Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere kjerner av høy kvalitet fra frosne musenyrer som forbedrer representasjonen av medulære nyrecelletyper og unngår genuttrykksartefakter fra enzymatisk vevsdissosiasjon.
Abstract
Nyrene regulerer ulike biologiske prosesser som vann, elektrolytt og syre-base homeostase. Fysiologiske funksjoner av nyrene utføres av flere celletyper arrangert i en kompleks arkitektur over organets kortikomedullære akse. Nylige fremskritt innen enkeltcelletranskriptomikk har akselerert forståelsen av celletypespesifikt genuttrykk i nyrefysiologi og sykdom. Imidlertid krever enzymbaserte vevsdissosiasjonsprotokoller, som ofte brukes til enkeltcelle RNA-sekvensering (scRNA-seq), for det meste friskt (ikke-arkivert) vev, introduserer transkripsjonelle stressresponser og favoriserer valg av rikelig celletyper i nyrebarken, noe som resulterer i en underrepresentasjon av celler i medulla.
Her presenterer vi en protokoll som unngår disse problemene. Protokollen er basert på kjerneisolering ved 4 °C fra frosset nyrevev. Kjerner er isolert fra et sentralt stykke av musnyren som består av cortex, ytre medulla og indre medulla. Dette reduserer overrepresentasjonen av kortikale celler som er typiske for hele nyreprøver til fordel for medulære celler, slik at data vil representere hele kortikomedullære akse i tilstrekkelig overflod. Protokollen er enkel, rask og tilpasningsdyktig og gir et skritt mot standardisering av enkeltkjernetranskriptomikk i nyreforskning.
Introduction
Nyrer viser en svært kompleks vevsarkitektur. De består av funksjonelt og anatomisk distinkte segmenter langs en kortikomedullær akse og formidler biologiske funksjoner, for eksempel regulering av ekstracellulært væskevolum, elektrolyttbalanse eller syre-base homeostase1.
Fremskritt innen enkeltcelletranskriptomikk har muliggjort grundig karakterisering av komplekse vev og akselerert forståelsen av segment- og celletypespesifikt genuttrykk i nyrefysiologi, utvikling og sykdom 2,3,4.
Imidlertid viser de enzymbaserte dissosiasjonsprotokollene som ofte brukes til scRNA-seq, flere ulemper og begrensninger. Avhengig av protokollen genererer de transkripsjonelle stressresponser og vevsdissosiasjonsskjevhet mot lettere å dissosiere kortikale celletyper 5,6. Selv om protokoller som bruker kaldaktive proteaser for embryonale nyrer, er i stand til å redusere stressrelaterte transkripsjonsendringer, klarer de ikke å overvinne dissosiasjonsskjevheten mot kortikale celler og kan ikke lett tilpasses forskjellige typer syke nyrevev7. I tillegg er enkeltcellede tilnærminger ikke lett kompatible med frosne vevsprøver, og begrenser deres anvendelse hovedsakelig til ikke-arkivert, ferskt vev, noe som gjør vevssamlingen til en begrensende faktor6.
RNA-sekvensering med enkeltkjerner (snRNA-seq) kan omgå disse begrensningene 8,9. Her presenterer vi en protokoll for kjerneisolering fra et sentralt stykke frosset voksent nyrevev fra mus (figur 1)10. Vår protokoll er enkel og gir en standardisert tilnærming for å oppnå RNA-sekvenseringsbiblioteker med en balansert representasjon av forskjellige nyrecelletyper for eksperimentelle modeller som ikke involverer sterke regionale vevsendringer. I sistnevnte tilfelle kan protokollen vår også utføres med hele nyrer.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til dyrevelferdsloven (TierSchG) og dyrevelferdsforskriften (TierSchVersV) og var godkjent av lokale myndigheter og dyrevelferdsansvarlige ved vår institusjon (MDC).
1. Vev forberedelse
- Forbered en 6-brønns plate som inneholder 2 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) per brønn for hver nyre som skal oppnås. Forbered en 6-brønnsplate som inneholder 2 ml RNA-stabiliseringsløsning per brønn og nyre. Forkjøl begge platene på is.
- Avlive en 3- til 6 måneder gammel mannlig C57BL/6-mus. Plasser musen på et dissekeringsbrett, pin ned ekstremiteter og steriliser magen med 70% etanol.
