Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Стереотаксическая вирусная инъекция и имплантация линз с градиентным индексом для глубокой визуализации кальция in vivo

Published: October 8, 2021 doi: 10.3791/63049
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Zoology and Physiology, University of Wyoming, 2School of Electrical Engineering & Computer Science, University of North Dakota, 3Department of Mathematics and Statistics, University of Wyoming

ERRATUM NOTICE

Summary

Минископ in vivo кальциевая визуализация является мощным методом для изучения динамики нейронов и микросхем у свободно ведущих себя мышей. Этот протокол описывает выполнение операций на головном мозге для достижения хорошей визуализации кальция in vivo с использованием минископа.

Abstract

Миниатюрный флуоресцентный микроскоп (минископ) является мощным инструментом для визуализации кальция in vivo от свободно ведущих себя животных. Он предлагает несколько преимуществ по сравнению с обычными многофотонными системами визуализации кальция: (1) компактный; 2) легкие; 3) доступные; и (4) позволяет вести запись от свободно ведущих себя животных. Этот протокол описывает операции на головном мозге для глубокой визуализации кальция in vivo с использованием специально разработанной системы записи минископа. Процедура подготовки состоит из трех этапов, включая (1) стереотаксическое введение вируса в желаемую область мозга мыши для маркировки определенной подгруппы нейронов генетически закодированным датчиком кальция; (2) имплантация линзы с градиентным индексом (GRIN), которая может передавать изображение кальция из глубокой области мозга в систему минископа; и (3) прикрепление держателя минископа к черепу мыши, где минископ может быть прикреплен позже. Для выполнения визуализации кальция in vivo минископ крепится к держателю, и нейронные изображения кальция собираются вместе с одновременными записями поведения. Настоящий протокол операции совместим с любыми коммерческими или специально созданными однофотонными и двухфотонными системами визуализации для глубокой визуализации мозга in vivo кальцием.

Introduction

Внутриклеточная передача сигналов Ca2+ является важным регулятором роста клеток, пролиферации, дифференцировки, миграции, транскрипции генов, секреции и апоптоза1. В нейронах передача сигналов Ca2+ точно контролируется, поскольку ее пространственно-временная картина связана с важнейшими функциями, такими как возбудимость мембраны, высвобождение нейротрансмиттера и синаптическая пластичность2.

Визуализация кальция in vivo является мощным методом, который может быть использован для декодирования элементального представления нейронной цепи для нормального поведения животных, выявления аберрантной нейронной активности в животных моделях расстройств головного мозга и разгадки потенциальных терапевтических целей, которые могут нормализовать эти измененные схемы. Двумя распространенными системами визуализации кальция in vivo являются двухфотонная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия 3,4,5,6 и головная миниатюрная микроэндоскопия (минископ)7,8,9,10,11,12,13 . Обычная двухфотонная микроскопия предлагает такие преимущества, как лучшее разрешение, более низкий уровень шума и более низкое фотоотбеливание; тем не менее, экспериментальные животные должны быть зафиксированы головой, ограничивая исследования поведения, которые могут быть выполнены 3,4,5,6. Напротив, головная минископическая система является небольшой и портативной, что позволяет изучать широкий спектр поведенческих тестов с использованием свободно ведущих себя животных 7,8,9,10,11,12,13.

Есть два ведущих индикатора Ca2+, химические показатели 5,14 и генетически закодированные показатели кальция (GECI)15,16. Визуализация Ca2+ была облегчена за счет использования высокочувствительных GECI, доставленных с вирусными векторами, которые позволяют специфическую маркировку нейронов в целевой цепи. Постоянные усилия по повышению чувствительности, долговечности и способности маркировать даже субклеточные компартменты делают GECI идеальными для различных исследований визуализации кальция in vivo 17,18,19.

Рассеяние света в ткани мозга во время визуализации ограничивает глубокое оптическое проникновение, даже при двухфотонной микроскопии. Тем не менее, линза Gradient Index (GRIN) преодолевает эту проблему, поскольку линза GRIN может быть непосредственно встроена в биологические ткани и передавать изображения из глубокой области мозга на объектив микроскопа. В отличие от обычной линзы, изготовленной из оптически однородного материала и требующей сложной формы поверхности для фокусировки и создания изображений, характеристики объектива GRIN основаны на постепенном изменении показателя преломления в материале линзы, которое достигает фокусировки с плоской поверхностью20. Объектив GRIN может быть изготовлен диаметром до 0,2 мм. Таким образом, миниатюрная линза GRIN может быть имплантирована в глубокий мозг, не причиняя слишком большого ущерба.

В этой статье представлен полный протокол операции для глубокой визуализации мозга in vivo кальцием. Для демонстрационной цели мы описываем операции на головном мозге, специально нацеленные на медиальную префронтальную кору (mPFC) мозга мыши и запись визуализации кальция in vivo с помощью специально разработанной системы минископа, разработанной группой доктора Лина в Национальном институте по злоупотреблению наркотиками (NIDA / IRP) 7,12. Экспериментальная процедура включает в себя две крупные операции на головном мозге. Первая операция заключается в стереотаксическом введении вирусного вектора, экспрессирующего GCaMP6f (GECI) в mPFC. Вторая операция заключается в имплантации хрусталика GRIN в ту же область мозга. После восстановления после этих операций на головном мозге последующая процедура заключается в прикреплении держателя минископа (основания) к черепу мыши с помощью зубного цемента. In vivo Визуализация Ca2+ может быть выполнена в любое время после установки минископа на его основание. Хирургический протокол для вирусных инъекций и имплантации линз GRIN совместим с любыми коммерческими или специально созданными однофотонными и двухфотонными системами визуализации для глубокой визуализации мозга in vivo кальция.

Protocol

Экспериментальный протокол следует рекомендациям по уходу за животными Университета Вайоминга. Мышь, используемая в этом исследовании, является 6-месячным самцом C57BL/6J. Процедура может быть использована для нацеливания на любые глубокие области мозга для визуализации кальция in vivo . Здесь, для демонстрации, целевой областью мозга является мышь mPFC (передняя и задняя (A / P): 1,94 мм, медиальная и латеральная (M / L): 0,5 мм, дорсальная и вентральная (D / V): 1,8 мм). Этот протокол модифицирован на основе ранее опубликованного протокола21.

