Summary
Внеклеточные везикулы (EV) способствуют клеточной биологии и межклеточной связи. Существует необходимость в практических анализах для визуализации и количественной оценки поглощения EV клетками. Текущий протокол предлагает анализ поглощения EV с использованием трехмерной флуоресцентной визуализации с помощью конфокальной микроскопии после изоляции EV микрофлюидным устройством на основе нанофильтрации.
Abstract
Существует необходимость в практических анализах для визуализации и количественной оценки поглощения внеклеточных везикул (EV) клетками. Поглощение электромобилей играет роль в межклеточной коммуникации в различных областях исследований; биология рака, неврология и доставка лекарств. В литературе сообщалось о многих анализах поглощения электромобилей; однако отсутствует практическая, подробная экспериментальная методология. Поглощение ЭЛЕКТРОМОБИЛей может быть оценено путем флуоресцентной маркировки электромобилей для определения их местоположения в клетках. Различение интернализованных EV в клетках и поверхностных EV на клетках трудно, но важно точно определить поглощение EV. Поэтому в этой работе предлагается анализ, который эффективно количественно определяет поглощение электромобилей с помощью трехмерной (3D) флуоресцентной конфокальной микроскопии. Флуоресцентно меченые электромобили были подготовлены с использованием микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации, визуализированного с помощью 3D-конфокальной микроскопии, а затем проанализированного с помощью передового программного обеспечения для обработки изображений. Протокол обеспечивает надежную методологию анализа электромобилей на клеточном уровне и практический подход для эффективного анализа.
Introduction
Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой наноразмерные, связанные с липидной мембраной частицы, которые классифицируются по их размерам: эктосомы (100-500 нм) и экзосомы (50-150 нм)1. ЭЛЕКТРОМОБИЛИ содержат различные биомолекулы, такие как белки, нуклеиновые кислоты и липиды. Эти биомолекулы происходят из клеток, прежде чем быть инкапсулированными в качестве груза и выпущены во внеклеточное пространство через EV1,2,3.
Из-за разнообразия их груза электромобили, как полагают, играют активную роль в межклеточной связи. Высвобождение и поглощение ЭВ клетками позволяет передавать биомолекулы между клетками4,5. Введение EV-груза в клетку может изменить функции клетки-реципиента и гомеостатическое состояние4,5,6. Электромобили интернализуются несколькими путями; однако точные механизмы не были точно продемонстрированы.
Большинство анализов поглощения электромобилей, таких как генетическая маркировка, флуоресцентно маркируют отдельные EV7. Результирующий сигнал может быть измерен с помощью микропластинчатого фотометра, проточной цитометрии или микроскопии, причем каждая технология имеет существенные ограничения. Микропластинчатые фотометры, проточная цитометрия или стандартная двумерная (2D) микроскопия не могут различать интернализованные и поверхностно прикрепленные EV8,9. Кроме того, необходимая пробоподготовка для каждого из этих методов может внести дополнительные проблемы в оценку поглощения EV. Например, подъем прилипших клеток трипсином перед анализом поглощения EV может расщеплять некоторые поверхностно прикрепленные EV на поверхности клетки10,11. Трипсин может также взаимодействовать с поверхностью клетки, влияя на клетку и фенотип EV. Кроме того, трипсин может не отделять поверхностные EV полностью, искажая изолированные популяции.
Чтобы точно маркировать электромобили флуоресцентными красителями, для удаления остаточного красителя7 требуются дополнительные этапы промывки. Принятые методы изоляции также могут способствовать ложноположительным сигналам из-за коагуляции, которая происходит во время изоляции EV. Например, последовательное ультрацентрифугирование (UC) широко используется для изоляции электромобилей и удаления обездвиженного красителя. Однако UC может со-осаждение EV, а остаточный краситель может привести к ложноположительному сигналу12,13. Другие методы нанофильтрации, такие как колонная фильтрация, также широко используются для удаления неиммобилизованных красителей. Сложный характер взаимодействия EV и красителя в матрице колонны может привести к неполному удалению остаточного красителя из-за изменения молекулярной отсечки колонны комплексным входом14,15,16.
