Summary
Dit artikel beschrijft de inkapseling van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) met behulp van een co-axiale stroomfocusapparaat. We tonen aan dat deze microfluïdische inkapselingstechnologie een efficiënte vorming van hPSC-sferoïden mogelijk maakt.
Abstract
Driedimensionale (3D) of sferoïde culturen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) bieden de voordelen van verbeterde differentiatieresultaten en schaalbaarheid. In dit artikel beschrijven we een strategie voor de robuuste en reproduceerbare vorming van hPSC-sferoïden waarbij een co-axiale stroomfocusapparaat wordt gebruikt om hPSC's in kern-shell microcapsules te vangen. De kernoplossing bevatte eencellige suspensie van hPSC's en werd viskeus gemaakt door de integratie van poly(ethyleenglycol) met hoog molecuulgewicht (PEG) en dichtheidsgradiëntmedia. De schelpenstroom bestond uit PEG-4 arm-maleimide of PEG-4-Mal en stroomde langs de kernstroom naar twee opeenvolgende olieknooppunten. Druppelvorming vond plaats bij de eerste olieverbinding met shell-oplossing die zich rond de kern wikkelde. Chemische crosslinking van de schaal vond plaats bij de tweede olieverbinding door een di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol of DTT) in deze druppels te introduceren. De crosslinker reageert met maleimide functionele groepen via klikchemie, wat resulteert in de vorming van een hydrogelschaal rond de microcapsules. Onze inkapselingstechnologie produceerde capsules met een diameter van 400 μm met een snelheid van 10 capsules per seconde. De resulterende capsules hadden een hydrogel-schil en een waterige kern waarmee afzonderlijke cellen zich snel konden samenvoegen tot aggregaten en sferoïden konden vormen. Het proces van inkapseling had geen negatieve invloed op de levensvatbaarheid van hPSC's, met >95% levensvatbaarheid waargenomen 3 dagen na inkapseling. Ter vergelijking: hPSC's ingekapseld in vaste gelmicrodeeltjes (zonder een waterige kern) vormden geen sferoïden en hadden 3 dagen na inkapseling <50% levensvatbaarheid. Sferoïde vorming van hPSC's in kern-shell microcapsules vond plaats binnen 48 uur na inkapseling, waarbij de sferoïde diameter een functie was van de celinentingsdichtheid. Over het algemeen was de microfluïdische inkapselingstechnologie die in dit protocol wordt beschreven zeer geschikt voor hPSCs-inkapseling en sferoïdevorming.
Introduction
Er is veel belangstelling voor 3D-culturen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) vanwege de verbeterde pluripotentie en differentiatiemogelijkheden die dit kweekformaatbiedt 1,2,3. hPSC's worden meestal gevormd tot sferoïden of andere 3D-cultuurformaten door middel van bioreactoren, microwells, hydrogels en polymere steigers 4,5,6. Inkapseling biedt een ander middel om enkele hPSC's in sferoïden te organiseren. Eenmaal ingekapseld kunnen hPSC-sferoïden gemakkelijk worden behandeld en overgebracht naar microtiterplaten voor differentiatie, ziektemodellering of experimenten met het testen van geneesmiddelen. Het inkapselen van hPSC's in een hydrogellaag beschermt cellen ook tegen afschuifschade en maakt het mogelijk om sferoïden in een bioreactor te kweken met hoge roersnelheden7.
Onze methodologie voor stamcelinkapseling evolueerde in de loop van de tijd. Ten eerste hebben we ons gericht op vaste hydrogel-microdeeltjes en succesvolle inkapseling en kweek van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) aangetoond)8. Er werd echter opgemerkt dat menselijke embryonale stamcellen (hESCs) een lage levensvatbaarheid hadden wanneer ze werden ingekapseld in dergelijke hydrogel-microdeeltjes, vermoedelijk vanwege de grotere behoefte van deze cellen om cel-celcontacten na de inkapseling te herstellen. We redeneerden dat heterogene microcapsule, die een waterige kern bezit, beter geschikt kan zijn voor inkapseling van cellen die afhankelijk zijn van een snel herstel van cel-celcontacten. Het concept van co-axiale flowfocus microfluïdische apparaat voor het maken van waterige kern / hydrogel shell microcapsules werd aangepast van He et al.9, maar in plaats van alginaat dat in de oorspronkelijke benadering werd gebruikt, werd een peg-gebaseerde hydrogel in de schaal opgenomen. We toonden voor het eerst succesvolle inkapseling en sferoïde vorming van primaire hepatocyten in core-shell microcapsules10 en meest recent beschreven inkapseling van hES- en iPS-cellen7. Zoals beschreven in figuur 1A, worden capsules vervaardigd in een stroomfocusapparaat waarbij de shell- en kernstroomstromen overgaan van zijwaartse naar co-axiale stroom voordat ze in de oliefase worden uitgeworpen. De kernstroom bevat cellen en additieven die de viscositeit van de oplossing verhogen (niet-reactieve PEG MW 35kD en iodixanol - handelsnaam OptiPrep), terwijl de shell-stroom reactieve moleculen (PEG-4-Mal) bevat. Continue co-axiale stroomstroom wordt gediscretiseerd in druppels die de core-shell-architectuur behouden. De kern-schilstructuur wordt permanent gemaakt door blootstelling aan di-thiol crosslinker (DTT), die reageert met PEG-4-Mal via klikchemie en resulteert in de vorming van een dunne (~ 10 μm) hydrogelhuid of -schaal. Nadat de emulsie is gebroken en capsules in een waterige fase zijn overgebracht, diffunderen moleculen van PEG uit de kern en worden vervangen door watermoleculen. Dit resulteert in waterige kern en hydrogel shell microcapsules.
