玻片孵育并在PBS中的10μM DRAQ5中使样品饱和10分钟。
- 在50mM Tris或PBS中制备0.2%二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)溶液:
通过在黑暗中剧烈搅拌将DAB溶解在最终体积的90%中,然后用NaOH调节pH至7.0-7.4。将体积调节至100%,并通过0.22μM过滤器过滤,用箔包装储存。 - 将DAB溶液加入细胞(每3厘米培养皿2mL)并孵育1分钟。
- 将盖玻片移动到玻璃底培养皿中,并将其放置在倒置显微镜的舞台上。在倒置显微镜上用金属卤化物光源和Cy5滤光片组(640nm,焦平面1 W / cm 2)通过Plan Apo λ 40х(NA = 0.95)透镜照射样品(几个视场)10分钟。
注意:DAB光转换成功的一个迹象是完全的DRAQ5光漂白和辐照核中暗DAB沉淀形成。然而,后者在强烈的EdU银金信号上并不总是很明显(特别是当使用扩展的EdU脉冲时)。 - 用去离子水洗涤三次,每次5分钟。
6. 脱水和环氧树脂包埋
- 在微量离心管中,将2%的K4Fe(CN)6水溶液与等量的2%OsO 4水溶液混合,制备部分还原的四氧化锇溶液,得到两种组分的1%终浓度。将盖玻片在还原的OsO4 中孵育1小时,并在去离子水中洗涤三次,每次5分钟。
注意:在这个阶段,还原的锇化合物与DAB沉积反应并增加DNA的对比度。
注意:锇是有毒的,在通风橱下工作,并根据当地安全法规处理废物。 - 样品在一系列分级乙醇溶液中以递增的百分比脱水:50%EtOH - 3 x 10分钟;70% 乙醚醇 - 3 x 10 分钟,80% 乙氧溶氧钠 - 3 x 10 分钟,96% 乙氧乙醚 - 3 x 10 分钟,100% 乙氧乙烷 - 3 x 10 分钟。
- 对于浸润和包埋,请使用具有以下组分体积比的树脂配方:环氧树脂单体:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23(w/w)。该配方可与乙醇混溶。
- 将盖玻片在乙醇树脂混合物(3份100%EtOH:1部分环氧树脂)中孵育30分钟。
- 将盖玻片在乙醇树脂混合物(1部分100%EtOH:1部分环氧树脂)中孵育2小时。
- 将盖玻片在乙醇树脂混合物(1份100%EtOH:3份环氧树脂)中孵育过夜。
- 用新鲜制备的纯树脂代替乙醇 - 树脂混合物。在纯树脂混合物中孵育8小时。打开培养皿,让残余的乙醇蒸发。
- 将盖玻片转移到具有纯树脂的新培养皿中,并在37-42°C下孵育2小时。
- 用新鲜制备的树脂填充硅模具。将盖玻片与细胞朝下放在填充有环氧树脂的适当硅模具上。树脂在37°C下固化24小时,然后在60°C下固化至少2天。
注意:环氧树脂混合物的组分是潜在的致癌物质。戴上手套,在通风橱下工作。
- 从模具中取出树脂板,用手术刀或剃须刀片清洁盖玻片表面。要去除盖玻片,请将盖玻片放入液氮中,然后将板放入沸水中。如有必要,可重复上述步骤。
- 找到立体显微镜下的照射区域,并用钢锯或任何其他合适的仪器将其从平板上切出。如果需要,在热板上以70°C预热板坯。
- 将切口固定到超微量样品架中,以进行最终的块修剪。使用剃须刀,准备金字塔形样品。将带有金字塔的支架安装到超显微镜上并安装刀。
- 修剪块,以便包括带有EdU标签的辐照电池。准备适合电子断层扫描的半薄切片(250nm厚度)。
注:截面厚度可根据实验要求进行调整。
- 修剪块,以便包括带有EdU标签的辐照电池。准备适合电子断层扫描的半薄切片(250nm厚度)。
- 从刀刃上取下部分,并将其放在单槽网格上。对于电子层析成像,将250 nm切片挑到1 mm单槽网格上,干燥后可以从两侧对这些切片进行碳涂层。无需额外的对比。
注意:由于切片已经包含高对比度的Au-Ag颗粒,因此无需在切片表面添加基准金颗粒。 - 在低放大倍率(约600x)下检查透射电子显微镜中的网格,以找到具有适当复制模式的细胞。
注意:该协议产生的标记密度足够高,即使在低放大倍率下也可以轻松检测复制病灶。建议首先创建该部分的地图,以便随后导航,并收集角度投影以进行断层扫描。切换到更高的放大倍率并拍摄高分辨率图像。
7. 电子断层扫描
- 将网格插入具有高倾斜支架的透射电子显微镜中。将样品装入电子显微镜并定位感兴趣的区域。
- 在近并行照明模式下,在EFTEM模式下对准显微镜。将能量滤波器调谐为20 eV能量选择狭缝,置于零损耗峰值。
- 以40 e / Å2 / s的剂量速率预照射断层扫描采集区域至少1.5-2分钟,这相当于至少3000 e / Å2的总剂量。
- 在SerialEM中使用自动任务调整偏心高度。检查自动对焦任务,确保其在零倾斜角度和 -0.8 mkm 目标散焦值下正常工作。
- 通过上行任务将样品架倾斜至-60°。