Текущий протокол предлагает микрофлюидное устройство на основе нанофильтрации для выделения и промывки флуоресцентно меченых изолированных электромобилей. Микрофлюидное устройство на основе нанофильтрации может обеспечить эффективную фильтрацию с помощью технологии разделения с помощью жидкости (FAST)17,18. FAST уменьшает падение давления в фильтре, тем самым уменьшая потенциальную агрегацию между электромобилями и красителями. Эффективно удаляя остаточный краситель, можно повысить качество флуоресцентно маркированных электромобилей и специфичность анализа.
Конфокальная микроскопия может различать интернализованные и поверхностно прикрепленные EV на поверхности клетки и всесторонне исследовать клеточные механизмы поглощения EV в пространственно-временном разрешении19,20,21,22,23,24,25. Например, Sung et al. описали визуализацию жизненного цикла экзосом с использованием своего разработанного репортера живых клеток. Местоположение интернализованных электромобилей было обнаружено и проанализировано с помощью конфокального микроскопа в трехмерных (3D) и пост-изображениях20. Хотя размер небольших электромобилей (40-200 нм) ниже предела разрешения оптического микроскопа, флуоресцентно меченые электромобили могут быть обнаружены с помощью конфокальной микроскопии, поскольку фотоприемник может обнаруживать усиленное флуоресцентное излучение. Таким образом, субклеточная локализация флуоресцентно меченых EV внутри клетки может быть точно определена путем получения нескольких z-образных изображений EV и окружающих клеточных органелл.
Кроме того, 3D-реконструкция и пост-обработка данных могут обеспечить дальнейшее понимание позиционирования интернализованных, поверхностных и свободно плавающих электромобилей. Используя эти процессы в сочетании с покадровой визуализацией живых клеток, предлагаемой конфокальной микроскопией, уровень поглощения EV может быть точно оценен, а также возможно отслеживание поглощения EV в режиме реального времени. Кроме того, анализ трафика ЭЛЕКТРОМОБИЛей может быть выполнен с использованием конфокальной микроскопии путем оценки совместной локализации EV с органеллами, что является первым шагом для определения того, как интернализованные EV участвуют во внутриклеточной функции. Этот протокол описывает методологию выполнения анализа поглощения EV с использованием микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации17,26, конфокальной микроскопии и анализа после изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изоляция электромобилей и встроенная иммунофлуоресцентная маркировка электромобилей
- Сбор сред клеточных культур (CCM) и предварительная обработка CCM для изоляции EV
- Семена клеток PC3 при 30% слиянии в колбу для культивирования клеток объемом 75 см2 . Позвольте контрольным клеткам вырасти до 90% конфлюентности (~48 ч) в стандартных средах и добавках, специфичных для клеточных линий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить влияние EV-содержащих компонентов на клеточное поглощение (т.е. фетальную бычью сыворотку), используйте истощенные экзосомами среды и добавки. - Соберите Урожай СКК.
- Центрифугирование CCM при 1000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) для гранулирования любых неприкрепленных клеток и крупного мусора, собранного со средой. Перенесите супернатант в новую коническую трубку.
- В новой трубке центрифугируют супернатант при 10 000 х г в течение 20 мин при 4 °C, чтобы гранулировать более мелкий мусор и апоптотические тела, оставшиеся в среде. Некоторые более крупные электромобили будут гранулировать. Перенесите супернатант в новую трубку.
- Фильтруйте супернатант через мембранный шприцевой фильтр 0,45 мкм гидрофильного поливинилиденфторида (PVDF).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если не сразу обработать CCM для изоляции EV, храните предварительно обработанный CCM при -80 °C до тех пор, пока не будет выполнена изоляция. Если заморожено, ограничьте циклы замораживания-оттаивания до одного.
- Семена клеток PC3 при 30% слиянии в колбу для культивирования клеток объемом 75 см2 . Позвольте контрольным клеткам вырасти до 90% конфлюентности (~48 ч) в стандартных средах и добавках, специфичных для клеточных линий.