Hieronder vindt u stapsgewijze instructies voor het maken van microfluïdische apparaten, het voorbereiden van cellen en het inkapselen van hPSC's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricage van apparaten
- Maak de ontwerpen voor het micro-inkapselingsapparaat en dissociatieapparaat met behulp van CAD-software10,11.
- Spin-coat de drie lagen SU-8 fotoresist sequentieel op een silicium wafer (figuur 2A) om structuren te bereiken met de gewenste hoogtes: 60, 100 en 150 μm.
OPMERKING: Het proces voor de bovenste en onderste mallen is identiek.- Spin coat een schone 10 cm silicium wafer met SU-8 2025 negatieve fotoresist bij 1.100 rpm om de eerste 60 μm laag te creëren. Na een zachte bak bij 65 °C gedurende 3 minuten en 95 °C gedurende 10 minuten op een hete plaat, belicht u de mal met behulp van een maskerloze aligner door het ontwerpbestand van het kernkanaalpatroon te uploaden naar de μPG 101 PC. Ga vervolgens verder met het bakken na blootstelling bij 65 °C gedurende 3 minuten en bij 95 °C gedurende 10 minuten.
- Spin coat de tweede SU-8 2025-laag (40 μm) bij 1.500 tpm en stel bloot door het juiste CAD-bestand voor het shellkanaalpatroon te uploaden.
OPMERKING: Zachte en post-exposure bakes waren vergelijkbaar met de vorige stap. - Spin de derde SU-8 2025-laag bij 1.400 tpm om een hoogte van 50 μm te bereiken en herhaal het bovenstaande proces, maar stel de structuren voor de oliefase bloot.
- Ontwikkel de mal met alle drie de lagen in één stap door onderdompeling in SU-8 developer totdat alle onbelichte fotoresist is verwijderd.
- Bak de vorm hard op een hete plaat bij 160 °C gedurende 10 minuten om de hechting te verbeteren en kleine scheuren af te dichten die na de ontwikkeling kunnen optreden.
- Stel de schimmel bloot aan chlorotrimethylsilaan om te voorkomen dat elastomeer zich in de volgende stap hecht en plaats het in petrischalen van 15 cm tot gebruik.
- Bereid de mal van het dissociatieapparaat op dezelfde manier voor, zoals beschreven in figuur 1D en figuur 2B. Spin coat een laag SU-8 fotoresist op een silicium wafer, zoals eerder beschreven in stap 1.2.3, om structuren te bereiken met de gewenste hoogte: 50 μm. Voer het zachte en na-blootstelling bakken, ontwikkelen en hard bakken op dezelfde manier uit als de vorige stap.
OPMERKING: Een reeks driehoekige palen bedekte de hele kamer, waarbij de afstand tussen de palen afnam naarmate de kamerbreedte afnam naar de uitlaat. Driehoekspalen waren 200 μm per zijde met een toonhoogte variërend van 400 μm (aan de inlaat) tot 30 μm (aan de uitlaat). - Bereid de mallen voor door zachte lithografie met polydimethylsiloxaan (PDMS).
- Meng PDMS-elastomeerbasis en elastomeeruithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 w/w in een planetaire centrifuge. Giet het mengsel op zowel micro-inkapselingsmastermallen als dissociatiemastermal om een laag van 3-4 mm te creëren.