1. Стереотаксическая инъекция вируса в mPFC (рисунок 1)

  1. Подготовка к операции
    1. Стерилизуйте все хирургические инструменты с помощью автоклава и поместите их на стерильную поверхность.
    2. Подготовьте шприц объемом 10 мкл, заправив его физиологическим раствором и предварительно засыпав 5 мкл физиологического раствора. Прикрепите шприц к микронасосу (см. Таблицу материалов).
    3. Включите грелку и поддерживайте температуру на уровне 35 °C.
  2. Поместите мышь в индукционную камеру (5" x 10" x 4", длина x ширина x высота) с 5% изофлурана и скоростью потока кислорода 1 л/мин. Внимательно следите и подсчитывайте частоту дыхания мыши. Выньте мышь, как только ее частота дыхания уменьшится до 1 вдоха / с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частоту дыхания мыши можно легко контролировать, наблюдая за движением мышц спины вниз и вверх во время каждого вдоха.
  3. Позвольте мыши расположиться на настольной области, отделенной от хирургической области. С помощью машинки для стрижки для бритья сбрите волосы от головы мыши до первых шейных позвонков.
  4. Поместите мышь на стереотаксическую сцену (см. Таблицу материалов) и закрепите ее положение с помощью ушных вкладышей и носового зажима. Поддерживать поступление изофлурана в стереотаксическую стадию при 1,5% изофлурана и 0,5 л/мин скорости потока кислорода.
  5. Нанесите смазывающую офтальмологическую глазную мазь на оба глаза чистым ватным тампоном, чтобы предотвратить сухость глаз во время операции. Оцените педальные рефлексы на мыши, чтобы подтвердить, что мышь полностью обезболена перед началом операции.
  6. Дезинфицируйте безволосую область 7,5% раствором повидона-йода (см. Таблицу материалов) и 70% этанолом три раза каждый с помощью стерильных ватных тампонов.
  7. Вводят небольшой объем (50 мкл) 2% лидокаина под кожу безволосой области.
  8. Сделайте разрез 2 см через кожу вдоль средней линии с помощью скальпеля, чтобы обнажить лямбду и брегму черепа.
  9. Удалите фасцию с черепа с помощью сухих ватных тампонов и заостренных щипцов.
  10. После того, как брегма и лямбда видны, используйте кончик зубного бормашины (диаметром 0,5 мм) для измерения Z-координат брегмы и лямбды (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте высоту держателя носа до тех пор, пока брегма и лямбда не окажутся в одном положении Z.
  11. Расположите зубной бурильщик диаметром 0,5 мм в положении A/P: 1,94 мм, M/L: 0,5 мм от брегмы. Просверлите череп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, для демонстрации, целевой областью мозга является mPFC мыши. Этот протокол может быть использован для нацеливания на любую другую глубокую область мозга. Например, если целевой областью мозга является Прилежащее ядро (NAc), соответствующая позиция должна быть A/P: 0,9 мм, M/L: 1,2 мм.
  12. Удалите твердое тело с помощью наконечника иглы весом 30 г и очистите все куски костного мусора с помощью острых щипцов под углом 45°.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кровотечение распространено, так как мелкие кровеносные сосуды могут быть разорваны во время этапа очистки. Используйте стерильные ватные тампоны, чтобы остановить кровотечение, и нанесите физиологический раствор для мытья области. Нанесите физиологический раствор на открытую область черепа, чтобы сохранить его влажным.
  13. Загрузите вирус в шприц микролитра с помощью панели управления микронасосом. Вывести 500 нл воздушного пузыря, а затем 800 нл вируса со скоростью потока 50 нл/с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для демонстрационных целей здесь в mPFC вводится аденоассоциированный вирус серотипа 1 (AAV1), экспрессирующий GCaMP6f (GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f (см. Таблицу материалов). Титр вируса составляет 2,8 х 1013 ГК/мл. Его 1:2 разводят в физиологическом растворе перед инъекцией.
  14. Поместите кончик иглы на верхнюю часть брегмы, чтобы просто коснуться брегмы, и запишите Z-координату брегмы. Переместите иглу над просверленным отверстием и введите 100 нл вируса, чтобы убедиться, что игла не засорена.
  15. Медленно переместите иглу в мозговую ткань к целевой Z-координате D/V: 1,75 мм, а затем слегка переместите ее вверх до Z-координаты D/V: 1,65 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для создания небольшого кармана для введения вирусного раствора. Если целевой областью мозга является NAc, то соответствующая целевая Z-координата D/V должна составлять 4,2 мм, а затем слегка переместиться до 4,1 мм.
  16. Используйте панель управления, чтобы настроить микронасос на впрыскивание 500 нЛ вируса со скоростью потока 50 нЛ/мин. Нажмите кнопку RUN на панели управления, чтобы внедрить вирус.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция займет около 10 минут. После того, как инъекция закончится, подождите еще 5-10 минут, прежде чем вынимать иглу из мозга. Часто применяйте физиологический раствор, чтобы держать открытую область черепа влажной в период инъекции.
  17. Переместите иглу вверх и из мозга. Впрыскивание 500 нЛ объем дважды при скорости потока 50 нЛ/с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг подтверждает, что надлежащий объем вируса был введен в мозг. Во время первых инъекций 500 нЛ вирус высвобождается, за которым следуют пузырьки воздуха. Во время второй инъекции 500 нЛ сначала появляются пузырьки воздуха, а затем физиологический раствор. Теперь шприц готов загрузить вирус для следующей мыши. После операции шприц и игла микролитра тщательно очищаются ацетоном, а затем физиологическим раствором.
  18. Выровняйте края кожи и аккуратно закройте разрез швом (размер 4,0). Нанесите антибиотическую мазь на область шва, чтобы предотвратить инфекцию.
  19. Выньте мышь из стереотаксической стадии и верните ее в домашнюю клетку. Поместите домашнюю клетку в инкубатор при температуре 33 °C до тех пор, пока мышь не станет амбулаторной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мыши требуется 10-15 минут, чтобы проснуться от изофлурановой анестезии, прежде чем она начнет двигаться.
  20. После того, как мышь начнет двигаться, вводят нестероидные противовоспалительные препараты в течение 3 послеоперационных дней (см. Таблицу материалов). Дайте мыши восстановиться после операции в течение 14 дней, прежде чем проводить имплантацию хрусталика GRIN.