- 设置从-60到+60°的断层扫描采集,步长为2.0°。曝光应根据倾斜角度进行设置,以保持相机上的平均强度。限制图像偏移,以防它引起能量偏移,从而导致狭缝不对中。断层扫描数据应保存为 .mrc 文件。
- 将 .mrc 文件导入 IMOD 软件以进行层析成像重建。删除由于 X 射线导致的异常值像素值。
- 对齐倾斜系列。执行初始互相关,然后手动将 10-12 个金颗粒标记为基准点。跟踪基准模型,并检查是否通过倾斜系列正确跟踪每个基准。创建样品断层扫描(切片)并手动标记薄截面边框,以防止体积内重建的密度可能倾斜。精细对准的平均残余误差小于1.2像素。
- 使用过滤的反向投影算法重建断层扫描,然后修剪输出以将感兴趣区域拟合到最终体积中。
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Representative Results
哺乳动物细胞核中的复制病灶根据S期进展在细胞核内显示出不同的分布模式。这些模式与被复制的位点的转录活性相关。由于这里介绍的方法使用相当强的固定程序,因此使用复制脉冲标记来特异性检测各种转录状态下的染色质位点是相当简单的,即使在提供通过室温化学固定获得的染色质的最佳结构保存的条件下也是如此。
质量控制步骤旨在确保成功完成该协议中的关键程序。最初,成功的EdU标记应通过使用荧光标记的叠氮化物的Click-reaction来确认,如果使用异质细胞群,则证明典型的复制模式(图2)。第二个重要步骤是链霉亲和素标记,它可能受到戊二醛固定的强烈影响。为了评估链霉亲和素结合效率,在与链霉亲和素纳米金相同的条件下使用AlexaFluor-488-共轭链霉亲和素(图3)。在这一点上,预计一些背景主要是由于戊二醛自发荧光以及链霉亲和素冲洗不完全。如果信噪比不可接受,请尝试在步骤2.6处增加洗涤步骤的数量和持续时间。或者,在步骤1.5之后加入戊二醛用NaBH4 (步骤2.9-2.10)淬火。
银增强过程通常会产生不一致的结果,需要优化。首先,反应速度根据金合欢粉溶液批次而有很大差异。溶液的粘度与银染色形成的时间成反比。最好是拥有同一批次的几种等分试样,并在对照样品上进行测试,以确定最佳反应时间。由于试剂的温度和环境对反应速度也有显著的影响,因此尽量在完全相同的温度下进行反应。如果同时处理三个以上的样品,则以30秒的间隔开始反应以有足够的时间进行洗涤步骤是很方便的。
银增强手术的一个很好的结果是一些(不是全部)细胞核的深棕色染色,具有非常微弱的淡黄色细胞质染色(图4)。这意味着银颗粒的平均尺寸约为20nm,这适用于在染色质复染的透射电镜的宽放大倍率范围内轻松检测标记。对于层析成像实验,应通过缩短反应时间将颗粒的尺寸减小到约10nm。在这种情况下,颜色应为浅棕色或红色。在调金之前,应检查银染的颜色。
DAB光转换和渗透是在金色调后进行的,以保护银壳不溶解。在金浸渍不足的情况下,银纳米颗粒被侵蚀并获得不规则的形状,但在TEM下仍然可见。DAB光转换的质量首先通过DRAQ5漂白(在荧光模式下)进行监测,然后在明场模式下,当辐照场中的细胞核变成深棕色时(图5)。DAB染色强度不应很高,以便Ag-Au染色保持良好检测,以允许选择具有切片所需复制时间的细胞。
超薄或半薄切片不需要额外的染色,可以直接在TEM下查看。适当的标记通常导致明确定义的Ag纳米颗粒簇划定复制位点(图6),而背景标记仅限于每平方微米的几个纳米颗粒。半薄切片已准备好进行断层扫描,并且不需要在切片表面添加金纳米颗粒,因为切片中存在的Ag纳米颗粒可用作基准标记(图7)。在该图中,显示了标记时间延长的效果:单个复制焦点融合成纤维样结构,描绘出高阶染色质结构域。
图 1.方法概述。 在盖玻片上生长的细胞用EdU标记,用2.5%戊二醛固定,透化,并用生物素化叠氮化物进行点击反应。或者,荧光标记的叠氮化物用于光学显微镜观察。用Nanogold-链霉亲和素(或荧光标记的链霉亲和素作为对照)标记生物素的位点,增强银,并在金色调后进行DRAQ5介导的DAB光转换和渗透。将样品嵌入环氧树脂中,切片,在TEM中检查,并进行电子断层扫描。 请点击此处查看此图的大图。
图 2.通过EdU标记和点击反应(绿色)揭示的哺乳动物细胞中的复制模式。 S期从早期到晚期S期(从左到右)的进展表现为复制模式的有序变化:A,B - 早期S期,C - S期中期,D,E - 晚期S期。DNA用DAPI(红色)染色。比例尺 = 10 um。 请点击此处查看此图的大图。
图 3.通过EdU标记和两步点击生物素和链霉亲和素 - AlexaFluor 488染色在戊二醛固定后揭示的哺乳动物细胞中的复制模式。 用链霉亲和素-AlexaFluor 488标记的对照样品在戊二醛固定后显示出最佳的标记效率和信噪比。 请点击此处查看此图的大图。
图 4.银增强程序后细胞的代表性图像(步骤3)。 在明场光显微镜模式下,各种复制模式(早期S相,箭头;中S相,箭头;晚期,双箭头)很容易看到。 请点击此处查看此图的大图。