- Åpne magen opp til brystkassen ved hjelp av tang og saks. Løft tarmen og andre organer til siden og fjern nyrene ved å kutte urinlederen, nyrearterien og venen forsiktig med en saks. Vask nyrene i den tidligere tilberedte, iskalde 1x PBS og fjern nyrefascien og eventuelt gjenværende fett fra nyrene til alt hvitt vev er fjernet (figur 2A).
- Legg nyren på en kald dissekeringsplate og bruk en skarp skalpell eller barberblad for å få en midtskive på 1-2 mm. Forsikre deg om at vevstykket inneholder hele kortikomedullær akse (figur 2B). Bruk mikrodisseksjon saks og tang for å forsiktig trimme cortex fra sidene av midtstykket. Innenfor det dissekerte vevsstykket skal de tre segmentene cortex, ytre medulla og indre medulla være godt synlige (figur 2C).
MERK: Skiven bør ikke overstige en tykkelse på 2 mm eller en vekt på 20 mg for å sikre tilstrekkelige buffermengder for effektiv vevslyse og for å minimere omgivende bakgrunns-RNA i cDNA-bibliotekene. Omgivende RNA kaster bort sekvenskapasitet, da det ikke er forbundet med enkeltkjerner. - Overfør nyrestykket til den tidligere tilberedte RNA-stabiliseringsløsningen og inkuber i 24 timer ved 4 ° C for å unngå RNA-nedbrytning. Etter 24 timer fjernes RNA-stabiliseringsløsningen og vevet oppbevares ved -80 °C inntil videre bruk. Fjern forsiktig overflødig løsning med silkepapir.
2. Kjerner isolasjon
- Rengjørings- og forberedelsestrinn
- Rengjør benkeplater og pipetter med 70% etanol og RNase dekontamineringsløsning.
- Rengjør et rundbunnet, 2 ml vevskvernrør og matchende pestel A og B med RNase dekontamineringsløsning, etterfulgt av 70% etanol og RNase-fritt vann (1 kvernrør og støtsett per prøve). La det tørke helt.
- Forkjøl sentrifugen til 4 °C.
- Merk og forkjøl tre 15 ml oppsamlingsrør, et 1,5 ml oppsamlingsrør, et 5 ml fluorescensaktivert cellesorteringsrør (FACS) og et tørrkvernrør for hver prøve på is.
- Buffer forberedelse
- Varm opp ribonukleosid-vanadyl-oppløsningen til 65 °C til den er rekonstituert til en grønn-svart, klar oppløsning i henhold til produsentens instruksjoner. 11
- Klargjør 1x PBS inneholdende 4 % bovint serumalbumin (BSA) som beskrevet i tabell 1A. I tillegg må du forberede 1x PBS med 0,04% BSA (tabell 1B). Filtrer begge oppløsningene med et 0,2 μm surfaktantfritt celluloseacetat (SFCA) membransprøytefilter og hold på is til videre bruk.
- Forbered kjernelysebuffer 1 (NLB1, tabell 1C). Legg til 4 ml EZ lysisbuffer for kjernelysebuffer 2 (NLB2, tabell 1D) og 2 ml 0,04 % BSA / PBS for kjernesuspensjonsbufferen (NSB, tabell 1E) til 15 ml rør. Tilsett RNase-hemmerløsningen til NLB2 og NSB rett før bruk som angitt nedenfor i protokollen. Oppbevares på is inntil videre bruk.
- Klargjør EZ lysis buffer med 10% sukrose (Sukrose Gradient Buffer, tabell 1F). Bland godt og filtrer bufferen i et nytt 15 ml rør ved hjelp av et 0,2 μm SFCA membransprøytefilter. Oppbevares på is inntil videre bruk.
- Vevshomogenisering og cellelyse
MERK: For å minimere RNA-nedbrytning, utføres alle trinnene på is. Kvernrøret, petriskålen og alle buffere må forkjøles. Alle trinn for resuspensjon utføres ved å pipettere kjernesuspensjonen forsiktig. Ikke virvle prøven for å unngå skjærekrefter og skade på kjerner.- Ta det frosne nyrestykket og overfør det til en 60 mm petriskål av polystyren på is som inneholder 1 ml NLB1.