- Изоляция электромобилей от CCM с помощью микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации
- При замораживании полностью разморозьте CCM и вихрь в течение 30 с перед шагом 1.2.2.
- Впрыскивайте 1 мл предварительно обработанного СКК (этап 1.1) в камеру для отбора проб микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации (см. Таблицу материалов)17,26.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте стандартной процедуре работы микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации17,26. - Вращайтесь со скоростью 3000 об/мин в течение 10 мин в настольной прядильной машине (см. Таблицу материалов) для работы микрофлюидного устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если CCM остается на камере для отбора проб после первоначального запуска, выполняйте дополнительные вращения до тех пор, пока весь CCM не опорожнится из камеры для отбора проб. - Удалите жидкость из камеры для отходов путем пипетирования и повторите шаги 1.2.1, 1.2.2 и 1.2.3 дважды.
ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 3 мл CCM будут обработаны для изоляции EV. - Введите 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в камеру для отбора проб для промывки изолированных электромобилей. Вращение в настольной прядильной машине для управления микрофлюидным устройством, как указано в шаге 1.2.3. Найдите чистые электромобили на мембране устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Качество электромобилей, выделенных из микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации, в частности, было подтверждено и сопоставлено с обычным методом UC с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM), сканирующего электронного микроскопа (SEM), анализа отслеживания наночастиц (NTA), структурированной микроскопии освещения, иммуноферментного анализа и ПЦР в реальном времени в предыдущем исследовании17,26.
- Иммунофлуоресцентная маркировка электромобилей с использованием микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации (рисунок 1)
- Выберите EV-специфическое антитело в соответствии с назначением анализа (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые антитела могут мешать сайтам связывания лигандов, специфичным для путей поглощения EV (т.е. эндоцитоза). - Вводят 1 мкг/мл EV-специфического антитела в элюционное отверстие устройства, содержащее 100 мкл изолированных EV.
- Инкубировать в течение 1 ч в темноте при РТ на пластинчатом шейкере, чтобы обеспечить равномерное распределение антитела по образцу.
- Прикрепите клейкую ленту к отверстию для элюирования. Введите 1 мл PBS в камеру для отбора проб, чтобы вымыть любые остаточные антитела.
- Вращайте устройство со скоростью вращения 3000 об/мин до тех пор, пока камера для отбора проб не опустеет. Удалите любую жидкость из отработанной камеры путем пипетки. Впрыскивайте 1 мл PBS в камеру для отбора проб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентно маркированные электромобили будут расположены в мембранной камере. - Пипетка флуоресцентно меченых электромобилей (рисунок 2) из мембранной камеры в янтарную трубку. Блокируйте от света до использования.
- Выберите EV-специфическое антитело в соответствии с назначением анализа (см. Таблицу материалов).
2. Инкубация клеток с флуоресцентно мечеными EV для анализа поглощения EV
- Целевой посев клеток и культивирование на блюдах, совместимых с клеточными культурами.
- Посейте 1 x 104 ячейки PC3 в микроскладную 8-луночную пластину (9,4 x 10,7 мм для каждой лунки) с 0,2 мл среды или 4 x 104 ячейки PC3 в 35-миллиметровую чашку с 1 мл среды. Поместите ячейки в тарелку, совместимую с клеточными культурами, состоящую из тонкого покровного листа (толщина: 0,18 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Тонкий покров минимизирует неблагоприятное рассеяние света. - Позвольте клеткам прилипнуть в течение ночи в оптимальных условиях клеточной культуры (37 °C, концентрация CO2 5%, влажность 90%).
- Дважды промывайте прилипшие клетки средой, обедненной экзосомами (описано на этапе 1.1.1).
- Посейте 1 x 104 ячейки PC3 в микроскладную 8-луночную пластину (9,4 x 10,7 мм для каждой лунки) с 0,2 мл среды или 4 x 104 ячейки PC3 в 35-миллиметровую чашку с 1 мл среды. Поместите ячейки в тарелку, совместимую с клеточными культурами, состоящую из тонкого покровного листа (толщина: 0,18 мм).
- Инкубация клеток с флуоресцентно мечеными EV.