图 5.DRAQ5介导的DAB光转换的典型结果。 (A) DRAQ5 染色(虚线圆圈表示照射区域)。注意圆圈内强烈的DRAQ5漂白。(B)在明场光显微镜中看到的相同区域。注意辐照区域细胞核中DAB降水较强。插图:箭头表示早期的S期细胞核,其中用Ag-Au标记的复制模式仍然很容易在DRAQ5光氧化DAB染色的背景下检测到。 请点击此处查看此图的大图。
图 6.通过EdU标记和戊二醛固定后两步点击生物素和链霉亲和素 - 纳米金染色揭示哺乳动物细胞核中的复制病灶。 S相细胞的薄90nm切片在复制焦点(A,红色圆圈)处显示Ag-Au纳米颗粒簇。背景水平可以在非S相电池(B)中欣赏。箭头表示各种规模的染色质纤维。 请点击此处查看此图的大图。
图 7.250 nm 截面的 0°倾斜投影。 (一)和虚拟断层扫描部分。(B)用EdU标记的细胞核2小时。参见融合成纤维样结构(箭头)的单个复制病灶。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
与以前发布的协议相比,此处描述的方法具有几个优点。首先,使用点击化学标记复制的DNA消除了用抗体检测BrdU的DNA变性先决条件的必要性,从而更好地保留了染色质超微结构。
其次,利用生物素作为戊二醛固定和未结合醛基团适当淬火后产生的二级配体,最大限度地减少了靶标的化学修饰,从而提高了标记效率,同时减少了内源性生物素引起的背景。生物素 - 链霉亲和素还增加了多功能性,因为使用荧光标记的链霉亲和素在手术的早期阶段提供了简单的质量控制。通过引入氟纳诺戈尔德标记的链霉亲和素可以进一步简化该方案,然而,在我们手中,这些试剂与Nanogold-链霉亲和素相比具有更高的背景,可能是由于探针尺寸更大。
第三,小探针的组合,链霉亲和素 - 纳米金是约5nm的最大成分,甚至可以很好地渗透到戊二醛交联的细胞中。这使得该技术适用于最佳超构造保存细胞的预包埋标记,并且易于与各种3D电子显微镜技术兼容,包括连续切片重建,阵列断层扫描,电子断层扫描,串行块面成像和FIB-SEM。
银增强是最关键的步骤,需要精确控制试剂扩散和洗涤步骤,这更容易用于贴壁细胞。另一方面,由于与戊二醛的强交联也会影响银的增强,因此应微调固定条件,以平衡染色质结构保存和银增强效率。因此,冷冻固定/冷冻替代技术,需要延长和控制不佳的固定后,尽管允许更好的结构保存,可能与所提出的标记策略23不完全兼容。该技术可以通过使用Au-amp化代替银增强24来进一步改进。这种修改可以跳过金色调色步骤,但是,在我们手中,它提供了相当高的背景。
最后,预包埋标记允许预先选择用于ChromEM的靶细胞,并根据明场或荧光显微镜下可检测到的复制模式进行切片。此外,该方法可以很容易地扩展到CLEM,包括各种超分辨率技术。这为研究染色质高阶结构和各种生理状态下的动力学开辟了新的视野。我们在这里描述的方法可用于研究复制位点的染色质组织,分析染色质的复制后重排,包括相间染色单体分离的高分辨率成像,以及大染色体结构域的复制标记和基因组特定部分(真染色质或异染色质,基于复制时间标记)的高阶染色质折叠研究。这些类型的成像技术作为替代方法生成的数据的参考点也很重要。
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Disclosures
作者无事可披露
Acknowledgments
这项工作得到了RSF(拨款#17-15-01290)和RFBR(拨款#19-015-00273)的部分支持。作者感谢莫斯科罗蒙诺索夫国立大学发展计划(PNR 5.13)和别洛泽尔斯基物理化学生物学研究所的尼康相关成像卓越中心对成像仪器的使用。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent | |||
5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
Instruments | |||
Carbon Coater | Hitachi | ||
Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
High-tilt sample holder | Jeol | ||
Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
Tweezers | Ted Pella | 523 | |
Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
Software | |||
Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
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