2. Имплантация хрусталика GRIN в mPFC (рисунок 1)

  1. Подготовка к операции
    1. Готовят искусственную спинномозговую жидкость (ACSF), содержащую 124 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 1,2 мМ MgCl2, 25 мМ глюкозы, 26 мМ NaHCO3 и 2,4 мМ CaCl2.
    2. Стерилизуйте все хирургические инструменты с помощью автоклава и поместите их на стерильную поверхность.
    3. Включите грелку и поддерживайте температуру на уровне 35 °C.
    4. Растопить 1% агарозы и держать на водяной бане при 42 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расплавленную агарозу можно держать на водяной бане в течение нескольких часов.
    5. Продезинфицируйте линзу GRIN (диаметром 1 мм, длиной 4,38 мм, рисунок 2A) в 70% этаноле в течение 15 минут, переложите ее в трубку, заполненную физиологическим раствором, чтобы правильно промыть ее перед имплантацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы GRIN (см. Таблицу материалов) производятся путем серебряного и литий-ионного обмена в специальных стеклах, что делает их нетоксичными и дружественными к нейронам 6,7. Тем не менее, многие коммерчески доступные линзы GRIN могут выщелачивать токсичные остатки, вызывая нейродегенерацию, что делает их непригодными для имплантации в живой мозг для долгосрочных исследований визуализации in vivo. Эти линзы GRIN могут потребовать покрытия биосовместимыми агентами, такими как парилен-С, для предотвращения токсических побочных эффектов на соседние нейроны22.
  2. Взвешивают мышь и обезболивают ее внутрибрюшинной инъекцией смеси кетамина/ксилазина (см. Таблицу материалов) (кетамин: 100 мг/кг; Ксилазин: 15 мг/кг).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши весом 30 г требуется 300 мкл смеси кетамина/ксилазина (кетамин 100 мг/мл и ксилазин 1,5 мг/мл) для начальной дозы и 150 мкл кетамина (10 мг/мл) для дополнительных доз во время операции. Чтобы мышь оставалась обезболенной в течение всего хирургического процесса, необходимо вводить дополнительные дозы кетамина (50 мг/кг) не реже одного раза в час. Стадия анестезии мыши должна часто контролироваться путем оценки педальных рефлексов.
  3. Сбрите волосы с хирургической области бритвой и очистите волосы с помощью влажного бумажного полотенца.
  4. Поместите мышь в стереотаксическую стадию и закрепите ее положение, затянув зажим для носа и ушные вкладыши. Нанесите смазывающую офтальмологическую глазную мазь на оба глаза стерильным ватным тампоном. Убедитесь, что мышь полностью обезболена, оценив педальные рефлексы.
  5. Продезинфицируйте безволосую область 7,5% раствором повидона-йода и 70% этанолом три раза каждый, используя стерильные ватные тампоны. Вводите 2 мг / кг дексаметазона внутримышечно в бедро, чтобы снизить риск отека и воспаления, связанных с хирургическим вмешательством.
  6. Вводят 50 мкл 2% Лидокаина под кожу области операции.
  7. Используйте тонкие ножницы, чтобы иссечь треугольную область кожи размером 1,5 см (высота) x 1,0 см (основание), от передней стороны между глазами до задней стороны позади лямбды.
  8. Удалите ткань надкостницы из черепа с помощью тонких щипцов, микролопастей и ватных тампонов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Череп должен быть тщательно очищен и высушен, прежде чем приступать к следующему шагу.
  9. Нанесите цианоакрилат (см. Таблицу материалов) на края кожи и прикрепите кожу к черепу. Подождите 5 мин, пока цианоакрилат не высохнет.
  10. С помощью наконечника бурового заусенца диаметром 0,5 мм выровняйте брегму и лямбду в одной горизонтальной плоскости, отрегулировав высоту носового зажима.
  11. Расположите бормашину (диаметром 1,2 мм) в положение A/P: 1,94 мм, M/L: 0,8 мм от брегмы. Просверлите череп. Удалите твердое тело с помощью наконечника иглы весом 30 г и очистите все куски костного мусора с помощью острых щипцов под углом 45°.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот костный мусор может блокировать последующую стадию аспирации, если не удалить полностью.
  12. Прикрепите вручную отполированную тупостороннюю иглу 27 G (рисунок 2B) к держателю иглы, соединенному с роботизированной рукояткой, наклоненной под углом 10° (рисунок 2C). Подключите другой конец игольчатого держателя к домашней вакуумной системе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Роботизированная рука (см. Таблицу материалов) разработана группой доктора Лина в NIDA/IRP и управляется специально разработанным программным обеспечением открытого доступа AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23
  13. Найдите кончик иглы, чтобы просто коснуться брегмы. Установите Z-координату брегмы в 0, нажав на кнопку Bregma на AutoStereota.
  14. Установите входное значение X равным 0,8, входное значение Y 1,94, входное значение Z равным 1,0, затем нажмите кнопку «Найти», чтобы переместить иглу на верхнюю часть просверленного отверстия на черепе.
  15. Отрегулируйте положение иглы к центру открытой области мозговой ткани с помощью AutoStereota.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы переместить иглу в боковом или медиальном направлении, введите значение Шага и нажмите боковые или медиальные кнопки на AutoStereota. Аналогично, чтобы переместить иглу в переднем или заднем и дорсальном или вентральном направлениях, нажмите на ростральные или каудальные и дорсальные или вентральные кнопки соответственно.
  16. Включите вакуум и начните промывать открытую область мозга с помощью ACSF через систему трубок с гравитационной системой (см. Таблицу материалов), подключенную к игле 30 G с изогнутым наконечником. ACSF непрерывно пузырится с газовой смесью 95% O2 и 5% CO2 и фильтруется через фильтр 0,2 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расход ACSF составляет ~ 1,5 мл/мин. Выходное давление газовой смеси поддерживается на уровне ~3 psi.