OPMERKING: Een mengsel van 50 g elastomeerbasis met 5 g uithardingsmiddel is voldoende om een hoofdmal met een dikte van 3 mm te bedekken. - Plaats de petrischaaltjes met de mallen gedurende 15 minuten in een vacuümsiccator om het niet-uitgeharde PDMS te ontgassen.
- Zet de petrischaaltjes in een oven en bak minimaal 60 min op 80 °C.
- Haal de hoofdvormen uit de oven en laat ze afkoelen. Snijd met een precisiemes voorzichtig de PDMS volgens de vorm van de wafer en pel de PDMS-stukken uit de hoofdvorm.
- Knip de PDMS-platen uit door de randen van elk apparaat bij te snijden met een scalpel en pons vervolgens inlaat- / uitlaatvloeistofpoorten uit in het dissociatieapparaat en alleen in het bovenste microfluïdische apparaat met behulp van roestvrijstalen naalden. Bedek de apparaten met magische tape om besmetting te voorkomen.
OPMERKING: De naaldmeter is respectievelijk 14 G en 15 G voor inlaat- en uitlaatpoorten. - Behandel voor het verlijmen de patroonzijden van de bovenste en onderste PDMS-stukken met O2 plasma op een plasma-ets gedurende 2 minuten.
- Lijn beide PDMS-onderdelen uit onder een stereoscoop na toevoeging van een dunne scheidingslaag gedestilleerd water direct in de microkanalen (2 μL).
- Plaats het uitgelijnde PDMS-apparaat 's nachts in de oven bij 80 °C om de verlijming te voltooien en het PDMS in de oorspronkelijke hydrofobe staat te herstellen. Bewaar de apparaten tot verder gebruik.
OPMERKING: Dit resulteert in een coaxiaal flowfocusapparaat met drie verschillende hoogtes van 120 μm voor kern, 200 μm voor schaal en 300 μm voor oliekanalen. - Om het apparaat direct na de plasmabinding te gebruiken, injecteert u zorgvuldig maar stevig 30 μL hydrofobe coatingoplossing in de vloeistofkanalen om hydrofobe coating te bereiken. Spoel vervolgens onmiddellijk lucht in de kanalen totdat er geen residuen van de hydrofobe coatingoplossing in het apparaat worden waargenomen.
- Bind het dissociatieapparaat vast door eerst de patroonzijde van het apparaat en een gereinigd schuifglas gedurende 2 minuten met O2-plasma te behandelen en monteer ze vervolgens voor verdere uitharding in de oven bij 80 °C gedurende een nacht.
OPMERKING: Apparaten kunnen worden opgeslagen tot verder gebruik.
- Meng PDMS-elastomeerbasis en elastomeeruithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 w/w in een planetaire centrifuge. Giet het mengsel op zowel micro-inkapselingsmastermallen als dissociatiemastermal om een laag van 3-4 mm te creëren.
2. Bereiding van oplossingen
- Voorraadoplossingen. Bereid eerst stamoplossingen (geconcentreerde oplossingen) voor die worden verdund tot lagere concentraties voor daadwerkelijk gebruik.
OPMERKING: Voorraadoplossingen worden gebruikt om bereidingstijd te besparen, materialen te besparen, opslagruimte te verminderen en de nauwkeurigheid te verbeteren bij het bereiden van een werkoplossing in lagere concentraties.- Bereid 30 ml 2x-kernoplossing (16% PEG en 34% dichtheidsgradiëntmedia): meng 4,8 g 35 kDa PEG, 10,2 ml dichtheidsgradiëntmedia en 19,8 ml DMEM/F12-media. Filtreer deze kernoplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm.
- Bereid 50 ml minerale olie met 3% oppervlakteactieve stof: meng 48,5 ml minerale olie en 1,5 ml oppervlakteactieve stof. In steriele toestand bewaren na filtratie door een spuitfilter van 0,22 μm.
- Bereid 50 ml minerale olie met 0,5% oppervlakteactieve stof: meng 49,75 ml minerale olie en 0,25 ml oppervlakteactieve stof. In steriele toestand bewaren.
- Bereid 1 M Dithiotheritol (DTT): los 1,5425 g DTT op in gedestilleerd water van 10 ml. In steriele toestand bewaren.
- Bereid 1 M Triethanolamine (TEA): voeg 66,4 μL TEA toe in 433,6 μL gedestilleerd water. In steriele toestand bewaren.
- Bereid 1% Pluronic F127 (PF127): los 100 mg PF127 op in 10 ml gedestilleerd water. In steriele toestand bewaren.