- Измерить концентрацию флуоресцентно меченых электромобилей (этап 1.3.5) с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA, дополнительный рисунок 1). Определить оптимальную концентрацию флуоресцентно меченых EV для добавления в культивируемые клетки (этап 2.1.2.).
- Разбавить флуоресцентно меченые EV средой, обедненной экзосомами, чтобы она соответствовала желаемой концентрации, измеренной на этапе 2.2.1. (т.е. 7,80 x 109 EV (в значении NTA) в 200 мкл истощенных экзосом средой.)
- Добавьте разбавленные EV (этап 2.2.2) к прилипшим клеткам-мишеням, приготовленным по стандарту 2.1.2. Инкубировать в течение экспериментального времени (т.е. 4, 8 или 12 ч).
- Трижды промывайте клетки носителями без экзосом, чтобы удалить любые неинтернализованные электромобили.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно: Ячейки могут быть зафиксированы после стирки. - Метят цитоплазму прилипших клеток 1 мкг/мл CMTMR ((5-(и-6)-(((4-хлорметил)бензоил)амино) тетраметилродамина) (см. Таблицу материалов) и инкубируют в оптимальных условиях клеточной культуры (37 °C, концентрация CO2 5%, влажность 90%).
ПРИМЕЧАНИЕ: Красители клеточной области должны флуоресцировать отдельно от меченых EV, чтобы помочь в определении пространственного местоположения (интернализованного или поверхностного) шипованных EV во время анализа поглощения EV. - Дважды промыть меченые клетки средой, обедненной экзосомами, чтобы удалить остаточный краситель. Добавьте свежие экзосомные среды к клеткам в рамках подготовки к конфокальной визуализации живых клеток.
3. Конфокальная микроскопия
- Для визуализации живых клеток используйте инкубатор на сцене для поддержания оптимальных условий клеточной культуры (37 °C, концентрация CO2 5%, влажность 90%).
- Поместите подготовленные клетки в инкубатор на сцене.
- Задайте параметры изображения на основе контрольных образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемые контрольные образцы включают: только флуоресцентно меченые EV, флуоресцентно меченые клетки, немаркированные EV и немаркированные клетки. - Определите глубину целевых ячеек и диапазон размеров укладки в z-направлении для получения 3D-конфокальных изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина Z-стека составляет 1 мкм. Конфокальное получение 3D-изображений длилось 2 мин 34 с (каждое получение изображения Z-плоскости занимало примерно 8 с; в общей сложности двадцать изображений Z-стека). - Установите получение изображения на несколько z-образных изображений как клеточного красителя (т.е. красного), так и EV-специфического красителя (т.е. зеленого) одновременно (рисунок 3 и рисунок 4A).
4. Обработка изображений
- Используйте программное обеспечение для автоматической обработки изображений для анализа необработанных конфокальных изображений с z-стеком и определения поглощения EV ячейками (см. Таблицу материалов).
- Установите пороговые параметры флуоресцентного сигнала клеток и EV-специфических красителей. Постройте виртуальные поверхности ячеек (рисунок 4A,B).
- Чтобы построить виртуальные поверхности ячеек, нажмите кнопку Добавить новые поверхности.
- Выберите Расчет кратчайшего расстояния в качестве «Настройки алгоритма», чтобы использовать алгоритм, предоставленный программным обеспечением, затем нажмите Далее: Исходный канал.
- Выберите Канал 2 - CMTMR в качестве "Исходного канала" в этом эксперименте.
- Выберите «Гладкий» и поместите соответствующее значение в «Детали поверхностей» для сглаживания поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: 0,57 мкм в этом эксперименте, так как 1 пиксель представляет 0,57 мкм в необработанных данных изображения. - Выберите «Абсолютная интенсивность» в качестве «Пороговое значение».
- Чтобы автоматически установить пороговое значение флуоресцентного изображения по предоставленному алгоритму, щелкните Порог (абсолютная интенсивность): значение устанавливается автоматически.