  17. Аспирация мозговой ткани слой за слоем с помощью программного обеспечения AutoStereota (Рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация мозговой ткани завершается в 4 раунда таким образом, чтобы образовался карман колонны (1,8 мм в глубину и 1 мм в диаметре).
    1. В сеансе "zStep" щелкните и проверьте первую и вторую строки. Задайте значения для первой строки равными 0,2 и 1. Установите значения для второй строки в 0,15 и 4 (рисунок 3A).
    2. В сеансе "Режим" установите Размер иглы 27 Калибр и 1.2, установите Dims 0.9. Все остальные значения используют значения по умолчанию (рисунок 3A).
    3. Последовательно нажмите кнопки Set, Keep Zero и Start , чтобы начать стремление.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это1-й раунд стремления. Входные значения указывают на то, что глубина аспирации составляет 0,2 мм (от Z-координаты 0) во время первой ступени с 1 слоем; на втором этапе глубина аспирации составляет 0,15 мм, непрерывно повторяется на протяжении 4 слоев. Разрешение аспирации составляет 1,2, а диаметр 0,9 мм. Во время аспирации мгновенное расположение кончика иглы можно контролировать через панель графика трека. После завершения этого аспирационного раунда создается карман колонны глубиной 0,8 мм и диаметром 1 мм. Кончик иглы вернется к центру с Z-координатой 0.
    4. В сеансе "zStep" щелкните и проверьте первую и вторую строки. Задайте значения для первой строки равными 1 и 1. Установите значения для второй строки в 0,15 и 4 (рисунок 3B).
    5. В сеансе "Mode" сохраните все значения такими же, как и в предыдущем раунде (рисунок 3B).
    6. Последовательно нажмите кнопки Set, Keep Zero и Start , чтобы начать стремление.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это2-й раунд стремления. Входные значения указывают на то, что глубина аспирации составляет 1 мм (от Z-координаты 0) во время первой ступени с 1 слоем; на втором этапе глубина аспирации составляет 0,15 мм, непрерывно повторяется на протяжении 4 слоев. После завершения этого аспирационного раунда создается карман колонны глубиной 1,6 мм и диаметром 1 мм.
    7. В сеансе "zStep" щелкните и проверьте только первую строку. Установите значения для первой строки в 1.8 и 1 (рисунок 3C).
    8. В сеансе "Режим" установите размер иглы 27 Калибр и 2.2. Все остальные значения остаются такими же, как и в предыдущем раунде (рисунок 3C).
    9. Последовательно нажмите кнопки Set, Keep Zero и Start , чтобы начать стремление.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это3-й раунд аспирации. Входные значения указывают на глубину аспирации 1,8 мм (от Z-координаты 0) с 1 слоем. Резолюция о стремлении — 2.2. После завершения этого аспирационного раунда создается карман колонны глубиной 1,8 мм и диаметром 1 мм.
    10. В сеансе "zStep" щелкните и проверьте только первую строку. Установите значения для первой строки в 1.6 и 1 (рисунок 3D).
    11. В сеансе "Режим" установите Размер иглы 27 Калибр и 2.2, установите Dims 0.6 (Рисунок 3D).
    12. Последовательно нажмите кнопки Set, Keep Zero и Start , чтобы начать аспирацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это4-й раунд аспирации. Целью этого шага является очистка крови, скопившейся в кармане. Кровотечение распространено, так как мелкие кровеносные сосуды разрываются во время процесса аспирации. Чтобы тщательно очистить кровь, прекратите орошение ACSF на 5 минут, а затем снова включите орошение. Повторите4-й раунд аспирации несколько раз, пока карман не освободится от крови. Этот протокол может быть использован для нацеливания на любые другие глубокие области мозга. Например, если целевой областью мозга является NAc, конечная соответствующая Z-координата D/V должна составлять 4,4 мм.
  18. Остановите вакуум и орошение ACSF. Доведите иглу до +2 мм Z-координаты и 0,5 мм спереди к центру. Поместите стерильную линзу GRIN 1 мм в карман.
  19. Держите кончик иглы в контакте с открытой линзой GRIN, чтобы обеспечить оседание линзы GRIN под углом 10°. Осторожно прижмите верхнюю поверхность линзы GRIN стерильной бумагой для мягких папирос, чтобы нижняя поверхность линзы GRIN контактировала с мозговой тканью.
  20. Нанесите расплавленную агарозу в щель между хрусталиком GRIN и мозговой тканью с помощью шпателя. После того, как Агароза образует гель, удалите избыток Агарозы с помощью микролопасти.
  21. Тщательно очистите череп солевыми и ватными тампонами. Дайте черепу высохнуть перед последующим нанесением зубного цемента (см. Таблицу материалов).
  22. Выньте хорошо перемешиваемую скважину из морозильной камеры при температуре -20 °C. Смешайте порошок зубного цемента и каталитическую жидкость и нанесите слой самоотверждающегося клейкого смоляного цемента на череп; сначала окружите линзу GRIN, а затем охватите весь открытый череп.
  23. Подождите 5 минут и дайте ему полностью затвердеть. Аккуратно извлеките аспирационную иглу.
  24. В чистом пластиковом колодце смешайте зубной цементный порошок, черный уголь с жидкостью, а сверху на 1-й слой зубного цемента нанесите тонкий слой смеси. Подождите 5 минут, чтобы дать ему затвердеть.
  25. Защитите экспонированную линзу GRIN, покрыв ее специальным колпачком, изготовленным из трубки ПЦР (рисунок 2D). Нанесите цианоакрилат, чтобы прикрепить колпачок к зубному цементу.
  26. Вводят 1 мл предварительного физиологического раствора подкожно мыши, а затем 0,1 мг/кг бупренорфина. Поместите мышь обратно в ее домашнюю клетку. Поместите домашнюю клетку в инкубатор с температурой 33 °C и следите за мышью, пока она не станет амбулаторной. Обычно мыши требуется 20-40 минут, чтобы проснуться от анестезии, прежде чем она начнет двигаться.
  27. Вводите нестероидные противовоспалительные препараты и контролируйте мышь в течение не менее 3 послеоперационных дней. Дайте мыши восстановиться после операции в течение 30 дней.