- Werkende oplossingen
- Bereid een crosslinker-emulsie door 4,5 ml minerale olie te mengen met 3% oppervlakteactieve stof en 300 μl 1 M DTT (verhouding 1:15). Vortex de oplossing gedurende 2 minuten en soniceer gedurende 45-60 minuten in een ultrasoon bad bij 20 °C. Laad deze oplossing op een spuit van 5 ml met een naald van 27 G.
OPMERKING: Emulsie wordt gegenereerd door het ultrasoon maken van het olie/water mengsel. - Bereid de afschermende olieoplossing voor door de minerale olie met 0,5% oppervlakteactieve stof te laden op een spuit van 5 ml met een naald van 27 G.
- Bereid de shell (8% w/v PEG-4-Mal en 15 mM TEA) oplossing voor door 32 mg PEG-4-Mal toe te voegen in 400 μL 1x DPBS om 8% w/v oplossing te vormen, en vortex de oplossing gedurende 2 min. Voeg vervolgens 6 μL van 1 M TEA toe (eindconcentratie 15 mM TEA). Centrifugeer ten slotte gedurende 5 minuten bij 13.000 x g door een spinfilter en houd het gedurende 30 minuten in het donker op de rocker. Laad deze oplossing vervolgens op een spuit van 1 ml met een naald van 27 G.
OPMERKING: Laat de PEG-4-Mal-container 10 minuten op kamertemperatuur staan voordat u het deksel opent en blaas N2-gas om de O2 door N2 te vervangen voordat u het deksel sluit. Vortex TEA voordat u aan de oplossing toevoegt.
- Bereid een crosslinker-emulsie door 4,5 ml minerale olie te mengen met 3% oppervlakteactieve stof en 300 μl 1 M DTT (verhouding 1:15). Vortex de oplossing gedurende 2 minuten en soniceer gedurende 45-60 minuten in een ultrasoon bad bij 20 °C. Laad deze oplossing op een spuit van 5 ml met een naald van 27 G.
- Bereid de celsuspensie voor in de kernoplossing
- Behandel de hPSC's met trypsine gedurende 5 tot 10 minuten bij 37 °C. Verzamel ze vervolgens van borden. Doof de trypsine met het medium na celloslating en breng de cellen vervolgens over naar een conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer de bulkcelsuspensie (400 x g, 5 min). Zuig het supernatant voorzichtig op en suspend de celkorrel vervolgens met een minimaal volume groeimedium. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller.
OPMERKING: Typische cel aliquots bevatten 12-20 x 106 cellen en zijn voldoende om 400 μL van de kernoplossing te maken. - Neem 12-20 x 106 cellen uit de bulkcelsuspensie en centrifugeer de cel/media-suspensie (400 x g, 5 min).
- Aspirateer zorgvuldig media uit de celkorrel. Voeg vervolgens 200 μL media en 200 μL 2x PEG-oplossing toe (eindconcentratie 30-50 x 106 cel/ml) en meng voorzichtig.
OPMERKING: Lage celconcentraties (minder dan 20 x 106 cellen / ml) resulteerden in veel lege capsules. - Voeg 30 μL van 1% PF127 toe aan de oplossing.
- Steek een microroerderstaaf (2 mm x 7 mm) in een spuit van 1 ml en laad vervolgens de celbevattende kernoplossing met een naald van 27 G in de spuit. Houd de oplossing koud met ijs tijdens het hele inkapselingsproces.
3. Experimentele opstelling
- Plaats een gebonden PDMS-druppelapparaat, vier stuks van 20 cm lang en een stuk van 5 cm lange inlaatmicrobuizen (0,38 mm I.D. x 1,1 mm O.D.), één stuk van 10 cm uitlaatbuis (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.) en zes stuks van 0,5 cm fittingbuizen (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) onder een kiemdodende lichtbron (meestal ingebouwd in biologische veiligheidskasten) en steriliseer gedurende 30 Min.
- Gebruik een tang om de slang in de vloeistofinlaatpoorten en de dissociatiepoorten te plaatsen.
- Gebruik de drie stukken van 20 cm lange inlaatmicrobuizen voor de schaal, olie, crosslinker-emulsie-inlaten en één stuk voor de inlaat van het dissociatieapparaat. Breng vervolgens het andere uiteinde van de buisjes in de naald van de spuit met de bijbehorende oplossing. Verbind ondertussen de kerninlaat van het microfluïdische apparaat en de uitlaat van het dissociatieapparaat met één microbuis van 5 cm (figuur 1C).