- Hakk vevet grundig med et barberblad eller skalpell (figur 3A).
- Klipp av spissen på en 1 ml pipettespiss og overfør hakket vev og buffer til kvernrøret. Sørg for å overføre alle vevbiter. Vask petriskålen 5-10 ganger med bufferen, om nødvendig.
- Homogeniser suspensjonen på is ved å bevege pestle A, sakte opp og ned i kvernrøret. Unngå luftbobler forårsaket av raske bevegelser (figur 3B).
- Før homogenatet gjennom en 100 μm sil i et forkjølt 15 ml oppsamlingsrør og vask filteret med ytterligere 1 ml NLB1.
- Vask kvernrøret med kald EZ-kjernelysisbuffer og kast bufferen.
- Overfør homogenatet tilbake i kvernrøret og homogeniser suspensjonen på is ved å bevege pestle B sakte, 15x opp og ned i kvernrøret. Unngå luftbobler forårsaket av raske bevegelser (figur 3C).
- Overfør homogenatet til et forkjølt 15 ml oppsamlingsrør. Vask kvernrøret med ytterligere 2 ml NLB1 og sørg for å overføre alle vevfragmenter til oppsamlingsrøret. Inkuber homogenatet (totalvolum på 4 ml) i 5 minutter på is for å lyse cellene.
- Rensing av kjerner
- Før homogenatet gjennom en 40 μm sil inn i et forkjølt 15 ml oppsamlingsrør. Spinn oppsamlingsrøret i 5 minutter ved 500 x g ved 4 °C i en sentrifuge med en svingbar bøtterotor. I mellomtiden legger du til RNase-hemmeroppløsning til NLB2 (tabell 1D).
- Fjern supernatanten uten å forstyrre pelleten. Bryt pelleten forsiktig i 4 ml NLB2.
- Legg suspensjonen forsiktig under med en 1 ml pute med sukrose gradientbuffer. Sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C i en sentrifuge med svingbøtterotor. I mellomtiden legger du til RNase-hemmerløsning til NSB (tabell 1E).
- Etter sentrifugering, fjern forsiktig oppsamlingsrøret fra sentrifugen og vær forsiktig så du ikke forstyrrer de to lagene når du håndterer oppsamlingsrøret. Celleavfall er synlig mellom de to lagene. Fjern supernatanten forsiktig, og begynn med ruskene. Fjern den gjenværende supernatanten uten å forstyrre pelletskjernene og resuspender pelleten forsiktig i 1 ml NSB.
MERK: Resuspensjonsvolumet avhenger av mengden vev som brukes til isolasjonen og pelletsstørrelsen som oppnås etter det siste sentrifugeringstrinnet. Volumet må kanskje tilpasses det forventede antallet kjerner. - Før homogenatet gjennom en 20 μm sil inn i det forkjølte 5 ml FACS-oppsamlingsrøret.
3. Kjerner sortering
- Tilsett 20 μL 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) per ml NSB til en endelig konsentrasjon på 2 μM til homogenatet i FACS-oppsamlingsrøret og bland forsiktig. Inkuber i 5 min på is.
- Klargjør det forkjølte 1,5 ml oppsamlingsrøret med 20 μL 4 % BSA / 1x PBS og tilsett 0,5 μL RNasehemmeroppløsning til en endelig konsentrasjon på 1 E / μL. Fortsett umiddelbart til sortering.
- Sorter kjernene ved hjelp av en cellesortering.
- Bland kjernesuspensjonen kort før du setter FACS-oppsamlingsrøret inn i sortereren.
- Angi en første gate P1 basert på foroverspredning (FSC) og sidespredning (SSC) for å utelate rusk og aggregater (figur 4A).
- Hvis du vil ekskludere tomme eller skadede kjerner og multipler, angir du en etterfølgende port basert på DAPI-området kontra DAPI-høyden (DAPI-A vs DAPI-H) (figur 4B).
- Sorter enkeltkjerner i 1,5 ml oppsamlingsrør inneholdende 4% BSA / 1x PBS med 1 U / μL RNase-inhibitoroppløsning fremstilt i 3,2.
4. Kvalitetskontroll
- Mål den endelige kjernekonsentrasjonen under et fluorescensmikroskop eller i et automatisert tellekammer i minst to uavhengige tellinger og vurder suspensjonskvaliteten (figur 5).