- Выберите «Включить» как «Разделить касающиеся объекты (регион выращивания)» и поместите значение предполагаемого размера ячейки в «Диаметр начальных точек», 10,0 мкм в этом эксперименте. Затем нажмите кнопку Далее: Фильтровать начальные точки.
- Чтобы настроить виртуальные поверхности ячеек, нажмите кнопку + Добавить , затем выберите Качество как «Тип фильтра». Пороговое значение (210 в этом эксперименте) для нижнего предела путем визуального осмотра и максимальное значение (1485) для верхнего предела, затем нажмите кнопку Готово .
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуальный осмотр означает, что исследователь может отличить клеточную область от необработанного флуоресцентного изображения. - Далее, чтобы построить виртуальные точки электромобилей, нажмите кнопку Добавить новые пятна.
- Выберите «Различные размеры пятен» (рост региона) и расчет кратчайшего расстояния в качестве «Настройки алгоритма», затем нажмите « Далее: Исходный канал».
- Выберите Канал 1 - Alexa Fluor 488 в качестве "Исходного канала" в этом эксперименте.
- Поместите соответствующее значение в «Расчетный диаметр XY» для обнаружения пятна, 1 мкм в этом эксперименте. Затем нажмите кнопку Далее: Фильтрация пятен.
- Чтобы настроить виртуальные точки EV, нажмите кнопку + Добавить , выберите Качество как «Тип фильтра» и установите «Нижний порог» визуальным осмотром, 100 в этом эксперименте. Затем нажмите кнопку Далее: Тип области пятна .
- Выберите «Абсолютная интенсивность » в качестве «Тип пятнистых областей», затем нажмите « Далее: Области пятна».
- Чтобы установить порог, область точек EV, поместите соответствующее значение в «Порог региона» путем визуального осмотра, 100 как «Порог региона» в этом эксперименте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуальный осмотр означает, что исследователь может отличить область электромобилей от необработанного флуоресцентного изображения. - Выберите «Объем региона » как «Диаметр из», затем нажмите «Готово».
- Используйте алгоритмы, предоставленные программным обеспечением, для разделения сгруппированных пятен внутри построенной поверхности на шаге 4.2 (рисунок 4C, i-iv).
- Щелкните встроенные точки, затем перейдите в фильтры.
- Нажмите кнопку + Добавить , затем выберите «Кратчайшее расстояние до поверхностей Поверхности = Поверхность 1 » в качестве типа фильтра, затем нажмите кнопку «Дублировать выделение в новые пятна ». Самое низкое пороговое значение (-7,0 в этом эксперименте) для нижнего предела и соответствующее значение (-0,5) для верхнего предела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите верхний предел с расчетным радиусом пятен. В этом эксперименте расчетный диаметр пятен, т.е. точек EV, был установлен равным 1 мкм на шаге 4.2.11.; таким образом, верхний предел может составлять 0,5.
- Автоматическое количество электромобилей внутри ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение автоматически подсчитывает количество электромобилей внутри клеток, указывая количество, интернализованное клетками-мишенями.- Щелкните выбранный вариант «Места 1» [Кратчайшее расстояние до поверхностей поверхностей = Поверхности 1 в диапазоне от -7,00 до -0,500].
- Перейдите в Статистику и экспортируйте значение из раздела "Общее количество мест"
ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритмы, предоставляемые программным обеспечением, автоматически вычисляют количество и объем ячеек.
- Определить выход поглощения EV за инкубационный период на основе выше рассчитанных значений (рисунок 5).
- Чтобы получить количество ячеек, щелкните построенные поверхности 1, затем перейдите в раздел Статистика и экспортируйте значение "Общее количество поверхностей" из списка Общие.