OPMERKING: De microbuizen van de inlaat moeten stevig worden vastgezet in de fittingbuizen, die in de laatste stap zijn ingebracht. - Steek één uitlaatbuis in de vloeistofuitlaatpoort en plaats het andere uiteinde in een opvangreservoir.
- Plaats het apparaat op een microscooptrap en bevestig de slang om beweging te voorkomen. Lijn en richt de microscoop op het mondstuk van het apparaat voor stroominspectie.
- Plaats elke spuit op verschillende spuitpompen en zet goed vast (figuur 1B). Programmeer elke pomp volgens de protocollen van de fabrikant volgens de volgende stroomsnelheden: kern (3-5 μL / min), shell (3-5 μL / min), afschermingsolie (20-80 μL / min) en crosslinking-olie (40-60 μL / min). Start de stroom in alle pompen.
- Wacht tot elke vloeistof het apparaat binnenkomt en vul de kanalen terwijl u de resterende lucht naar buiten duwt.
OPMERKING: Als er een grote hoeveelheid lucht in de inlaatbuis zit, verhoog dan tijdelijk elk debiet totdat de lucht volledig is verwijderd. Houd er rekening mee dat een te hoog debiet kan leiden tot pdms-naar-PDMS-bindingsfouten. - Wanneer de capsulevorming is gestabiliseerd (figuur 3), plaatst u het andere uiteinde van de opvangbuis in een nieuwe conische buis met 5 ml mTeSR-media.
OPMERKING: De media bevatten 10 μM ROCK-remmer, 100 E / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine. - Nadat een voldoende aantal capsules is verzameld, incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 10 minuten. Capsules die zich in de oliefase bevinden, bevinden zich aan de bovenkant van de buis (zie figuur 4A). Zachtjes tikken op de buis zorgt ervoor dat capsules naar de bodem bezinken. Hierna kan het grootste deel van de olie en media worden aangezogen.
- Verzamel de capsules van de bodem van de conische buis, plaats ze op een celzeef (poriegrootte van 100 μm) en was ze met overvloedige hoeveelheden media. Verzamel vervolgens microcapsules met behulp van 2 ml media in een 6-well cultuurplaat door de media door het filter te laten lopen terwijl het omgekeerd is bovenop de putplaat (zie figuur 4A).
4. hPSC-cultuur en analyse in microcapsules
- Basiscultuur
- Incubeer de stamcelcapsules in een 6-wells bordkweekschaal bij 37 °C met 5% CO2.
- Vervang de media om de dag door de capsules op een celzeeffilter te verzamelen, ze te wassen met overtollige media en ze opnieuw te besteden aan een nieuwe put in 6-putplaten met 2 ml media zoals werd gedaan in stap 3.10.
- Kweek de capsules gedurende ten minste 10 dagen.
- Voer de levend/dood-test uit om de levensvatbaarheid van ingekapselde stamcellen te bepalen.
- Ontdooi levend/dood assay oplossingen (ethidium homodimer-1 en calceïne AM).
- Voeg 4 μL van de 2 μM ethidium homodimeer-1 en 1 μL van de 4 μM calceïne AM-oplossingen toe aan 2 ml steriele DPBS. Vortex om een volledige menging te garanderen.
- Verzamel ongeveer 100 microcapsules op een celzeef en spoel ze af met steriele DPBS om diffusie van medium uit de capsules mogelijk te maken.
- Verzamel ze opnieuw op een kweekplaat met 12 putten met behulp van 1 ml van de in stap 4.2.2 bereide oplossing. Incubeer bij 37 °C gedurende 20 min.
- Visualiseer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop.
OPMERKING: De levensvatbaarheid van cellen wordt gekwantificeerd door het percentage levende cellen te berekenen, dat als groen wordt gevisualiseerd, onder het totale aantal cellen.
- Karakterisering van de sferoïde grootte.
- Plaats desgewenst de putplaat met microcapsules onder de microscoop en meet de diameter van de sferoïden die op de bijbehorende software worden weergegeven met de juiste schaalstaven.