3. Прикрепление держателя минископа (основания) к черепу мыши (рисунок 1)

  1. Обезболивают мышь в индукционной камере 5% изофлураном и скоростью потока кислорода 1 л/мин до тех пор, пока скорость дыхания не снизится до 1 вдоха/с.
  2. Поместите мышь в стереотаксическую сцену и закрепите ее положение с помощью ушных вкладышей и зажимов для носа. Поддерживать непрерывный поток изофлурана (1,5%) и кислорода (0,5 л/мин).
  3. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы сохранить их влажными. Включите грелку и поддерживайте температуру на уровне 35 °C. Убедитесь, что мышь полностью обезболена, оценив педальные рефлексы.
  4. Аккуратно снимите колпачок, закрывающий линзу GRIN, с помощью заостренных щипцов. Сверлите высушенные остатки цианоакрилата из зубного цемента полностью с помощью микродрилла (см. Таблицу материалов).
  5. Обрежьте волосы вокруг области зубного цемента небольшими ножницами. Очистите мусор с помощью пылесоса со сжатым воздухом. Используйте ацетоновый ватный тампон для очистки верхней поверхности линзы GRIN.
  6. Подготовьте минископ с его держателем (основанием).
    1. Поместите шестигранную гайку #00-90 (см. Таблицу материалов) в прорезь, присутствующую в основании, и нанесите цианоакрилат, чтобы закрепить его там (рисунок 2E).
    2. Плотно нанесите полиэтиленовую ленту (PTFE) вокруг резьбы минископа и обрежьте дополнительную ленту (рисунок 2F).
    3. Прикрепите минископ к основанию и используйте стопорный винт для крепления минископа к основанию (рисунок 2G).
    4. Подключите минископ к кабелю и включите специально разработанное программное обеспечение с открытым доступом NeuView (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение NeuView специально разработано для визуализации кальция в минископе in vivo из группы доктора Лина в NIDA/IRP 7,12. Это открытый доступ (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0).
    5. В NeuView щелкните Hardware, проверьте LED1 и нажмите кнопку Stream , чтобы просмотреть живые изображения (рисунок 4A). Чтобы остановить прямую трансляцию, нажмите кнопку Стоп .
    6. Поместите минископ в специально изготовленный кронштейн минископа (рисунок 2H), положением XYZ которого можно манипулировать с помощью моторизованных контроллеров (рисунок 2I).
  7. Расположите минископ чуть выше экспонированного объектива GRIN и сделайте его параллельным поверхности объектива. Медленно опустите минископ к объективу GRIN и отрегулируйте его положение Z, пока не будет найдена лучшая плоскость фокусировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшая фокальная плоскость определяется путем сравнения нескольких возможных положений Z и выбора фокальной плоскости с четкой визуализацией большинства тел клеток.
  8. Аккуратно нанесите первый слой зубного цемента вокруг основания минископа, не изменяя положения минископа. После того, как цемент затвердеет, аккуратно снимите удерживающую руку так, чтобы минископ мог самостоятельно стоять на головке мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зубной цемент имеет тенденцию сжиматься после затвердевания, и он будет тянуть вниз минископ от исходной плоскости фокусировки. Как правило, положение минископа Z слегка приподнимается над исходной фокальной плоскостью перед нанесением зубного цемента для компенсации потенциального изменения.
  9. Нанесите второй слой зубного цемента вокруг основания, чтобы заполнить все зазоры и убедиться, что из зазоров нет утечки светодиодного света. Дайте зубному цементу затвердеть.
  10. Извлеките мышь из стереотаксической стадии. Ослабьте стопорный винт и отсоедините минископ от основания. Поместите защитный колпачок с 3D-печатью в основание, чтобы защитить открытую линзу GRIN, и затяните стопорный винт в основании (рисунок 2J).
  11. Поместите мышь обратно в ее домашнюю клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мыши требуется 10-15 минут, чтобы проснуться от изофлурановой анестезии, прежде чем она начнет двигаться.

4. Монтаж минископа и визуализация in vivo Ca2+ (рисунок 1)

  1. Крепление минископа к его основанию
    1. Ненадолго обезболивают мышь в индукционной камере (5% изофлурана и скорость потока кислорода 1 л/мин). Поместите мышь на чистую поверхность скамейки.
    2. Ослабьте стопорный винт небольшой отверткой, снимите защитный колпачок и очистите поверхность линзы GRIN пропитанным ацетоном ватным тампоном.
    3. Плотно оберните ленту из PTFE вокруг резьбы минископа и прикрепите минископ к его основанию на головке мыши.
    4. Подключите минископ к кабелю (рисунок 2K), включите программное обеспечение NeuView.
    5. В NeuView щелкните Hardware, проверьте LED1 и нажмите кнопку Stream , чтобы просмотреть живые изображения (рисунок 4A).
    6. Определите наилучшую фокальную плоскость, отрегулировав положение минископа относительно основания, либо слегка затягивая, либо ослабляя с помощью тупых щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшая фокальная плоскость определяется путем сравнения нескольких возможных мест и выбора одного с четкой визуализацией большинства клеточных тел.
    7. Затяните стопорный винт и поместите мышь обратно в домашнюю клетку.
    8. В NeuView отрегулируйте мощность светодиодного индикатора до оптимального уровня. Нажмите «Захват», а затем «Триггер», чтобы начать запись, и нажмите «Стоп» через 150 кадров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимально возможная мощность определяет оптимальный уровень мощности светодиода для достижения достаточно яркого изображения. Целью записи короткого видео является облегчение идентификации одной и той же фокальной плоскости в будущем для повторяющейся визуализации.
    9. Отсоедините кабель от минископа. Дайте мыши восстановиться не менее чем за 30 минут до начала эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для защиты минископа, как правило, бутылка с водой и проволочное устройство подачи пищевых продуктов удаляются в течение этого короткого периода времени. Если мыши необходимо дольше оставаться в своей домашней клетке, рекомендуется поставлять коммерчески доступный диетический гель (см. Таблицу материалов) в домашнюю клетку.
  2. Сбор данных для визуализации кальция in vivo
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация кальция In vivo может проводиться одновременно с любыми поведенческими тестами, которые пожелает исследователь. Для демонстрационных целей приведенным здесь примером является визуализация in vivo Ca2+ во время испытания в открытом поле. Для достижения этой цели требуется два компьютера. Один компьютер оснащен коммерческим программным обеспечением (см. Таблицу материалов) для управления камерой для автоматической записи поведения мыши. Другой компьютер оснащен NeuView для управления минископом и записи изображений Ca2+ .
    1. Включите программное обеспечение поведенческой камеры (см. раздел Таблица материалов), чтобы просмотреть арену поведения мыши с помощью функции Livestream. Вручную отрегулируйте фокус верхней камеры (рисунок 2L).
    2. Выберите Триггер/Строб и установите флажок "Включить/выключить триггер" (рисунок 4B). Нажмите кнопку Запись , используйте Обзор , чтобы выбрать место, где будут сохранены записи поведения, выберите нужный формат изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функция "Trigger Control" включена, чтобы позволить программному обеспечению NeuView инициировать запись поведения, так что кадры поведения и соответствующие кадры визуализации кальция временно связаны друг с другом. Запись поведения может быть сохранена в любом желаемом формате. Запись поведения обычно сохраняется в формате JPEG в указанной папке.
    3. Поднесите мышь близко к арене и подключите минископ к кабелю, подключенному к системе сбора данных (рисунок 2L) (см. Таблицу материалов). Затем мышь помещается в центр арены.
    4. С помощью функции Livestream программного обеспечения NeuView отрегулируйте мощность светодиодов для оптимизации яркости изображения кальцием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для кальциевой визуализации частота кадров записи по умолчанию составляет 10 кадров/с.
    5. В NeuView снимите флажок LED1, нажмите кнопки Capture , а затем Triggers , чтобы начать запись, и нажмите Stop через 100 кадров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это для записи фоновых изображений в течение примерно 100 кадров с выключенным светодиодным светом.
    6. В программном обеспечении поведенческой камеры щелкните Начать запись (рисунок 4C). В NeuView проверьте LED1, нажмите «Захват», а затем «Триггерные кнопки», чтобы начать запись. Нажмите Стоп после 3000 кадров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для одновременной записи изображений и поведения кальция. Испытание в открытом поле длится 15 минут, обычно разбивается на три сеанса записи по 5 минут каждый. Это делается для предотвращения перегрева минископа из-за постоянного использования.
    7. Сохраняйте изображения кальция и записи поведения в указанных папках. Повторяйте запись еще в течение двух сеансов, записывая фон перед каждым сеансом, и сохраняйте все записи в указанной папке.
  3. Отсоедините минископ от его основания.
    1. После завершения записи отсоедините кабель от минископа.
    2. Ненадолго обезболивают мышь в индукционной камере (5% изофлурана и 1 л/мин скорости потока кислорода). Поместите мышь на чистую, теплую поверхность.
  4. Открутите стопорный винт в основании и отсоедините минископ от основания. Наденьте защитный колпачок на основание и затяните стопорный винт. Поместите мышь обратно в ее домашнюю клетку.