MERK: Optimale konsentrasjoner er mellom 700 - 1,200 kjerner / μL. Lavere cellekonsentrasjoner som 700 kjerner / μL kan være å foretrekke, da resulterende cDNA-biblioteker inneholdt mindre omgivende bakgrunns-RNA (transkripsjoner som ikke er forbundet med individuelle kjerner). - Beregn det nødvendige volumet av kjernesuspensjon for ønsket utvinning av sekvenserte enkeltkjerner. For å unngå kjerneaggregering og RNA-nedbrytning, fortsett umiddelbart til bibliotekforberedelse.
Representative Results
For å bestemme ytelsen til protokollen vår, brukte vi 10x Genomics Chromium Single Cell 3' Gene Expression Kit v3.1 for bibliotekforberedelse og analyserte snRNA-seq-dataene med Seurat pakken12,13.
Figur 6 viser resultater fra et representativt snRNA-seq-bibliotek. For å vurdere kvaliteten på kjernene våre, plottet vi antall gener mot antall transkripsjoner (definert av unike molekylære identifikatorer (UMI)) farget av fraksjonen av mitokondrielle avlesninger (figur 6A). Kjerner av god kvalitet viser generelt høyere antall avlesninger, korrelerer UMI og gentall, og lave mitokondrielle lesefraksjoner.
For den påfølgende analysen ble kjerner med mindre enn 500 eller mer enn 4000 telte gener, eller mer enn 5% av mitokondrielt RNA ekskludert (n = 828). Kun gener uttrykt i minimum tre kjerner ble inkludert. Vi oppdaget omtrent 20.000 gener totalt i de resterende 6.000 kjernene med 1.600 mediangener og 2.800 median UMI per kjerne (figur 6B).
Clustering var basert på svært variable gener. Vi identifiserte totalt 18 klynger. Celleidentiteter ble kommentert basert på kjente markørgener (ikke vist). Underklynger av en celletype ble oppsummert til en klynge, noe som resulterte i totalt 11 forskjellige celletyper: podocytter, proksimale tubuli (PT), tynn lem (tL), tykk stigende lem (TAL), distal kronglete tubuli (DCT), forbindende tubuli (CNT), samlekanalhoved og interkalerte celler (CD-PC, A-IC, B-IC), dypt medullært epitel i bekkenet (DMEP) og endotel. Genuttrykksmønstre av klyngeberikede markører ble visualisert i et punktplott (figur 6C) og celletypeklynger i et t-distribuert stokastisk naboinnebyggingsplott (t-SNE) (figur 6D).
For å vurdere celletypefordelinger i vårt utvalg ble prosentandelen av hver celletype beregnet (figur 6E) og brukt til å bestemme forholdet mellom PT og TAL. PT er hovedsakelig lokalisert i nyrebarken og ofte overrepresentert i nyre enkeltcelle datasett som celler av PT er lett å dissosiere og svært rikelig i hele nyreprøver. TAL derimot strekker seg over hele ytre medulla14. Dermed representerer forholdet mellom PT- og TAL-fraksjoner et godt mål for anrikning av medulære celletyper i et nyre-encelle-datasett. Generelt varierte PT/TAL-forholdet i encellede hele nyredatasett fra 8 (upubliserte data fra kuldeproteasebehandlet helt nyrevev) til 45 for enzymatisk dissosiert vev10,14,15. I snRNA-seq-datasettet presentert her var vi i stand til å nå et PT / TAL-forhold på 2. Dette resultatet illustrerer at fjerning av overflødig cortex under vevsdisseksjon kombinert med snRNA-seq resulterer i en påfallende forbedret nyrecelletyperepresentasjon.