- Meet en analyseer de sferoïde grootte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door het bovengenoemde protocol te volgen, kan de lezer microfluïdische apparaten fabriceren en celdragende microcapsules produceren. Figuur 3A toont voorbeelden van optimale en suboptimale microcapsules vervaardigd met behulp van microfluïdische druppelgeneratie. Verschillende formuleringen van PEG-4-Mal resulteerden in capsules met verschillende morfologieën - gerimpelde capsules werden geassocieerd met slechte gelation, lage mechanische integriteit en waren niet bestand tegen teelt in een geroerde bioreactor. Gladde capsules waargenomen bij PEG-gehalte van >6% vertegenwoordigden de gewenste capsulemorfologie en waren robuust genoeg voor celkweek. De kern-schilstructuur werd bevestigd door de opname van microbeads in de kern en fluorescerende moieties in de schaal van microcapsules. Aggregatie van kralen in het midden van de capsules zoals te zien in figuur 3B werd gebruikt als indicatie dat de kern waterig was en de kralen vrij waren om te bewegen. Fluorescerende annulus waargenomen in figuur 3C duidde op de aanwezigheid van een hydrogelschaal en werd gebruikt om de dikte van de schaal te bepalen. We raden gebruikers aan microbead-integratie en fluorescerende etikettering te gebruiken in de vroege stadia van het inkapselingsproces.
Zodra het inkapselingsproces is vastgesteld, kan men overgaan tot inkapseling van hPSC's. Hoewel dit protocol de inkapseling van H9-cellen beschrijft, hebben we een vergelijkbare strategie gebruikt voor het inkapselen van een andere hESC-lijn (HUES-8) en een iPSC-lijn (1016). 7
Hoewel inkapseling kan worden uitgevoerd met alleen het inkapselingsapparaat, merkten we op dat hPSC's de neiging hadden om in het systeem te klonteren, wat resulteerde in niet-uniforme inkapseling of capsulebezetting. Om deze uitdaging aan te gaan, hebben we een dissociatie- of filtratieapparaat ontworpen en vóór het inkapselingsapparaat geplaatst. Deze dissociatie-inrichting bestond uit een stroomkanaal met een reeks driehoekige palen gemeten 200 μm per zijde en met een toonhoogte variërend van 400 μm bij de inlaat tot 30 μm aan de uitlaat, zodat klonten worden vastgehouden of gebroken voordat ze het inkapselingsapparaat betreden (zie figuur 1D)7. Het gebruik van het dissociatieapparaat maakt het mogelijk om de uniformiteit van sferoïden aanzienlijk te verbeteren en de celbezetting van capsules te verhogen van 57% tot >90% 7.
Figuur 4B,C beschrijft representatieve resultaten van een inkapselingsrun. Zoals te zien is op deze beelden, hebben H9-cellen een hoge levensvatbaarheid met een levensvatbaarheid van >95% die routinematig wordt bereikt tijdens de inkapselingsruns. We vergeleken de groeisnelheid (zie figuur 4B,C) en het differentiatiepotentieel van ingekapselde versus niet-ingekapselde sferoïden7 en stelden vast dat het proces van inkapseling geen nadelige effecten heeft op hPSC's. Aan de andere kant zijn er verschillende voordelen aan het inkapselen van hPSC's. Ingekapselde sferoïden zijn gemakkelijk te hanteren en kunnen worden verstrekt / gedistribueerd in microtiterplaten voor het ontwikkelen van differentiatieprotocollen of het testen van therapieën. Ons lab is geïnteresseerd in het gebruik van microcapsules als stamceldragers voor suspensieteelt in geroerde bioreactoren en heeft aangetoond dat hydrogel shell bescherming biedt tegen afschuifschade in dergelijke culturen7. Dit is een extra weg die door ons wordt gevolgd bij het creëren van bioactieve microcapsules waarbij hydrogel-schaal kan worden geladen met groeifactoren voor lokale en continue afgifte van inductieve signalen tijdens differentiatie.