Representative Results

На рисунке 1 показана схематическая экспериментальная процедура, включая вирусную инъекцию, имплантацию линзы GRIN, прикрепление основания минископа к черепу мыши и визуализацию кальция in vivo с помощью минископа. Вся процедура занимает ~2 месяца. На рисунке 2 показаны основные компоненты, описанные в протоколе визуализации кальция in vivo минископом in vivo. На рисунке 3 показаны интерфейсы программного обеспечения AutoStereota во время имплантации линзы GRIN. На рисунке 4 показаны интерфейсы NeuView и программного обеспечения для записи поведения во время визуализации кальция in vivo.

Результат визуализации кальция in vivo зависит от успеха как вирусных инъекций, так и операций по имплантации хрусталика GRIN. На рисунке 5 показан ряд исходов (т.е. неудачных, неоптимальных и хороших) из записей визуализации кальция in vivo . В неудачных случаях изображение кальция может казаться либо темным, либо ярким, но обычно не обнаруживает или очень мало активных нейронов. Обычно мы не проводим эксперименты по регистрации кальция in vivo , если есть менее пяти активных нейронов. Хорошая визуализация кальция in vivo обычно выявляет несколько сотен активных нейронов. Если запись содержит менее ста активных нейронов, мы считаем ее неоптимальной записью.

Как в неоптимальных, так и в хороших записях проводились эксперименты по визуализации кальция in vivo , и был проведен последующий анализ данных. На ролике 1 показана репрезентативная запись визуализации кальция in vivo от мыши mPFC. Видео о поведении и данные визуализации кальция обычно обрабатываются отдельно. Видео о поведении мыши можно оценивать вручную. Файлы изображений кальция обрабатываются с использованием набора инструментов24 для обработки изображений кальция CaImAn. На рисунке 6 показана репрезентативная карта клеток и несколько следов кальция из хорошей записи визуализации кальция in vivo .

После завершения визуализации кальция in vivo последним шагом является подтверждение того, произошла ли вирусная инъекция и имплантация линзы GRIN в желаемую область мозга. Для этой цели мышь перфузировали фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS), за которым следовал 4% параформальдегид (PFA). Мозг мыши собирали, постфиксировали в 4% PFA в течение 12 ч и хранили в PBS при 4 °C. Затем мозг мыши был разделен на срезы толщиной 50 мкм с вибратомом. Срезы мозга окрашивали DAPI и наблюдали под микроскопом (не описанным в протоколе)12. На рисунке 7 показан срез мозга мыши ~ 1,94 мм к брегме от экспериментальной мыши, показывающий след, где была имплантирована линза GRIN. Зеленая область флуоресценции под и вокруг трека объектива GRIN указывает на экспрессию GCaMP6f в области mPFC.

Figure 1
Рисунок 1: Схематический обзор экспериментальной процедуры. (А) Стереотаксическая инъекция вируса в mPFC. (B) Имплантация хрусталика GRIN в mPFC. (C) Прикрепление основания минископа к черепу мыши. (D) Монтаж минископа и визуализация кальция in vivo . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Основные компоненты, необходимые для визуализации кальция in vivo . (A) Объектив GRIN диаметром 1 мм и длиной 4,38 мм. (B) Игла 27 Г, отполированная вручную тупой концом, используемая для аспирации тканей головного мозга. (C) Роботизированная рука, соединенная с держателем иглы. (D) Изготовленный на заказ колпачок из ПЦР-трубки для защиты экспонированной линзы GRIN до прикрепления основания минископа к черепу мыши. (E) Держатель минископа (основание) с шестигранной гайкой. (F) Минископ, резьбовая часть которого обернута лентой из PTFE. (G) Минископ, прикрепленный к его основанию с помощью стопорного винта. (H) Минископ, держащий руку. (I) Специально изготовленный 3D-моторизованный контроллер, используемый для облегчения перемещения минископа в положениях XYZ. (J) Защитный колпачок, прикрепленный к основанию для защиты открытой линзы GRIN, в то время как мышь не выполняет визуализацию кальция in vivo . (K) Минископ, подключенный к кабелю. (L) Система сбора данных для визуализации in vivo Ca2+ . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Интерфейсы программного обеспечения AutoStereota во время послойной аспирации мозговой ткани. (A) Интерфейс, соответствующий шагам 2.17.1 - 2.17.3. (B) Интерфейс, соответствующий шагам 2.17.4-2.17.6. (C) Интерфейс, соответствующий шагам 2.17.7-2.17.9. D) интерфейс, соответствующий шагам 2.17.10-2.17.12. Красными полями выделены входные значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Интерфейсы программного обеспечения NeuView и программного обеспечения для записи поведения во время визуализации кальция in vivo . (A) Интерфейс NeuView. (В,С) Интерфейсы программного обеспечения для записи поведения. Красными полями выделены кнопки, которые необходимо нажать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Карты клеток максимальной проекции флуоресценции для отображения диапазона возможных исходов. (A,B) Неудачная визуализация кальция in vivo , которая неприемлема для последующего анализа данных. (A) темный и содержит менее 5 активных нейронов. (B) яркий, но не имеет активных нейронов. (C) Клеточная карта из субоптимальной визуализации кальция in vivo , которая содержит некоторые активные нейроны. (D) Клеточная карта из хорошей визуализации кальция in vivo , которая включает в себя несколько сотен активных нейронов. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Репрезентативная клеточная карта и переходные процессы кальция из успешной визуализации кальция in vivo . Левая панель представляет собой карту клеток максимальной проекции флуоресценции из записи визуализации кальция in vivo в mPFC во время испытания в открытом поле. Запись длится 5 минут. На правой панели показаны переходные процессы кальция из 15 областей, представляющих интерес (в соответствии с цветом). Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Посмертная оценка экспериментальной мыши. Посмертная оценка экспрессии GCaMP6f и имплантации линзы GRIN в mPFC экспериментальной мыши. Прямоугольная область указывает путь для имплантации хрусталика GRIN. Зеленая зона под имплантированной областью линзы GRIN подтверждает, что GCaMP6f был экспрессирован, а линза GRIN была имплантирована именно в нужную область мозга. Cg, поясная кора; PrL, прелимбическая кора; IL, инфралимбическая кора. Шкала: 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сравнение специализированной системы минископов в NIDA с другими минископическими системами 7,8,9,10,11,13,25,26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Фильм 1: Запись изображений кальция in vivo с мыши mPFC во время испытания в открытом поле. В демонстрационных целях это видео показывает только 1 минуту записи. Исходная частота кадров записи составляет 10 кадров/с. Видео в 6 раз быстрее, чем оригинальная запись. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Discussion