- Перейдите в раздел Подробно описано в разделе Статистика, чтобы экспортировать том из подробного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя микрофлюидное устройство на основе нанофильтрации, EV были выделены из PC3 CCM и помечены флуорофор-конъюгированным EV-специфическим (CD63) антителом (рисунок 1). Меченые электромобили были успешно визуализированы с помощью 3D-конфокальной микроскопии (рисунок 2). Меченые EV инкубировали с клетками в течение нескольких часов в средах, обедненных экзосомами. После инкубации клетки промывали экзосомами, обедненными средой. Остальные EV были интернализованы или приклеены к клеткам во время инкубации. Область ячейки была помечена. Интернализованные электромобили были визуализированы как puncta19,20,24,27 и отдельный EV (Рисунок 3 и Рисунок 4A). Постобработка этих изображений позволяет визуализировать и количественно оценить интернализацию EV в клетки (рисунок 4). Этапы в сочетании позволяют эффективно проводить точный анализ поглощения EV. На рисунке 5 показаны репрезентативные результаты анализа поглощения EV. Анализ показывает, что уровень поглощения EV зависит от продолжительности инкубационного периода. Процедура позволяет систематически исключать неинтернализованные электромобили (рисунок 4C), чтобы точно определить количество интернализованных электромобилей. Было рассчитано распределение размеров интернализованных точек EV (рисунок 6). Кроме того, количество интернализованных EV может быть нормализовано до объема клеток реципиента для определения фактической скорости поглощения EV для конкретной ячейки. Нормализация учитывает размер гетерогенных клеток и представляет собой количество интернализованных EV относительно площади клеточной поверхности. Площадь клеточной поверхности определяется как площадь клетки, контактирующая с EV-шипами, истощенной экзосомами культуральной средой во время инкубации.
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация изоляции электромобилей и маркировки на кристалле с использованием микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации. (A) Изоляция электромобилей от СКК. (B) Встроенная иммунофлуоресцентная маркировка электромобилей. (C) Удаление несвязанных антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Визуализация флуоресцентно меченых электромобилей. Флуоресцентно меченые (анти-CD63-Alexa Fluor 488) электромобили были обнаружены с помощью конфокального микроскопа (объектив 40x). (A) Положительный образец (анти-CD63-Alexa Fluor 488 меченые электромобили). (B) Отрицательный контроль 1 для маркировки EV (EV только со 2-м антителом (Alexa Fluor 488), без 1-го антитела). (C) Отрицательный контроль 2 (EV с мышиным (MS) антителом IgG и 2-м антителом (Alexa Fluor 488)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Визуализация интернализованных EV в клетки на 2D-изображении. (A) Флуоресцентно меченые (анти-CD63-Alexa Fluor 488, зеленые) EV и клетки (CMTMR, красный) были обнаружены с помощью конфокального микроскопа (20-кратный объектив) после инкубации. (B) Отдельное изображение только флуоресцентно маркированных электромобилей. (C) Отдельное изображение только флуоресцентно меченых клеток. Длины волн лазера возбуждения/излучения для CMTMR и Alexa Fluor 488 составляют 560,6/595 (±50) нм и 487,8/525 (±50) нм. Настройки мощности лазера составляют 3,0 % для CMTMR и 10,0 % для Alexa Fluor 488. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Количественная оценка интернализованных EV процессом поствизуализации. (A) Необработанное конфокальное изображение, полученное из анализа поглощения EV. (B) Виртуальный рендеринг электромобилей в виде точки (зеленый) и ячеек в виде поверхности (красный) с использованием программного обеспечения для обработки изображений. (С, i-iv) Дискриминация интернализованных электромобилей (желтые точки) и неинтернализованных электромобилей (зеленые точки, белая стрелка) с использованием программного алгоритма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Количество поглощения EV в зависимости от времени инкубации. (A) Количество интернализованных электромобилей на ячейку. (B) Количество интернализованных электромобилей на объем ячейки. Количество интернализованных электромобилей увеличивалось в зависимости от времени инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Распределение размеров интернализованных точек EV. Размер точек EV был измерен и нанесен на график распределения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Измерение NTA анти-CD63-Alex Fluor 488 меченых электромобилей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Количество колокализованных EV с лизосомами в зависимости от времени инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Количество поглощения EV в зависимости от времени инкубации. (A) Количество интернализованных электромобилей на ячейку. (B) Количество интернализованных электромобилей на объем ячейки. Количество интернализованных электромобилей увеличивалось в зависимости от времени инкубации. Образец EV был помечен окрашивающим красителем РНК (см. Таблицу материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ поглощения электромобилей, основанный на 3D-флуоресцентной визуализации с помощью конфокальной микроскопии, обеспечивает эффективную методологию и чувствительный анализ. Эта флуоресцентная маркировка EV облегчает визуализацию электромобилей и успешно выполняет точный анализ поглощения EV. Сообщалось о предыдущих методах маркировки электромобилей и удаления остаточного красителя путем удаления осаждения с использованием ультрацентрифугирования (UC); однако UC может со-осаждение EV, а иммобилизованный краситель может привести к ложноположительному сигналу12,13. Микрофлюидные устройства на основе нанофильтрации устраняют это совместное осаждение электромобилей и красителя, тем самым повышая качество флуоресцентно меченых электромобилей и специфичность анализа. Поглощение EV измерялось с помощью объемного анализа для различения и количественной оценки интернализованных EV отдельно от поверхностных EV на поверхности клетки. Объемный анализ поглощения EV позволяет нормализовать поглощение EV по размеру ячейки. Анализ поглощения EV живыми клетками был достигнут с использованием инкубатора конфокального микроскопа на сцене. Протокол применяется к исследованиям, требующим живых клеточных культур и EV. Внутриклеточное отслеживание электромобилей в режиме реального времени может быть выполнено через 3D-окно. Кроме того, анализ пространственно-временного разрешения ev-трафика наряду с совместной локализацией EV с субклеточными органеллами может быть достигнут с помощью протокола (дополнительный рисунок 2). Протокол, описанный здесь, является мощным инструментом для клеточного анализа электромобилей.
Несмотря на все преимущества протокола, существуют потенциальные ограничения. Нанофильтрационное микрофлюидное устройство, используемое в этом исследовании, может совместно изолировать другие загрязняющие вещества во время изоляции EV. Липопротеины низкой плотности похожи по размеру на EV и могут попадать в мембрану во время изоляции28. Хотя специфические для EV маркеры могут указывать EV, совместно изолированные загрязняющие вещества могут влиять на последующий анализ. В этой рукописи электромобили были помечены CD63-сопряженным красителем Alexa Fluor 488. Эта маркировка повышает специфичность для обнаружения EV; однако он также связывает поверхностную молекулу EV и увеличивает конкурентное связывание. Кроме того, уровень поглощения EV может зависеть от клеточной линии и CCM. Методы маркировки, подробно описанные в этом протоколе, могут быть адаптированы к другим окрашивающим красителям, таким как липофильные красители, цитозольные красители и РНК-красители (дополнительный рисунок 3). Протокол использует легкий сканирующий конфокальный микроскоп (LSCM) для обнаружения крошечного сигнала электромобилей. LSCM полагается на интенсивные лазеры, и в результате живые клетки могут быть повреждены или изменены длительным лазерным возбуждением. Быстрая скорость сбора может уменьшить фотоповреждения с помощью вращающегося дискового конфокального микроскопа (SDCM). SDCM также может использоваться в отслеживании электромобилей, которое требует короткой покадровой визуализации для визуализации движений на короткие расстояния.
Несмотря на эти потенциальные ограничения, предлагаемый протокол обеспечивает эффективный метод оценки поглощения EV и имеет потенциал для дальнейшего анализа отслеживания EV в живых клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ю.-К. Чо является изобретателем патентов на микрофлюидное устройство на основе нанофильтрации Exodisc, которые лицензированы Labspinner (Ульсан, Корея). Всем остальным авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NCI nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 и CA143055 к K. J. P. Это исследование было поддержано грантом Корейского проекта исследований и разработок в области технологий здравоохранения через Корейский институт развития индустрии здравоохранения (KHIDI), финансируемый Министерством здравоохранения и социального обеспечения Республики Корея (номер гранта: HI19C1122). Работы Д. Кима и Ю.-К. Чо был поддержан Институтом фундаментальных наук (IBS-R020-D1), финансируемым корейским правительством. Авторы благодарят нынешних и бывших членов Урологического института Брейди, особенно сотрудников лаборатории Pienta-Amend, за критическое прочтение рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