Figuur 1: Fabricage van core-shell microcapsules. (A) Het microfluïdische apparaat voor het genereren van capsules bestaat uit vier inlaatkanalen (core, shell, olie en crosslinkerolie) en een serpentijnkanaal dat leidt naar een verzamelbuis. Het apparaat is zodanig vervaardigd dat kern-, schaal- en oliekanalen respectievelijk 120 μm (H1), 200 μm (H2) en 300 μm (H3) hoog zijn. De inzet vertegenwoordigt een dwarsdoorsnede bij het mondstuk - de kruising tussen waterige en oliestromen. Deze dwarsdoorsnede is 90° gekanteld om de lezer een beter zicht op coaxiale stroomkanalen te geven. Een 3D-weergave van het kern-shell microcapsule fabricageproces laat zien hoe de coaxiale stroom wordt gegenereerd stroomopwaarts van de flow-focusing junction om core-shell microcapsule structuur te produceren. Emulgering wordt bereikt door waterige druppels bloot te stellen aan twee oliestromen, waarvan de eerste is ontworpen om de druppels te stabiliseren en de tweede om de crosslinker DTT te leveren, die reageert met PEG-4-Mal. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie12. Copyright 2019, Amerikaanse chemische vereniging. (B) Experimentele opstelling van het inkapselingssysteem met vermelding van de locaties van spuitpompen, slangen, microfluïdische apparaten en van de capsule-opvangbuis. (C) Een afbeelding van het inkapselingssysteem, dat bestaat uit dissociatie- en inkapselingsinrichtingen in een reeks. D) Ontwerp van het microfluïdische dissociatieapparaat dat wordt gebruikt om te voorkomen dat grote celaggregaten in een micro-inkapselingsinrichting terechtkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fabricage van microfluïdische apparaten die worden gebruikt voor inkapseling. (A) Fabricage van het inkapselingsapparaat. Drie lagen SU-8 fotoresist werden gespind en met een fotopatroon om kern-, schaal- en oliekanalen met verschillende hoogtes te genereren. Kernkanalen hebben een breedte van 220 μm die op de capsuleverbinding versmalt tot 135 μm. Kanalen voor alle fasen volgen hetzelfde principe: shell- en oliekanalen beginnen met een breedte van 500 μm, versmallen op de kruising tot 220 μm en afschermingsolie begint bij 500 μm en versmalt tot 270 μm. Uitlaat serpentijn heeft een breedte van 1,5 mm en een lengte van ~ 55 mm. Boven- en onderkant werden PDMS-stukken vervolgens uitgelijnd en plasma gebonden. (B) Fabricage van de dissociatie-inrichting. Eén laag SU-8 fotoresist was spin-coated en fotopatroon om dissociatiekanalen te genereren. PDMS-stuk werd vervolgens plasma gebonden met glasplaat. Dissociatie-apparaat bestaat uit een kleine kamer met een hoogte van 30 μm, lengte van 16,5 mm en breedte van 5 mm bij de inlaat en 1, 7 mm bij de uitlaat. Het heeft driehoekige structuren (200 μm, gelijkzijdig) die van elkaar gescheiden zijn door 420 μm van de inlaat en dichter bij de weg naar de uitlaat komen, met een scheiding van 50 μm in de laatste rij. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van microcapsules. (A) Verschillen in capsulemorfologie als functie van peg-4-mal-gehalte in de schaal. Gladde capsules met heldere randen worden geassocieerd met de gewenste mechanische integriteit. (B) Bevestiging van waterige kern van de microcapsules. Ingesloten microbeads zijn vrij om te bewegen in de waterige kern en aggregeren in het midden van microcapsules. (C) Bevestiging van de kern-schaalstructuur door rhodamine B-gelabelde PEG op te nemen in de schaal van microcapsules. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Inkapseling van hPSC's. (A) Microcapsules in de oliefase worden verzameld in een conische buis gevuld met media. Nadat microcapsules zijn gemaakt om naar de bodem van de buis te bezinken, worden olie en media aangezogen, microcapsules worden gewassen en vervolgens overgebracht naar een 6-well plaat voor de teelt. (B) Levende/dode kleuring 6 uur na het inkapselen van H9-cellen. Bovenste afbeelding werd genomen met 10x en onderste afbeelding met 20x. (C) Afbeeldingen waarin sferoïdegroottes worden vergeleken die in de loop van de tijd veranderen voor H9-cellen in capsules en in commerciële 3D-kweekplaten (onderste afbeeldingen). (D) Kwantificering van de sferoïdediameter die toeneemt voor hPSC's in microcapsules en in standaard 3D-kweekplaten gedurende 7 dagen in H9-media. Statistische analyse -t-test, p < 0,05, n = 20. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven inkapselingsproces resulteert in reproduceerbare vorming van hPSC-sferoïden. Het microcapsule-formaat maakt het gemakkelijk om sferoïden in putten van een microtiterplaat te doseren voor experimenten gericht op het verbeteren / optimaliseren van differentiatieprotocollen of het testen van therapieën. Ingekapselde stamcelsferoïden kunnen ook worden gebruikt in suspensieculturen waar hydrogelschaal cellen beschermt tegen door afschuiving veroorzaakte schade7.