Центральным вопросом в нейробиологии является понимание того, как нейронная динамика и схемы кодируют и хранят информацию, и как они изменяются при заболеваниях мозга. Используя систему визуализации miniscope in vivo Ca2+, индивидуальная нейронная активность нескольких сотен нейронов в локальной микросхеме может одновременно контролироваться от свободно ведущего себя животного. Здесь описан подробный хирургический протокол для вирусной инъекции и имплантации линзы GRIN для подготовки грызунов к глубокой визуализации мозга in vivo Ca2 + с помощью специально разработанной системы записи минископа. В таблице 1 показаны сравнения нашей минископической системы с другими коммерчески доступными и изготовленными на заказ системами минископов 7,8,9,10,11,13,25,26. Стоит отметить, что имплантация хрусталика GRIN с использованием настоящего хирургического протокола совместима с любыми коммерческими или изготовленными на заказ однофотонными и двухфотонными системами визуализации для глубокой визуализации мозга in vivo кальцием.

От вирусной инъекции до получения данных минископом in vivo кальциевой визуализации, вся экспериментальная процедура занимает не менее 2 месяцев. Это сложный и трудоемкий процесс. Конечный успех эксперимента зависит от множества факторов, включая правильный выбор GECI, точную инъекцию вируса в целевую область мозга, достаточную вирусную экспрессию в желаемой нейронной популяции, имплантацию хрусталика GRIN точно в нужное место, адекватное восстановление после операций, а также, возникает ли тяжелое воспаление после операции, и серьезно ли поведение животного влияет на операции, и так далее.

Два критических этапа включают стереотаксическую инъекцию вируса и имплантацию хрусталика GRIN. Для демонстрационной цели стереотаксическую микроинъекцию выполняли в мышином mPFC, с аденоассоциированным вирусом (AAV1), кодирующим GCaMP6f под контролем промотора CaMKII, который избирательно маркирует пирамидальные нейроны в mPFC. GCaMP6f был выбран, так как это один из самых быстрых и чувствительных показателей кальция со временем полураспада 71 мс15. Кроме того, вирусная экспрессия AAV GCaMP6f является длительной (т.е. несколько месяцев), что делает ее идеальной для выполнения повторяющейся визуализации in vivo Ca2+ в течение длительного периода для продольных исследований на мышиных моделях нейродегенеративных заболеваний27. Текущий протокол операции может быть адаптирован для нацеливания на различные клеточные популяции в любой другой области мозга. Различные доступные вирусные инструменты позволяют селективно маркировать конкретные нейронные популяции в нужной области мозга в нужном возрасте. Кроме того, исследователи могут воспользоваться системой рекомбинации Cre-LoxP и различными доступными трансгенными моделями мышей для проведения генетических модификаций и изучения поведенческих и нейронных схем28,29.

Одной из уникальных особенностей представленного протокола является то, что автоматизированная послойная аспирация мозговой ткани была выполнена перед имплантацией линзы GRIN (диаметром 1 мм). Это достигается с помощью иглы 27 G, подключенной к вакуумной системе, управляемой специально изготовленной роботизированной рукой и программным обеспечением23. Основываясь на нашем опыте, этот метод создает однородную поверхность для контакта линзы GRIN и наносит меньший ущерб соседней ткани, чем мануальная тканевая аспирация23. По этой причине эта процедура приносит очевидное преимущество для линз GRIN с относительно более широким диаметром (например, 1 мм). Однако тканевая аспирация может не потребоваться для имплантации линзы GRIN с меньшим диаметром (0,5 мм или 0,25 мм). Вместо этого он может быть непосредственно посажен вдоль ведущей дорожки, сделанной с помощью иглы30 G 21.

Помимо двух критических шагов, рассмотренных выше, многие другие факторы должны быть тщательно рассмотрены для успешной операции. (1) Все инструменты, которые контактируют с мозгом, должны быть стерилизованы для предотвращения инфекции. (2) Все хирургические шаги должны быть выполнены, чтобы свести к минимуму повреждение мозга, чтобы предотвратить дальнейшее воспаление и чрезмерное образование рубцовой ткани. (3) Дозы анестезии, вводимые первоначально и поддерживаемые во время операции, особенно те, которые вводятся внутрибрюшинно, должны быть тщательно рассмотрены. Дозы анестезии могут быть изменены в соответствии с различными штаммами мышей, так как некоторые из них могут быть более восприимчивыми. (4) Состояние мыши необходимо постоянно контролировать во время операции. Наконец, (5) мыши должны регулярно контролироваться после операции, так как после операции может возникнуть много осложнений.

Хотя кусок мозговой ткани удаляется в одностороннем порядке на этапе имплантации хрусталика GRIN, мы не наблюдали каких-либо очевидных дефицитов поведения 7,12. Вес минископа составляет около 2 граммов, а кабель специально разработан, чтобы сделать его легким и гарантировать, что мышь может легко его переносить. Минископ и кабель прикрепляются к животному только перед визуализацией in vivo и отсоединяются после визуализации. Весь процесс визуализации обычно занимает не более 30 минут. Поэтому эти приборы не мешают мыши свободно вести себя. Этапы установки и деинсталляции минископа требуют кратковременной анестезии (менее 2 минут) изофлураном с целью удержания животных. Обычно мы оставляем мышь оправиться от кратковременного воздействия изофлурана в течение 30 минут, прежде чем выполнять визуализацию in vivo. Мы проводили минископическую визуализацию кальция in vivo один раз в неделю в течение нескольких недель, не замечая какого-либо влияния на здоровье мышей и социальное поведение мыши12.