Figur 1: Skjematisk oversikt over arbeidsflyten. Protokollen består av fire hovedtrinn som inkluderer vevsdisseksjon etterfulgt av kjerneisolering, kjernesortering og en endelig renhets- og konsentrasjonsvurdering. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Nyredisseksjon og vevspreparering. (A) Representativt bilde av dissekert hel nyre. De stiplede linjene indikerer kuttene som kreves for å oppnå en midtskive på 1-2 mm med en representasjon av alle nyrecelletyper. (B) Representativt bilde av innhentet midtstykke. De stiplede linjene indikerer kuttene for cortex trimming fra siden. (C) Representativt bilde av sentralt nyrestykke med trimmet cortex. Cortex (C), ytre medulla (OM) og indre medulla (IM) er tydelig synlige. Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vevshomogenisering og kjernerensing . (A) Representativt bilde som viser tilstrekkelig hakket nyrevev. Skalastang = 500 μm. (B) Homogenat etter første homogeniseringstrinn (25 slag med pestle A, 2 ml kvernrør). (C) Homogenat etter andre homogeniseringstrinn (15 slag med pestle B, 2 ml kvernrør). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gating strategi for kjernesortering. (A ) En første gate P1 ble satt basert på fremoverspredning (FSC) vs sidespredning (SSC) for å ekskludere rusk og aggregater. (B ) En etterfølgende port basert på DAPI-område (DAPI-A) vs DAPI-høyde (DAPI-H) ekskluderte tomme eller skadede kjerner og multipler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kjernesuspensjon før og etter kjernesortering. (A, C) DAPI-fargede kjerner (blå). (B, D) Overlegg av DAPI og Brightfield-kanal (BF). Før sortering (øvre panel) inneholder kjernesuspensjonen cellerester og aggregater (merket med hvite pilspisser). Etter sortering (nedre panel) virker kjernesuspensjonen mye renere. Eksempler på DAPI-fargede kjerner er merket med svarte pilspisser. Kjerner av god kvalitet virker runde og glatte med en intakt membran og er godt separert, mens kjerner av dårlig kvalitet virker rynkete og viser tap av kjernemembranen. Skala bar = 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kvalitetskontroll og analyse av et representativt snRNA-seq datasett. (A) Antall gener (nGene) plottet mot antall unike molekylære identifikatorer (nUMI) farget av fraksjonen av mitokondrielle avlesninger (percent.mt). Kjerner av lav kvalitet tilsvarer nedre venstre kvadrant av plottet (n = 828) og ble ekskludert fra senere analyse. (B) Distribusjon og median av nGene og nUMI oppdaget per kjerne i snRNA-seq-datasettet, som representerer 6.177 kjerner (> 500 gener). Bibliotekene ble sekvensert til en mediandybde på ~ 8,200 kartlagte leser per kjerne. (C) Punktplott som viser genuttrykksmønstre av klyngeberikede markører (x-akse) for individuelle celletyper (y-aksen). Størrelsen på prikken tilsvarer andelen celler som uttrykker det angitte genet. Fargen tilsvarer gjennomsnittsuttrykket. (D) T-distribuert stokastisk naboinnebygging (t-SNE) plott av identifiserte celletyper. (E) Celletypefordeling i snRNA-seq datasett. PT, proksimal tubuli; tL, tynn lem; TAL, tykk stigende lem, DCT, distal kronglete tubuli; CNT, forbinder tubule; CD-PC, samle kanal hovedceller; A-IC, type A interkalerte celler; B-IC, type B interkalerte celler; DMEP, dypt medullært epitel i bekkenet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Endelig konsentrasjon | Volum (ml) | ||
| (A) 4 % BSA/PBS | ||||
| Fosfatbufret saltvann (PBS) med 10% storfealbumin | 4% | 2 | ||
| PBS (fosfatbufret saltvann) 1X uten kalsium eller magnesium | - | 3 | ||
| (B) 0,04 % BSA/PBS | ||||
| 4 % BSA/PBS | 0.04 % | 0.5 | ||
| PBS (fosfatbufret saltvann) 1X uten kalsium eller magnesium | - | 49.5 | ||
| (C) Kjernelysebuffer 1 (NLB1) | ||||
| Kjernefysisk EZ lysis buffer | - | 4 | ||
| RiboLock RNase-hemmer (40 E/μL) | 1 U/μL | 0.1 | ||
| Ribonukleosid-vanadylkompleks (200 mM) | 10 mM | 0.2 | ||
| (d) Kjernelysebuffer 2 (NLB2) | ||||
| Kjernefysisk EZ lysis buffer | - | 4 | ||
| RiboLock RNase-hemmer (40 E/μL) | 1 U/μL | 0.1 | ||
| (E) Kjernesuspensjonsbuffer (NSB) | ||||
| 0,04 % BSA/PBS | - | 2 | ||
| RiboLock RNase-hemmer (40 E/μL) | 1 U/μL | 0.05 | ||
| (F) Surkål for gradient (10 % sukrose) | ||||
| Vekt 1 g sukrose | ||||
| Oppløs i 6 ml kjernefysisk EZ lysisbuffer | ||||
| Fyll opptil 10 ml med kjernefysisk EZ lysisbuffer | ||||
| Filtrer gjennom et 0,2 μm sprøytefilter inn i en ny slange | ||||
Tabell 1: Løsningsoppskrifter: (A) Tilberedning av 4% BSA/1x PBS. Filtrer med et 0,2 μm SFCA membransprøytefilter og hold det på is til bruk. (B) Tilberedning av 0,04 % BSA/1 x PBS. Filtrer med et 0,2 μm SFCA membransprøytefilter og hold det på is til bruk. (c) Fremstilling av kjernelysebuffer 1 (NLB1). Angitte volumer er gitt per prøve. Oppbevares på is til bruk. (d) Fremstilling av kjernelysebuffer 2 (NLB2). Angitte volumer er gitt per prøve. Legg RiboLock RNase Inhibitor til NLB2 direkte før bruk som nevnt i protokollen. Oppbevares på is til bruk. (E) Fremstilling av kjernesuspensjonsbuffer (NSB). Angitte volumer er gitt per prøve. Tilsett RiboLock RNase-hemmer til NSB rett før bruk som angitt i protokollen. Oppbevares på is til bruk. (f) Tilberedning av sukrosegradientbuffer. Filtrer med et 0,2 μm SFCA membransprøytefilter og hold det på is til bruk.
Discussion
Enkeltcelle transkriptomikk fremmer forståelsen av celletypespesifikt genuttrykk i nyrefysiologi og sykdom. Her ga vi en enkel og reproduserbar metode for å isolere enkeltkjerner av høy kvalitet fra frosset musnyrevev for snRNA-seq på en standardisert måte.
For snRNA-seq er det avgjørende å bruke kjerner av høy kvalitet som input for bibliotekgenerering og for å unngå RNA-nedbrytning under vevsbehandling. Derfor er inkubasjon av vevsstykker i RNA-stabiliseringsløsning umiddelbart etter disseksjon avgjørende for å beskytte og stabilisere cellulært RNA og gjør det mulig å lagre prøver ved - 80 ° C på ubestemt tid. Ved bruk av denne protokollen på frosset vev uten RNA-stabiliseringsløsningsbehandling, for eksempel arkivmateriale, er det nødvendig med en prøvekjøring, og RNA-kvaliteten må vurderes da vi observerte et signifikant tap av RNA-integritet i snapfrosset vev uten tidligere inkubasjon i RNA-stabiliseringsløsning.
Generelt er riktig prøvehåndtering avgjørende for å maksimere utvinningen av intakte, enkle kjerner. Alle opphengstrinn skal utføres forsiktig ved å pipettere for å unngå skjærbelastning og fysisk skade. Buffere for de endelige kjernene resuspensjon og kjernesortering bør inneholde BSA for å unngå kjernetap og aggregering.
Buffervolumer i denne protokollen er optimalisert for svært små vevsprøver (~15 mg). Det er avgjørende å sikre fullstendig cellelyse og tilstrekkelig vask for å generere suspensjoner av høy kvalitet. Større vevsblokker eller hele nyreprøver vil resultere i overdreven kjernekonsentrasjoner som fører til klumping og aggregering, høy overflod av omgivende RNA og generelt dårlig suspensjonskvalitet. Hvis større prøver eller annet vev behandles, anbefales det sterkt å utføre prøvekjøringer for å bestemme optimale buffervolumer for minimale omgivende RNA-nivåer. Kjerne- og RNA-kvalitet og konsentrasjoner må undersøkes nøye, da overbelastning resulterer i generelt dårlig ytelse.
I tillegg påvirker store mengder celleavfall, som forårsaker høye nivåer av omgivende RNA som ikke er forbundet med enkeltkjerner, sekvenseringsresultatene negativt. Avklaring av kjernesuspensjonen ved sentrifugering gjennom en sukrosepute demper dette problemet til en viss grad, men det kan også føre til skjevhet i cellerepresentasjon ved motseleksjon mot tette, små kjerner som finnes for eksempel i immunceller16. Hvis dette er bekymret, bør sukrosegradienten utelates. Derimot fant vi at flowcytometri basert på DAPI-farging var avgjørende for å redusere mengden celleavfall for å produsere en enkelt kjernesuspensjon av høy kvalitet.
Isoleringen av enkeltkjerner har betydelige fordeler sammenlignet med enkeltcelletilnærminger8. Den er kompatibel med riktig frosset vev, noe som gjør vevssamlingen mer fleksibel, og omgår behovet for enzymbasert vevsdissosiasjon, som kan introdusere transkripsjonelle stressresponser 6,17. Videre overvinner den dissosiasjonsskjevheten som favoriserer valget av lett dissosiable celletyper i nyrebarken, noe som kan føre til en underrepresentasjon av medulære celletyper i noen enzymbaserte tilnærminger 5,6,10.
Ved å bruke et sentralt nyrestykke i stedet for hele nyrevevet sparer du ytterligere ressurser og korrigerer for overrepresentasjon av rikelig med celletyper som beskrevet tidligere10. Avhengig av musemodellen eller fenotypen som er undersøkt, kan det imidlertid være fordelaktig å bruke hele nyreprøver i stedet for en enkelt midtskive. Hele nyreprøver kan være mer representative for sanne celleproporsjoner, eller forandringer som forekommer i hele nyrene, mens en trimmet midtskive viste seg å være fordelaktig for medullære fenotyper eller når prøvematerialet var begrenset. Denne avgjørelsen er derfor svært brukerspesifikk og bør vurderes nøye.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Scientific Genomics Platform ved Max Delbrück Center for Molecular Medicine i Helmholtz Association, Berlin for teknisk støtte.
JL og KMSO ble støttet av German Research Foundation (DFG) Research Training Group GRK 2318 og av Research Unit FOR 2841. KMSO ble støttet av Collaborative Research Grant 1365. AB ble støttet av midler fra Gottfried Wilhelm Leibniz-prisen fra DFG tildelt NR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell sorter | - | - | For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000015 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope. |
| 4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) | Biotrend | 40043/b | Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM. |
| D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free | VWR | 0335-500G | |
| DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22431021 | |
| Ethanol, 70 % | - | - | |
| FACS tubes | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma-Aldrich | D8938-1SET | |
| Minisart Syringe Filters 0.2 µm | Sartorius | 16534-GUK | |
| Nuclease-free Water | Invitrogen | AM9937 | |
| Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit | Sigma-Aldrich | NUC-101 | Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation. |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Petri dishes, polystyrene 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| pluriStrainer Mini 100 µm | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| pluriStrainer Mini 20 µm | pluriSelect | 43-10020-40 | |
| pluriStrainer Mini 40 µm | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL) | Falcon | 352099 | |
| Razor blades | - | - | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | EO0384 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C. |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | |
| RNase AWAY | Fisher Scientific | 11952385 |
References
- Thomas, R. S. Kidney modeling and systems physiology. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 1 (2), 172-190 (2009).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Park, J., Liu, C. L., Kim, J., Susztak, K. Understanding the kidney one cell at a time. Kidney International. 96 (4), 862-870 (2019).
- Clark, A. R., Greka, A. The power of one: advances in single-cell genomics in the kidney. Nature Reviews Nephrology. 16 (2), 73-74 (2020).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Muto, Y., et al. Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney. Nature Communications. 12 (1), 2190 (2021).
- Hinze, C., et al. Kidney single-cell transcriptomes predict spatial corticomedullary gene expression and tissue osmolality gradients. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (2), 291 (2021).
- Berger, S. L. Isolation of cytoplasmic RNA: ribonucleoside-vanadyl complexes. Methods in Enzymology. 152, 227-234 (1987).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al.
- Park, J., et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease. Science. 360 (6390), 758-763 (2018).
- Kirita, Y., Wu, H., Uchimura, K., Wilson, P. C., Humphreys, B. D. Cell profiling of mouse acute kidney injury reveals conserved cellular responses to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15874-15883 (2020).
- Schneeberger, S., et al. The neuroinflammatory interleukin-12 signaling pathway drives Alzheimer's disease-like pathology by perturbing oligodendrocyte survival and neuronal homeostasis. bioRxiv. , 441313 (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