Er zijn verschillende kritieke stappen binnen het protocol. Het is belangrijk om de stroomsnelheden van kern-, shell- en oliestromen binnen het bereik te houden dat wordt beschreven in de sectie Protocol. Als het debiet van de schaal te laag is, wordt de stroom onstabiel, wat resulteert in vervormde en mechanisch onstabiele capsules. Een succesvolle celinkapseling moet lijken op de microcapsules in figuur 4C. Microcapsules moeten een vergelijkbare diameter hebben en een vergelijkbaar aantal cellen in de kern hebben. Aggregatie van afzonderlijke cellen tot sferoïden vindt meestal plaats binnen 48 uur en gebrek aan sferoïdevorming bij 72 uur is een waarschuwingssignaal. Een reden voor het ontbreken van sferoïdevorming kan zijn dat viskeuze moleculen in de kern niet snel genoeg uitlogen door de hydrogelschil. We kwamen dit scenario tegen bij het aanpassen van de viscositeit van de kernoplossing met behulp van polymeren met een hoog molecuulgewicht, zoals carboxymethylcellulose (MW 250 kD). Men kan microbeads inkapselen (zie figuur 3B) om te testen of deze celgrote objecten vrij zijn om door de kern te bewegen en hoe snel componenten van de kern uitlogen. Gebrek aan sferoïde vorming werd ook door ons aangetroffen bij het gebruik van PEG-4-Mal-concentraties van >8% w / v. In dit scenario zijn porositeit en diffusiviteit van de hydrogelschil verminderd en lekken elementen met een hoge viscositeit in de kern niet snel genoeg uit om cellen tot aggregaten te laten vormen. Het is denkbaar dat de kwaliteit van PEG-4-Mal kan verschillen van batch tot batch of fabrikant. Daarom kan enige aanpassing van de polymeerconcentratie in de schaal nodig zijn. Nogmaals, de methode voor het incorporeren van kralen moet onthullen hoe snel viskeuze componenten in de kern worden verplaatst door watermoleculen. In onze ervaring zou dit moeten gebeuren binnen 3 uur na het overbrengen van microcapsules in de waterige omgeving.
Het hier beschreven inkapselingsprotocol heeft goed gewerkt voor verschillende hPSC-lijnen7, primaire hepatocyten10 en meerdere kankercellijnen (ongepubliceerde resultaten). We ondervonden echter problemen bij het vormen van sferoïden na inkapseling van stamcellen afgeleide (sc) -hepatocyten en sc-β-cellen. Probleemoplossing met ingekapselde microbeads onthulde dat viskeuze componenten snel uit de kern werden geëlueerd en dat cellen vrij waren om te bewegen en cel-celcontacten te vormen. Aanvullende probleemoplossing betrof het titreren van de concentratie van di-thiol crosslinker DTT (aanwezig in de oliefase) van 66 mM naar 10 mM. Sferoïde vorming voor sc-hepatocyten en β-cellen trad op bij deze lagere concentratie DTT. Daarom kan de gebruiker overwegen om de concentratie van crosslinkers te optimaliseren, maar alleen als andere bovenstaande stappen voor probleemoplossing niet succesvol zijn geweest. We vinden dat DTT-concentratie van cruciaal belang is voor het behoud van de mechanische integriteit van microcapsules met 66 mM DTT, wat resulteert in mechanisch robuuste microcapsules en niet-toxisch is voor de overgrote meerderheid van de celtypen die tot nu toe zijn gebruikt.
Een aantal strategieën voor het maken van 3D-stamcelconstructies zijn beschreven in de literatuur. De voordelen van het vormen van stamcelconstructies in kern-shell microcapsules zijn meervoudig. Eenmaal ingekapseld, kunnen sferoïden gemakkelijk worden behandeld met hydrogelcapsules die bescherming bieden tegen afschuifschade. Ingekapselde sferoïden kunnen in suspensie worden gekweekt met krachtige agitatie zonder stamcellen te beschadigen.
Er zijn meerdere mogelijkheden om de mogelijkheden van microcapsules uit te breiden. Ons team heeft eerder het gebruik van heparine-bevattende hydrogels beschreven voor inkapseling van hepatocyten en stamcellen 8,12, en ontwikkelt momenteel heparine-bevattende bioactieve kern-shell microcapsules die dienen als depots voor opslag en lokale afgifte van inductieve signalen (GFs) aan stamcellen. Dergelijke microcapsules kunnen helpen het gebruik van dure GF's te verminderen en tegelijkertijd de differentiatieresultaten te verbeteren. Microcapsules kunnen verder worden verbeterd door ECM-eiwitten in de kern op te nemen, waardoor de micro-omgeving van stamcellen wordt gemoduleerd. Core-shell microcapsules kunnen afbreekbaar worden gemaakt om het gemakkelijker te maken om hPSC-sferoïden op te halen13,14. Over het algemeen vertegenwoordigen core-shell microcapsules een platformtechnologie die kan worden aangepast en verbeterd om tegemoet te komen aan de behoeften van een specifiek stamceldifferentiatieprotocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de subsidies van het Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) en NIH (DK107255).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