Одним из основных ограничений нынешней системы записи минископа является необходимость подключения микроскопа к кабелю для сбора данных. Наличие кабеля иногда ограничивает выполнение задач мыши и ограничивает запись одного животного за раз. Недавно был разработан беспроводной минископ25,26. Это расширит производительность задачи и позволит одновременно получать изображения in vivo от нескольких животных в группе. Кроме того, разработка более чувствительных GECI со спектрально разделяемыми длинами волн в сочетании с двухцветным минископом предложит более захватывающие возможности для исследований в области неврологии.

Disclosures

Авторы сообщают об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается грантами Национального института здравоохранения (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 и UG3NS115608.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6mm and 1.2mm drill burrs KF technology 8000037800 For craniotomy
27-G and 30-G needle BD PrecisionGlide Needle REF 305109 and REF305106 For both surgeries
45 angled forceps Fine Science tools 11251-35 For surgeries
7.5% povidone-iodine solution (Betadine) Purdue Products L.P. NDC 67618-151-17 Surface disinfectant
Acetone Sigma-Aldrich 179124-1L GRIN lens cleaner
Agarose Sigma-Aldrich A9539-25G For GRIN lens implantation
Antibiotic ointment HeliDerm Technology 81073087 For virus injection
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen) Johnson & Johnson Consumer Inc 30043308 Acts as pain killer after surgeries
AutoStereota NIDA/IRP github.com/liang-bo/autostereota For GRIN lens implantation
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2) Point Grey Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C For recording behavior
Brass hex nut McMASTER-CARR 92736A112 For GRIN lens implantation
Buprenorphine Par Pharmaceuticals NDC 4202317905 For GRIN lens implantation
Calcium chloride Sigma 10043-52-4 For preparing aCSF
Commutator NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank Rocky Mountain Air Solutions BI-OX-CD5C-K For GRIN lens implantation
Compressed Oxygen tank Rocky Mountain Air Solutions OX-M-K For virus injection
Cordless Microdrill KF technology 8000037800 For craniotomy
Cyanoacrylate Henkel Coorporation # 1811182 For GRIN lens implantation
Data acquisition controller NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Data transmission cable NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Dental cement set C&B Metabond and Catalyst A00253revA306 and A00168revB306 For GRIN lens implantation
Dental cement set Duralay 2249D For GRIN lens implantation
Dexamethasone VETone NDC 1398503702 For GRIN lens implantation
Dextrose Sigma 50-99-7 For preparing aCSF
Diet gel Clear H20 72-06-5022 Diet Supplement for mouse
GRIN lens GRINTECH NEM-100-25-10-860-S For GRIN lens implantation
Heating Pad Physitemp Instruments LLC. #10023 To keep the mouse body warm during surgeries
Isoflurane VETone V1 502017 Anesthesia
Ketamine VETone V1 501072 For GRIN lens implantation
Lidocaine WEST-WARD NDC 0143-9575-01 Local anesthesia
Magnesium chloride hexahydrate Sigma 7791-18-6 For preparing aCSF
Microliter syringe (Hamilton) Hamilton 7653-01 For virus injection
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instrument #178647 For virus injection
Miniscope NIDA/IRP Custom-designed For imaging
Miniscope base Protolabs Custom-designed For mounting the base
Miniscope holding arm NIDA/IRP Custom-designed For mounting the base
Miniscope protection cap Protolabs Custom-designed For protecting the miniscope
Motorized controller Thorlabs KMTS50E For mounting the base
NeuView NIDA/IRP https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 For in vivo imaging
Ophthalmic ointment Puralube Vet Ointment NDC 17033-211-38 Ophthalmic
PCR tube Thermo Scientific AB-0622 For GRIN lens implantation
Pinch Clamp World Precision Instrument 14040 For clamping the tubing
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape TegaSeal PTFE Tape A-A-58092 For fastening miniScope to the base
Potassium chloride Sigma 7447-40-7 For preparing aCSF
Robotic arm NIDA/IRP Custom-designed For GRIN lens implantation
Saline Hospira RL 7302 For both surgeries
Set screw DECORAH LLC. 3BT-P9005-00-0025 For screwing the brass hex nut in miniscope base
 Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD McMaster 2124T3 For irrigation of aCSF
Sodium bicarbonate Sigma 144-55-8 For preparing aCSF
Sodium chloride Sigma 7647-14-5 For preparing aCSF
Sodium phosphate monobasic Sigma 7558-80-7 For preparing aCSF
Stereotaxic stage KOPF Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic For both surgeries
Sterile cotton swab Puritan REF 806-WC For both surgeries
Surgical tools Fine Science tools 11251-35 For surgeries
Suture Sofsilk REF SS683 For virus injection
 Syringe filter (0.22 µm) Millex SLGVR33RS For filtering aCSF during GRIN lens implantation
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f) Addgene 100834-AAV1 For virus injection
Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml
Xylazine VETone V1 510650 For GRIN lens implantation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  2. Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex. Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).
  4. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  5. Komiyama, T., et al. Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice. Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).
  6. Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. Reorganization of corticospinal output during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).
  7. Barbera, G., et al. Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information. Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).
  8. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  9. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  10. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  11. Jacob, A. D., et al. A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
  12. Liang, B., et al. Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration. Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).
  13. Liberti, W. A., et al. Unstable neurons underlie a stable learned behavior. Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  17. Bassett, J. J., Monteith, G. R. Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery. Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).
  18. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  19. Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators. Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).
  20. Moore, D. T. Gradient-index optics: A review. Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).
  21. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
  22. Yang, Y., et al. A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging. Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).
  23. Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).
  24. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
  25. Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice. Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).
  26. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  27. Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).
  28. Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome. Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).
  29. McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).

Tags

Неврология Выпуск 176 Минископ визуализация кальция in vivo mPFC мышь хирургия головного мозга

Erratum

Formal Correction: Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging
Posted by JoVE Editors on 05/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. The Discussion was updated.

The following paragraph was added to the end of the Discussion:

Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

Стереотаксическая вирусная инъекция и имплантация линз с градиентным индексом для глубокой визуализации кальция <em>in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li,… More

Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (176), e63049, doi:10.3791/63049 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter